EGF

近期生物技术领域取得了重大突破，其中一款 治疗型KRAS突变癌症疫苗ELI-002 ，引起了广泛关注。 KRAS突变是一种常见的基因突变类型，存在于多款癌种（如 胰腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、甲状腺癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌 等）中。这款突变既往一直被视为“无法成药”的靶点，然而ELI-002疫苗的成功研发，为这一难题提供了新的解决方案，该疫苗 无需单独单独设计 ，即可 刺激机体免疫系统识别和攻击癌细胞，免去了复杂的流程，节约了制作疫苗的耗时 ，具有广阔的应用前景， 为病情急迫的癌症患者带来了新的希望 ！ “现货型”ELI-002疫苗，6例胰腺癌/结直肠癌达到完全缓解 ELI-002疫苗是由美国研发的一款 针对KRAS突变的治疗型疫苗 ，主要针对KRAS突变阳性实体瘤，尤其是 胰腺导管腺癌 （93%）、 结直肠癌 （52%）。 该疫苗由两个关键组件构成，即 AMP-CpG （一种特有的免疫激活剂，可刺激免疫系统产生强烈的反应）、 AMP-mKRAS-肽 。其中，AMP-mKRAS-肽是一种经修饰的KRAS突变肽，其作用类似于 “信号塔” ，可 特异性地引导机体免疫系统，追踪并摧毁携带KRAS突变的癌细胞 。 2024年1月，世界权威期刊《Nature》发表了 ELI-002的1期AMPLIFY-201临床试验（NCT05726864） 数据。截至2023年4月25日，共有25例（其中胰腺癌20例、结直肠癌5例）mKRAS驱动的高复发风险的癌症患者入组，中位年龄61.0岁（范围37-77岁），这些患者既往均接受过手术和化疗，28%的患者接受过放疗，肿瘤标志物CA19-9及ctDNA检测仍提示有残留癌症（阳性）。入组后，接受为期6个月的ELI-002单一辅助治疗。经过为期2年的随访，结果显示： 1、 肿瘤标记物 ：在23例可评估的患者中，治疗6个月时， 77%患者出现肿瘤标志物减少 ，其中 6例患者更是达到了完全缓解（CR） ，这意味着 这6例患者的癌症被清除了 ！ 2、 中位总生存期（OS） ：从第一剂疫苗接种日期起，入组的25例患者，其 中位OS为16.33个月 （详见下图）。 ▲图源“nature medicine”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 3、 不良反应 ：48%的患者在治疗后，出现了1或2极相关不良反应，未见严重不良反应（≥3级），常见包括 疲劳、肌痛、注射部位反应 等。 综上，ELI-002疫苗显著降低了患者肿瘤标志物水平，并产生了强烈的T细胞应答，从而降低了患者复发及死亡的风险，且总体上被认为是安全可控的。 除了本次提到的新型ELI-002疫苗外，还有多款疫苗效果惊艳，剑指 肺癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、前列腺癌 等多款癌种，值得期待！下面全球肿瘤医生网小编帮大家汇总一下这几款癌症疫苗，以供参考。 古巴肺癌疫苗Cimavax-EGF：近半数肺癌患者生存期≥2年 CIMAvax-EGF是由古巴开发的一款针对 非小细胞肺癌 的治疗性疫苗， 2014年获古巴国家药品和医疗器械控制中心CECMED批准 ，之后又在 秘鲁、阿根廷、波斯尼亚、哥伦比亚、黑塞哥维那 等国获批使用。 该疫苗是通过诱导免疫系统，产生针对自身EGF（表皮细胞生长因子）的抗体，阻断EGF-EGFR的相互作用，从而将依赖EGF滋养的 癌细胞“活活饿死” ，最终达到抗癌、预防癌症扩散等目的。 《Journal of Cancer》发表了一项“ Cimavax-EGF治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC） ”的令人惊艳的临床研究结果。入组的106例晚期非小细胞肺癌患者（脑转移除外），在接受一线治疗（如放化疗、铂类双药或单药化疗）待病情稳定后，入组接受CIMAvax-EGF治疗，经过14.2个月的中位随访，结果显示如下： 1、 中位总生存期（OS） ：从一线治疗和CIMAvax-EGF开始之日起估算的 中位OS为22.46个月 ，其中，患者6个月生存率为 97.7% 、12个月生存率为 82.7% 、24个月生存率为 45.5% （详见下图），这意味着 近半数患者的生存期在2年以上！ ▲图源“J Cancer”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 2、 中位无进展生存期（PFS） ：全部入组患者的 中位PFS达8.16个月 [95% CI（4.9-11.3）]。其中，患者6个月的无进展生存率达 55.4% 、12个月无进展生存率为 36.4% 、24个月的无进展生存率为 19.1% （详见下图）。 ▲图源“J Cancer”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 3、 不良反应 ：接种疫苗后的常见不良反应包括 注射部位疼痛（27.2%）、局部红斑（10.9%）、呕吐（1.8%） 等，未见严重不良反应。 如何寻求癌症疫苗帮助？ 1、古巴肺癌疫苗 想寻求古巴肺癌疫苗帮助的患者，可考虑 出国就医、邀请古巴专家会诊 或 向古巴医疗部门申请肺癌疫苗 。 2、其他癌症疫苗 目前有几款癌症疫苗，正在招募恶性肿瘤患者，包括但不限于肝癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、宫颈癌等癌种！想参加临床试验的患者，可将近期病理报告、治疗经历、出院小结等资料，提交至全球肿瘤医生网医学部进行评估申请！ DC疫苗Neo-MoDC重大突破！晚期胃癌持久缓解 2022年6月，国际权威期刊《Nature》子刊上，发表了1例晚期转移性胃癌（IV期，Bormann III型）患者，首次接受 免疫检查点抑制剂（PD-1） 联合 Neo-MoDC （一款个性化新抗原负载树突状细胞疫苗）治疗后， 肿瘤体积迅速减小，病灶完全消失并持续长达25个月 的报道，这是 目前已知的首个通过新抗原DC疫苗联合PD-1，治疗胃癌后，肿瘤完全和持久消退的案例 ，具有里程碑式的意义！ Neo-MoDC是 由中国自主研发的一款个性化载有新抗原的树突状细胞（DC）疫苗 ，可充分调动机体免疫系统，促进并调动T细胞，对全身癌细胞进行猛烈攻击，最终达到抗癌目的。本次入组的患者，既往接受过 FOLFOX治疗、D2根治性远端胃切除术 ，但病情依旧进展，而且出现 淋巴结及腹膜转移 。这些患者在入组参加Neo-MoDC临床试验（NCT03185429）后，结果显示如下： 1、 肿瘤标志物CA125（即胃癌进展的生物标志物） ：首轮纳武单抗治疗后5天，血清CA-125水平从 596U/ml ，迅速下降至 64U/ml 。2周后，患者 恶性腹水症状消失 。 2、 影像学检查 ：初次接种疫苗后第231天，PET示 右侧卵巢病灶近乎完全消退 （详见图1）。联合治疗第389天，CT示 卵巢种植转移完全消失 （详见图2）。截至2021年10月，CT显示 完全消退持续25个月 。 图1 治疗第231天，右侧卵巢PET/CT图像 ▲图源“npj”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 图2 治疗期间目标肿瘤病变的代表性图像 ▲图源“npj”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 注：黄色箭头代表目标肿瘤病变；蓝色箭头代表肿瘤病变完全消退。 肝细胞癌GNOS-PV02疫苗，疾病控制率达54.2% GNOS-PV02是由美国研发的一款 个性化新抗原DNA疫苗 ，主要针对 肝细胞癌（HCC） ，可编码多达40余种患者特异性肿瘤新抗原（即癌细胞产生的异常突变及基因组变异），从而发挥强大的抗肿瘤效力！ 一项关于“ GNOS-PV02治疗转移性或不可切除肝细胞癌（HCC） ”的Ib/IIa期临床试验（GT-30），共入组36例病情持续进展的不可切除或转移性肝细胞癌患者，中位年龄66.5岁（范围40-78岁），入组后接受派姆单抗联合GNOS-PV02治疗。 结果显示，在32例可评估病情的患者中， 客观缓解率（ORR）为30.4%(7/23)，疾病控制率（DOR）高达54.2% （详见下图）！其中， 3例患者获得完全缓解（CR）、7例达到部分缓解（PR）、9例患者疾病稳定（SD） 。我们也期望这款疫苗能尽早上市，让更多肝癌患者获益！ 头颈癌福音，个体化新抗原疫苗TG4050效果亮眼 TG4050是一款 个体化新抗原癌症疫苗 ，用于治疗 HPV阴性的头颈癌 患者。2023年，美国临床肿瘤学会（ASCO）上，发表了“ TG4050治疗HPV阴性头颈癌 ”的Ⅰ期临床研究数据，共入组32例HPV阴性头颈癌头颈癌患者，中位随访时间为10.4个月，结果显示： 所有接受TG4050治疗的16例患者，均产生了 特异性的免疫反应，不仅保持疾病缓解状态，而且未见严重不良反应 。相比之下，对照组中有2例具有相似特性的患者病情复发，另2例患者也有复发的迹象。 Transgene和NEC公司计划，在2023年下半年启动头颈癌Ⅱ期辅助试验，并计划在2024年中期，实现18个月的中位随访。 Sipuleucel-T疫苗-前列腺癌克星，生存期延长4.1个月 Sipuleucel-T（即Provenge）是一款 树突状细胞（DC）疫苗 ，已获美国FDA批准，治疗 无症状或症状轻微的转移性去势抵抗性前列腺癌 ，它也是 首款获批治疗癌症的自体细胞疗法。 本次获批是基于“ Sipuleucel-T的3期临床试验（IMPACT）结果 ”，本次共纳入512例男性转移性雄激素非依赖性前列腺癌患者，将其随机分为两组，即Sipuleucel-T疫苗接种组（n=341）、对照组（n=171）。 结果显示，中位总生存期（OS）为 25.8个月 （疫苗接种组） vs 21.7个月 （对照组）。显然，与对照组相比， Sipuleucel-T使患者的生存期延长了4.1个月，死亡风险降低了22.5%！ 小编寄语 癌症疫苗经历了数十载的发展，逐渐从早期基础研究阶段，转向了临床研究阶段。值得欣慰的是，不断有诸如ELI-002疫苗等新款疫苗的出现，一次一次地突破技术壁垒，扩大应用范围，唤醒免疫系统重新识别并杀伤癌细胞，同时产生免疫记忆反应，使免疫细胞发挥持续的保护作用。全球肿瘤医生网小编也希望随着癌症疫苗的不断优化，未来能创造出更多的抗癌奇迹！ 不过需要提醒病友们，作为一种高度突变的全身性疾病， 癌症的初始治疗非常重要，对每一位癌症患者而言，都是一次珍贵的治疗机会，建议患者开始治疗前，尽可能地咨询权威医院的专业肿瘤专家，把握宝贵的治疗机会，坚持科学规范的治疗 ，目前临床一般提倡综合性治疗方式，如在手术+放化疗等传统方法的基础上，配合靶向治疗、免疫治疗（CAR-T、TCR-T、TIL疗法）等，需要根据患者病情、个体情况、经济条件等，“量身定制”适合自己的治疗方案， 对未来整个病情和预后都具有积极的影响 ！ 如果您对目前的治疗方案存疑，或想寻求癌症疫苗等国内外新兴抗癌疗法的帮助，可提交资料至全球肿瘤医生网医学部，详细评估病情或申请国际会诊。 参考资料 [1]Pant S,et al.Lymph-node-targeted, mKRAS-specific amphiphile vaccine in pancreatic and colorectal cancer: the phase 1 AMPLIFY-201 trial[J].Nature medicine,2024:1-12. https://www.nature.com/articles/s41591-023-02760-3 [2]Flores Vega YI,et al.Survival of NSCLC Patients Treated with Cimavax-EGF as Switch Maintenance in the Real-World Scenario.J Cancer.2023 Apr 1;14(5):874-879. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10088885/ [3]Guo Z,et al. Durable complete response to neoantigen-loaded dendritic-cell vaccine following anti-PD-1 therapy in metastatic gastric cancer[J]. NPJ Precision Oncology, 2022, 6(1): 34. https://www.nature.com/articles/s41698-022-00279-3

深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769近期，国人团队发表重要综述 Organoids: opportunities and challenges of cancer therapy，仅需一张图简明扼要地总结了不同肿瘤类器官培养方法的关键。从肿瘤组织中通过机械或酶解获得肿瘤细胞，用几乎相同的基础培养基进行培养，而细胞因子是肿瘤类器官培养成功的决定因素之一。不同肿瘤类器官培养方法的简要概述（源自参考文献：Organoids opportunities and challenges of cancer therapy）接下来，我们将重点介绍几种重要的肿瘤类器官培养基组分及方案。1. 胃癌类器官通过构建源自胃癌患者的类器官（PDO），能够直接对临床样本进行研究。Vlachogiannis 等人为了成功培养胃癌类器官，除了使用 ADMEM/F12 培养基和基底膜基质外，还添加了 EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10 等细胞因子。胃癌患者的类器官（PDO）培养步骤：如下实验流程和数据均引用Vlachogiannis等人发表的文章（doi: 10.1126/science.aao2774），供参考。1，配置 PDO 培养基：改良的 DMEM/F12 基础培养基，添加 1x B27 additive、1x N2 additive、0.01% BSA、2 mM L-Glutamine、100 units/ml 青霉素-链霉素，以及如下表的细胞因子或其他添加物：*HGF 仅用于胆管癌类器官。2，样本收集：通过图像引导或内窥镜手术收集活检样品。收获后，样本置于冷 PBS 中，并在冰上运输到实验室，20 分钟～2 小时内将组织切片切碎。3，样本处理：组织切碎后，加入 5 ml 5 mM  的 PBS/EDTA，室温静置 15 分钟。用含有 2x TrypLe 的 1 mM PBS/EDTA 5 ml 在 37 ℃ 消化 1 小时。施加机械力（如吹液）以促进消化。4，接种细胞：用改良的 DMEM/F12 培养基收集分离的细胞，并在 4 ℃，1,200 转/分离心 5 分钟，使细胞成球状，用 120 µl GFR 基质胶重悬，接种到 24 孔或 48 孔的平底细胞培养板中。5，将基质在 37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 20 分钟，进行固化。然后添加 500 µl 配置好的 PDO 培养基，要完全覆盖培养孔。6，每两天换一次培养基。2. 结直肠癌类器官患者来源的肿瘤类器官已成为结直肠癌临床前研究的一种出色的模型，原代上皮细胞可在特定生长因子的控制下和 3D 细胞外基质（ECM）中成功培养类器官。肠上皮细胞的自我更新由位于隐窝中的 Lgr5 干细胞驱动。Wnt 信号是维持隐窝干细胞活跃所必需的，Wnt 激动剂 R-Spondin 1 是 Lgr5 的配体，诱导隐窝增生。EGF 信号与肠道增殖有关，Noggin 诱导隐窝数量的急剧增加。因此 van de Wetering 等人开发的结直肠癌类器官培养体系如下：（如下实验流程和数据均引用 van de Wetering 等人发表的文章（doi: 10.1016/j.cell.2015.03.053），供参考。）1. 基础培养基：改良的 DMEM/F12 培养基，添加青霉素-链霉素、10 mM HEPES 和 Glutamax。2. 人肠干细胞培养基：Wnt 条件培养基、R-Spondin 1 条件培养基、Noggin 条件培养基和基础培养基按照 50%、20%、10% 和 20% 的体积比混合，然后加入 1x B27、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、50 ng/ml 人 EGF、10 nM Gastrin、500 nM A83-01、3 uM SB202190、10 nM Prostaglandine E2 和 100 mg/ml Primocin。3. H&E 染色分析：通过 H&E 染色对培养后的原代肿瘤细胞和类器官进行分析，发现大多数类器官的特征是存在一个或多个管腔，与原代肿瘤的管状结构相似（如 P8 和 P19b），没有管腔的原代肿瘤会形成没有管腔的紧凑型类器官（P19a）。肿瘤类器官与原代肿瘤上皮相似3. 肝癌类器官肿瘤类器官的培养非常复杂，如肝癌类器。原发性肝细胞癌主要分为肝细胞癌（HCC）、胆管细胞癌（CC）和混合型（CHC）。在肝细胞癌类器官培养中需要使用地塞米松但是胆管细胞性肝细胞癌类器官培养则需加入 R-spondin 1 来维持细胞生长。Broutier 等人发现原发性肝癌（PLC）组织培养获得的类器官可以在体外真实地模拟人类 PLC 的遗传复杂性。构建的类器官包含 PLC 常见的三种亚型：HCC、CC 和 CHC，再现亲本肿瘤的组织结构和表达谱，同时保留患者及亚型之间的差异性，有利于肝癌相关基因和潜在生物标志物的鉴定。肝癌类器官分类培养基：如下实验流程和数据均引用 Broutier 等人发表的文章（doi: 10.1038/nm.4438），供参考。1，基础培养基：改良的 DMEM/F12 培养基，添加 1% 青霉素-链霉素、1% Glutamax、10 mM HEPES 和 1:50 B27 添加剂。2，经典人肝类器官分离培养基：Wnt 条件培养基、R-Spondin 1 条件培养基和基础培养基按照 30%、10% 和 70% 的体积比混合，然后加入 1:100 N2 添加剂、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重组人 Gastrin I、50 ng/ml 重组人EGF、100 ng/ml 重组人 FGF10、25 ng/ml 重组人  HGF、25 ng/ml Noggin、5 uM A83-01、10 uM Forskolin、10 uM Y27632。3，肿瘤细胞特异性分离培养基：经典人肝类器官分离培养基中添加 3 mM 地塞米松。4，肝癌类器官培养基：基础培养基、10% （体积比）R-Spondin 1 条件培养基、1:100 N2 添加剂、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重组人 Gastrin I、50 ng/ml 重组人 EGF、100 ng/ml 重组人 FGF10、25 ng/ml 重组人 HGF、5 uM A83-01、10 uM Forskolin。4. 乳腺癌类器官乳腺癌类器官的培养基与其他肿瘤的略有不同。Seino 等人在类器官培养基优化过程中发现，Neuregulin 1 与乳腺发育和肿瘤发生有关，将其添加到培养基中可维持类器官有效再生和长期增殖（超过 20 代）。Wnt-3A 对类器官培养条件改善不明显。EGF 对乳腺癌类器官培养具有双重作用，高于 5 ng/ml 促进细胞增殖，但会导致类器官解体，失去自组织功能，低浓度则相反。Hans Clevers 等构建乳腺癌类器官的培养基组分：（如下实验流程和数据均引用 Hans Clevers 等人发表的文章（ doi 10.1016/j.cell.2017.11.010 ），供参考。）a：类器官出现解体时减少或不添加，b：浓度超过 1 μM 会降低类器官生成效率5. 肺癌类器官培养肺癌是全球常见的恶性实体肿瘤，但是肺癌早期临床表现不明显，容易与其他感染混淆而被忽视，一般确诊时已发展到中晚期，因此，及时准确地筛选合适的抗肿瘤药物对肺癌患者非常重要。1 份从原发性肿瘤组织中衍生出肺腺癌类器官（成功率达到 80%）的培养基组分：（如下实验流程和数据均引用Zhichao Li等人发表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供参考。）试剂详细配制指南关键：所有操作都应在二级生物安全柜中进行，以保持无菌状态。1200 μg/mL FGF-10 (10,000 X)a. 取100 μg溶于0.5 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 5 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。2250 μg/mL FGF-7 (12,500 X)a. 取 100 μg 溶于 0.4 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 4 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。3100 μg/mL R-spondin 1 (200 X)a. 取 250 μg 溶于 2.5 mL 无菌的 PBS（加 0.1% BSA，质量/体积）。b. 每管 250 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 1 个月。4100 μg/mL Noggin (1,000 X)a. 取 100 μg 溶于 1 mL 无菌的 PBS（加 0.1%  BSA，质量/体积）。b. 每管 50 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 2 个月。5100 mM Y-27632 dihydrochloride (10,000 X)a. 取 50 mg 溶于 1.56 mL 的超纯水中。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 5 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 6 个月。6500 mM N-Acetylcysteine (400 X)a. 取 408 mg 溶于超纯水，至终体积为 5 mL。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 125 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。72 M Nicotinamide (200 X)a. 取 6.1 g 溶于 1x PBS，至终体积为 25 mL。b. 用 0.22 μm 的过滤器过滤溶液。c. 每管 250 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。830 mM SB202190 单盐酸盐水合物 (3,000 X)a. 取 5 mg 溶于 0.453 mL 的二甲基亚砜（DMSO）中b. 每管 16.67 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的黑色离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。关键：不要用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤含有 DMSO 的溶液，因为 DMSO 可以溶解这种膜。关键：使用黑色离心管，防止该溶液受到光照。建议：过滤 DMSO 溶液，可以使用 DMSO 安全过滤器或尼龙膜过滤器。925 mM A83-01 (50,000 X)a. 取 5 mg 溶于 0.474 mL 的二甲基亚砜（DMSO）中b. 每管 2 μL，将溶液分装到 1.5 mL 的离心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 个月。10分装基质胶a. 取一瓶新的基质胶，放于 4 ℃ 冰箱中解冻 8 小时。b. 将瓶子倒置几次，使其充分混合。c. 取 1.5 mL 的离心管置于冰上冷却。d. 将基质胶和 1.5 mL 的离心管置于冰上，按实验所需体积将基质胶分装到 1.5 mL 的离心管中，并在 -20 ℃ 保存。关键：移液器枪头应在抽吸基质胶之前，为了防止基质胶黏在枪头上，应通过多次抽吸和排出冷的无菌 PBS（含 01.% BSA）进行预湿和预冷。注意：基质胶是一种重组基膜制剂，富含胞外蛋白，应避免反复冻融。6. 卵巢癌类器官目前，培养卵巢癌类器官的方法有多种，但成功率较高的是使用基质胶和改良 DMEM/F12 基础培养基的组合，并辅以 EGF、FGF2、FGF10、Noggin、Rspondin1、p38 抑制剂等，可使类器官培养成功率达到 80%～90%。Senkowski 等人为了获得高级别浆液性卵巢癌（HGSC）类器官的长期培养方案，对培养基添加组分进行优化，获得两种成功率更高的配方。并且体外培养的 HGSC 类器官保留了原始肿瘤的基因组和表型特征，其药物反应与临床结果具有相关性。培养基优化主要涉及添加物种类和浓度，尤其是细胞因子类。研究人员在改良型 DMEM/F12 培养基中加入 Glutamax、Primocin、N-acetyl-cysteine 和 B27 添加剂构成基础培养基。通过分析添加剂对 HGSC 原代细胞短期类器官形成和生长的影响，使用添加 FGF-10、SB202190 和 A83-10 的基础培养基（M 0.1）进行优化。但 M 0.1 培养基能促进生长，但在传代后并不能维持生长。进一步确定 HGSC 类器官培养基配方中加入了 5 mM 烟酰胺，形成培养基 M1。在培养基 M1 中添加 EGF、Heregulin-β-1、Hydrocortisone 和 Forskolin，形成培养基 M2。对于不同的样品，M2 可能具有促进或抑制类器官生长的「矛盾」结果，因此为了最大限度地提高类器官形成，每个 HGSC 样品应在两种不同的培养基 M1 和 M2 中平行培养。类器官形成和长期培养测试的主要因子及其影响概述7. 其他肿瘤类器官膀胱癌类器官利用 CTOS 培养基进行培养，主要成分为改良型 DMEM/F12、B27、A83-01，需补充添加 FGF10、FGF7、HER3。培养前列腺类器官时，一般会加入 FGF10、FGF2、p38 抑制剂 SB202190、Rho 激酶抑制剂等，而小鼠前列腺癌类器官无需添加 FGF10、FGF2、PGE2、烟酰胺和 SB202190。文章来源：生物学霸END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

引言在医学和生物科学的前沿，类器官（Organoids）的概念逐渐成为了一个突破性的研究领域。简而言之，类器官是一种实验室培养的、能够模拟真实器官微观结构和功能的三维细胞结构。它们由来源于特定器官的干细胞或前体细胞在特定的培养条件下发育而成，这些细胞能够自组织形成类似于真实器官的微结构。类器官的研究和应用具有重要意义，它们不仅为研究人员提供了一个独特的视角，以观察和理解人体器官的发育和疾病机制，还能够在药物开发和毒性测试中扮演关键角色。通过使用类器官，研究人员可以在没有动物实验或临床试验的情况下，预测药物在人体中的效果和安全性。（3月4日Nature “Organoids grown from amniotic fluid could shed light on rare diseases”）从羊水中培养类器官的创新随着生物技术的不断进步，从羊水中培养类器官的方法为研究人员提供了一个全新的视角，以探索人体器官的发育和疾病机制。这种创新技术不仅展示了科学研究的前沿，也为未来的医疗治疗带来了希望。羊水采样的优势与挑战无创性采样： 与其他获取细胞的方法相比，羊水采样为无创性或低创性操作，减少了患者的不适和并发症的风险。细胞多样性：羊水中含有丰富的胎儿细胞，包括多种类型的干细胞和前体细胞，为研究不同类型的类器官提供了基础。高质量的细胞：羊水中的细胞处于活跃的分裂和分化状态，有助于提高类器官培养的成功率和质量。细胞培养的复杂性： 尽管羊水提供了丰富的细胞资源，但要将这些细胞培养成具有复杂结构和功能的类器官，技术难度较高。伦理和法律问题：从羊水中获取细胞涉及到伦理和法律的考量，尤其是在涉及到胎儿健康和隐私的问题上。与传统生物样本相比的优势从羊水中培养类器官的技术，与传统的从成人组织或干细胞库中获取生物样本的方法相比，具有一系列显著的优势：较低的排斥反应：由于羊水细胞来源于胎儿，与成人细胞相比，免疫原性较低，这意味着在未来应用于临床治疗时可能会减少排斥反应。更接近人体生理状态：羊水中的细胞直接来自于发育中的胎儿，因此培养出的类器官在结构和功能上更接近自然状态下的人体器官。研究发育性疾病的潜力：使用羊水细胞培养的类器官，特别适合用于研究先天性和发育性疾病，如先天性心脏病和遗传性疾病。类器官的培养羊水样本的采集与处理在类器官研究领域，羊水样本的采集与处理是一项关键步骤，它为研究提供了珍贵的细胞资源。羊穿和羊水引流的过程羊穿术（Amniocentesis）是一种常见的产前检查方法，通过在专业医疗人员的指导下，使用细长的针管穿透腹壁和子宫壁，从而取得羊水样本。此过程通常在妊娠中期（大约第15至20周）进行，不仅用于遗传疾病的诊断，也为从羊水中获取细胞提供了途径。羊水引流则是在特定情况下进行的医疗程序，旨在缓解羊水过多症（Polyhydramnios）带来的压力和不适。在此过程中，同样可以获得羊水样本，供科研使用。这两种方法的共同优点在于它们能够在不对胎儿造成显著风险的情况下，获取足够数量的羊水样本，用于后续的科学研究。样本的细胞分离与鉴定获取羊水样本后，下一步是通过一系列实验室技术从中分离出所需的细胞。这一过程包括但不限于：离心分离：利用离心机将羊水样本中的细胞与其他成分（如羊水本身和非细胞成分）分离开来。细胞培养：将分离出的细胞置于特定的培养基中，以促进其生长和繁殖，为后续实验提供充足的细胞数量。细胞鉴定：通过免疫细胞化学、流式细胞仪分析等技术，鉴定分离出的细胞类型，确保它们适合用于类器官的培养。细胞的成功分离和鉴定是从羊水中培养类器官研究的基础。这不仅要求精确的实验操作，还需要深厚的生物学和医学背景知识，以确保所得细胞的质量和可用性。细胞培养基与环境在类器官培养的过程中，选择合适的细胞培养基至关重要。培养基不仅需要提供细胞生长所需的营养物质，如氨基酸、糖类、维生素和无机盐等，还要根据不同类型的细胞提供特定的生长因子和激素，以促进细胞的分化和组织的形成。除了培养基外，环境条件的控制也是类器官培养成功的关键因素。这包括温度、湿度、氧气和二氧化碳的浓度等。大多数情况下，细胞培养需要在37°C的恒温条件下进行，同时保持相对湿度为95%，以及5%的二氧化碳浓度，以模拟人体内部环境。不同器官类器官的培养方法根据目标器官的不同，类器官的培养方法也各不相同：肺类器官培养：需要在培养基中添加特定的生长因子，如表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF），以促进肺上皮细胞的增殖和分化。肾类器官培养：除了基本的生长因子外，还需要添加用于刺激肾上皮细胞分化的诱导剂，如视黄酸。肠类器官培养：需要在三维培养环境中，通过添加诺盖利因（Noggin）、Wnt和R-spondin等生长因子，模拟肠道微环境，促进肠上皮细胞的形成和分化。在类器官的培养过程中，细胞的三维培养技术尤为关键。这通常需要使用基质胶或其他支架材料，以提供适宜的三维结构，支持细胞的生长和组织的形成。通过模拟真实器官的微环境，研究人员可以观察到细胞如何相互作用、分化和组织成复杂的组织结构。类器官在研究中的应用研究先天性疾病类器官技术在模拟和研究人类发育过程中的先天性疾病方面显示出巨大的潜力。通过利用类器官，研究人员能够深入理解特定疾病的发病机制，并探索新的治疗方法。类器官如何模拟特定的先天性疾病类器官能够复制人体器官的关键结构和功能，使其成为研究先天性疾病的理想工具。通过从受影响的个体中获取细胞，并在实验室中培养成特定的器官结构，研究人员可以观察疾病是如何影响器官发育的。这种方法不仅能够展示疾病在分子和细胞层面的影响，还能提供一个平台，用于测试潜在的药物和治疗方法，而无需直接在人体或动物模型中进行。先天性膈疝的研究先天性膈疝（CDH）是一种在婴儿中发现的先天性缺陷，其中膈肌（分隔胸腔和腹腔的肌肉）未能正确形成，导致腹部器官移位到胸腔，影响肺部发育。通过使用类器官技术，科研团队成功地从患有CDH的患者羊水细胞中培养出肺类器官。这些肺类器官在结构和功能上都展现了CDH的特征性变化，为研究人员提供了一个独特的视角，以观察疾病是如何影响肺部发育的。此外，这也为测试可能的干预措施提供了机会，包括药物治疗和基因疗法，旨在纠正发育异常并恢复正常的器官功能。研究亮点首次从人类羊水和气管液中导出了胎儿上皮器官类器官(organoids)，这为研究胎儿发育和先天性疾病提供了新的非侵入性模型。通过单细胞分析(single-cell analysis)，研究人员成功识别并分离了具有胃肠道(gastrointestinal)、肾脏(renal)和肺部(pulmonary)来源的胎儿上皮干/祖细胞(epithelial stem/progenitor cells)。这些细胞在培养中形成了能够反映其组织来源的克隆性上皮器官类器官(clonal epithelial organoids)，并且通过转录组学、蛋白表达和功能特征证明了其与原始组织的高度相似性。此外，研究还从先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia, CDH)胎儿的羊水和气管液细胞中派生出肺器官类器官(lung organoids)，重现了该疾病的一些特征。这些发现为胎儿期疾病模型的发展和个性化治疗的设计提供了宝贵的基础。主要研究策略单细胞分析(Single-cell analysis): 研究首先通过单细胞分析技术对人类羊水(amniotic fluid, AF)中的细胞进行了表征，以识别存在于其中的不同细胞身份(cellular identities)。这一步骤是理解羊水中细胞多样性的基础，并为后续的细胞分离和器官类器官(organoid)生成提供了指导。单细胞分析（Credit: Nature Medicine）细胞分离和培养(Cell isolation and culture): 研究人员从羊水中分离出具有特定组织来源的胎儿上皮干/祖细胞(epithelial stem/progenitor cells)，如胃肠道(gastrointestinal)、肾脏(renal)和肺部(pulmonary)细胞。这些细胞随后在特定的培养条件下进行培养，以促进其增殖和自我组织成为三维的上皮器官类器官(epithelial organoids)。类器官的形成和表征(Organoid formation and characterization): 从分离的细胞中形成的类器官在形态和功能上类似于其原始组织，通过转录组学(transcriptomic)、蛋白表达(protein expression)和功能特征(functional features)等多种手段进行了详细表征。这证实了它们可以作为研究胎儿发育和疾病的有效模型。先天性疾病模型的建立(Disease modeling): 研究中特别关注了利用从患有先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia, CDH)的胎儿羊水和气管液(tracheal fluid, TF)细胞派生的肺器官类器官(lung organoids)来模拟疾病。这些肺器官类器官展示了CDH特有的一些病理特征，表明它们可以用于研究此类先天性疾病的发病机制和潜在治疗策略。通过使用来自先天性膈疝（CDH）患者的羊水（AF）和气管液（TF）生成、分化和表征肺泡原基体（LAFOs）和气管液原基体（LTFOs）的过程（Credit: Nature Medicine）药物测试与疗法开发随着类器官技术的不断进步，其在药物测试和疗法开发中的应用日益显现出重要的科研和临床价值。类器官在药物筛选中的潜力类器官技术能够复制人体器官的关键功能和微环境，为药物测试提供了一个独特而有效的平台。相比于传统的二维细胞培养模型，类器官能更准确地模拟药物在人体中的实际效果和副作用，从而提高药物开发的成功率和安全性。高度模拟人体环境：类器官能够重现特定器官的复杂结构和生理功能，使药物筛选更加接近人体内的实际情况。减少动物实验： 利用类器官进行药物测试可以减少对动物实验的依赖，符合伦理原则，同时也能提供更接近人类生理反应的结果。加速药物筛选过程：类器官可以在较短的时间内对多种药物候选分子进行有效评估，加快药物从实验室到临床应用的转化速度。个性化治疗的可能性类器官技术在推动个性化医疗方面展现出巨大的潜力。通过利用患者自身的细胞培养出特定的类器官，医生可以在不对患者造成任何风险的情况下，测试不同药物和治疗方法对患者的实际效果，从而为患者量身定制最适合的治疗方案。针对性药物测试：基于患者特定的遗传背景和疾病特征，类器官可以用于评估药物对个体的具体效果，优化治疗方案。疾病模型的个性化：对于罕见疾病或复杂的遗传性疾病，通过患者特定的类器官模型研究，可以深入理解疾病机制，开发针对性治疗。提高治疗效果与安全性：个性化的药物测试减少了治疗过程中的不确定性和风险，提高了治疗效果的同时，降低了不良反应的发生率。面临的挑战与未来发展技术与伦理挑战类器官技术作为一种革命性的生物医学研究工具，虽然在疾病模型构建、药物开发和再生医学等领域具有巨大潜力，但其发展过程中也面临着一系列技术和伦理挑战。类器官研究的限制类器官技术在模拟复杂的人体器官系统时仍存在一定的局限性：复杂度限制：虽然类器官能够模拟特定器官的关键功能，但复制完整器官的所有细微结构和复杂交互作用仍然是一大挑战。可重复性问题：类器官培养过程的高度复杂性可能导致实验结果的可重复性受到影响，这对科学研究的标准化和推广构成挑战。规模化生产难题：目前，将类器官技术应用于大规模生产仍面临技术难题，这限制了其在药物筛选和临床应用中的广泛应用。伦理考量与社会接受度类器官研究不仅要应对技术上的挑战，还必须解决伦理和社会接受度方面的问题：伦理问题：类器官的研究涉及人类细胞和组织的使用，这引发了一系列伦理问题，如捐献者的同意权、细胞来源的透明度以及研究目的的合理性等。人性化担忧：随着类器官技术的进步，一些具有高度复杂结构和功能的类器官可能引发“人性化”（即类器官可能展现出某些人类特有的生理或认知特征）的伦理担忧。社会接受度：公众对于使用类器官进行医学研究和治疗的接受程度不一，这需要研究人员、伦理学家和政策制定者共同努力，通过教育和对话提高社会公众的理解和支持。未来的方向与潜力类器官技术的快速发展正在不断推动医学研究和临床应用的新前沿。展望未来，这一领域的技术进步和临床应用前景令人期待。技术进步的可能性随着生物工程、材料科学和计算生物学等相关领域的持续进步，类器官技术也将迎来新的发展机遇：高度复杂化和精细化：未来的类器官将能够更加精确地模拟人体器官的复杂结构和功能，包括更复杂的细胞类型、细胞间的精确交互以及更加模拟真实微环境的支架材料。自动化和规模化培养：借助于生物反应器和自动化技术，类器官的培养过程将实现高度自动化和规模化，从而满足大规模药物筛选和临床应用的需求。整合与多功能：将不同类型的类器官通过微流控技术整合在一起，模拟整个人体系统的交互作用，为系统生物学研究和复杂疾病的模拟提供新工具。在临床应用中的潜在影响类器官技术在临床应用方面展现出巨大的潜力，未来可能在以下方面产生重要影响：精准药物测试：利用患者特定的类器官进行药物测试，可以为每位患者提供最适合的治疗方案，推动个性化医疗的发展。疾病模型和机制研究：通过类器官模拟特定疾病状态，深入理解疾病的发生发展机制，为发现新的药物靶点和治疗方法提供可能。组织工程和再生医学：未来类器官技术可能用于直接修复或替换受损的人体器官，为治疗重大器官损伤和器官衰竭提供新方案。Q&A类器官与真实器官有何不同？类器官是在实验室条件下培养的，能够模拟真实人体器官关键功能的微型三维细胞结构。它们通常由干细胞或特定类型的细胞在特殊的培养基中培养而成，能够再现真实器官的部分结构和功能。与真实器官相比，类器官体积较小，复杂度较低，但足以用于疾病模型的构建、药物筛选和生物学研究。从羊水中培养类器官的过程是怎样的？从羊水中培养类器官的过程涉及几个关键步骤：-羊水采集：通过羊穿术等方式安全获取羊水样本。-细胞分离与培养：从羊水样本中分离出细胞，通常是上皮细胞或干细胞，并在适宜的培养基中进行培养。-诱导分化：通过添加特定的生长因子和信号分子，诱导细胞分化成目标器官的特定细胞类型。-三维结构形成：利用支架材料或自组织方法，使细胞在三维空间中排列和生长，形成类似于目标器官的微结构。-功能成熟：继续培养，直至类器官展现出类似于真实器官的功能特征。通过这一过程，研究人员可以从羊水样本中培养出具有特定功能的类器官，为疾病研究和新疗法的开发提供重要工具。类器官研究如何帮助了解先天性疾病？类器官研究通过提供一个能够在控制条件下模拟人体器官发育和疾病进程的平台，对于深入理解先天性疾病具有重要意义。这些微型器官能够再现疾病在分子、细胞和组织层面的影响，使研究人员能够观察疾病如何干扰正常的器官发育，从而揭示疾病的根本原因。此外，类器官还可以用于测试治疗先天性疾病的新药物和干预措施，加速安全有效治疗方法的开发。类器官研究面临哪些主要挑战？类器官研究面临的挑战包括技术复杂性、高成本、伦理和法律问题。技术上，精确模拟人体复杂器官系统的结构和功能仍然具有一定难度，特别是对于那些结构复杂、功能多样的器官。此外，类器官研究的高成本限制了其在科研和临床中的广泛应用。伦理和法律问题，尤其是关于使用人类细胞和组织的规范，也需要得到妥善解决。类器官研究的未来发展方向是什么？类器官研究的未来发展方向预计将集中在提高类器官模型的复杂度和功能性、降低研究成本以及解决伦理和法律挑战上。技术进步将使得类器官能够更加精确地模拟真实的人体器官，包括器官之间的相互作用。此外，未来的研究可能会更加侧重于将类器官技术应用于个性化医疗，通过使用患者自身的细胞来测试治疗方案，为患者提供更为精确和有效的治疗选择。随着技术的不断进步和伦理法律问题的逐步解决，类器官研究有望在生物医学领域发挥更加重要的作用。参考文献Tozer L. Organoids grown from amniotic fluid could shed light on rare diseases. Nature. Published online March 4, 2024. doi:10.1038/d41586-024-00656-xGerli MFM, Calà G, Beesley MA, et al. Single-cell guided prenatal derivation of primary fetal epithelial organoids from human amniotic and tracheal fluids. Nat Med. Published online March 4, 2024. doi:10.1038/s41591-024-02807-z责编|探索君排版|探索君转载请注明来源于【生物探索】End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述