SMAC

▎药明康德内容团队报道 今日（10月22日），中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，百济神州1类新药注射用BGB-B3227获批临床，拟开发治疗晚期或转移性实体瘤。根据百济神州公开资料，BGB-B3227是一款MUC1/CD16A双抗，是该公司在泛肿瘤领域布局的早期产品管线之一。本次为该产品首次在中国获批IND。 截图来源：CDE官网 MUC1是癌症免疫疗法的新兴靶点。MUC1是一种高度糖基化的跨膜蛋白，在正常上皮细胞的润滑和保护中起着至关重要的作用。研究发现，MUC1在多种人类上皮恶性肿瘤中过度表达，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和结肠癌等等，并在多发性骨髓瘤的恶性浆细胞中呈现过表达的现象。但在正常组织中MUC1表达的水平很低。 而CD16A是免疫球蛋白Fcγ受体家族的重要成员。它是连接适应性免疫与固有免疫系统的桥梁之一，特别是在自然杀伤细胞（NK细胞）介导的免疫应答中发挥着核心作用。当前，CD16A在免疫治疗，尤其是在双特异性抗体新药开发中的潜力得到广泛关注。 Clinicaltrials.gov官网信息显示，一项BGB-B3227单独及联合PD-1抑制剂tislelizumab治疗晚期或转移性实体瘤的研究已经于今年8月在美国启动。该研究预计于2027年初完成。 此次注射用BGB-B3227在中国获批临床，也意味着百济神州实体瘤创新早期分子管线又迎来一项新进展。 截图来源：百济神州官网（参考资料[3]） 根据百济神州公开资料，该公司在重点肿瘤类型中布局了分子类型多样且差异化的分子，针对泛肿瘤适应症的早期产品管线涵盖SMAC模拟物、DGKζ抑制剂、HPK1抑制剂、CCR8单抗、IL-15前体药物、MUC1/CD16A双抗等，目前这些产品均已经进入临床阶段。 参考资料： [1] 中国国家药监局药品审评中心官网. Retrieved Oct 22, 2024, from https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/da6efd086c099b7fc949121166f0130c [2]https://www.beigenemedical.com/pipeline-pdfs/May_2024/BeiGene%20Clinical%20Static%20Pipeline_Global_May%202024_MRC%20Approved_SolidTumor.pdf [3]百济神州官网.From https://ir-api.eqs.com/media/document/bd69e696-d86a-4efe-8f50-6509f31cd4e5/assets/2024%E5%B9%B4%E7%AC%AC%E4%BA%8C%E5%AD%A3%E5%BA%A6%E6%8A%95%E8%B5%84%E8%80%85%E6%BC%94%E7%A4%BA%E6%9D%90%E6%96%99.pdf?disposition=inline 本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权及其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。

摘要：溶瘤病毒（OVs）正成为癌症治疗的潜在选择。自然和基因工程病毒表现出多种抗肿瘤机制。OVs通过直接细胞溶解、通过抗原释放增强免疫系统以及激活炎症反应来发挥作用，或者间接通过干扰肿瘤微环境中的不同类型元素、改变肿瘤细胞的能量代谢和抗血管生成作用。OVs的作用是多方面的，它们与宿主和肿瘤细胞有多种相互作用。在溶瘤病毒治疗中的一个重要障碍是病毒进入肿瘤细胞的途径以及它可能与不同的生物和非生物载体结合的可能性。在许多临床试验中，OVs已被证明能够消除对标准治疗有抵抗力的癌细胞（黑色素瘤、肺癌和肝癌）；然而，病毒本身的作用存在几种抗性元素。因此，有必要评估OVs与其他标准治疗方式（如化疗、免疫治疗、靶向治疗和细胞治疗）的结合，以提高反应率。本综述提供了OVs、它们在溶瘤病毒治疗中的使用以及这种疗法与目前用于癌症治疗的标准疗法的未来前景的全面更新。 1.引言 病毒通常被认为是导致人体致命感染的恶魔，但近几十年来，人们开始意识到可以将它们转变为保护天使，用作对抗恶性细胞的武器。使用病毒治疗癌症的想法源于一些病例报告中记录的肿瘤消退与病毒感染之间的关联。 近年来，溶瘤病毒（OVs）因其能够选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，并可能刺激抗肿瘤免疫而受到特别关注。工程化肿瘤选择性靶向OVs具有可控的安全概况和对不同癌症的有效性，具有许多优势。被选为破坏肿瘤细胞的候选病毒必须具备某些特征：它必须是促炎性的，不应引起慢性传染病，对各种人群安全，应在肿瘤细胞中发挥溶解活性，并应具有整合到宿主基因组中的能力。促炎性的溶瘤病毒具有以下特征：存在可被免疫系统识别的抗原性，感染性，复制以触发强烈的免疫反应，以及有助于免疫识别和炎症反应的基因变异。 基因工程在开发具有可控安全概况和对广泛癌症高效性的OVs中发挥着重要作用。在这方面，OVs必须通过修改非编码突变并添加或删除某些功能、基因和非编码元素，专门为相应的肿瘤类型和肿瘤突变量身定制，以赋予它们额外的有益特性。癌症治疗使用OVs的三个研究方向是：病毒复制、肿瘤生长和免疫激活。因此，OVs的主要靶标是肿瘤细胞、宿主免疫和肿瘤微环境。大多数病毒载体通过释放肿瘤相关抗原引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后引发抗肿瘤免疫反应。通过激活抗肿瘤免疫，OVs超越了ICIs和其他精确靶向药物的表现。OVs表现出广泛的抗肿瘤免疫增强特性。必须识别具有适当分子特征的患者，以从OV治疗中受益。因此，发现OV治疗的预测性生物标志物很重要。 2.溶瘤病毒治疗的有吸引力的病毒  病毒治疗是一种基于将OV感染的细胞引入被诊断出恶性肿瘤的宿主的治疗方法，可能是一种创新的未来癌症治疗方法。最近的研究揭示了使用OVs通过诱导系统性抗肿瘤免疫来特异性破坏肿瘤细胞。然而，这个过程并不像看起来那么简单，因为并非所有细胞类型和病毒都可用作此目的。了解不同类型病毒对选定肿瘤的肿瘤趋向性，以及它们可以包含的联合疗法，决定了选择适当和准确的病毒肿瘤治疗选项，以增加治疗的整体有效性。OVs可以是单链或双链RNA或DNA病毒，分为自然病毒株和基因修饰病毒。下面描述了合格的病毒肿瘤治疗候选病毒的主要类型，主要特征（表1）以及益处和问题（表2）： 单纯疱疹病毒（HSV），包括两个血清型（HSV-1和HSV-2），是一种带有核衣壳的包膜病毒，保护着双链DNA。HSV作为溶瘤病毒的优势如下：（i）大基因组和复杂结构，使得插入大片段和多个转基因成为可能，而不影响病毒效率；（ii）能够感染大多数类型的恶性细胞；（iii）插入多个转基因的灵活性；（iv）尽管在大部分人群中存在高频率的抗病毒抗体，但它们并不阻止病毒复制。HSV通过四种病毒糖蛋白，即gB、gD、gH和gL，与各种细胞受体结合。基于基因修饰HSV的Talimogene laherparepvec（T-VEC），编码人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是唯一获得FDA和EMA批准用于治疗IIIB/C–IVM1a黑色素瘤的七个溶瘤HSV之一。T-VEC刺激局部和系统性抗肿瘤免疫反应。T-VEC已在两项II期临床研究中进行了评估——一项是与放射疗法联合治疗局部晚期皮肤血管肉瘤（NCT02923778），另一项是软组织肉瘤。OH2是另一种基因工程2型溶瘤HSV，表达GM-CSF以促进抗肿瘤免疫反应。G207是一种基因工程单纯疱疹病毒，缺失ICP 34.5和ICP 6区域的基因，具有直接溶瘤效应，也可以刺激系统性抗肿瘤免疫反应。G207衍生的三种基因组修饰的工程病毒是G47∆，在肿瘤中高度复制，并具有更多的细胞病理效应。 腺病毒（Ad），具有双链DNA基因组和二十面体衣壳，其C末端负责识别细胞受体。腺病毒溶瘤疗法的优势如下：病毒还破坏了癌症干细胞，触发了各种细胞死亡信号，并释放了许多损伤相关分子模式分子（DAMPs），如高迁移率盒1（HMGB1）、热休克蛋白（HSPs）和核酸。腺病毒诱导局部炎症反应，产生大量病毒颗粒，并释放肿瘤抗原，具有直接和间接溶瘤效应。 大多数溶瘤腺病毒（oAds）与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合感染细胞。Ad是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒，并且由于其高遗传稳定性和可用性，是该领域研究最多的病毒之一。遗传稳定性指的是病毒保持其遗传物质，特别是治疗或所需基因，而不会随着时间的推移发生显著突变或改变的能力。2005年，中国FDA批准了第一种oAd Oncorine与化疗联合用于治疗鼻咽癌。截至2021年，人类腺病毒工作组已识别出104种注册的腺病毒基因型，其中18种目前正在进行病毒肿瘤治疗测试，自2005年至2021年共进行了59项试验。为了使溶瘤治疗有效，病毒需要基因工程改造，非必需基因必须被其他增强治疗效果的基因所取代。 正在研究的三种基因工程腺病毒，也称为条件复制腺病毒（CRAd），如下所示。第一代CRAd由Onyx-015代表，它结合并灭活p53和Ixovex-1，阻止肿瘤生长，并参与不同的临床试验。第二代CRAd包含一个工程化腺病毒Delta-24-RGD（DNX-2401），针对视网膜母细胞瘤（Rb）的肿瘤抑制途径。第三代CRAd由一种与DNX-2401相似的病毒代表，E1A启动子发生变化，以提高肿瘤抑制性能。 Maraba，一种弹状病毒，最近被认为是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒。使用这种病毒的想法源于在溶瘤病毒治疗试验中使用类似病毒——水泡性口炎病毒，这种病毒具有更强的溶瘤活性。体外实验中，Maraba病毒对正常细胞表现出非常广泛的肿瘤趋向性，良好的肿瘤选择性和低毒性。此外，在异种移植模型中进行的体内研究显示了强大的抗肿瘤活性和优越的治疗效力。 麻疹病毒（MeV）是一种RNA副黏液病毒，对包括卵巢癌和乳腺癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤和胶质母细胞瘤在内的广泛癌症类型具有趋向性。MeV溶瘤治疗正在与其他疗法（如化疗）联合测试，用于腹膜或卵巢癌的治疗。MeV与宿主细胞的相互作用是通过三种受体介导的，即Nectin-4、CD46和SLAM/CD150。由于存在预先存在的抗麻疹抗体，系统性给药MeV可能很困难，因此开发了几种策略，如使用细胞载体运输病毒，编码抑制免疫系统的基因，用非反应性糖蛋白替换某些糖蛋白，或与免疫抑制药物联合给药。MeV具有有利的安全性概况和有限的毒性，MeV特异性T细胞反应可能增加溶瘤病毒治疗的有效性。 新城堡病病毒（NDV）是一种在鸟类中自然发现的1型禽类副黏液病毒。它已经被用于溶瘤治疗研究五十年了；因为它不通过重组进行基因交换的过程，所以它是高度安全的。 这一点从人类是非许可宿主这一事实上可以看出。NDV通过其RIG-I受体，可以减缓肿瘤活性，并且具有非常广泛的肿瘤趋向性，包括对乳腺癌、结直肠癌和头颈部癌的趋向性。 呼肠孤病毒在环境中很常见，通过根除病毒感染的肿瘤细胞，其抗癌活性可以得到增强。尽管呼肠孤病毒已被作为治疗黑色素瘤、骨髓瘤和胶质瘤的治疗选择进行研究，但也在进行其他恶性肿瘤的试验（表3），如胰腺癌、肺癌和结直肠癌（与pelareorep和atezolizumab联合进行的GOBLET研究）。 柯萨奇病毒对膀胱癌有肿瘤趋向性，特别是。一些研究人员已经研究了柯萨奇病毒B3对结直肠癌治疗的溶瘤活性，并显示出显著的肿瘤生长抑制作用，但也出现了一些严重的副作用，如心肌炎和胰腺炎。在一项II期临床试验中，对无法切除的黑色素瘤患者进行柯萨奇病毒A21（V937）瘤内注射，6个月无进展生存率为38.6%（95% CI，26.0至52.4）（表3）。 小病毒是临床上研究用于癌症病毒治疗的最小病毒。已经研究了三种重要的方法来提高这种病毒的溶瘤活性，即与其他各种抗癌剂结合，制备具有升级的溶瘤和免疫调节功能的新型小病毒，以及使用细胞复合物作为生物标志物来监测对小病毒治疗的反应（表3）。 3.溶瘤病毒治疗的抗癌机制  3.1.选择OV  理想的OV必须满足以下要求：（i）高度靶向肿瘤细胞；（ii）快速复制和扩展；（iii）低免疫原性，减弱抗病毒反应；（iv）强烈激活免疫反应。 病毒复制和扩展涉及一系列过程，病毒在宿主生物体内复制自身并增加数量。不同类型病毒的具体机制可能有所不同，但这里是一般概述： 1. 附着和进入，病毒首次使用表面蛋白附着在特定宿主细胞上，然后通过与细胞膜直接融合或通过内吞作用进入宿主细胞。2. 释放病毒基因组。一旦进入宿主细胞，病毒将其遗传物质（DNA或RNA）释放到细胞中。3. 复制和转录。病毒基因组控制宿主细胞的机制以复制和转录其遗传物质。DNA病毒通常在宿主细胞核中复制，而RNA病毒在细胞质中复制。4. 翻译和蛋白质合成：宿主细胞的核糖体被劫持以使用病毒RNA或DNA中的指令合成病毒蛋白。5. 组装。新合成的病毒组分（蛋白质和遗传物质）被组装形成完整的病毒颗粒。6. 成熟，组装好的病毒颗粒经历成熟并获得感染其他细胞的能力。7. 释放。成熟的病毒从宿主细胞中释放出来，要么通过细胞溶解（细胞破裂），要么通过从细胞膜出芽。8. 传播和扩展。释放的病毒可以感染邻近的细胞，重复复制周期，并导致宿主内病毒种群的扩展。 低免疫原性，减弱抗病毒反应，指的是免疫系统对病毒表现出减少或弱反应的情况，特别是当病毒已经被减弱或削弱用于各种目的时，如疫苗开发。减弱的抗病毒反应涉及使用弱化的病毒形式作为疫苗。病毒被修改以减少其毒力，使其更不有害，同时仍然保留刺激免疫反应的能力。这种方法旨在诱导提供针对自然更强病毒形式的保护的免疫反应。T-VEC就是一个减弱的溶瘤病毒的例子。 在确定破坏恶性细胞的OV时，首先要考虑的是病毒骨架。DNA病毒具有多重优势，因为它们具有更稳定的基因组，并且比RNA病毒更容易进行基因工程。DNA病毒的免疫原性低于RNA病毒，并且具有更多的修复机制，减少了复制过程中错误的可能性。一些DNA病毒，如逆转录病毒，具有将其遗传物质整合到宿主基因组中的能力。RNA病毒体积较小，可以穿过血脑屏障，并且比DNA病毒具有更恒定的复制能力；然而，它们的遗传不稳定性和突变率高于DNA病毒。最常用的平台是那些带有DNA病毒的平台，如HSV-1和Ad。基因工程是增强OVs某些特性的替代方法。据报道，临床试验中有三分之二的病毒已经被基因工程改造。1991年首次尝试使用HSVs对OVs进行基因工程改造。今天，第四代基因工程溶瘤病毒可用于肿瘤免疫治疗。基因工程OVs的研究重点是提高它们的效力和安全性，主要是促进选择性复制，减少免疫原性，促进肿瘤破坏，并减弱病毒致病性。迄今为止，已有20多个病毒家族经过基因工程改造；这些包括MeVs、NDVs、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒（VVs）、HSVs、Ad、痘病毒、粘液病毒和水泡性口炎病毒（VSVs）。这些转变的目的是针对病毒复制、免疫刺激的启动和肿瘤相关抗原的释放。一些临床前研究表明，工程化的OVs通过诱导所需的免疫反应发挥免疫调节作用。一个例子是通过添加GM-CSF或ICAM-1转基因来刺激宿主免疫反应。一个代表性的例子是VSV，其包膜中的糖蛋白已经被修改以减少病毒的神经毒性。已经为OVs的基因工程开发了各种策略。必须了解病毒的生物学和遗传学，以了解病毒与宿主之间的关系，并理解细胞如何防御病毒感染。基因工程使用具有不同机制的转基因来破坏肿瘤细胞。采用不同的策略替换病毒中的不同蛋白质以增加肿瘤靶向。许多病毒受体在癌细胞中高度表达，允许病毒在癌细胞中的摄取量高于正常细胞。一些受体，如层粘连蛋白、CAR、CD 46和CD155，在不同的癌细胞中表达过多，导致Ad、Sindbis病毒和Poliviruses的摄取量增加。一些病毒蛋白对肿瘤细胞有毒，并可以在病毒暴露时直接杀死细胞，而在病毒复制之前，如Ad编码的E3死亡蛋白和E4或f4蛋白。在一项研究中，VSV的糖蛋白G被一种脑膜炎病毒的变异蛋白替换，以增加VSV对恶性细胞的选择性。另一种策略是增加宿主对肿瘤的反应。T-VEC疫苗包含一个被基因改造以表达GM-CSF的Ad，增加了抗原呈递细胞（APCs）进入肿瘤免疫抑制微环境的招募，导致招募各种细胞因子，放大抗肿瘤活性。药物递送的效力与将药物递送到肿瘤床而不损害正常细胞有关，并将药物保持未降解直到它到达肿瘤。在一项研究中，用人血清白蛋白包裹的溶瘤Ad延长了病毒的存活率。在另一项研究中，人血清白蛋白涂层的腺病毒保护它免受中和抗体的侵害。 3.2.OVs的抗肿瘤机制 已经描述了OVs对肿瘤细胞作用的各种机制（图1）。 图1. 溶瘤病毒的作用机制。肿瘤细胞内病毒的复制引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后释放肿瘤抗原激活免疫系统，重塑肿瘤微环境（TME），激活抗血管生成机制，增加肿瘤突变细胞中病毒复制，并传播病毒感染到其他肿瘤细胞。 OVs，无论是自然产生的还是由于基因工程修改，都表现出肿瘤选择性，通过靶向恶性细胞表面的受体，在癌细胞中优先复制，并引起癌细胞内途径和基因表达的细胞内异常，但不影响健康细胞。OVs可以感染健康细胞，但它们展现出抑制病毒传播的机制，这些机制在癌细胞中通常缺失。因此，在VSV感染中，正常细胞可以产生I型干扰素来阻止病毒复制，但大多数癌细胞I型干扰素信号传导有缺陷。研究表明，Semliki病毒感染在肿瘤细胞中诱导分泌WNT配体（WNT2B和WNT9B）和β-catenin（CTNNB1）的稳定，并以反馈机制减少IFNB1的表达，有利于减弱宿主的抗病毒反应。一些研究报告称，两个小鼠细胞系（NR6和B82），不表达表皮生长因子受体（EGFR），对呼肠孤病毒感染相对有抵抗力，但转染了编码EGFR基因的相同细胞系表现出显著更高的敏感性。这种感染效率的提高需要功能性EGFR，因为在表达突变EGFR的细胞中没有观察到，就像在肿瘤细胞中一样。诸如HPV、HCV和KSHV等致瘤病毒感染，已经发展出在感染期间减弱肿瘤抑制基因（如p53和RB）的机制，以促进病毒增殖，强调了这些守门人基因在控制病毒感染中的重要性。 OVs采用的主要抗肿瘤机制如下：(i) 直接肿瘤裂解；(ii) 通过激活抗肿瘤活性重塑TME；(iii) OVs的基因靶向；(iv) 破坏和重塑肿瘤部位的血管系统；(v) 肿瘤细胞的代谢重编程；以及(vi) OVs诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）。3.2.1.直接肿瘤裂解 OVs采用的经典抗肿瘤机制是在癌细胞内复制，随后直接裂解这些细胞；这种机制被称为直接病毒诱导的溶瘤作用（图2）。因此，转基因表达并触发宿主免疫反应，从而激活抗肿瘤免疫。 图2. 溶瘤病毒（OVs）通过内吞作用或靶向一个或多个受体进入肿瘤细胞。OVs直接溶瘤作用的机制如下：(A) 大量OV复制，随后破坏溶酶体、自噬和细胞溶解；(B) OV改变通透性和线粒体代谢，随后发生细胞溶解；(C) OV决定肿瘤细胞应激反应，触发JNK途径和caspase级联反应，随后发生细胞溶解；(D) OV表面的蛋白质与TRAILR1和TRAILR2受体结合，激活TRAIL介导的凋亡（BioRender.com）。 有报道称，经过工程改造的新城堡病病毒导致肿瘤细胞线粒体膜通透性丧失，随后发生ICD。M1病毒诱导内质网应激介导的凋亡，随后肿瘤细胞溶解。携带TRAIL基因的工程病毒A4，可在病毒表面诱导TRAIL蛋白的表达，能够与肿瘤细胞上的TRAILR1或TRAILR2受体结合，并促进凋亡。这一机制通过直接肿瘤裂解在局部诱导肿瘤细胞死亡，但它也通过激活免疫系统（图2D）触发系统性反应，并激活参与肿瘤血管化的内皮细胞，减少肿瘤血管生成。3.2.2.通过激活抗肿瘤活性重塑TME OVs的抗肿瘤活性的一个复杂机制是TME重塑，激活抗肿瘤活性，局部OV诱导的炎症，以及对感染和未感染肿瘤细胞的间接介导凋亡。 肿瘤细胞的溶解释放肿瘤抗原，并在宿主中引发系统性抗肿瘤免疫反应。TME是一个由免疫细胞、血管和功能障碍的代谢途径组成的活跃的支持网络，这些途径刺激肿瘤细胞的增殖。一些环境由于肿瘤抗原水平降低和肿瘤抑制免疫细胞的浸润而被认为是免疫学上的“冷”。OVs是强大的免疫疗法剂，能够影响免疫抑制环境，创造一个有利于宿主免疫系统作用的免疫学上的“热”环境。OVs介导TME的重塑，创造一个有利于抗肿瘤免疫细胞的涌入和激活的环境，有利于肿瘤的消除（图3）。 图3. 冷TME包含基质和免疫抑制细胞。OVs引起细胞死亡。将抑制性免疫和代谢环境重塑为热TME。CAF，癌相关成纤维细胞；DC，树突细胞；IFN，干扰素；IL，白介素；MDSC，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞；OV，溶瘤病毒；TME，肿瘤微环境；Treg，调节性T细胞（Biorender.com）。 OVs经历复制和扩增，这是肿瘤破坏的主要因素，导致新的肿瘤细胞被感染。这些复制和扩增过程是OVs特有的，并不在其他非生物癌症治疗中发现。 DC/T细胞激活 OVs通过包括先天免疫和适应性免疫以及诱导ICD在内的各种机制触发抗肿瘤免疫活性。 释放DAMPs。溶瘤病毒(OVs)导致内质网(ER)应激，随后是凋亡，病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的释放，肿瘤相关抗原，损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，以及先天免疫的激活。PAMPs与病毒元素一起结合到Toll样受体(TLRs)上，诱导树突状细胞(DCs)的成熟和细胞因子的释放。OVs激活的ICD可以随后释放其他DAMPs，如钙网蛋白(CRT)，ATP，热休克蛋白(HSPs)，尿酸，高迁移率族蛋白盒1(HMGB1)，以及细胞因子(IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子-α和白介素1,6,8和12)。DCs的激活。DAMPs也可以在DCs的TLR4配体(HMGB1和CRT)的支持下启动DCs的成熟。DCs在肿瘤中很少见，但代表与适应性和先天免疫系统相关的强大的专业抗原呈递细胞(APCs)。通过溶瘤效应调节肿瘤微环境中的DC群体提供了新的肿瘤抗原，并支持DCs的渗透和成熟。抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞后，激活效应T细胞反应，这些细胞记忆信息，在淋巴结中增殖，并迁移到肿瘤。遗传工程被用来通过删除或添加有效载荷(单克隆抗体，细胞因子和趋化因子)来修改溶瘤病毒，以增加肿瘤微环境中的免疫反应并限制不良反应。其中一个例子是添加GM-CSF，这是一种触发DCs转化为强大的APCs的细胞因子。临床前数据证明了GM-CSF武装HSVs的远隔效应。IL12也参与了DCs，T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞在肿瘤微环境中的成熟，抑制调节性T细胞(Tregs)和MDSC活性，并诱导M1型巨噬细胞的极化。关于IL12的一个主要问题是其与致命炎症综合征的关联，这是由于IL12在全身的积累。为了避免这些毒性，工程化了一种表达IL12突变形式的oAd，以安全给药。 巨噬细胞的参与 TME中M2型巨噬细胞的存在是大多数癌症低总生存率的强大预后因素。在TME水平上，OVs作用于M2型巨噬细胞，这些细胞被重极化为M1表型，并表达各种促炎细胞因子和趋化因子(IFN-γ，CXCL10，各种白介素)，等等，这些因子加强了抗肿瘤免疫环境；这种效应已在一些OVs的研究中显示，包括VSVs，HSVs，呼肠孤病毒(RV)，副黏病毒(MeV和MuV)，GLV-1h68和Ad5 D24-RGD。 NK细胞的参与 NK细胞是溶瘤病毒疗法的重要介导者。此外，NK细胞参与对抗病毒感染，因此，它们可能对OVs的效力产生不利影响。OVs对NK细胞的影响包括促进NK细胞从循环中招募到肿瘤，增强NK细胞激活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。OVs有能力裂解肿瘤细胞并触发免疫原性细胞死亡，随后释放DAMPs，被DCs检测到，促进炎症。此外，OVs感染DCs，作为对感染，肿瘤和髓样细胞的反应，产生趋化因子，招募NK细胞进入肿瘤。此外，DCs和其他髓样细胞产生各种细胞因子，增强NK细胞存活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。当NK细胞被激活时，它们产生大量的IFN-γ并杀死肿瘤细胞。NK细胞配体在癌细胞表面的配体也由OVs调节。此外，OVs感染的细胞释放病毒蛋白，被NK细胞识别，增加激活受体的表达，并增强杀死肿瘤细胞。一些OVs介导增加细胞因子和趋化因子的产生，随后表达NK细胞抑制配体，如肿瘤细胞中的MHC-I。 已经证明，IL2武装的仙台病毒在血管肉瘤小鼠模型中增加了NK细胞的招募。在另一项研究中，表达IL-2的细小病毒(H-1PV)在胰腺导管腺癌模型中增加了NK细胞的激活。工程化的天花病毒(VV)，VV∆TK∆N1L，武装有IL12，并删除了胸苷激酶和N1L基因，作为新辅助治疗在各种小鼠和仓鼠手术癌症模型中使用时延长了存活时间。 中性粒细胞的参与 已经证明了基于VV和VSV的病毒促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效应。在临床前实验中，发现TGF-β极化的N2中性粒细胞具有促肿瘤效应，而1型IFN极化的N1中性粒细胞具有促免疫和抗肿瘤结果。N1促进CD8+ T细胞的招募和激活以及细胞因子的产生，如VGF，TNF-α，GM-CSF和IL12。一种名为PVSIPO的重组脊髓灰质炎病毒疫苗株，包括一个异源内部核糖体进入位点，被证明可以促进前列腺和乳腺癌中中性粒细胞的积累，并与改善存活相关。 Tregs的参与 Tregs也通过高表达转录因子Foxp3诱导强烈的免疫抑制活性。已经证明，感染AdCMV∆24可以降低TME中的Treg水平。最近的研究报告说，溶瘤VV可以直接感染并减少小鼠癌症模型中的Treg数量，随后产生抗肿瘤效应。 基质修饰 一些OVs针对肿瘤基质并重塑细胞外基质(ECM)以改善其抗肿瘤效应。一种表达松弛素的oAd与各种调节剂结合形成平台oAd/IL-12/GM-RLX，导致ECM降解，增强治疗性单克隆抗体的渗透，并在胰腺癌模型中促进抗肿瘤效应。此外，一种表达PH20透明质酸酶的oAd导致ECM中透明质酸的降解，从而改善了其传播。癌症相关成纤维细胞(CAFs)在许多癌症中上调，并通过成纤维细胞激活蛋白(FAP)激活基质中的成纤维细胞。肿瘤相关周细胞是胶质母细胞瘤模型中的主要基质细胞亚群。一种oAd，ICOVIR15，减少了FAP+周细胞，胶质母细胞瘤细胞和GMP相关基质FAP+小鼠细胞的数量。另一种溶瘤VV，Western reserve double-deletion (WRDD)，已被证明针对CAFs并在黑色素瘤中具有抗肿瘤效应。 3.2.3.OVs的基因靶向 基因靶向是OVs的主要抗肿瘤机制。例如，呼肠孤病毒利用通常在癌细胞中改变的特定细胞特征。在肿瘤细胞中，癌基因被激活，肿瘤抑制基因被灭活，导致特定蛋白的信号传导调节，如TP53，PTEN，RB1和RAS，并激活肿瘤形成，血管生成，抑制凋亡，侵袭和转移。这些信号级联被OVs靶向，调节肿瘤细胞中的各种信号通路。已经研究了呼肠孤病毒对肿瘤细胞培养的作用，并确定了病毒在肿瘤细胞内的有选择性复制步骤—Ras突变可以促进呼肠孤病毒进入和肿瘤转化，增强OVs的产生，诱导凋亡，并在呼肠孤病毒感染后防止干扰素产生，允许病毒由于有缺陷的抗病毒反应而扩散。呼肠孤病毒通过与特定细胞表面受体相互作用进入细胞。癌细胞上这些受体的表达或可及性的变化可能增强病毒进入和感染它们的能力。溶瘤VVs和VSVs只能感染肿瘤细胞并促进由于ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的高表达而破坏内皮细胞。有些病毒，如呼肠孤病毒，对肿瘤细胞有天然的偏好，而其他病毒，如Ads，VSVs和HSVs，必须适应这种对肿瘤细胞的选择性。 被OVs感染的健康细胞通过不同的机制抑制病毒的传播，这些机制在肿瘤细胞中通常不足。细胞的I型IFN相关抗病毒潜能与其对VSV对癌细胞的选择性相关。正常细胞产生I型IFN以防止病毒复制；然而，大多数肿瘤细胞的I型IFN产生有缺陷，因此，它们被提议用于VSV感染。3.2.4.破坏和重塑肿瘤部位的血管系统 影响肿瘤血管生成的因素由癌基因介导的蛋白的表达和诱导细胞条件的因素组成，如低pH值、缺氧、营养缺乏或诱导活性氧(ROS)。OVs的抗血管生成方式如下：(i) 直接感染肿瘤细胞，随后裂解新形成的血管的血管内皮细胞；(ii) OVs触发的免疫反应，导致细胞聚集和血流减慢；(iii) 表达病毒蛋白，阻断肿瘤诱导的促进血管生成的因子的合成（图4）。 图4. 溶瘤病毒(OVs)诱导的抗血管生成机制。(A) OVs促使中性粒细胞的招募，发展为微血栓和缺血，随后发生凋亡。(B) 工程化病毒可以诱导内皮细胞的直接裂解。(C) OVs可以调节转录因子，减少IL8的产生，从而刺激凋亡。(D) OVs与血管生成蛋白相互作用，下调VEGF的表达。(BioRender.com)。 许多OVs具有直接的抗血管特性。一种含有人类端粒酶逆转录酶元素的腺病毒，OBP-301，被设计用来调节E1基因的表达，产生具有抗血管生成效应的IFN-gamma，选择性地破坏小鼠结肠肿瘤中的癌细胞。在血管内，VSVs刺激血栓形成和炎症。 最重要的因素包括CRT、ATP、HMGB1、热休克蛋白（HSPs）和annexins[135]。增强树突细胞吞噬抗原的DAMPs之一是CRT。ATP从凋亡细胞释放并结合到巨噬细胞和单核细胞上的P2Y2受体，加速凋亡细胞的清除。HMGB1激活未成熟树突细胞中的TLR4，导致树突细胞成熟并加速树突细胞对肿瘤抗原的摄取。热休克蛋白（HSPs）能够结合到树突细胞受体上，刺激抗原肽；它们也刺激内在的促炎级联反应。Annexin A1（ANXA1）在解决炎症过程中和协助树突细胞活动方面发挥着重要作用。参与ICD发展的其他因素包括细胞因子、趋化因子、核酸和转录因子。一些溶瘤病毒（OVs）对肿瘤组织有天然的趋向性，而另一些则经过基因改造在肿瘤细胞中复制以检测特定目标并传递某些基因（图5）。 图5. 由天然溶瘤病毒（OVs）诱导的免疫原性细胞死亡途径。一些天然OVs，包括新城疫病毒（NDVs）、柯萨奇病毒（CVs）、麻疹病毒（MVs）、单纯疱疹病毒（HSVs）、牛痘病毒（VVs）、腺病毒（Ads）、森林塞姆利基病毒（SFVs）和绵羊痘病毒（ORFVs）可以诱导特定模式的免疫原性细胞死亡。NDV、HSV和Ad可以诱导多模式细胞死亡，调节濒死恶性细胞中损伤相关分子模式的暴露，随后招募先天免疫应答者并触发强烈的免疫反应。VV诱导坏死性凋亡，而CV、MV、SFV和ORFV诱导免疫原性凋亡（BioRender.com）。 免疫原性凋亡是OV诱导的细胞死亡的最常见类型。受体，如TRAIL-R、TNF-R和Fas，形成死亡诱导信号复合体（DISC），被病毒感染调节，并调节激活caspase-8，诱导凋亡。这些受体过度表达并触发caspase级联反应，启动外源性凋亡。腺病毒在肿瘤细胞中诱导凋亡，这是其自然特征。表达三聚体肿瘤坏死因子的H5CmTERT-Ad株（H5CmTERT-Ad/TRAIL）在对照组中比天然腺病毒具有更强的肿瘤杀伤效果。HSV也参与凋亡。一种工程化的oHSV-2配备了凋亡激活因子Her2-COL-sFasL，以增强感染细胞中caspase的激活并放大凋亡。坏死代表细胞通过自溶的过早死亡，包括细胞膜完整性的丧失、细胞器的肿胀和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡过程，可以诱导或增强抗肿瘤免疫。它经常与由于DNA、ATP、尿酸、核蛋白和HSPs的释放而激活的级联炎症体激活相关，这些物质激活类激酶蛋白（MLKL），随后膜通透性增加并释放DAMPs。OVs还触发目标肿瘤细胞中的多种细胞死亡过程。例如，野生型Ad血清型5诱导自噬、焦亡和坏死性凋亡细胞死亡途径。NDV触发凋亡并被发现激活内在和外在凋亡途径。溶瘤NDV株FMW（NDV/FMW）是肺、黑色素瘤和前列腺癌细胞中的ICD诱导剂，显示HSP70/90和ATP分泌，并在黑色素瘤细胞中触发凋亡、自噬和坏死性凋亡。NDV/Hitchner B1促进胶质瘤细胞中的凋亡和坏死性凋亡。 4.OVs的递送系统  4.1.溶瘤病毒的直接递送  4.1.1.瘤内递送  瘤内给药是临床试验中用于递送OVs的最常用途径。各种试验已经建立了瘤内给药的有效性，并研究了其通过避免循环洪流来保持OVs足够生物利用度的能力。瘤内局部给药方法通过减少病毒失活来利于这一过程。有限的病毒与先天免疫系统的相互作用降低了系统毒性的可能性，并通过对独特给药途径的期望病毒载量进行转移。限制因素包括由于密集的ECM而在肿瘤中达到的非治疗水平，以及由于新生血管生成而导致的瘤内灌注不足。瘤内给药的OVs可以诱导全身反应。肿瘤抗原的产生是对OVs和肿瘤细胞之间相互作用的反应。对T-VEC给药的研究显示，研究的黑色素瘤病变大小都有所减小，无论是注射的还是未注射的。 4.1.2.静脉内递送 静脉给药对于转移性癌症有益，当需要感染不同大小和位置的多种肿瘤时，以及由于肿瘤位置原因无法进行瘤内给药时。这种类型的给药可以确保OVs在肿瘤质量中更好地分布；然而，最佳OV剂量尚不确定。一些OVs在静脉给药时可以刺激更明显的免疫反应。免疫系统可以使用不同策略阻止OVs成功传播到目标组织。OVs可以非特异性地连接到血清蛋白或循环流中的循环细胞，随后被破坏。由于这些机制是先天免疫系统的一部分，它们在未暴露于特定病毒的患者中也有效，暴露史可以通过存在精确而有力的免疫反应通过抗体的存在显著破坏病毒。通过与病毒颗粒结合，抗体可以通过补体作用或被位于不同器官的巨噬细胞破坏而消除。肝脏、脾脏和肺是中和OVs的主要器官。另一个有效静脉给药OVs的障碍是肿瘤ECM和间质流体压力。高间质流体压力限制了进入肿瘤中心的通道，其中由于其周边的流体流动而具有最高值，但它也减少了大分子的通过。 4.2.通过OVs的货物系统递送 在OVs货物递送到肿瘤的领域已经进行了众多且多样的研究，可以分为生物和非生物递送系统。生物载体包括细胞、细胞膜介导的和血清白蛋白介导的OVs载体。非生物载体的OVs包括矿化纳米结构、磁性纳米结构和基于聚合物的纳米载体。 4.2.1.OVs的有机载体 细胞载体 间充质干细胞（MSCs）因其独特的生物学特性、广泛的治疗应用以及对组织工程的影响而在科学研究中受到越来越多的关注。MSCs通过分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞来展示这种能力，并且具有广泛的分泌网络，包括多种介质、细胞因子和信号分子，除了它们显著的自我更新和多能性特征。这种分泌塑造了炎症反应，并控制了组织再生和修复所需的关键渗透过程。MSCs的调节行为是由MSC分子-靶细胞轴内的反馈驱动的。MSCs无法显示共刺激粒子，因此与较低的免疫活性有关，有机会用于肿瘤的基于细胞的免疫疗法。MSCs可能促进体外oAds的病毒复制，通过防止大鼠模型中的病毒特异性免疫反应，使运输和提高病毒的长期存活率成为可能。此外，与体内单独病毒接种相比，CR-MSCs可能减少刺激T细胞合成的IFN的数量，并导致oAds在扩散和存活方面的增加更大。全身给药的MSCs感染了肝细胞癌异种移植标本中的oAds，增强了病毒粒子的积累，并显著抑制了肿瘤增殖。另一项涉及由人类MSCs携带的复制Ad的研究，其中包括由甲胎蛋白启动子调节的E1A基因，显示在正位和皮下肝异种移植癌小鼠模型中显著限制了生长。经过全身给药后，MSCs被oAd污染，在肺和乳腺恶性肿瘤的正位小鼠模型中显示出治疗特性，提高了存活率。在转移性乳腺癌的实验模型中，全身注射工程化的人类MSCs，携带可复制病毒的副本，如Ad5/3.CXCR4和Ad5R6D.CXCR4 Ads，增加了动物的存活率。全身输注感染了HER2重定向溶瘤HSV的MSCs，在实验室模型中将感染传播到乳腺和卵巢癌细胞，随后减少了肺部和大脑的转移。对SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植的研究显示，腹腔内给药的MSCs装载了溶瘤MeVs在SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植可以进入肿瘤病变，并最终在小鼠中传播病毒感染，增加了平均寿命。针对MSCs的CRAd5/F11嵌合oAds显著抑制了结直肠癌细胞的生长。 神经干细胞（NSCs） 一些研究表明，NSCs具有迁移到脑肿瘤细胞的能力，并可能为各种抗癌剂提供运输平台。Ad（CRAd-Survivin (S)-pk7病毒）可以针对NSCs上的CD46受体。感染的NSCs迁移到胶质瘤细胞，从而减少肿瘤生长。NSCs和MSCs被用作载体在胶质瘤模型中运输oAd，观察到NSCs和MSCs都允许病毒复制并减少神经炎症。然而，NSCs释放的Ads数量多于MSCs，并且使用病毒载NSCs在肿瘤携带动物中注射瘤内，存活时间延长，这表明NSC细胞系中CXCR4的高表达是原因。Kim等人报告说，CRAd-S-pk7和NACA的组合提高了NSCs中oAds的复制，从而提高了OV的效率。 细胞膜介导的OVs系统递送 作为载体的某些实体在来自几种细胞类型的细胞外载体的多样化保护伞下共同可用。使用这些载体的好处，由生物模拟技术作为PEG化替代品，包括在环境中的安全性和耐用性，从而克服了药物递送系统的局限性。 整合来自细胞膜的运输者的主要优势在很大程度上是由于保留了它们来源的细胞内的固有功能和信号传导途径。结合这些纳米载体只包含来自单一来源的膜部分，如红细胞、血小板、癌细胞和负责免疫防御的细胞的膜，或者是从几种不同的细胞类型生成的，结果是有价值的载体选择，它们具有靶向肿瘤细胞的能力，是细胞膜的生物工程过程的结果，并且可以携带小分子，如遗传物质、特定药物和疫苗抗原。这些由细胞的基本组成部分生成的囊泡在肿瘤学试验中使用，主要是通过在它们内部运输实体或通过包裹纳米粒子-药物复合物。在所有细胞来源替代品中，红细胞为所讨论的目标提供了一些最有用的特征。可以相当容易地获得这些细胞，它们在血管系统中的平均存活时间很长，并且由于这些细胞缺乏天然细胞器，因此还有潜力封装额外数量的产品。依赖于具有混合涂层的囊泡的新模型，称为红细胞脂质体，由人工成分与红细胞膜的组合生成，对分布有益。随后，在体外和体内检查了肿瘤细胞膜，以评估病毒感染的程度及其破坏性影响。因此产生的颗粒，称为ExtraCRAd，被瘤内给药，并显示出通过clathrin介导的内吞作用的适当吸收，考虑到oAds感染需要表达CAR的需求，这是一个重要的好处。此外，这种设置对于体内抗体识别和灭活是一个重要的限制。 血清白蛋白介导的OVs系统递送 用不同材料包裹OV颗粒是一种保护它们免受免疫系统作用的策略。Ads和血清白蛋白之间的关联阻止了针对OVs的抗体的作用。抗体识别病毒的衣壳蛋白，并通过吞噬作用对它们进行涂层。因此，它们使OVs成为免疫效应细胞的目标；然而，它们也可以在细胞水平上阻止转导。白蛋白是血浆中浓度最高的蛋白质，并且具有长的半衰期。 经过基因工程改造后，白蛋白自然地结合到Ad的表面。形成病毒衣壳的最常见蛋白质具有高变区域，可以促进白蛋白和病毒之间的相互作用，但也是抗OV抗体的主要目标。使用降解ECM的蛋白酶可以增加肿瘤床中的病毒载量。透明质酸是ECM的组成元素之一。它是一种复杂的多糖，在某些癌症中以高浓度存在。透明质酸的积累可能发生在消化道癌症的上皮中，如结肠和胃。在卵巢、乳腺和前列腺癌症的肿瘤基质中，聚集是明显的。有些器官具有富含透明质酸的多层上皮和基质。在这些情况下，变化是可见的，并且与癌症进展相关。在头部、颈部和皮肤的鳞状细胞癌中，透明质酸水平降低，与肿瘤阶段有关。增加的浓度与侵袭性肿瘤和预后不良有关。透明质酸酶降解ECM并降低间质流体压力。因此，抗肿瘤剂对靶细胞的作用增加。透明质酸酶的表达增加了OVs的有效性。Hexon是Ad包膜中发现的一种重要蛋白质。衣壳蛋白与白蛋白的结合域结合。透明质酸酶的蛋白水解作用和基于白蛋白与病毒表面结合的递送机制决定了OVs的溶瘤效力。VCN-11是一种修饰的腺病毒，表达透明质酸酶和白蛋白结合域。目前正在研究其细胞毒性和逃避免疫系统的能力。这些OVs对肿瘤细胞的作用最强，并且细胞毒性是450倍。在体内，含有白蛋白结合域的OVs组中存在高滴度的中和抗体，表明它们没有作用。VCN-01是一种oAd，其透明质酸酶作用于胰腺间质基质。它可以增强化疗药物的效果。HAdV5是最好表征的Ad类型之一，靶向呼吸道上皮细胞。在具有健全免疫系统的个体中，可以轻松控制这种病毒的感染。这种病毒是溶瘤治疗的良好候选者，考虑到其个体性。这种病毒确保有效地转导到感染的细胞中。因此，在感染靶细胞后，遗传物质被转移到细胞核中。在将核酸释放到细胞核后，细胞使用病毒提供的遗传物质产生所需的蛋白质。此外，这种方法用于分裂细胞系和难以接近的细胞，如原代细胞。另一个优点是大规模生产的可能。适应悬浮培养的细胞确保了细胞培养的简便程序，从而提高了安全性并降低了生产成本。通过将白蛋白层适应病毒，可以减少OVs在肝脏中的清除。通过将适配蛋白附加到这个复合物上，可以将遗传物质传递给表达HER2或EGFRs的肿瘤细胞。此外，这种适应减少了免疫介导的清除。免疫中和可以通过阻断特定受体或将其暴露于蛋白酶体降解的抗体发生；这被称为抗体依赖性细胞内中和。先天免疫系统通过IgM抗体和补体系统与OVs相互作用。 细胞外囊泡（EVs） 细胞外囊泡是各种类型细胞释放的膜囊泡，通过携带脂质、蛋白质、RNA、DNA和碳水化合物参与细胞间信号传导，并根据其大小被分类为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小体。它们通常用于携带抗癌药物，如OVs。Garofalo等人报告说，Ad5D24-CpG和PTX封装在EVs中在体外和体内诱导了肺癌模型中的肿瘤周围炎症，提高了疗效和细胞毒性。来自肿瘤细胞的外泌体通常具有免疫抑制功能；然而，感染OVs的肿瘤细胞的外泌体可能具有免疫刺激功能。Labani-Motlagh等人表明，感染OVs的黑色素瘤细胞，装备有CD40（CD40L）和4-1BB（4-1BBL）配体，增强了树突细胞的激活和TME中的响应。OVs可以包含选择性在肿瘤中积累的外泌体，局部或在远处肿瘤中表达抗肿瘤效应。它们被设计成带有免疫刺激转基因的LOAd溶瘤腺病毒。LOAd感染的肿瘤细胞表达转基因包装到内体区室并作为外泌体释放。此外，mRNA在外泌体中的表达在LOAd700和LOAd703感染的细胞中显著增加。观察到任何感染的细胞都可以表达转基因，即使病毒只在肿瘤细胞中复制。然后未成熟的树突细胞被LOAd病毒感染，并在体外被外泌体激活。OVs用其免疫刺激转基因武装肿瘤衍生的外泌体，这可能部分解释了为什么局部治疗可以导致全身免疫。还证明了感染细胞中外泌体中微小RNA（miRNA）的转运发生了变化。 微粒子（MPs） 另一种用于OVs系统运输的车辆是微粒子（MPs），它们是通过外泌作用从细胞释放的直径最大为1微米的囊泡。微粒子提供免疫保护并延长oAds的释放。封装在微粒子或PLGA中的Ads为oAds提供了免疫保护。使用MPs的总循环系统对oAds的高保护增加了oAds的释放。肿瘤细胞衍生的MPs被用作oAds的货物，被运送到肿瘤细胞的细胞核，并保护Ads免受抗体的影响；由MPs携带的oAds比用游离oAds治疗肿瘤更有效。 4.2.2.无机载体介导的OVs系统递送 包括脂质体、树状分子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和氧化铁纳米粒子在内的各种类型的纳米粒子（NPs）可以与OVs链接。使用NPs递送OVs有两种策略。第一种是屏蔽和表面修饰，第二种是OV-NPs的联合疗法。将NPs递送到肿瘤部位有两种机制，即主动和被动。在被动机制中，EPR效应增加了肿瘤血管的通透性，NPs在肿瘤区域集中。主动递送涉及NPs对目标细胞的选择性结合，目的是在减少副作用的情况下增加治疗剂在肿瘤中的浓度。各种生物配体，如肽、蛋白质、核酸适体和多糖，对肿瘤细胞中的分子或受体表现出亲和力和特异性。 药物递送中的屏蔽 聚乙二醇（PEG）最常用于屏蔽NPs的表面，因为它在极端pH溶液中的生物相容性、稳定性和亲水性。PEG成功地与Ad载体结合，延长了循环时间并减少了肝脏毒性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是另一种通过内吞作用进入细胞的配体。阳离子脂质体（DOTAP/DOPE）被报道可以增强病毒基因组在肿瘤细胞中的转移，并增加肿瘤的通透性和优先靶向。 OV-NP联合疗法 金纳米粒子（AuNPs）在溶瘤病毒疗法中广泛使用，有助于DNA进入肿瘤，尽管存在抗体。设计了一种含有Ad的微胶粒包被的粒子，并与紫杉醇结合，显示出对肿瘤的高效性。我们测试了聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）与聚合物微胶粒的结合，携带紫杉醇到特定目标，比紫杉醇诱导了更高的抗肿瘤效应。另一种聚合物，聚半乳糖基-b-agmatyl二嵌段共聚物（Gal32-b-Agm29），涂覆了oAd，对肝肿瘤细胞表面表达的糖蛋白受体表现出非常强的亲和力。oAds也可以与水凝胶系统结合，提供决定恶性细胞细胞毒性影响的保护环境。oAds可以装载在海藻酸盐凝胶中并瘤内给药，与裸oAds相比，在肿瘤异种移植模型中显示出oAds的长效性。Almstätter等人将磁技术与OV递送结合起来，以改善OVs的递送。设计了四种磁性病毒复合模型，被证明可以提高OVs的疗效并减少系统毒性。 5.当前溶瘤病毒治疗策略  5.1.对溶瘤病毒治疗的耐药性  并非所有患者和癌症类型对病毒治疗都有相同的反应。这种治疗方法的局限性和挑战，以及治疗耐药性的存在，已经被描述。宿主对病毒的免疫反应是病毒治疗中的关键挑战。在几项临床前研究中，宿主免疫反应被证明在减少OVs的复制和更快的清除中发挥重要作用，并对降低抗肿瘤效力负责。在这种情况下，涉及OVs的新的治疗策略集中在调节宿主免疫系统以最大化抗病毒反应，从而改善肿瘤破坏[9]。已经描述了不同的耐药机制；这些包括抗病毒免疫、肿瘤细胞介导的、基质细胞和系统反应。对病毒感染的抵抗力可以在四个阶段完成：（i）病毒的进入和结合；（ii）病毒转录和翻译；（iii）细胞存活；（iv）细胞信号传导。包括中和抗体、正常细胞受体和ECM中的蛋白酶在内的多种因素影响病毒的结合和进入。在上皮-间质和间质-上皮转换期间，据报道细胞间连接得到加强，这使得OVs的渗透变得困难。 为了执行其自身基因组的转录和翻译，病毒的下一个关键步骤是适当调节宿主转录和负责将mRNA翻译成蛋白质的机制。例如，肿瘤细胞可以通过表观遗传修饰和表达几种蛋白质（如载脂蛋白B mRNA编辑酶）来影响病毒转录。几种存活蛋白保护肿瘤细胞免受病毒感染。除了表观遗传修饰外，对OVs的耐药性被发现与调节自噬、肿瘤细胞中的凋亡和促进细胞存活有关。Li等人证明了病毒治疗溶瘤活性的增加，其中Ads中的beclin-1活性促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，对病毒感染和肿瘤细胞中的增殖的抵抗力与几个细胞存活调节因子（MEK、MAPK、MYCN、MDR1和SMAC）有关。感染的细胞释放可溶性信号，保护周围细胞免受各种病毒感染。此外，通过分泌干扰素在OVs感染的背景下触发肿瘤细胞中的干扰素受体（IFNR）基于Janus激酶（JAK-STAT）途径在抗病毒耐药性中发挥重要作用。基质细胞的抗病毒活性比肿瘤细胞更强，这影响了对OVs的治疗反应。Arwert等人表明CAFs通过干扰素调节转录因子3（IRF3）和干扰素基因刺激因子（STING）阻止病毒感染。类似地，在卵巢和乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN促进对OVs的耐药性，从而创造了保护性的抗病毒状态。OVs也可以诱导局部免疫反应，随后将免疫学上“冷”的TME转化为“热”的，被免疫细胞浸润，其中干扰素信号通路发挥重要作用。干扰病毒治疗效力的机制存在于不同的水平，并涉及TME中不同细胞的相互作用。因此，上皮细胞代表了控制肿瘤中病毒传播的物理屏障。此外，肿瘤血管生成是病毒传播和感染的调节组成部分。对oncoviral治疗产生耐药性的另一个因素是肿瘤中存在缺氧区域。缺氧可以减少OVs在肿瘤细胞中的增殖并干扰肿瘤细胞的裂解机制。缺氧诱导因子1（HIF-1α）是缺氧中的主要因素，促进肿瘤细胞的血管生成和转移。除了物理限制外，前列腺素和VEGF与TME中的耐药性有关。使用病毒载体开发新疗法的困难与无效分布、肿瘤中的缺氧、血管屏障、亚优免疫反应和在细胞间水平发生的抗病毒分子机制有关。总而言之，某些机制对病毒治疗施加了一定程度的耐药性，并负责随后杀死肿瘤细胞。尽管如此，这种机制在赋予OVs耐药性方面的作用仍然不清楚。 这些数据表明需要鉴定新的因素，如肿瘤缺氧和表观遗传修饰，这些因素被认为是对溶瘤病毒治疗产生耐药性的组成部分。关于这一机制的额外数据将为研究人员和临床医生提供完美的工具，以合理设计OVs并制定适当的治疗策略。 5.2.当前将溶瘤病毒治疗与其他协同疗法结合在癌症治疗中的现状 如前所述，已经描述了在单药治疗中对OVs产生耐药性的几种因素。已经考虑了联合疗法来克服这个问题。这种方法在临床前和临床环境中的各种类型的肿瘤中证明了其有效性。 5.2.1.与化疗的结合 化疗仍然是传统的抗癌疗法。OVs与化疗在多个层面上协同作用，包括抑制免疫介导的病毒降解和中和。化疗通过多种机制补充病毒治疗，如通过增强肿瘤细胞的免疫原性、直接杀死癌细胞和阻断抗病毒免疫反应（NCT00006106、NCT00634595、NCT01584284）。环磷酰胺是一种烷化剂，可以提高使用不同病毒的病毒治疗的疗效。这种化疗药物触发的免疫调节被认为可以改善病毒的复制、传播和溶解活性。在临床前和I/II期研究（NCT00006106）中取得了有希望的结果，一种工程化的Ad载体，ONYX-015，与5-氟尿嘧啶和顺铂联合用于治疗头颈部或食管鳞状细胞癌的III期试验。联合治疗的患者反应率为79%，而单独接受化疗的患者为40%。此外，当Ad与不同的药物如阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康和环磷酰胺联合给药时，抗肿瘤效应得到加强。此外，在临床前研究中，对胶质瘤患者测试了替莫唑胺与OV的联合使用，并显示出良好的毒性剖面和提高的存活率。然而，OVs与化疗的结合效果仍然存在争议，需要进一步研究。尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但其他涉及大样本的研究报告了这种联合方案的无效性。例如，Eigl等人在用多西他赛和pelarorep联合治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者中，中位生存时间为19.1个月，而接受多西他赛治疗的患者为21.1个月（NCT01619813）。 5.2.2.OVs与放疗的结合 一些研究表明，病毒治疗和放疗的结合导致了有希望的治疗结果。尽管存在强有力的临床前数据，但由于缺乏一个完善的机制，这种效应是由于这两种疗法之间的协同活动。这种结合导致了改善的抗癌活性。放疗诱导的细胞修饰可以增加病毒在肿瘤中复制和传播的能力。Pokrovska等人证明，当OV与放疗结合时，通过增加病毒产生诱导了肿瘤特异性细胞毒性。在一项I期试验中，一种突变的HSV（G207）与复发性恶性胶质瘤的放疗结合，显示出临床反应的潜力。在这项研究中，9名患者中有6名显示出部分反应或稳定疾病，这被证明具有协同效应。另一种方法是，病毒治疗可以增加肿瘤对放疗的敏感性。表达p53的Ad诱导感染的p53缺陷肿瘤细胞对辐射诱导的凋亡更敏感，随后比未从放疗中受益的肿瘤细胞的凋亡减少，导致更大的肿瘤抑制。 5.2.3.OVs与免疫治疗的结合 尽管文献中关于免疫治疗和病毒治疗的结合的报告很少，但将针对PD-1和/或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂与OV结合在癌症治疗中提供了新的视角，特别是在具有免疫抑制微环境的癌症中，其中PD-1/PD-L1抑制剂的单一疗法可能变得无效。这种疗法的溶瘤活性决定了细胞因子和其他分子的释放，这些分子具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的效果，这种修改可以改善免疫治疗对易感目标的效果。除了PD-1，一些也表达在TIL上的免疫检查点分子也被证明可以诱导免疫抑制微环境并减少活化的CD8+细胞。这一类包括CTLA-4、TIGIT、TIM-3和LAG-3。OVH-aMPD-1与抗TIGIT协同作用，并在MC38和Hepa 1-6肿瘤模型中显著改善免疫反应。然而，在难治性肺癌中，vvDD单一疗法与抗PD-1和抗TIM-3 mAbs的结合未能显示出治疗优势。重要的是，将超过两种ICIs作为治疗策略结合使用可以产生更好的抗肿瘤结果。T-VEC是一种瘤内疗法，是免疫疗法的领先组合。GM-CSF在这种结合中的作用是增强细胞免疫。T-VEC的作用来自于病毒载体的直接溶瘤效应和免疫反应触发的结合。在将T-VEC与抗CTLA4，ipilimumab联合用于治疗IIIB-IV期黑色素瘤的I期试验中，观察到了客观和持久的反应率的有希望的结果。此外，在一项开放标签的II期试验中，无论是原发性还是转移性肿瘤，与ipilimumab单一疗法相比，T-VEC与ipilimumab联合使用的目标反应率显著增加。在T-VEC与ipilimumab与ipilimumab单独用于晚期黑色素瘤的II期试验中，在5年分析中，联合治疗的中位PFS为13.5个月，ipilimumab为6.4个月，估计的5年OS在联合治疗组为54.7%，ipilimumab组为48.4%（NCT01740297）。Pexastimogene Devacirepvec（Pexa-VEC）是一种溶瘤牛痘病毒，与抗PD-1抑制剂，cepilimumab联合在肾肿瘤患者中在Ib期试验中显示出令人鼓舞的结果。这种联合疗法报告了37.5%的总体反应。腺病毒DNX-2401是一种OV，在接受恶性胶质瘤诊断的患者中进行了剂量递增研究。在那项研究中，单剂量的DNX-2401，瘤内给药，获得了不同的肿瘤反应。目前，这种OV正在与pembrolizumab联合用于胶质母细胞瘤患者的II期试验中进行研究。中期分析显示，48名接受联合治疗的患者中位总生存期为12个月，反应率为47%。将抗PD1/PD-L1与抗CTLA4和OV结合使用的三重疗法的想法最近变得非常吸引人，在其中一项研究中，Ad与抗PD-L1和抗CTLA4的结合在TNBC正位小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了存活。通过增加CD8+ T和T记忆细胞的比例以及耗尽Tregs和极化为M1表型的肿瘤相关巨噬细胞，增强了抗肿瘤效应的协同增加，调节了TME。这种联合疗法具有很大的潜力，代表了一种有前景的治疗策略，用于改善癌症细胞治疗，应该很快就会可用。考虑到安全性、毒性剖面和有希望的结果，越来越多的ICIs和OVs正在进入临床试验。 5.2.4.激酶抑制剂的作用 药物病毒方法是用来克服对OVs的耐药性的策略之一，它将病毒治疗与针对激酶的分子治疗相结合。在临床前模型中，已经获得了重要的协同结果，明显的表现是在肿瘤组织中OVs的复制和传播显著增加。受体酪氨酸激酶（RTKs），位于细胞表面，控制大多数情况下介导细胞生长和存活的细胞内反应。一些途径，如MAPK级联或PI3K/Akt/mTOR途径，通过受体特异性配体结合在下游激活。RTKs的超激活导致细胞生长不受控制，是一个重要的药物靶标。最近，病毒治疗与RTK抑制剂的结合已经取得了一些有吸引力的效果。肿瘤间质液压力（IFP）高是有效药物递送的障碍，被认为通过阻碍病毒在整个肿瘤微环境中的接触和侵入，限制了OVs的临床效益。肿瘤组织中IFP增加的原因尚有争议。一个被认为对此有贡献的机制是异常的VEGF介导的血管化增强。Kottke等人指出，当将VEGF配体VEGF165与oReoV结合时，OV给药前给予VEGF165可以改变肿瘤血管并改善OV递送到肿瘤组织。两种酪氨酸激酶抑制剂，厄洛替尼和阿西替尼，与oHSV1结合，通过抑制oHSV1血管生成刺激病毒递送，并被报告影响小鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长和血管生成。总的来说，这些观察结果证实了与不同的激酶抑制剂结合治疗的合理性，在临床前研究中取得了有希望的结果。此外，临床前研究的结果与药物病毒结合使用OVs与这些分子可以刺激病毒治疗在癌细胞中溶瘤效力的观点一致。 5.2.5.与细胞治疗的结合 嵌合抗原受体（CAR）-T疗法是治疗癌症的一种新颖且有前景的治疗方法，产生了有效和持久的临床反应。合成受体主要重新定向T细胞，消除表达特定靶标抗原的细胞。2017年，FDA批准了针对B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法存在一些限制，包括主要毒性，限制了其对实体瘤的疗效，抗原逃逸，持久性有限，以及肿瘤渗透性差。这些都导致了新的方法，在这些方法中，CAR-T疗法与其他抗癌治疗相结合，以提高抗肿瘤效力并减少毒性。抗CD19 CAR-T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗。一些研究表明，CD-19在多种OV感染的肿瘤细胞类型表面表达，携带CD19-T编码基因（OV19T）。因此，CD-19刺激CAR-T细胞并触发肿瘤溶解，刺激来自死亡肿瘤细胞的OV19T的释放，可以激活内源性抗肿瘤免疫。此外，病毒治疗可以与免疫治疗和CAR-T细胞同时结合，增加TME中的免疫细胞数量并改善抗肿瘤反应。例如，可以同时给予表达IL12的Ad和全身HER-2和PD-L1阻断抗体。在临床前肿瘤模型中，这种结合显示出增强或协同效应。此外，抗CTLA4、病毒治疗、抗PD-(L)1抗体和新兴ICI抗体给药的时间是另一个需要进一步观察的重要领域。为了提高疗效并改善肿瘤反应性，需要系统探索免疫治疗在OVs和CAR-T细胞之前、之后和同时给药的效果。 6.结论及展望  溶瘤病毒在破坏肿瘤细胞方面的优势源于其本身的品质，包括直接细胞溶解、针对免疫系统、调节TME和直接特性，如调节肿瘤细胞中的特定途径、抗血管生成作用和调节肿瘤细胞代谢。基因工程在增强细胞溶解作用和肿瘤细胞攻击的多样性方面提供了巨大的优势。将病毒运送到肿瘤细胞的方法仍然是一个挑战，有多种可能性获得表现出更有效作用的OVs。在过去的几年中，许多研究已经使用非生物或生物纳米载体将OVs运送到肿瘤细胞中，并显示出有希望的结果。OVs作为单一药物疗法或与其他治疗策略结合在临床前和临床研究中都已得到证明。OVs具有抗肿瘤潜力；然而，作为一类新的抗癌治疗，它们的发展仍然存在一些特定的障碍。导致溶瘤病毒治疗失败的障碍包括OVs渗透和扩散不足、宿主抗病毒免疫、患者之间的个体差异、溶瘤病毒与病毒耐药或病毒敏感肿瘤细胞的相互作用，以及作为单一药物使用时的低或中等效力。单一OV给药的效力低是因为宿主免疫系统可能将其从血流中清除，病毒可能只在短时间内表达转基因，或者病毒传播可能受到限制。已经在用oHSV或oAds治疗的小鼠中进行了研究，在这些小鼠中，病毒颗粒被迅速清除。此外，oAds在目标组织中的效力有限且持久性低。为了克服这些限制，溶瘤病毒治疗可以与其他抗癌治疗结合使用，如化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。治疗效果与宿主的抗病毒反应和OV诱导的抗肿瘤免疫之间的平衡有关；然而，影响这种平衡的生物学机制仍然不清楚。各种类型的肿瘤和癌症的不同阶段在选择OVs、运输方式及其与各种系统治疗的结合方面仍然具有挑战性。