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摘要：尽管基于干细胞的治疗方法在管理某些疾病方面显示出比传统手术更大的潜力，但它也不可避免地存在一些缺点，这些缺点可能会限制其临床转化。与干细胞相比，干细胞衍生的外泌体拥有许多优势，例如无免疫原性、无输注毒性、易于获取、保存方便，且没有致瘤潜力和伦理问题。外泌体可以通过垂直传递其多能性或多向分化能力，从其亲本细胞（如胚胎干细胞和成体干细胞）继承相似的治疗效果。在对过去五年的相关文献进行彻底搜索和细致剖析后，我们呈现了这篇全面、最新、专业特定和疾病导向的综述，以突出干细胞衍生外泌体在外科应用和潜力。来自干细胞（例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和内皮干细胞）的外泌体能够治疗骨科手术、神经外科、整形外科、普通外科、心胸外科、泌尿科、头颈外科、眼科和妇产科中遇到的众多疾病。干细胞衍生外泌体的多样化治疗效果是通过组织特异性反应和细胞特异性分子信号通路的层级转化实现的。在这篇综述中，我们强调干细胞衍生外泌体作为管理各种外科状况的干细胞疗法的可行且强大的替代方案。我们建议未来的研究结合外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者的智慧，在这一相关且引人入胜的研究领域进行探索。 1.引言 干细胞是一群未分化的细胞，具有自我更新和重建功能性组织的独特能力。它们主要根据分化潜能、来源和谱系进展进行分类。根据它们的潜能，干细胞可以是全能的、多能的、多向的、寡能的和单能的。干细胞存在于胚胎和成体细胞中。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）是多能干细胞的最佳例子，而成体多能干细胞则以造血干细胞（HSCs）、间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞（NSCs）和内皮干细胞/祖细胞（EPCs）为代表。所有这些亚型的干细胞都已广泛用于人类疾病的治疗。 作为再生医学的一种方式，干细胞疗法引起了巨大关注，因为它为以前无法治愈的疾病患者提供了新的选择。随后，成千上万的相关临床试验被注册，涵盖了广泛的医学问题，如肌肉骨骼和神经系统疾病、免疫疾病、血液学功能障碍和退行性状况。然而，一些试验未能在临床上显示出任何益处。这可能是由于干细胞疗法不可避免的限制，如输注毒性、免疫原性、致瘤潜力和伦理问题。 外泌体，由几乎所有细胞类型包括干细胞分泌，被认为是比干细胞疗法更安全、更通用的替代品。外泌体是纳米级、球形、脂质双层单膜细胞外囊泡，充当细胞间信使。外泌体被视为其亲本细胞的缩小版，部分原因是某种细胞类型的外泌体提供细胞特异性或独特的生物分子集合。此外，已发现干细胞通过其可溶性分泌物包括外泌体以旁分泌方式发挥作用。换句话说，干细胞衍生的外泌体（SC-Exo）继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如抗炎、免疫调节和组织再生。总的来说，干细胞衍生的外泌体是干细胞疗法的强大替代品，没有表现出其细胞对应物所呈现的缺点。（表1） 在临床应用之前，外泌体必须在生产、纯化和修饰方面进行准备和优化。近年来，已发表了许多医学综述，分析了外泌体疗法的这些上游措施。然而，一些研究途径仍然未被充分调查：特别是，缺乏系统调查下游临床应用的研究，尤其是从外科角度来看。无论是由疾病还是外科医生的手术刀造成的组织损伤，都会通过炎症和再生动态作出反应，这使得外科成为干细胞衍生外泌体疗法的完美场所。干细胞衍生的外泌体继承了其亲本细胞相似的治疗效果，例如组织再生、抗炎和免疫调节。 在这项工作中，我们将剖析过去五年的相关出版物，以呈现一个全面、最新、专业特定和疾病导向的综述。我们的目标是弥合目前外科医生、纳米医学从业者和干细胞研究者之间存在的差距。 2.外泌体和外泌体疗法的一般背景 2.1.外泌体的生物发生、组成和摄取 外泌体在大小、内容和生产机制方面与其他类型的原发性细胞外囊泡（例如凋亡体和小囊泡）不同。外泌体形成的最广泛接受的机制，即内体途径，如下。最初的内体是通过细胞膜内陷产生的，在这个过程中生物活性物质开始在早期排序内体中积累。晚期排序内体随后形成多泡体（MVBs），在第二次内陷后。最后，MVBs与细胞膜融合，将携带的外泌体释放到外部。也有报道称非内体途径的外泌体生物发生，例如血浆膜出芽。 正如三大外泌体数据库（即ExoCarta、VesiclePedia和EVpedia）总结的，外泌体包含众多分子，包括蛋白质、糖复合物、脂质、核酸、代谢物和其他生物活性物质。每个类别的例子及其相应功能已在其他地方进行了全面审查。一方面，外泌体包括一个复杂的蛋白质网络，包括外部蛋白质（例如四跨膜蛋白、抗原呈递复合物和粘附分子）和内部蛋白质（例如热休克蛋白、ESCRT机制、细胞因子和趋化因子以及膜转运蛋白）。另一方面，作为人类外泌体核酸中最丰富的，微小RNA（mRNA）可以通过外泌体介导的细胞间通信参与造血、外泌体和神经及血管再生。 外泌体一旦到达受体细胞，就有多种摄取机制，这些机制可以归类为膜融合、受体相互作用和内吞作用（图1b）。最终，外泌体的货物被释放到细胞质中，这一过程取决于外泌体的来源、货物的性质以及受体细胞的代谢状态。从外泌体生物合成到摄取和细胞内信号传导的整个生命周期可以使用荧光、发光和放射性技术进行追踪。 图1 外泌体治疗的上游措施说明（使用Autodesk 3ds Max 2023生成的图表）。a 外泌体的生产和纯化（以MSCs和NSCs为例，展示多能干细胞）。b 天然外泌体的内容。c 外泌体的修饰。（BM 骨髓，DC 树突细胞，IAC 免疫亲和色谱，iPSC 诱导多能干细胞，MHC 主要组织相容性复合体，miRNA 微小RNA，MSC 间充质干细胞，MVB 多泡体，NSC 神经干细胞，SEC 尺寸排阻色谱，UC 脐带） 2.2.外泌体的来源和分类 根据外泌体是否经过人工修饰，它们大致被分类为天然外泌体和工程化外泌体（第2.4节）。根据物种来源，外泌体被分为动物源性和植物源性外泌体。目前，外泌体主要根据其亲本细胞的类型进行分类。几乎所有类型的人类细胞都能产生外泌体。这些包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、血小板、干细胞，甚至是肿瘤细胞（图1a）。 例如，巨噬细胞源性外泌体有助于疾病进展（例如糖尿病、动脉粥样硬化和心力衰竭）和疾病治疗（例如皮肤创伤、炎症性肠病和真菌及病毒感染）。然而，它们在抑制和促进肿瘤方面似乎扮演着矛盾的角色。与DCs类似，DC源性外泌体（Dex）也可以通过其表面蛋白如主要组织相容性复合体（MHCs）与免疫细胞（例如T细胞、B细胞和NK细胞）相互作用。一些临床前和临床试验已经证明了基于Dex的免疫疗法对癌症的有效性和安全性。此外，肿瘤源性外泌体（Tex）不仅参与肿瘤增殖、侵袭、转移和免疫，而且可以作为癌症诊断和治疗的生物标志物。最近，Tex被用作抗肿瘤药物和DC疫苗的抗原呈递者，作为一种有前景的无细胞癌症免疫疗法。最后，干细胞源性外泌体的临床应用将在以下部分详细讨论。 外泌体可以在所有体液中找到，如血液、唾液、尿液、血浆、眼泪、精液、羊水甚至母乳。体液衍生的外泌体是疾病生物标志物的高稳定储库，协助液体活检在各种临床环境中进行，如癌症、心血管疾病和围产期疾病。然而，每种体液中共同存在的内容和可用性可能会给外泌体分离带来挑战。 2.3.外泌体的生产、分离和纯化 阻止基于外泌体的治疗进入临床实践的主要障碍之一是外泌体的产量和效率低。例如，在实验室环境中，从1毫升培养基中只能收获不到1微克的外泌体蛋白。有各种扩大外泌体生产的方法，这些方法被归类为生化策略（例如LPS、BMP-2、HIF-1α和IFN-γ及TNF-α）、物理策略（缺氧、热应激和饥饿）、机械策略（剪切应力和3D培养）和仪器策略（中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器）。 外泌体在大小、内容、表面标记和来源方面是异质的，这使得它们的分离变得困难。目前可用的外泌体分离和纯化技术是基于它们的大小、表面电荷或免疫亲和性（图1a）。然而，没有一种“一刀切”的方法，因为这些技术都有优点和缺点。 例如，超速离心被认为是外泌体提取的金标准。尽管它需要最少的试剂和专业知识，但时间消耗、高成本、低效率和脂蛋白共分离限制了它的大规模使用。免疫亲和色谱是一种基于抗体和配体特异性结合的分离技术。它快速且提供高纯度、特异性和产量。然而，使用的抗原/蛋白偶联需要表达在外泌体表面。基于大小的分离技术主要是指超滤和尺寸排阻色谱，这两种方法都快速且适合大规模应用。但是孔堵塞、外泌体丢失和纯度低使得这种方法难以普及。尽管没有单一的技术是完美的，将上述技术与其他技术（例如基于沉淀和基于微流体的）结合起来可能是一种解决方案，以同时满足外泌体分离和纯化的多重要求。 2.4.外泌体的修饰 外泌体可以生化修饰以扩大、改变或改善它们的治疗效果。外泌体的修饰分为内部策略（例如药物装载）和外部策略（例如表面修饰）。一方面，外泌体可能是一个理想的治疗载体，用于输送药物、核酸和疫苗，因为它们在稳定性、非免疫原性和靶向受体细胞方面的优势。有各种货物装载技术，包括生产前装载方法（例如转染、共培养和电穿孔）和生产后装载方法（例如冻融循环、孵化、超声、挤出和低渗透析），这取决于它们是在外泌体生物合成之前还是之后应用（图1c）。例如，Tian等人使用电穿孔将阿霉素装载到Dex中以治疗乳腺癌。Kim等人使用孵化和超声将紫杉醇装载到RAW 264.7衍生的外泌体中以克服癌细胞的多药耐药性。Ohno等人使用转染将抗肿瘤let-7a miRNA装载到HEK293衍生的外泌体中以管理乳腺癌。 另一方面，外泌体的表面修饰以遗传工程外泌体膜或亲本细胞、化学连接靶向配体、静电相互作用和磁性纳米颗粒技术为例。表面修饰的主要目的是选择性地将外泌体输送到目标细胞以进行精确治疗。例如，Alvarez-Erviti等人通过遗传工程修改DC以表达Lamp2b和RVG肽，从而靶向中枢神经系统（CNS）。Zhu等人使用化学反应将肿瘤靶向肽c(RGDyK)插入外泌体表面以靶向胶质母细胞瘤。Nakase等人使用静电相互作用将外泌体与由pH敏感融合肽和阳离子脂质形成的复合物结合，从而实现增强的细胞质递送。 2.5.外泌体的特性和验证 外泌体在治疗应用前需要进行特性和验证。当前用于外泌体特性的方法主要集中在外泌体的大小、形态和货物剖面上。基于大小的验证包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS），而基于形态的分析包括扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）。此外，货物剖面进一步细分为蛋白质组学、脂质组学和基因组学分析，包括西方印迹、ELISA、流式细胞术、质谱和PCR。由于上述每种特性方法都有优点和缺点，将三个方面的分析结合起来是一种普遍做法，例如一组TEM、NTA和西方印迹，以识别分离的外泌体。 例如，基于显微镜的方法，如SEM和TEM，可以分别直接可视化表面形貌和内部结构。然而，由于操作复杂和样品制备繁琐，TEM不适合快速测量大量样品。NTA有助于快速检测和实时外泌体观察，同时比流式细胞术具有更高的分辨率。NTA的主要缺点是难以区分外泌体和污染蛋白。作为一种成熟的技术，西方印迹可以定性和定量地检测外泌体蛋白生物标志物的表达，特别是来自细胞培养介质的外泌体。然而，它耗时且不适合检测来自生物流体的外泌体。 2.6.外泌体的储存 目前用于外泌体长期保存的方法主要包括冷冻保存、冻干和喷雾干燥。温度和防冻液是冷冻保存中最重要的两个成分。4°C的储存可能会削弱外泌体的生物活性并减少蛋白含量，而-80°C被认为是对外泌体形态和内容影响最小的最佳温度。不可渗透的二糖防冻液，特别是海藻糖，是最佳选择，因为它可以防止外泌体聚集和冷冻损伤。对于热敏感材料，例如外泌体和疫苗，通过冷冻干燥的冻干处理可以轻易储存，并且通过简单地加水重新配制。最近的一项研究表明，即使在室温下储存，带有冷冻保护剂的冻干可以保持外泌体蛋白和RNA的活性大约4周。最后，与冷冻干燥相比，喷雾干燥是一个单步过程，从而减少了对昂贵设备和漫长多步骤研磨的需求。然而，喷雾干燥的核心参数，如外泌体给药速率、雾化压力和出口温度，都会影响外泌体的稳定性和货物完整性。 图2 外泌体治疗在外科应用的下游说明（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。外泌体的治疗效果是通过疾病特异性组织反应、组织特异性细胞变化和细胞特异性分子信号通路的层次转化实现的。 3.骨科和创伤手术以及SC-EXO治疗 3.1.骨折 骨折是最常见创伤性大型器官损伤，大约有10%无法正常愈合。骨折愈合涉及一个合成组织体积增加阶段和一个分解组织重塑阶段，这两个阶段受到各种因素的控制，如干细胞、先天和适应性免疫功能以及稳定性。骨折的生物药理治疗可以局部给药（例如骨形态发生蛋白，BMP）或系统给药（例如甲状旁腺激素，PTH）。作为一种有前景的替代方案，外泌体治疗骨折愈合主要利用骨髓源性MSCs作为细胞供应者（表2）。 推测MSC源性外泌体促进骨折愈合的机制如下。首先，骨修复的进展需要多种细胞，例如炎症阶段的炎症细胞、纤维血管阶段的内皮和间充质祖细胞、骨形成过程中的成骨细胞和软骨细胞以及骨痂重塑过程中的破骨细胞。其次，这些细胞中的大多数可以吸收外泌体，特别是成骨细胞和血管内皮细胞，它们与骨折愈合最为相关。最后，在吸收外泌体后，受体细胞的基因表达被修改，从而激活各种信号通路（图3a），引起各种细胞和组织反应（图3b），最终导致改善骨折愈合。 图3 干细胞衍生外泌体治疗的机制（使用Adobe Photoshop 2023和Adobe Illustrator 2023生成的图表）。a 激活和调节各种信号通路。b 疾病特异性的细胞和组织反应。 早期研究使用了各种动物模型来研究骨折愈合。在横向股骨干骨折模型中，发现外泌体不仅促进了野生型小鼠的成骨作用，还挽救了CD9−/−小鼠骨折愈合的迟缓，这是一种已知具有较低骨结合率的品系。在股骨不连模型中，外泌体通过可能的BMP-2/Smad1/RUNX2途径促进成骨和血管生成，从而增强骨折愈合。在胫骨牵张成骨模型中，年轻MSC分泌的外泌体促进了老年MSC的成骨能力，并在老年大鼠中增强了新骨形成。此外，EPC源性外泌体通过刺激血管生成加速牵张成骨过程中的骨再生。作为外泌体的主要货物（第2.1节），RNA可以改变受体细胞的基因表达和表型功能，其中微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）被最广泛研究。从外泌体miRNA的角度来看，一个小组发现，骨髓MSC源性外泌体中的miR-136-5p促进了体外成骨细胞的增殖和分化，从而促进了体内的骨折愈合。这是通过抑制miR-163-5p的下游靶基因，低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4），通过Wnt/β-catenin途径实现的。另一个小组发现，MSC源性外泌体miR-25可以通过Smad泛素化调节因子1（SMURF1）调节Runt相关转录因子2（Runx2）的泛素化和降解，以促进小鼠骨折愈合。从lncRNA的角度来看，特别是骨特异性lncRNA H19，一个中国小组揭示了尽管高脂饮食减少了成骨分化并削弱了骨折愈合，但这可以通过MSC源性外泌体lncRNA H19通过miR-467/HoxA10轴在肥胖诱导的骨折模型中逆转。此外，一个美国小组证明了外泌体lncRNA H19不仅改善了成骨作用，还通过血管生成素1/Tie2-NO信号途径改善了血管生成。 与其使用MSC自然衍生的外泌体，一些研究人员对分离前的外泌体进行了预处理以获得更好的结果。梁等人用小剂量的二甲基草酰甘氨酸（DMOG），一种小的血管生成分子，预处理MSCs，以准备外泌体，通过靶向蛋白激酶B/mechanistic target of rapamycin（Akt/mTOR）途径，在临界尺寸颅骨缺损模型中增强血管生成和骨再生。另一种方法，陆等人将miR-29a装载到MSC源性外泌体中，通过靶向vasohibin 1，显示出强大的促进血管生成和成骨作用的能力。此外，脐带MSC源性外泌体在骨折愈合中显示出与骨髓MSC相当的成果。此外，低氧条件下的MSC源性外泌体对骨折愈合的效果比正常氧条件下的更好。从机制上讲，低氧预处理通过激活低氧诱导因子1（HIF-1α）增强了外泌体miR-126的产生。各种研究表明，低氧预处理是MSC源性外泌体治疗骨折愈合效果的有效和有前景的优化方法。 3.2.骨关节炎 骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，也是成人活动限制的最常见原因，全球约有2.4亿患者受到影响。OA的病理学已经从被视为仅软骨发展到影响整个关节的所有组成部分的多组织疾病，包括骨骼、滑膜、肌肉、韧带和周围脂肪。临床试验成功揭示了阻止结构进展（例如，组织蛋白酶K和Wnt抑制剂）或减少OA疼痛（例如，神经生长因子抑制剂）的系统化合物。作为一种潜在的OA治疗选择，大多数MSC源性外泌体治疗在体外模型中以软骨细胞为目标。这些MSCs可以来自各种组织，如骨髓、滑膜、牙龈和髌下脂肪垫（IPFPs）。 一些关注软骨生成的研究特别关注miRNA的作用。吴等人发现IPFP MSC源性外泌体通过miR100-5p调节的mTOR-自噬途径抑制来保护关节软骨免受损害，并改善OA小鼠的步态异常。由于在临床上通过关节镜手术容易从OA患者中检索到人类IPFP，这种类型的外泌体治疗可能会简化和加速从实验室到床边的过程。刘等人发现MSC源性外泌体可以通过lncRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1轴促进软骨细胞的增殖并抑制其凋亡。孔等人进行的细胞工作表明，滑膜MSC源性外泌体miR-320c可以通过靶向ADAM19增强软骨生成。此外，毛等人建议，来自软骨生成MSCs的外泌体miR-92a-3p可以通过靶向Wnt5a增强软骨生成并抑制软骨降解。82 与这些使用原始外泌体的研究相比，很少有小组在系统给药前对外泌体进行了修改。陶等人通过转染滑膜MSCs与miR-140-5p修改外泌体，发现外泌体miR-140-5p过表达可以增强软骨组织再生并防止大鼠模型中的膝关节OA。同时，王等人使用TGF-β1刺激MSCs，由此产生的外泌体miR-135b通过调节特异性蛋白-1增加了软骨细胞的增殖。在一项比较研究中，朱等人证明了来自iPSC衍生的MSCs的外泌体比滑膜MSC衍生的外泌体对OA的治疗效果更强。 其他研究不仅关注软骨形成，还关注在骨关节炎(OA)治疗中的抗炎和免疫调节作用。例如，间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体在体外抑制了炎症因子、与谷氨酰胺代谢活性相关的蛋白、谷氨酰胺以及GSH/GSSG比例，同时在体内改善了小鼠的软骨细胞功能、组织炎症和运动能力，从而缓解了OA的进展。使用整体方法，近期研究已将注意力从软骨转移到其他组织（例如，骨骼）在关节中。首先，骨髓MSC衍生的外泌体miR-206促进了OA中成骨细胞的增殖和成骨分化，通过减少E74样因子3(Elf 3)，改善了炎症，并增加了小鼠股骨组织中骨钙素和BMP2的表达。其次，MSC外泌体处理的骨软骨缺陷表现出再生免疫表型，特征是CD163+ M2型巨噬细胞的浸润高于CD86+ M1型巨噬细胞，并伴随着促炎滑膜细胞因子IL-1β和TNF-α的减少。最后，牙龈MSC衍生的外泌体在预防胶原诱导的关节炎方面被证明具有免疫抑制作用。与亲代细胞相比，这些外泌体在抑制IL-17A和促进IL-10、降低关节炎的发病率和骨侵蚀方面具有相同或更强的效果，通过抑制IL-17RA-Act1-TRAF6-NF-κB信号通路。 目前，没有单一的“一刀切”药物可能适合所有OA患者。改变疾病的OA药物(DMOADs)可能成为下一代OA治疗。MSC衍生的外泌体治疗OA与DMOADs相吻合非常有价值和相关：两者都能靶向炎症细胞因子、基质降解酶和Wnt通路。因此，DMOADs开发中的新兴方法，如基于miRNA的模式和靶向细胞衰老，也可能被用来完善基于MSC的外泌体治疗OA。 3.3.脊髓损伤 创伤性脊髓损伤(SCI)是一个毁灭性的全球健康问题，对患者和社会都造成了重大的功能和经济负担。SCI的病理生理学包括由机械创伤引起的原发性损伤和以凋亡、水肿、缺血、炎症细胞浸润和兴奋毒性为特征的继发性损伤级联。尽管进行了外科干预，涉及药物治疗的临床研究可以被广泛分类为神经保护性或神经再生性。针对上述机制链的每个事件，MSC和NSC衍生的外泌体治疗都能对脊髓保护和再生产生有益影响。 一些研究小组已经针对神经细胞死亡。Ma等人。揭示了胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激的NSC衍生的外泌体可以通过miR-219a-2-3p/YY1途径抑制神经细胞凋亡，同时促进SCI后的功能恢复。另外，Zhang等人。发现蛛网膜下腔注射NSC衍生的外泌体可以通过激活自噬来抑制神经细胞凋亡，通过miR-374-5p/STK-4轴增强SCI后的功能恢复。Shao等人。使用MSC衍生的外泌体探索了其他形式的细胞死亡（例如，铁死亡），发现外泌体lncGm36569可以通过miR-5627-5p/FSP1轴抑制神经细胞铁死亡，从而减少神经功能障碍。 一些研究小组已经针对抗炎和免疫调节。Nakazaki等人。发现分数静脉注射MSC衍生的外泌体可以靶向M2型巨噬细胞并上调TGF-β，从而稳定微血管并改善功能恢复。类似地，Liu等人。证明除了缺氧增加骨髓MSCs中外泌体的产生外，预处理的外泌体miR-216a-5p也可以通过TLR4/NF-κB/PI3K/Akt途径调节小胶质细胞M1/M2极化，修复创伤性SCI。Huang等人。有价值地证明了硬膜外脂肪MSC衍生的外泌体可以减轻NLRP3炎症体并改善SCI后的功能恢复。与MSC衍生的外泌体相比，内皮祖细胞(EPC)衍生的外泌体可以提供相当的抗炎效果。Yuan等人。显示EPCs的外泌体miR-222-3p可以通过SOC3/JAK2/STAT3途径促进抗炎巨噬细胞，并改善SCI后小鼠的功能修复。 一些研究小组已经针对血管生成和血-脊髓屏障(BSCB)完整性。例如，Zhong等人。使用未修饰的NSC衍生的外泌体，发现它们富含VEGF-A，因此可以增强脊髓微血管内皮细胞(SCMECs)的血管生成活性。相比之下，Chen等人。用FTY720修饰NSC衍生的外泌体，FTY720是一种免疫调节剂和微血管调节剂，通过PTEN/Akt途径保护SCMECs的屏障功能，从而改善后肢功能。众所周知，脊髓微血管内皮与周细胞之间的连接对于维持BSCB的结构完整性至关重要。因此，Zhou的团队试图验证外泌体治疗在周细胞稳态中的作用。他们证明骨髓MSC衍生的外泌体可以减少体外周细胞焦亡并增加周细胞存活率，同时改善BSCB完整性和运动功能恢复。 最后，一些研究小组在神经保护和神经再生期间针对其他方面，如神经毒性星形胶质细胞和内源性NSC的可持续性。Lai等人。证明人脐带MSC衍生的外泌体可以通过靶向神经毒性星形胶质细胞来促进脊髓功能的恢复。此外，miR-146a-5p修饰的外泌体比未修饰的外泌体具有更强的效果。Li等人。发现从神经生长因子(NGF)过表达的骨髓MSCs衍生的外泌体可以增强NSCs的神经元分化和轴突再生。Zhou等人。证明胎盘MSC衍生的外泌体可以促进增殖内源性NSCs的激活，从而改善运动活性和膀胱功能障碍，这是一个可能进一步恶化SCI患者生活质量的常见后遗症。 3.4.肌肉和肌腱撕裂 肌肉和肌腱撕裂可能是由急性创伤（例如，骨折，第3.1节）或慢性过度使用（例如，运动损伤）引起的。肌肉拉伤和肌腱撕裂的愈合遵循典型的伤口愈合过程，涉及炎症、增殖和重塑阶段。包括基于细胞和基于生长因子的治疗在内的多种非外科策略已被试验以改善愈合。以下概念验证研究表明，MSC衍生的外泌体可能成为下一代肌肉骨骼治疗。 一方面，一些研究小组专注于肌肉-肌腱-骨单元的各个组成部分。Nakamura等人。声称MSC衍生的外泌体可以改善C2C12肌细胞的体外肌生成和HUVECs中的血管生成，同时加速体内骨骼肌再生在心脏毒素诱导的肌肉损伤模型中。这些好处至少部分是通过miRNAs如miR-494介导的。Chen等人。发现脂肪MSCs的外泌体可以增强原代腱细胞的增殖和迁移，同时通过上调装饰蛋白和小胶原在兔子跟腱断裂模型中改善修复肌腱的机械强度。 另一方面，一些研究小组将肌肉-肌腱-骨单元视为一个单一的功能系统，并使用肩袖撕裂作为疾病模型，这是患者寻求治疗的最常见肩部疾病。一组研究人员发表了两项连续的研究，使用脂肪MSC衍生的外泌体。在大鼠大量肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止肌肉的萎缩、炎症和血管化。在兔子慢性肩袖撕裂模型中，外泌体治疗可以防止脂肪浸润并改善生物力学特性。另一组报告说，骨髓MSC衍生的外泌体可以增加肩袖重建后的断裂负荷和刚度，诱导肩袖端点周围的血管生成，并促进腱-骨界面的生长。 3.5.其他骨科疾病 骨质疏松症是一种代谢性骨病，其特征是骨密度低和骨结构弱化，增加了骨折的风险。它是由破骨细胞骨吸收过度补偿成骨细胞骨形成引起的。在一项细胞研究中，脂肪MSC衍生的外泌体可以拮抗缺氧/血清剥夺诱导的骨细胞凋亡和骨细胞介导的成骨细胞生成。进一步的动物研究揭示了脐带MSC衍生的外泌体可以通过miR-1263/Mob1/Hippo途径抑制骨髓MSC凋亡并预防废用性骨质疏松症，并通过miR-2110和miR-328-3p改善胫骨密度和逆转雌激素缺乏性骨质疏松症。 与脊髓损伤(SCI)相比，周围神经损伤（例如坐骨神经损伤）更为常见。随后的神经再生受到神经元和施万细胞之间相互作用的控制，并因炎症细胞浸润而变得更加复杂。研究表明，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过增加体外神经突起生长和体内轴突再生以及步行行为来靶向神经元。脂肪MSC衍生的外泌体可以通过促进施万细胞的增殖、迁移和神经营养因子的分泌来靶向施万细胞，在体外促进神经营养因子的分泌，并在体内恢复去神经肌肉萎缩。LPS预处理的MSC衍生外泌体可以通过增强体外M2型巨噬细胞极化来靶向炎症细胞，并加速体内周围神经再生。 腰椎间盘退变(IVD)是导致下背痛的主要原因，这是导致全球残疾寿命年数最多的伤害。其分子过程包括细胞外基质(ECM)退化、炎症、氧化应激、凋亡、衰老和自噬减少。外泌体治疗的新途径试图解决这些问题。Cheng等人证明，骨髓MSC衍生的外泌体通过外泌体miR-21抑制髓核细胞(NPC)凋亡，缓解IVD退变。另一方面，Chen等人发现，人类ESC衍生的外泌体可以通过传递miR-302c抑制NLRP3炎症体，从而减轻髓核细胞的焦亡。除了细胞死亡和线粒体损伤外，NPC中的氧化应激也被MSC衍生的外泌体抑制。由于IVD退变和OA共享常见的分子疾病谱，使用MSC衍生外泌体治疗OA（第3.2节）的积极结果可以作为IVD退变研究的参考。 股骨头坏死（ONFH），也称为缺血性坏死，是一种影响年轻人群的致残性疾病，通常导致全髋关节置换。糖皮质激素(GC)诱导的骨坏死是ONFH最常见的原因之一，其发病机制表现在两个方面：股骨头的血液供应受损和成骨活性减弱。刘等人表明，iPSC衍生的MSCs的外泌体可以通过PI3K/Akt途径促进血管生成和成骨来预防GC诱导的ONFH。Zuo等人证明，过表达miR-26a的外泌体衍生自HSCs，可以提供类似的治疗效果。 4.神经外科和SC-EXO治疗 4.1.缺血性中风 中风是全球死亡第二大原因，也是导致残疾的第三大原因，其中缺血性中风是最常见的亚型。缺血性级联反应中的关键事件包括神经元功能障碍、兴奋毒性、神经化学损伤和神经炎症。在治疗方面，新一代的临床试验正在进行中，使用细胞保护药物，如免疫调节剂、IL-6受体拮抗剂、Rho激酶抑制剂和自由基清除剂。针对上述病理生理学的每个事件，几乎所有亚型的SC-exo都显示出对中风恢复的强效治疗效果（表3）。 一些研究小组已经针对神经保护和神经发生。首先，SC-exo治疗可以抑制神经细胞死亡。Luo等人发现，NSC衍生的外泌体可以抑制凋亡，同时在正常和缺氧糖剥夺（OGD）条件下促进SH-SY5Y细胞的增殖。这在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中也得到了测试，表现为减少的梗死面积和神经细胞凋亡，通过外泌体miR-150-3p。其他体外和体内研究表明，使用EPC衍生的外泌体具有类似的抗凋亡效应。Zhang等人发现，通过用干扰素γ（IFN-γ）预处理亲代NSCs，可以提高外泌体的抗凋亡效应。其次，SC-exo治疗可以保护中枢神经系统的细胞。Kang等人揭示，来自骨髓MSCs的外泌体可以通过抑制NLRP3炎症体介导的焦亡来挽救OGD诱导的神经细胞损伤。来自缺氧培养的外泌体比正常培养的外泌体具有更显著的神经保护效应。同样，Li等人发现，来自人类iPSC衍生的神经祖细胞的外泌体对OGD神经元和神经突起生长具有神经保护作用。在缺血条件下保护神经功能是通过PTEN/Akt途径调节的。此外，Sun等人证明，NSC衍生的外泌体也可以保护星形胶质细胞，这些细胞在中风后变成支持反应性星形胶质细胞（RAs）。第三，SC-exo治疗可以改善中风后的神经发生。Wei等人表明，来自骨髓MSCs的外泌体中的Zeb2/Axin2可以改善中风后的神经发生、神经可塑性和空间记忆以及神经功能，可能通过SOX10、Wnt/β-catenin和内皮素-3/EDNRB途径。Wang等人说明，修饰miR-126的EPC衍生的外泌体可以通过增强神经发生来缓解急性脑损伤并促进中风后的功能恢复。 一些研究小组已经针对抑制神经炎症。首先，未修饰的SC-exo治疗通过外泌体miRNAs显示出抗炎效应。Dong等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以在体外诱导BV2小胶质细胞失活和M2极化，同时通过传递miR-23a-3p减少体内梗死大小并改善神经功能。类似地，Zhang等人揭示，脐带MSC衍生的外泌体miR-146a-5p可以减轻体外OGD后小胶质细胞介导的神经炎症，同时通过IRAK1/TRAF6信号通路改善体内行为缺陷和小胶质细胞激活。其次，通过修饰外泌体可以增强SC-exo治疗的抗炎效应。Yoon和同事建立了过表达肿瘤易感性基因（TSG）101的人类NSCs，从而增加外泌体分泌。工程化外泌体不仅在体外减轻了LDH释放和促炎因子，而且在体内减少了梗死体积，抑制了DNA损伤途径，并上调了神经营养因子。此外，Tian的团队通过巧妙地将RGD肽附着在NSC衍生的外泌体膜上，开辟了新的领域，该外泌体在静脉给药后靶向缺血性大脑的损伤区域，从而通过抑制MAPK途径抑制脑缺血后的炎症反应。有趣的是，Gao等人使用从小鼠成纤维细胞重编程的诱导NSCs（iNSCs）进行中风治疗。他们表明，iNSC衍生的外泌体与NSC衍生的外泌体具有相似的治疗效应，不仅可以促进神经发生，还可以抑制神经炎症。 最后，一些研究小组在中风恢复期间针对其他方面，如神经化学损伤和氧化应激。Zhu等人将脑源性神经营养因子（BDNF）装载到NSC衍生的外泌体中，构建工程化外泌体。在H2O2诱导的氧化应激模型中，外泌体治疗显著增强了NSC的存活。在大鼠MCAO模型中，外泌体治疗不仅抑制了小胶质细胞激活，还促进了内源性NSCs向神经元的分化。总的来说，基于BDNF的NSC衍生外泌体的修饰在治疗缺血性中风中提高了效果。另一方面，修饰miR-210的EPC衍生外泌体可以保护神经元免受缺氧和再氧化（H/R）诱导的凋亡、氧化应激和活力下降，从而支持缺血性中风的治疗。来自富含ACE2的EPC衍生外泌体的miR-17-5p可以改善老年小鼠的脑缺血损伤。在Xu和同事进行的一项有趣的研究中，NSC-exo和EPC-exo的组合，通过BDNF-TrkB和Nox2/ROS途径保护H/R损伤的神经元，通过miR-210和miR-123过表达对缺血性中风发挥更好的治疗效果。 与缺血性中风相比，出血性中风对大多数幸存者构成了更致命的威胁和更严重的残疾。miR-137过表达被发现可以增强EPC衍生外泌体对氧血红蛋白处理的SH-SY5Y细胞（一种体外出血性中风模型）中凋亡、铁死亡和线粒体功能障碍的神经保护效应，部分通过COX2/PGE2途径实现。 4.2.创伤性脑损伤 全球每年大约有7000万患者遭受创伤性脑损伤（TBI），这构成了严重的身体、心理社会和经济威胁。TBI可以分为原发性损伤（例如，轴突死亡、神经炎症、神经化学变化和代谢功能障碍）和继发性损伤（例如，缺血和缺氧损伤、脑水肿、颅内压增高、脑积水和感染）。每位TBI患者都有一套独特的情况，这取决于伤害的位置和严重程度等变量，使得医疗和外科治疗相当具有挑战性。因此，使用SC-exo的系统疗法可能成为管理TBI的“一刀切”选项。 一系列最初关注MSC衍生外泌体疗法功能恢复和宏观方面的动物研究发表。在大鼠TBI模型中，接受外泌体治疗的动物在空间学习和感觉运动功能方面显示出显著改善。此外，外泌体治疗显著增加了病变边界区域新生内皮细胞的数量，以及齿状回中的新生未成熟和成熟神经元。在另一个具有类似发现的大鼠TBI模型中，从3D系统中培养的MSC衍生的外泌体比传统2D条件下的外泌体提供了更好的结果。在对主要运动皮层进行TBI的猴子模型中，接受外泌体治疗的动物在恢复的前3-5周内恢复到术前的抓握模式和获取食物奖励的潜伏期。在一个更复杂且临床上更现实的大动物模型中，研究了TBI和出血性休克，外泌体疗法减轻了神经损伤的严重程度并加快了神经恢复。 相比之下，近年来完成的研究为SC-exo疗法对TBI的分子机制提供了新的见解。Chen等人报告称，脂肪MSC衍生的外泌体可以通过特别被微胶质细胞摄取并抑制它们的激活来促进功能恢复、抑制神经炎症、减少神经元凋亡和增加神经发生，通过抑制NF-κB & MAPK途径实现。Wen等人表明，骨髓MSC衍生的外泌体可以减少TBI小鼠模型的皮层组织中细胞凋亡，抑制神经炎症，并促进微胶质细胞向抗炎表型的转变。这是通过miR-181b对IL-10/STAT3途径的作用实现的。Abedi等人证明，NSC衍生的外泌体可以改善神经行为表现，抑制星形胶质细胞神经炎症，增强神经发生，同时保持NSC干性。一个有价值的额外发现是，与亲本NSC相比，外泌体在感觉运动功能恢复方面似乎更优越。最后，剂量反应和治疗窗口表明，MSC衍生的外泌体可以改善血管生成和神经发生，以及感觉运动和认知功能，同时减少神经炎症和海马神经元细胞丢失。尽管100 µg和1天可能是最佳剂量和治疗窗口，但外泌体在至少7天伤后的治疗窗口内对TBI治疗显示出广泛的有效剂量范围。 TBI和SCI是两种最严重的CNS创伤，日益被认为是全球健康优先事项。第3.3节和4.2节中提出的新兴证据对这两个密切相关的研究子专业是相互有益的。因此，未来对TBI和SCI的SC-exo疗法的研究可以是机制基础的（例如，脑肠轴转录因子炎症体和补体系统的作用）或基于修饰的（用药物装载外泌体，例如，免疫调节剂抗氧化剂循环RNA和microRNAs）。 4.3.阿尔茨海默病 与TBI和SCI不同，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是最常见的神经退行性疾病（NDD）。NDD的标志包括但不限于，病理性蛋白聚集，突触和神经网络功能障碍，异常蛋白质稳态，细胞骨架异常，能量稳态改变，DNA和RNA缺陷，炎症和神经元细胞死亡。AD是全球最常见的痴呆形式，占2500万例。目前，只有两类药物被批准用于症状性AD治疗，包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA拮抗剂。尽管有几种疗法正在积极进行临床试验，但它们都远未治愈AD。大脑-药物输送的挑战，例如，血脑屏障（BBB）和药代动力学缺点，很可能被纳米大小的外泌体解决，这些外泌体还包装有强大的生物分子。大多数SC-exo疗法涉及淀粉样β（Aβ），它位于AD病理生理学的中心。 最初的工作集中在清除病理性蛋白Aβ肽的聚集。Elia及其同事通过脑内注射MSC衍生的外泌体，在AD的临床前模型的早期阶段减少了皮质和海马中的Aβ斑块负担和营养不良的神经突起。此外，作者使用免疫印迹确认了Neprilysin的存在，Neprilysin是一种能够降解Aβ的中性内肽酶，存在于外泌体的裂解物中及其mRNA中。 一些团队专注于缓解突触功能障碍和氧化应激。Wang等人发现，MSC衍生的外泌体可以挽救突触损伤并改善APP/PS1小鼠的认知行为，同时减轻外源性Aβ诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达。与使用MSC衍生的外泌体不同，Li等人给予NSC衍生的外泌体并增强线粒体功能，激活sirtuin 1，突触活动，并挽救认知缺陷。Huber等人注意到，热休克诱导的NSC衍生的外泌体表现出更大的神经保护作用，对抗氧化应激以及Aβ诱导的神经毒性。 一些团队将研究重点放在能量稳态上。Chen等人发现，MSC衍生的外泌体可以改善AD转基因小鼠的大脑葡萄糖代谢和认知功能，分别使用18F-FDG PET/CT成像和NOR测试。 一些团队专注于小胶质细胞神经炎症。在Zavatti的细胞研究中，发现羊水MSC衍生的外泌体可以减轻神经炎症小胶质细胞表型并从Aβ中恢复神经毒性，使用LPS刺激的BV2小胶质细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞作为模型。Ding等人表明，脐带MSC衍生的外泌体可以通过调节小胶质细胞激活来减轻神经炎症和减少Aβ沉积，从而增加AD小鼠的空间学习和记忆功能。 一些团队专注于神经元细胞死亡和神经发生，希望抵消AD的进展。Reza-Zaldivar及其同事给予AD小鼠MSC衍生的外泌体，SC-exo疗法刺激了侧脑室区的神经发生并减轻了Aβ诱导的认知障碍。这些效果与MSC中显示的效果相当。 一些团队专注于血脑屏障（BBB），其功能障碍导致通透性增加、微出血、葡萄糖运输受损以及周细胞和内皮细胞退化。刘等人指出，5xFAD（家族性阿尔茨海默病）小鼠在4个月大时BBB破裂，更重要的是，用NSC衍生的外泌体治疗逆转了AD引起的BBB缺陷。 最后，一些团队专注于提高AD的SC-exo疗法的技术性。当外泌体被静脉注射时，它们可以在大脑以外的其他器官中被追踪，而不是目标区域。崔等人将MSC衍生的外泌体与CNS特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）结合，以靶向转基因AD小鼠的大脑。修改后的外泌体不仅显示出增加的皮层和海马体输送，而且还显著改善了学习能力和记忆能力，同时减少了Aβ沉积。另一方面，高等人通过体细胞重编程获得了iNSC，为治疗性外泌体的来源开辟了新窗口。他们证明，与NSC衍生的外泌体具有相似治疗效果的iNSC衍生外泌体，可以减轻各种AD表型，例如，认知功能、Aβ沉积、神经炎症和神经再生，在临床前小鼠模型中。 4.4.帕金森病 帕金森病是老年人中第二常见的神经退行性疾病，全球影响超过600万患者。PD是由黑质多巴胺能神经元坏死和名为Lewy体的蛋白质包涵体存在引起的。分子病理生理学包括α-突触核蛋白蛋白质稳态、线粒体功能障碍、氧化应激、钙失衡和神经炎症。 在一项使用骨髓MSC衍生外泌体的研究中，黄等人发现，外泌体衍生的肿瘤坏死因子刺激基因-6（TSG-6）可以减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+，神经毒素MPTP的代谢产物）诱导的神经毒性。在这个使用SH-SY5Y和SK-N-SH细胞的体外PD模型中，外泌体抗PD进展效应被发现是通过STAT3/miR-7/NEDD4轴介导的。 在一项使用NSC衍生外泌体的研究中，李等人揭示了SC-exo疗法可以帮助预防PD的神经病理学和进展。在体外对SH-SY5Y和BV2细胞工作时，NSC衍生的外泌体可以减少细胞内活性氧（ROS）和相关的凋亡途径。在体内对6-羟多巴胺诱导的PD小鼠工作时，NSC衍生的外泌体可以下调促炎因子并显著减少多巴胺能神经元丢失。确认了NSC特异性microRNAs的存在，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-9和let-7，并发现它们参与细胞分化、神经营养功能和免疫调节。 4.5.多发性硬化症 多发性硬化症（MS）是最常见的非创伤性、神经退行性和致残性CNS疾病，影响年轻成人。MS的病理标志是大脑和脊髓中脱髓鞘病变的形成，伴有炎症和自身免疫参与。目前批准的疾病修饰疗法包括基于干扰素的、免疫调节的、免疫抑制的和免疫重建药物。一些初步研究强调了MSC衍生外泌体对MS治疗的潜力。 在一项使用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠的动物实验中，李等人表明SC-exo疗法显著降低了神经行为评分，减少了炎症细胞渗入CNS，并减少了脱髓鞘。此外，外泌体治疗通过调节小胶质细胞的极化，上调M2相关细胞因子，同时下调M1相关细胞因子。 在一项使用两种脱髓鞘小鼠模型（EAE模型和铜饮食模型）的动物研究中，张等人发现SC-exo疗法可以通过直接作用于少突胶质细胞（OL）前体和间接作用于小胶质细胞来促进再髓鞘化。MSC衍生的外泌体可以改善神经系统结果，增加新生成和成熟的OL数量，减少Aβ前体蛋白密度，通过从M1转变为M2表型减少神经炎症，并抑制TLR2/IRAK1/NF-κB途径。 4.6.其他神经外科和相关疾病 上述已经详细讨论了MSC和NSC衍生外泌体疗法在四种主要类型的神经外科或神经系统疾病中的外科潜力。除了血管破裂、创伤、神经退行性和自身免疫相关疾病外，最近证明其他疾病也适合SC-exo疗法（表3）。这些包括但不限于：1，痴呆症，如血管性痴呆。HIV相关的神经认知障碍和辐射诱导的认知功能障碍；2，功能障碍，如癫痫和机械性痛觉过敏；3，先天性异常，如开放性脊柱裂；4，神经心理状况，如抑郁和压力；5，大脑衰老；6，医源性大脑问题，如深度低温循环停止。 5.整形外科和SC-EXO疗法 人体所有部位都发生伤口愈合，其中皮肤伤口最为常见。伤口相关费用最高的是外科伤口，其次是糖尿病溃疡。伤口愈合的总体但重叠阶段包括止血、炎症、血管生成、增殖和重塑，每个阶段由不同的细胞类型控制，并由各种信号通路调节。超过一半的相关使用SC-exo疗法促进皮肤伤口愈合的工作是基于MSC的（表4）。 在炎症阶段，外泌体能够抑制外周血单个核细胞的增殖，并在体外促进调节性T细胞的转化，减少皮肤中淋巴细胞的浸润。此外，外泌体能够减少IgE、嗜酸性粒细胞和肥大细胞的数量，并下调炎症细胞因子。在血管生成阶段，受过教育的外泌体（例如，阿托伐他汀和去铁酮）能够通过Akt/eNOS和PTEN/PI3K/Akt途径促进糖尿病伤口的血管生成。内皮祖细胞衍生的外泌体能够通过Erk1/2途径和p53途径加速皮肤伤口愈合。在增殖阶段，干细胞衍生的外泌体能够促进成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移。一些是通过PI3K/Akt、Akt/HIF-1α、ERK1/2和Wnt/β-catenin途径实现的，而另一些则是通过抑制LATS2、PPARγ和AIF核转位实现的。在伤口愈合的最后重塑阶段，肉芽组织被永久性瘢痕所取代，异常的伤口愈合可能会发生（例如，瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕）。间充质干细胞衍生的外泌体能够通过TGF-β/Smad2途径抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化，并在早期增加胶原蛋白合成，在晚期减少，从而减少瘢痕形成。此外，胚胎干细胞衍生的外泌体被发现对伤口愈合具有与间充质干细胞衍生的外泌体相似的治疗作用。陈等人使用人类胚胎干细胞衍生的外泌体帮助治疗压力性溃疡。他们注意到外泌体能够通过激活Nrf2改善内皮细胞衰老，并恢复与衰老相关的血管生成功能障碍，从而加速伤口愈合。此外，Bae等人揭示了来自胚胎干细胞的外泌体mmu-miR-291a-3p能够通过TGF-β受体2途径抑制人皮肤成纤维细胞的细胞衰老，从而加速切除性皮肤伤口愈合过程。除了伤口愈合，其他与整形外科相关的疾病已被证明适合SC-exo治疗（表4）。这些包括但不限于：1，皮肤移植，如皮瓣；2，组织丢失，如颅面缺陷；3，自身免疫性皮肤病，如硬皮病；4，皮肤感染，如利什曼病；5，毛发移植，如治疗脱发；6，皮肤老化。 6.普通外科和SC-exo治疗 作为普通外科的一个主要亚专业，肝胆外科对SC-exo治疗引起了极大的关注。首先，急性肝损伤（ALI）/急性肝衰竭（ALF）是一种罕见但具有挑战性的综合征，表现为肝功能障碍、凝血病、脑病和多器官衰竭。大约60%的ALF病例需要并接受原位肝移植或导致死亡。在一项研究中，林的团队关注了ALI的细胞死亡方面，并发现间充质干细胞衍生的外泌体能够通过稳定SLC7A11对抗四氯化碳诱导的ALI中的铁死亡。或者，邵的团队关注了外泌体的预分离修饰，并揭示了来自脐带间充质干细胞的外泌体能够通过外泌体miR-455-3p改善IL-6诱导的ALI。其次，与ALI相比，肝纤维化发生在肝脏持续慢性损伤时，可能会发展成肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌甚至死亡。马等人发现间充质干细胞起源的外泌体circDIDO1能够通过miR-141-3p/PTEN/Akt途径在人肝纤维化中抑制肝星状细胞的激活。此外，王等人发现来自3D人类胚胎干细胞球体的外泌体能够通过外泌体miR-6766-3p的失活Smad途径减轻肝星状细胞的激活并抑制肝纤维化。对于那些需要肝移植的晚期肝纤维化患者，肝脏缺血再灌注损伤（IRI）是移植物功能障碍和器官排斥的严重并发症。杨等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体能够缓解肝IRI，减少肝细胞凋亡，并降低肝脏酶水平，通过增强自噬。杜等人表明，来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-1-磷酸途径保护肝脏免受肝IRI。第三，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）被知道对中风恢复产生不利影响。使用2型糖尿病小鼠模型，Venkat等人证明HSC衍生的外泌体能够同时减少肝功能障碍并改善神经和认知功能。最后，急性胰腺炎是一种不可预测且可能致命的疾病，其预后主要取决于是否发展成多器官功能障碍综合征。陈等人揭示了来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体能够通过Akt/Nrf2/HO-1途径改善严重急性胰腺炎引起的心肌损伤。外周动脉疾病影响全球2亿患者，在最严重的阶段，可能导致严重肢体缺血，使患者面临增加的心血管事件、截肢和死亡风险。作为一种无细胞治疗，胎盘间充质干细胞衍生的外泌体输注能够在小鼠耳缺血损伤模型中增强血管生成，使用激光多普勒血流分析。从机制上讲，间充质干细胞衍生的外泌体不仅促进体外管状结构的形成，而且动员内皮细胞进入皮下Matrigel栓塞体内，主要通过外泌体促血管生成的微小RNA，如miR-30b。此外，HSC衍生的外泌体能够通过改善肢体灌注、毛细血管密度、运动功能及其截肢来修复小鼠的缺血后肢。这很可能是由于内皮细胞相对于平滑肌细胞和成纤维细胞的外泌体miR-126-3p的内化。人类iPSC衍生的外泌体通过外泌体miR-199b-5p展示了类似的新生血管生成效应。另一方面，腔内再通越来越多地被用来重建血流到缺血区域，并恢复外周动脉疾病患者的组织丢失或坏疽。三个独立的团队都证明了EPC衍生的外泌体能够通过增强内皮细胞功能促进血管修复并加速大鼠球囊诱导的血管损伤模型中的再内皮化。此外，Kong等人通过抑制新内膜增生展示了EPC衍生的外泌体对球囊损伤的类似保护效果。这是通过促进再内皮化和抑制再狭窄而不是通过直接抑制平滑肌细胞的增殖和迁移来实现的。 McCulloh及其同事发表了一项关于坏死性小肠结肠炎（NEC）的SC-exo治疗的有趣研究，该研究对需要手术的早产儿的总体死亡率超过30%。作者比较了四种不同类型的干细胞衍生的外泌体的治疗效应，即羊水间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、羊水神经干细胞和新生儿肠神经干细胞。当以至少4×10^8的浓度注射时，所有类型的SC-exo都被证明能够像它们的亲本干细胞一样有效地减少实验性NEC的发生率和严重程度。 败血症是普通外科中致命且可能可以预防的并发症，其中微血管功能障碍导致多器官衰竭和死亡。使用通过盲肠结扎和穿刺（CLP）的小鼠败血症模型，周等人证明EPC衍生的外泌体能够改善败血症结果。这表现为减少肺和肾脏血管渗漏，改善器官功能，并增加通过外泌体miR-126-5p和miR-126-3p的生存率。同样，刘等人通过外泌体miR-382-3p通过IκBα/NF-κB途径展示了EPC衍生的外泌体对败血症诱导的器官损伤和免疫抑制的保护作用。 7.心脏外科和SC-EXO治疗 全球主要死因是缺血性心脏病（IHD），主要由阻塞性冠状动脉粥样硬化引起。动脉粥样硬化斑块的破裂是急性动脉血栓形成导致心肌梗死（MI）最常见的触发因素。心肌长期缺氧可导致心肌细胞死亡。尽管及时的再灌注至关重要，但可能发生心肌IRI，从而减轻再灌注的有益效果。尽管现代冠状动脉再灌注，与急性MI导致的心力衰竭发展相关的死亡率和发病率仍然很高，这突出了下一代心脏保护治疗的重要性，如SC-exo。 邢等人进行的工作关注动脉粥样硬化。脂肪来源的间充质干细胞衍生的外泌体miR-342-5p被证明可以通过靶向H2O2挑战的HUVEC模型中的PPP1R12B来保护内皮细胞免受动脉粥样硬化的影响。彭等人和高等人进行的工作关注MI。来自间充质干细胞的外泌体miR-25-3p能够通过靶向促凋亡蛋白和EZH2来缓解MI，在OGD心肌细胞模型和左前降支结扎动物模型中。类似地，人类iPSC衍生的外泌体可以在不增加心律失常并发症的频率的情况下改善MI的恢复，在猪模型中。温等人和桑索等人进行的工作关注心肌细胞的死亡。间充质干细胞衍生的外泌体可以通过miR-144靶向PTEN/Akt途径在缺氧条件下改善心肌细胞凋亡，而iPSC衍生的外泌体可以调节缺氧心肌细胞中的自噬。卡苏尔等人和陈等人关注心肌IRI。前者发现来自非心肌细胞相关细胞的外泌体，即CTX0E03 NSCs，可以通过JAK/STAT途径减少梗死面积，同时延迟心肌细胞线粒体通透性转换孔的开启。后者发现间充质干细胞衍生的外泌体miR-143-3p可以通过CHK2-Beclin2途径调节自噬来抑制心肌IRI。最后，陈等人证明骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以减轻压力过载诱导的重构中的心肌肥大和纤维化，从而为心力衰竭提供了有希望的潜在治疗。 与间充质干细胞衍生的外泌体相比，来自胚胎干细胞的外泌体对心脏状况显示出相似的治疗效果。在保护心肌细胞方面，Khan等人发现胚胎干细胞衍生的外泌体miR-294可以改善心肌细胞存活，促进新生血管形成并抑制MI后的纤维化，从而增强MI后心脏功能。此外，Tavakoli Dargagni等人证明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过抑制TLR4-NLRP3介导的焦亡细胞死亡来减轻阿霉素诱导的心脏毒性。类似地，Singla团队表明胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过增强抗炎M2型巨噬细胞和减少炎症诱导的焦亡来改善心脏重构。在管理心力衰竭方面，Pang等人展示胚胎干细胞衍生的外泌体可以通过FGF2信号在主动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中减轻心力衰竭，改善心脏功能，并促进心肌血管生成。使用冠状动脉闭塞诱导的心力衰竭模型，Kervadec等人表明胚胎干细胞衍生的心血管前体分泌的外泌体可以恢复心脏功能，如减少左心室收缩末期和舒张末期容积。最后，同一研究小组后来证明，来自更易获得的细胞来源的外泌体，例如iPSCs，能够提供与胚胎干细胞衍生的外泌体相似的心脏保护效果。 其他重要的SC-Exo亚型，如iPSC-exo、HSC-exo和EPC-exo，也显示出心脏保护效果。例如，iPSC分泌的外泌体可以发挥细胞保护作用，维持细胞内Ca2+稳态并促进心肌细胞存活，从而改善MI的恢复。HSC-exo可以减少心脏损伤相关指标和心脏纤维化程度，同时提高心力衰竭动物模型的射血分数。此外，HSC衍生的外泌体的全身输注可以改善急性MI大鼠模型中的缺血性心肌病，同时在治疗副作用如肾脏损伤方面也有额外的好处。使用声波刺猬蛋白（Shh），一种血管生成因子，通过将外泌体Shh传递到缺血心肌，可以保持急性MI后的心脏功能。Ke等人证明EPC衍生的外泌体可以通过激活间充质-内皮转化和降低HMGB1的表达来增强心脏成纤维细胞的增殖和血管生成，后来发现EPC衍生的外泌体中的外泌体miR-218-5p和miR-363-3p可以通过靶向p53/JMY途径改善MI。在Yue等人的一项有趣的研究中，发现IL-10缺乏引起的全身炎症会通过在受体细胞中外泌体富集整合素相关激酶（ILK）和ILK介导的NF-κB途径的激活来损害EPC衍生的外泌体对心肌修复的修复特性。 在治疗胸部疾病方面，刘等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以减轻炎症，防止过量胶原沉积，并保持博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺部的肺泡结构。这是通过外泌体mi-17-5p靶向血栓蛋白-2实现的。同样，周等人证明iPSC衍生的外泌体中的外泌体miR-302a-3p可以通过TET1抑制M2型巨噬细胞，从而减轻肺纤维化。刘等人表明EPC衍生的外泌体可以通过调节Mitofusion-2和Ras-Raf-ERK1/2途径抑制肺动脉平滑肌细胞增殖及其对凋亡的抵抗力，从而作为治疗肺动脉高压的潜在治疗候选药物。两个独立团队都揭示了人类EPC衍生的外泌体可以通过将miR-126传递到受损肺泡来改善LPS诱导的急性肺损伤的结果。张等人发现EPC衍生的外泌体可以改善肺微血管内皮细胞的生物活性，并保护它们免受过氧化损伤，在发育中的肺血管中，从而有助于治疗支气管肺发育不良。此外，Montay-Gruel等人证明人类胚胎干细胞衍生的外泌体可以改善与暴露于肺部电离辐射相关的晚期正常组织并发症，如在肺癌术后治疗中遇到的。 8.泌尿科和SC-EXO治疗 慢性肾脏病（CKD）是一种以肾脏结构、功能或两者持续变化为特征的综合征，影响全球10-14%的人口。CKD最常见的病理特征和最终表现是某种形式的肾纤维化。当伤口愈合失调时会发生肾纤维化，导致过多的细胞外基质蛋白，如胶原和纤维连接蛋白的积累。在他们的研究中，刘等人发现骨髓间充质干细胞衍生的外泌体可以通过靶向NFAT5的外泌体miR381-3p来减轻血管钙化，这是CKD中发病率和死亡率的一个不利指标。这在透析患者的严重动脉钙化中得到了进一步验证。在替代研究中，几个小组证明了骨髓间充质干细胞衍生的外泌体在治疗肾纤维化方面的能力，每个都有不同的作用机制解释。在细胞研究中，尹等人发现外泌体可以通过运输Nedd4L来防止TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化，Nedd4L激活自噬。在5/6亚全肾切除大鼠模型中，刘等人揭示外泌体可以通过调节Smurf2/Smad7轴来改善肾功能并减少纤维化大小。在单侧输尿管梗阻诱导的间质纤维化小鼠模型中，陆等人证明外泌体可以通过激活EP2受体减少M1和M2型巨噬细胞的极化来改善肾纤维化。 急性肾损伤（AKI）和CKD紧密相连，每个都是发展为另一个的风险因素。肾脏IRI是AKI和急性肾衰竭的主要原因。Lim等人证明来自iPSC衍生的间充质干细胞的外泌体可以通过激活ERK1/2信号通路纠正AKI小鼠的血清肌酐水平、小管坏死、凋亡、炎症细胞因子产生和氧化应激。在张等人的类似工作中，发现EPCs的外泌体miR-21-5p可以通过抑制CLP大鼠中RUNX1的表达来减轻败血症诱导的AKI。 9.耳鼻喉头颈外科和SC-EXO治疗 听力损失是全球最常见的感觉缺陷，影响着近20%的全球人口。感音神经性听力损失（SNHL）的原因非常多样，如老年性耳聋、耳毒性药物诱导、噪声诱导和特发性突发性SNHL。Tsai团队证明，脐带间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体能够挽救顺铂诱导的听力损失中外毛细胞的丢失，并修复耳蜗损伤。耳蜗保护效应的潜在机制是通过miRNAs（例如miR-125a-5p和miR-125b-5p）和重塑因子（例如纤维连接蛋白和半乳糖结合蛋白-3）介导的。耳蜗缺血再灌注损伤（IRI）是特发性突发性和噪声诱导性SNHL的主要原因之一，可能导致感觉毛细胞和双极耳蜗螺旋神经节不可逆损伤。其病理生理学包括氧化应激、细胞过度死亡和炎症调节失调。Hao等人发现，过表达miR-21的神经干细胞（NSC）衍生的外泌体可以通过抑制小鼠耳蜗中的炎症过程来预防IRI引起的听力损失。这通过降低听觉脑干反应阈值、上调IL-10和下调TNF-α和IL-1β得到证实。甲状腺功能减退症是一种非常常见的疾病，可能由于甲状腺切除术或放射性消融治疗甲状腺功能亢进或甲状腺癌而发生。干细胞治疗和干细胞衍生的外泌体治疗已成为通过甲状腺再生治疗甲状腺功能减退症的有希望的管理方法。Degoserie等人使用体外甲状腺叶培养系统表明，EPC衍生的外泌体可以促进甲状腺细胞组织成甲状腺滤泡和腔扩张（即滤泡形成），这由层粘连蛋白-α1促进。颞下颌关节（TMJ）紊乱是影响31%成人和11%儿童的第二常见肌肉骨骼疾病。与其他滑膜关节一样，TMJ也容易受到骨关节炎（OA）的影响，共享常见的病理生理过程（第3.2节）。Zhang及其同事证明，MSC衍生的外泌体可以通过减轻免疫能力兔模型中的炎症和恢复基质稳态来缓解TMJ OA。外泌体介导的关节修复归因于腺苷激活Akt、ERK和AMPK信号传导，以及增强s-GAG合成。 10.眼科学和SC-EXO治疗 获得性视神经病变是成人失明的主要原因之一，有多种病因，如血管性、炎症性、创伤性、毒性、压迫性和营养性病因。视网膜神经节细胞（RGC）丢失是视神经病变的标志，通过多种细胞死亡途径发生。Mead和Tomarev发现，骨髓MSC衍生的外泌体可以在大鼠视神经压碎模型中促进RGC的生存和轴突再生。外泌体的神经保护和神经营养效应是通过外泌体miRNAs实现的，展示了无细胞潜力用于创伤性和退行性眼病。视网膜退行性疾病（例如，年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性）是全球导致双侧不可逆视力丧失的主要原因。其特征是光感受器、RGC或视网膜色素上皮（RPE）细胞的逐渐退化。Bian团队发现，NSC衍生的外泌体可以在RCS视网膜退化大鼠模型中保护光感受器、视觉功能和防止外核层变薄。这是通过外泌体靶向TNF-α、IL-1β和COX-2显著灭活小胶质细胞炎症实现的。在两项连续研究中，Gao团队表明，ESC衍生的外泌体可以通过增强视网膜Müller细胞的增殖和逆转分化来缓解视网膜退化，作为替代视网膜神经元前体。一方面，这是通过调节Müller细胞中外泌体HSP90的Oct4表达实现的。另一方面，通过向Müller细胞传递BDNF蛋白激活Wnt信号通路也发挥了重要作用。此外，使用遗传性视网膜退化大鼠模型，Park等人证明，无论是视网膜下还是玻璃体内注射人类HSC衍生的外泌体都可以提供退化视网膜的功能挽救。角膜缺陷愈合失败常常导致角膜盲，据报道是仅次于白内障的导致失明的主要原因。最严重和难以治疗的病例需要角膜移植。Wang等人比较了iPSC和MSC衍生的外泌体作为角膜上皮缺陷治疗的治疗提供者。发现这两种类型的外泌体都可以促进体外增殖、细胞周期进展和迁移，同时抑制凋亡，并加速体内角膜上皮缺陷愈合。更重要的是，iPSC衍生的外泌体比MSC衍生的外泌体具有更强的治疗效果。角膜移植是固体器官移植最成功的形式之一。然而，高达90%的高风险受者可能会发生移植物排斥。先天和适应性免疫是移植物失败的主要原因。免疫抑制药物仅显示出部分效果。Jia等人表明，MSC衍生的外泌体可以跨越生物屏障，并在角膜同种异体移植排斥的大鼠模型中延长移植物存活时间。这可能是通过抑制CD4+和CD25+ T细胞的浸润以及通过Th1信号通路减少IFN-γ和CXCL11实现的。 11.妇产科和SC-EXO治疗 原发性卵巢功能不全（POI）或早发性卵巢衰竭（POF）定义为40岁之前卵巢功能丧失。POI的非遗传因素包括自身免疫性疾病、代谢状况、感染和医源性程序（例如，化疗、放疗和手术）。POI女性遭受各种并发症，如骨质疏松症、不孕、心血管疾病和抑郁。尽管及时启动激素替代疗法对于控制这些症状和并发症至关重要，但它无法恢复卵巢功能。目前正在测试的实验性治疗方法包括线粒体激活、体外激活、干细胞治疗和外泌体治疗。Li等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在环磷酰胺（CTX）诱导的POI小鼠模型中改善卵巢功能。SC-exo治疗不仅恢复了与卵巢功能相关的激素水平和卵巢滤泡数量，还改善了POI小鼠的生殖能力。此外，外泌体通过调节Hippo途径促进卵巢颗粒细胞（GCs）的增殖，这种效应被YAP抑制剂中和。使用iPSC衍生的MSCs的外泌体也获得了类似的结果。Ding等人进行的工作表明，脐带MSC衍生的外泌体可以在POI小鼠模型中恢复卵巢表型和功能，促进CTX损伤的人类GCs和卵母细胞的增殖，并通过传递外泌体miR-17-5p和靶向其下游mRNA SIRT7来减轻ROS积累。进一步阐明miR-17-5p通过抑制SIRT7下调PARP1、γH2AX和XRCC6的表达。最后，Yang等人完成的工作揭示，骨髓MSC衍生的外泌体可以在化疗诱导的POF大鼠模型中恢复发情周期，增加基底和窦卵泡的数量，增加雌二醇E2和抗苗勒管激素水平，并降低卵泡刺激激素和黄体生成激素水平。从机制上讲，这是通过靶向PTEN的外泌体miR-114-5p实现的。 12.从外泌体治疗的临床前研究到临床试验 如第3至11节所讨论的许多临床前研究已证实，MSC衍生和NSC衍生的外泌体治疗许多疾病的优势，涵盖外科实践的亚专业。不仅限于干细胞衍生的外泌体，许多临床试验已证明外泌体的作用是双重的：生物标志物和治疗剂。在ClinicalTrials.gov上使用“外泌体治疗”、“外泌体治疗”和“外泌体”作为关键词进行搜索，产生了188条记录。然而，其中只有60（32%）直接涉及使用外泌体作为治疗剂的干预性研究（表5）。其余的，特别是与肿瘤学相关的试验，大多使用外泌体作为生物标志物，例如疾病发病机制中的关键角色（例如NCT04288141，NCT04154332），诊断标志物和治疗前的指导（例如NCT04629079，NCT03791073，NCT05451342，NCT03432806），监测指数和治疗效果的预测工具（例如NCT05427227，NCT04499794，NCT04852653，NCT05370105，NCT03800121，NCT05370105，NCT05328089），以及治疗后的预后指标（例如NCT06026735，NCT05705583，NCT05411445，NCT04167722，NCT05575622）。外泌体作为生物标志物的临床应用已在其他综述中广泛探讨328-332，因此不在本综述中讨论。就60项外泌体治疗临床试验的临床特征而言（表5），有几个亮点值得一提。 首先，所涵盖的疾病范围非常广泛，包括外科和内科疾病。这些包括第3至11节中讨论的许多外科疾病，如骨科疾病（NCT05060107中的膝关节骨关节炎、NCT04998058中的骨丢失和NCT04849429中的椎间盘退变）、神经外科疾病（NCT03384433中的缺血性中风和NCT04388982中的阿尔茨海默病）、整形外科疾病（NCT02565264和NCT05475418中的皮肤伤口愈合）、普通外科疾病（NCT05871463中的肝硬化）、心胸外科疾病（NCT05669144中的心肌梗死）和眼科疾病（NCT05413148中的视网膜色素变性）。换句话说，一些临床前研究尚未发展成为临床试验。这些包括但不限于，针对骨折、脊髓损伤、创伤性脑损伤、急性肝损伤和听力损失的外泌体治疗，这些可能成为未来外泌体治疗相关临床试验的方向。 其次，越来越多的临床试验关注两种医疗状况，即COVID-19（16项试验，占27%）和癌症（5项试验，占8%）。MSC衍生的外泌体可以通过修复作用和再生效应管理COVID-19中的病毒感染和肺损伤。前者表现为阻断病毒进入和复制，抑制细胞因子风暴，后者表现为预防炎症、液体清除和恢复肺通透性。此外，外泌体可以被设计成药物（例如，CD24，一种强大的免疫调节剂）传递平台，甚至疫苗来对抗COVID-19。与用于COVID-19管理的MSC衍生外泌体相比，用于癌症治疗的外泌体主要依赖非干细胞和货物工程。部分原因是MSC衍生的外泌体对肿瘤发生和转移表现出有争议的效应。尽管MSC衍生的外泌体与肿瘤细胞之间的确切相互作用仍有待讨论，但科学家们通过修改外泌体货物来传递抗癌核酸和抗癌药物，以及外泌体膜用于特定肿瘤靶向，克服了几个障碍。 最后，在用于疾病治疗的40项临床试验中，有38项（95%）使用MSC，2项（5%）使用iPSC作为外泌体的细胞来源。然而，这与第3至11节中讨论的临床前研究显著不同。NSC衍生外泌体在临床试验中使用不足，可能部分是因为其母细胞的供应限制。目前，NSC可以从三个来源获得：1、从初级CNS组织（例如成人和胎儿大脑）中分离；2、从多能干细胞（例如iPSC和ESC）分化而来；3、从体细胞（例如成纤维细胞和血细胞）重编程为iNSC。最近的研究开发了成纤维细胞衍生的iNSC，为从NSC样细胞中获得外泌体开辟了新窗口。这些iNSC-exo不仅在体外促进细胞生存和增殖不亚于NSC-exo，而且在缺血性中风后恢复和减轻AD样表型方面也有所增强。因此，iNSC可能是产生临床级外泌体的优秀细胞来源，用于临床试验。 总之，从临床前研究到外泌体治疗的临床试验的进展已经加快。然而，外泌体治疗的临床指示不足和亲本干细胞来源有限等问题仍有待解决。此外，一旦克服了在放大制造、遵守良好生产规范和监管框架方面的限制，干细胞衍生的外泌体治疗将很快被纳入临床实践，并服务于患者床边。 13.结论和未来展望 外泌体最近被追求作为一种无细胞的干细胞治疗替代品。ESC、iPSC、HSC、MSC、NSC和EPC衍生的外泌体特别引人注目，部分原因是其亲本细胞的多能性或多向分化能力。在经过有或没有修改的生产和纯化后，干细胞衍生的外泌体在治疗外科实践中遇到的许多疾病方面展现出巨大的潜力。这些疾病包括骨科疾病（例如骨折、骨关节炎和脊髓损伤）；神经外科（例如缺血性中风、创伤性脑损伤和阿尔茨海默病）；整形外科（例如伤口愈合）；普通外科（例如急性肝损伤）；心胸外科（例如心肌梗死）；泌尿外科（例如慢性肾病）；头颈外科（例如感音神经性听力损失）；眼科（例如获得性视神经病变）和妇科（例如原发性卵巢功能不全）。从机制上讲，干细胞衍生的外泌体通过疾病特异性的细胞和组织反应（例如组织再生、抗炎、抗细胞死亡、免疫调节和抗氧化应激）以及组织特异性的分子信号通路（例如Wnt/β-catenin、PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α、MAPK和JAK/STAT通路）实现多种治疗效果。总的来说，干细胞衍生的外泌体治疗已被证明是外科领域干细胞治疗的强大且多功能的替代品。 干细胞衍生的外泌体的临床应用的未来重点应该放在这种治疗管道的各个节点上。首先，针对外泌体治疗前的大规模生产，需要一个高通量细胞来源以及一个可重复和可扩展的生产和分离协议。与静态系统培养单层细胞相比，生物反应器形式的动态系统，例如中空纤维生物反应器和搅拌罐生物反应器，可以通过在短期内产生大量细胞和外泌体来提高效率。然而，由于在反应器中遇到的物理和剪切应力，亲本细胞和衍生外泌体的表型可能会发生变化。因此，必须优化生物反应器的工作参数，以促进干细胞衍生外泌体的大规模生产。其次，针对外泌体的治疗方式，需要探索除全身给药之外的传递方法。当通过静脉系统传递时，外泌体会迅速从血液循环中清除，并在肝脏、脾脏和肺部积累，这可以通过局部给药来克服。最近，各种生物材料被用来保护、协助和增强局部传递的外泌体，以最大化它们的治疗效果。这些生物材料可以根据它们的来源（例如天然、合成和混合聚合物）、格式（例如支架、补片、喷雾和微针）和响应性（例如温度、pH和蛋白质）来设计，从而允许疾病特异性定制。最后，针对外泌体治疗的治疗指示，应该在未来的临床前研究和临床试验中包括比本综述中讨论的更多的疾病。例如，考虑到MSC衍生外泌体的免疫调节效应，气道炎症状况（例如过敏性鼻炎和哮喘）可能是外泌体治疗的合适候选者。最适合使用外科植入物治疗的疾病（例如人工耳蜗植入物、人工晶状体和避孕宫内节育器）可以以植入物为基础的局部释放外泌体的形式进行管理。除了主要疾病外，次要疾病，包括外科手术和全身麻醉相关的并发症（例如认知障碍、伤口麻木和恶性高热）可能成为外泌体治疗的治疗目标。总的来说，扩大外泌体生产的努力与多模式外泌体传递相结合，将加速干细胞衍生外泌体在迅速扩大的疾病谱中的临床应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:对抗疾病上升和传播最宝贵且成本效益最高的健康措施是疫苗接种。癌症疫苗（CV）是临床肿瘤学家极具前景且有益的工具。众多肿瘤相关抗原为免疫疗法和疫苗接种提供了极好的靶点。为确保抗原持续释放到免疫系统，载体被用于疫苗管理。最近，研究人员专注于可以专门针对肿瘤组织的疫苗输送系统，避免了与系统效应相关的挑战。本章讨论了旨在开发更精确疫苗输送系统以治疗肿瘤的研究。装载抗原的载体在靶向治疗中显示出前景，通过激活免疫系统以触发对疾病抗原的独特免疫反应。这些载体可以被抗原呈递细胞（APCs）主动摄取。有多种载体系统可用，包括物理方法和非物理方法，如类病毒颗粒（VLP）/病毒体、聚合物微粒和纳米颗粒（NPs）、脂质体、古菌脂质脂质体（archaeosomes）、免疫刺激复合物和细胞穿透肽（CPP）。本章将讨论它们在未来CV开发中的潜力以及它们的治疗潜力。 1.引言 1.1.癌症简介 几十年来，癌症一直是死亡的主要原因。然而，开发成功的癌症治疗方法非常具有挑战性。理解恶性肿瘤的病因和癌症细胞扩散过程至关重要。一系列以异常细胞无控制增殖为特征的恶性疾病统称为“癌症”。它被认为是继心血管疾病之后全球第二大死因。2015年，世界卫生组织（WHO）报告称，癌症单独导致了全球5800万死亡中的760万。研究表明，到2030年，全球将有1540万癌症相关死亡，比每年增加1000万例。化疗、放疗和手术是癌症常见且有效的治疗方法。这些治疗的有效性取决于癌症的类型。化疗的一个缺点是它无差别地针对快速分裂的细胞，导致恶性和健康细胞的破坏。放疗和手术的主要限制是它们不能消除转移。因此，仍然需要更有效、伤害更小的癌症治疗方法。研究表明，癌症疫苗（CVs）可能比传统化疗更有效，因为它们与患者的免疫系统协同工作以抑制癌细胞的生长。 1.2.疫苗简介 自1798年爱德华·詹纳首次测试天花疫苗以来，疫苗显著降低了疾病发病率和死亡率，潜在地使它们成为有史以来最重要的医学创新。尽管疫苗无疑已被证明是有益的，但在载体生产、运输和可用性方面的进展将非常有利。路易·巴斯德的“三步”范式——分离、灭活和注射——历史上一直是疫苗开发的基础。然而，随着我们对免疫学、病理学和微生物学的更好理解，疫苗开发正转向更“合理设计”的观点。这些合理设计的疫苗通常由最小成分组成（如亚单位或肽段），这使它们免疫原性较低，但在安全性和生产成本方面提供了优势。预计整合和优化这些方法，连同实施新的剂量和佐剂策略，可以帮助弥合这一效力差距。 1.3.癌症疫苗 CVs通过激活适应性免疫系统工作，最终消除癌细胞，同时通过诱导对肿瘤的免疫反应提供预防性防御。这种方法减少了来自身体不同器官或器官系统的癌细胞的肿瘤复发可能性。这归因于免疫系统识别体内肿瘤细胞的固有能力。抗原作为免疫系统刺激物，为身体对抗癌细胞做好准备。许多调查已经识别出与癌症相关的广泛抗原，其中一些目前正在临床试验和研究中作为CVs使用。现代技术在识别肿瘤中T细胞特别识别的抗原方面取得了重大进展。肿瘤抗原（TAs）可以分为两大类：肿瘤特异性共同抗原和肿瘤特异性独特抗原。由多种肿瘤细胞表达的共享抗原有时被称为肿瘤相关抗原（TAAs）。最有效的免疫疗法剂和/或输送系统与在正常组织中表达程度不同的最合适的TAs协同工作，以实现最佳治疗效果。因此，选择合适的疫苗输送机制对于发展癌症治疗的免疫策略至关重要。 1.4.治疗性免疫疗法 研究人员已经认识到治疗性抗癌疫苗相较于预防性疫苗的必要性。治疗性疫苗在疾病发生后进行管理，旨在完全停止恶性细胞的生长或控制转移和疾病复发。在针对癌症的免疫激活中涉及的主要因子是抗原呈递细胞（APCs），特别是树突状细胞（DCs）。通过针对肿瘤微环境（TME）中的DCs，可以将促进肿瘤生长的炎症转向杀伤肿瘤模式。DC特异性抗体和DC激活剂，结合癌症特异性抗原，诱导强烈的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞介导的免疫反应。在触发细胞介导的免疫反应后，癌细胞被干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子和接触介导的细胞毒性所破坏。许多纳米颗粒（NP）/脂质体配方包含靶向分子，如抗体和免疫调节剂，以及肿瘤特异性抗原，以促进APCs的激活，主要是DCs。由于其大小和组成，纳米配方很容易被DCs摄取，导致T细胞和抗体反应。大多数治疗性疫苗接种技术通过DC介导的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应导致肿瘤退缩。这些配方设计交付的货物（抗原/抗体/Toll样受体（TLR）配体/细胞因子，见图1.1）用于进一步分类这一部分。 图1.1 癌症疫苗诱导免疫的机制途径。 在过去20年中，对肿瘤疫苗和免疫学的研究，这些都是当前癌症治疗的诱人替代品或补充品，已显著增加。这些方法旨在刺激患者的免疫系统识别和消除肿瘤细胞。它们提供了几个重要优势，包括能够： 诱导针对性的肿瘤细胞死亡，对健康非肿瘤细胞的伤害最小； 通过系统性诱导抗肿瘤免疫反应，同时针对原发性和继发性转移； 产生免疫记忆，为未来潜在的肿瘤复发提供长期保护。 2.疫苗输送系统 2.1.物理方法 DNA疫苗诱导的免疫反应类型可能因其管理方法而异。DNA可以通过静脉内（I.V.）、皮下（S.C.）、肌肉内（I.M.）或鼻内（I.N.）给药。一些研究表明，皮肤给药具有免疫学优势，与传统给药方法相比，具有更强的免疫反应。然而，由于缺乏能够一致且准确将疫苗输送到皮肤的有效给药系统，皮肤免疫接种的结果有时不明确。疫苗管理的鼻途径也因其局部和系统效应而受到关注。然而，缺乏有效的疫苗配方和安全的鼻内给药方法。当前研究正在调查基于聚丙烯酸盐聚合物的颗粒系统以增强粘膜免疫反应。标准疫苗通常使用皮内（I.D.）或皮下（S.C.）接种。在各种动物模型和临床研究中，肿瘤内和/或淋巴结内疫苗接种已被证明比其他方法更有效。在“癌症研究进展”中报告的一项研究报告中，皮下初次免疫后序贯进行静脉加强疫苗接种比单独任一管理方法产生了更强的抗肿瘤效果。注射途径可能受到几个因素的影响。最近的发现表明，使用生物弹道方法，如基因炮或Biojector 2000，可以提高效率。在小鼠上进行的研究表明，与针头注射相比，需要100倍更少的DNA就能引发抗体反应。生物弹道和针头注射可能导致不同的免疫反应。基因枪通常诱导DNA疫苗的T辅助型2（Th2）反应，而针头注射通常引发Th1反应。这种差异可能归因于使用更高的注射剂量。需要注意的是，这种结果并不常见。先前的研究表明，使用未经任何涂层的裸露DNA疫苗的基因枪输送会导致Th1偏向的免疫反应，表明基因枪轰击中使用的Au颗粒可以改变产生的免疫反应。此外，无论途径如何，某些抗原都可以影响免疫反应。增加表达DCs的抗原数量的一些技术包括激光疗法前的皮内注射、电穿孔前的肌肉内注射和微胶囊疫苗的肌肉内注射。以下讨论通过物理输送增强基于基因的免疫接种的策略。这些方法也在图1.2中描述。 图1.2 通过物理方法进行癌症疫苗递送的不同方法。 2.1.1.纹身 最近，纹身被提出作为一种将脱氧核糖核酸（DNA）物理注入表皮细胞的方法。这种方法与用于天花疫苗接种的有效策略相似，因为它似乎加快了强健宿主防御和有效免疫的发展。免疫后抗原的快速和零星合成可能解释了这种效果。研究表明，与皮内注射和基因枪递送相比，DNA纹身后的基因表达更高。通过纹身进行DNA转移似乎与肌肉内注射相比，导致不同的基因表达模式。在一个实验中，肌肉内（I.M.）注射100微克DNA导致至少比纹身20微克DNA高出10倍的基因表达峰值。纹身后基因表达立即增加，然后在接下来的四天内逐渐减少。相比之下，观察到肌肉内注射DNA后基因表达水平升高，峰值出现在七天后，可能持续长达30天。尽管DNA浓度较低且基因表达减少，但与肌肉内DNA注射相比，纹身DNA诱导了更强的细胞和体液免疫反应对抗原。此外，已经研究了通过纹身或肌肉内针头注射施用的DNA疫苗的有效性，与两种添加剂：心脏毒素和含有小鼠GM-CSF的质粒DNA（pDNA）的效果。本研究中使用了编码L1主要衣壳蛋白的人乳头瘤病毒16型（HPV16）基因作为模型抗原。结果显示，肌肉内给药分子佐剂显著提高了HPV16 L1 DNA疫苗的效果。此外，纹身设备施用的HPV16 L1 DNA比肌肉内针头递送配合分子佐剂产生了更强更快的体液和细胞免疫反应。然而，当需要更即时和强大的免疫反应时，纹身递送DNA是一种实用且经济的技术，可以应用于实验室。纹身导致几个小的机械损伤，随后出血、坏死、炎症和皮肤再生，这无意中增强了免疫系统。因此，纹身“仅”部分取代了佐剂的作用。 2.1.2.基因枪 基因枪是一种生物弹道装置，允许DNA通过使用附近的室击中目标DNA直接进入细胞。通过体外或体内基因枪技术，包括原代培养和知名细胞系在内的各种体细胞类型，已被作为悬浮或粘附培养物移植。这些事件导致树突状细胞（DCs）扩展和迁移到附近的淋巴组织，在那里它们启动T细胞以目标方式响应抗原。最近，使用TAA、人类gpl00和报告基因测定作为实验平台，进行了针对黑色素瘤的皮肤疫苗接种。研究发现，在不同类型的癌症中，包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌和结直肠癌中，表皮生长因子受体（EGFR）蛋白高度表达。在一项小鼠实验中，通过三种不同的技术传递编码人类EGFR外域的pDNA来评估免疫和抗癌反应：肌肉内针头注射（I.M.）、镀金的DNA基因枪和未镀金的DNA基因枪。在动物肺癌研究中，未镀金pDNA基因枪注射显示出最大的抗肿瘤效果和CTL活性。这些发现可能指导未来人类临床试验中使用的DNA疫苗的开发。创建一个针对表达该基因的恶性肿瘤的EGFR DNA疫苗可能需要DNA免疫。此外，发现由胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤组成的CpG基序可以修改基因枪轰击后在引流淋巴结（LN）中建立的Th2型细胞因子环境。发现表明，插入CpG基序可以提高局部LN中白介素（IL）-12 mRNA的水平，无论它是通过皮内注射、肌肉内注射还是基因枪轰击给药。这些结果表明，CpG基序注射在局部LN中诱导了T辅助细胞类型1（Th1）偏向的环境。DNA疫苗和CpG基序的结合可以激活Th1免疫反应，并作为一种“警告信号”。与常规肌肉内（I.M.）注射相比，使用基因枪进行皮内（I.D.）给药被发现是施用人类乳头瘤病毒（HPV）DNA疫苗最有效的方法。最近，有报道称可以使用低压下的基因手枪传递无载体裸DNA。与金颗粒包被的DNA免疫相比，无载体无保护的预防性HPV DNA疫苗有效地减少了局部皮肤损伤。通过与金颗粒层HPV DNA疫苗进行比较，研究人员确定它也能增强对HPV抗原的T细胞免疫并改善抗肿瘤效果。最近的临床调查使用了一种名为Sig/E7detox/HSP70 DNA疫苗的HPV16 DNA疫苗，该疫苗编码与HSP70连接的信号肽与HPV16 E7（E7 detox）的抑制变体。在之前的研究中，使用三种不同的递送方法施用了pNGVL4a-Sig/E7（detox）/HSP70疫苗：针头肌肉内注射、生物喷射器和基因枪。目的是评估抗原和抗肿瘤反应。基因枪DNA免疫方法产生的E7特异性CD8+ T细胞数量最多，与针头肌肉内注射和生物喷射器给药相比。 2.1.3.超声波 为了促进细胞内DNA的融合，细胞膜可以通过超声波（US）暂时性破坏。此外，治疗性超声波与微泡造影剂的结合可能提高基因转染的效率。这一过程使得DNA能够直接且成功地转移到细胞质中。虽然已经使用这种技术将蛋白质送入细胞，但尚未将抗原引入树突状细胞（DCs）用于癌症免疫疗法。体外和体内研究表明，使用US技术可以促进裸pDNA进入结肠癌细胞。此外，在小鼠鳞状细胞癌模型中，在US处理前进行裸pDNA的肿瘤内注射增强了DNA的运输和基因表达。目前，US正在临床环境中进行研究。Memgen开发的CV在加州大学圣地亚哥分校进行的II期研究（ID：NCT00849524）中，反复通过静脉（I.V.）给药给患有慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）的患者。 2.1.4.电穿孔 在这种方法中，对皮肤施加电脉冲，导致暂时性孔隙形成，促进DNA细胞内进入。一旦移除电能，皮肤就会恢复其结构，并由于孔隙关闭而保持免疫原性物质。历史上，毫秒和微秒脉冲已在电穿孔（EP）中得到应用。最近的研究探索了使用极强纳秒电脉冲（10-300纳秒）在极高强度（10-300千伏/厘米）下直接将DNA转移到细胞核。EP可以通过增加蛋白质表达，释放炎症趋化因子和细胞因子，吸引如巨噬细胞和DCs的APCs到EP部位来增强免疫反应。与单独肌肉内DNA注射所达到的水平相比，EP介导的pDNA传输增加了抗原特异性的体液和细胞免疫反应。已证明，在体内，EP在小型和大型动物中都能可靠地增强免疫反应，表明其在人类中的潜在应用。随后EP和US之间的比较显示了使用EP转染骨骼肌与暴露的pDNA的有效性。在最近的研究中，已经证明单独在小鼠中通过EP给药pDNA已被证明是成功的作为增强免疫。这种成功可能归因于EP增强疫苗所达到的高水平抗原生成。值得注意的是，与使用两剂DNA和EP剂量相比，这种方法显示出更大的成功。这种策略特别吸引人，因为它消除了需要两种不同的疫苗类型。例如，研究表明，当使用表达结肠癌细胞CT26的CTL表位AH1的DNA疫苗时，疫苗的剂量和体积显著影响小鼠的启动和肿瘤保护效率。动物模型已被用来研究EP驱动的DNA疫苗策略治疗前列腺癌。为了有效刺激针对表达前列腺抗原的肿瘤的抗肿瘤免疫反应，通过肌肉内介导的EP在体内给药编码phPSA的质粒。结果表明，phPSA疫苗治疗显著延缓了恶性肿瘤的进展并延长了动物的寿命。研究人员采用了多种策略来开发最佳的HPV DNA疫苗，包括融合E6和E7肿瘤抗原（E6/E7）、组织型纤溶酶原激活剂（tpa）信号序列、包含CD40配体（CD40L）和Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）。当E6和E7融合（E6/E7（Co））时，E6/E7抗原特异性CD8(+) T细胞反应减少，但预防性抗肿瘤影响增加。与CD40L相关的HPV DNA疫苗相比，Flt3L融合的HPV DNA疫苗显示出改善的治疗抗肿瘤结果和增加的E6和E7特异性CD8+ T细胞反应。在卡罗林斯卡大学医院进行的I/II期临床调查中，Chron Vac-C，一种治疗性DNA疫苗，通过EP给药给以前感染过病毒的患者，以通过增强免疫反应加快他们的康复。这项临床试验在瑞典医院的胃肠病学和传染病诊所进行。这是最早使用EP技术给人们使用的针对传染病的DNA疫苗之一。为了通过MHC类I途径增强抗原处理和传递，并增强细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的产生，有必要通过与免疫刺激性分子如钙网蛋白（CRT）的相互作用将TAs亚细胞定位。即使在当前的进步下，找到一个可靠的DNA递送机制仍然是确保免疫治疗方法有效性的关键。在比较三种疫苗接种技术的研究中——传统的肌肉内（I.M.）注射、通过电穿孔（EP）介导的I.M.递送和表皮基因枪介导的粒子递送——使用了pNGVL4a-CRT/E7（detox）DNA疫苗。结果表明，EP是免疫E7最有效的方法，因为它产生了最大量的E7特异性细胞毒性CD8+ T细胞。 最近，几种HPV DNA疫苗已经成功地使用电穿孔（EP）技术给猕猴和老鼠模型生物进行了接种。其中一种疫苗是VGX-3100，它包含针对HPV亚型16和18的E6和E7蛋白的质粒。目前，该疫苗正在进行I期临床试验。建议有CIN 2或3病史的个体以及接受过手术的人接种这种疫苗。Cyto Pulse比以往的肌肉内电穿孔技术更有效地特异性针对皮肤细胞。Cyto Pulse开发了两种临床疫苗输送设备，DermaVax和Easy Vax。Easy VaxTM专注于皮肤的表皮层，广泛用于预防性病毒疫苗接种。另一方面，Derma VaxTM主要针对皮肤的真皮层。这种方法适用于需要强烈免疫反应和高剂量的情况，如基因治疗和癌症疫苗（CVs）。Derma Vax将在进行中或计划中的临床研究中使用。其中一项研究，编号NCT01064375，旨在使用ID EP（El-porCEA）创建一种DNA疫苗来治疗结直肠癌。该研究评估了CEA DNA免疫技术在结直肠癌患者中的免疫原性和安全性。 2.1.5.激光 体外研究表明，激光束可以将能量（首次高达20兆电子伏）传递给目标细胞，通过局部热效应改变膜的通透性。对于药用用途，需要额外的能量（高达250兆电子伏）。最近，这种尖端方法被描述为提高注射质粒的转染效率的有效方式，并在T细胞和体液免疫中引发针对抗原的免疫反应。这种新方法仅在少数试验中使用，显示出开发治疗性HPV DNA疫苗的巨大潜力。 2.1.6.喷射注射器 喷射注射器用于将雾化的药液或悬浮液注入皮肤，使用弹簧机制或压缩气体（通常是二氧化碳、氮气或氦气）包含在一个小药筒或大罐中。这种方法允许药物直接到达肌肉或更深入地穿透皮下或真皮层。 2.1.6.1.液体喷射注射器 液体喷射注射器正在开发为一次性和多次使用组件。对于像糖尿病这样的慢性疾病，使用可重复使用的设备来每天给予持续效果的剂量。预装药物的可更换设备用于办公室基础免疫、大规模疫苗接种和紧急情况，如治疗过敏和偏头痛发作。 这些设备在不需要针头的情况下对液体进行加压，这会在皮肤上形成孔。压缩气体或弹簧可以用作动力源。这导致压力配置文件较低，将剩余的液体推入皮肤。由于药物已经是液体形式，因此无需重新配制。 Walther等人已经证明，使用注射器、有限喷射注射少量暴露的pDNA用于半乳糖苷酶（LacZ）和绿色荧光蛋白靶基因范式，可以成功且安全地在各种临床前癌症模型中进行非病毒基因转染。对喷射注射的肿瘤进行定性和定量分析，揭示了有效的基因转录、增加的肿瘤内分散和深入的DNA渗透。基于这些有趣的临床前数据，进行了一项I期基因交换实验，使用喷射注射将微量的pDNA肿瘤内注射。通过定量和定性检查LacZ在mRNA和蛋白水平的表达，评估了基因转移的效率。这个实验的结果证明了这种方法在治疗局部可及的转移性实体瘤如黑色素瘤、乳腺肿瘤和其他类型的恶性肿瘤方面的有效性。对使用喷射注射器输送小干扰RNA的临床前研究也显示出额外的癌症基因治疗应用的潜力，包括DNA疫苗接种、免疫基因治疗和基因抑制技术。此外，体内喷射注射输送人TNF-α作为CD的自杀基因显著减少了肿瘤进展。 然而，液体喷射注射器也有一些缺点。它们需要精确的动力源控制，以准确可靠地向不同的皮肤类型或同一个人的皮肤的不同区域输送疫苗。喷射的高速冲击血管和神经，导致出血和不适，可能会降低患者的依从性。 2.1.6.2.固体剂量注射器 以固体形式交付的疫苗的稳定性，无论是药物还是变应原，都消除了对冷链储存的需求。这允许同时给予初始剂量和加强剂量，增强了患者的依从性。一种交付固体配方的方法是Powderject方法，它使用氦气驱动的设备将药物以超音速推进到皮肤的外层。药物颗粒由氦气微缸中的压缩气体加速，使它们在激活时能够穿透皮肤。使用时，设备直接应用于皮肤。Corgentech和辉瑞都在探索这项技术，分别用于开发局部麻醉剂和在金载体颗粒上交付DNA疫苗。另一种方法是滑块固体剂量注射器方法，其中手动操作器推动药物。操作器由一个小型固体杆组成，包含药物和辅料。当达到预定的弹簧力时，操作器自动启动并给予药物。推动动作至关重要，因为它确保了药物一致且受控地输送到皮肤的深层，无论皮肤类型或位置如何。这与Powderject方法不同，在Powderject方法中，建立一致且有效的治疗率可能是具有挑战性的。在需要给予多个剂量的情况下，操作器可以设计为可重复使用的设备，带有预装药物盒，以方便使用。 2.1.7.微针（MN） 微针（MN）由多个微结构投影组成，涂有药物或疫苗。它被应用于皮肤以将活性物质皮内输送，绕过角质层。与依赖扩散的经皮给药系统不同，MNs手动暂时性地破坏表皮，促进药物或疫苗进入其目标部位。由于它们的尺寸很小（直径1微米，长度1到100微米），MNs与普通针头不同。它们可以由各种材料制成，如金属、硅、二氧化硅、聚合物、玻璃等。MNs可以设计得足够短，以避免神经末梢，同时仍然到达角质层，减少不适、感染或受伤的风险。空心MNs、实心MNs、涂有药物的MNs和可溶解MNs是不同设计中的一部分。这些设计通过各种机制使药物的给药成为可能，允许研究治疗时间控制。实心MNs通常用于组织预处理，以增强治疗药物向选定组织的输送。在这里，微小针头的引入及其随后的移除在组织中创造了只有几纳米宽的孔，允许后来应用的氢凝胶或药物溶液到达更深的组织层。另一方面，MNs可能具有分层结构，下层输送治疗化学品，上层为穿透目标组织提供机械支持。通过这种方式，MNs应用后，不同的MN层将分解，允许治疗分子流入组织。基于癌症免疫的免疫接种旨在动员宿主的先天免疫来破坏肿瘤组织。这些方法通常侧重于将疫苗输送到皮肤，皮肤是身体最大的免疫器官，含有丰富的APCs，如巨噬细胞、朗格汉斯细胞和DCs。这些APCs可以激活T和B细胞，从而引发对肿瘤的更广泛的免疫反应。为了实现这一目标，研究人员正在研究含有免疫刺激佐剂和/或抗原的MN贴片的使用。Zaric等人通过结合甲基乙烯基醚和顺丁烯二酸酐MNs与OVA负载的PLGA NPs，展示了一种刺激免疫系统对抗表达OVA的B16黑色素瘤肿瘤的方法。作者在这一过程中使用了水包油双乳液技术来生成OVA负载的PLGA NPs用于MNs，然后将NPs添加到甲基乙烯基醚和顺丁烯二酸酐的溶液中（19×19阵列）。这些研究人员观察到MNs能够穿透小鼠皮肤并达到真皮层和附近的DCs在体外测试中。研究人员还观察到，转染的DCs能够迁移到近端LN，在那里它们可以激活CD8+ T细胞并诱导产生如IFN-γ等细胞因子。此外，这种由MNs释放NPs触发的免疫系统激活，导致表达OVA的B16黑色素瘤肿瘤生长延迟了13天。同样，Kim和同事开发了一种使用Pluronic F127和聚乙二醇（PEG）的MN贴片，以同时共输送resiquimod（R848）和TAs。人TLR7和TLR8作为R848的配体，表达在巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等免疫细胞上。R848与TLR7/8之间的相互作用导致IL-12、IFN-γ和TNF的产生，随后触发针对抗原的体液和Th1免疫反应。在这项研究中，使用表达OVA的淋巴瘤细胞允许同时给予OVA，将免疫反应集中在由E.G7-OVA组成的肿瘤异种移植物上。 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具被用来沉积Pluronic F127/R848和PEG/OVA的混合物，然后在室温下在真空中固化，之后被切割成一个包含49个金字塔形针头的微针（MN）阵列。发现这些微针可以穿透小鼠的皮肤并将有效载荷释放到附近的细胞中。作者还观察到溶解的微针形成了纳米胶束，可能有助于R848和OVA分布到RAW264.7细胞中，从而诱导巨噬细胞成熟和细胞因子释放。体内实验表明，装载R848和OVA的微针可以迁移到淋巴结并激活皮肤抗原呈递细胞（APCs）。 另一方面，微针可以被设计为基于抗体的免疫疗法，旨在克服或绕过肿瘤细胞发出的免疫抑制信号。Ye及其同事开发了一种由透明质酸（HA）组成的微针阵列，用于向B16F10黑色素瘤肿瘤递送1-MT和抗PD1抗体。通过特别针对T细胞表达的PD-1受体，抗PD1抗体可以逃避癌细胞的抑制信号，允许T细胞激活。 2.2.病毒和非病毒递送系统（非物理的） 2.2.1.病毒载体 2.2.1.1.病毒载体 病毒的遗传物质可以被改变以递送转基因到感染的细胞中，因为它们天生具有免疫原性。然而，使用病毒载体在临床试验中的有效性并没有产生与传染病研究相似的结果。重组病毒可以在免疫细胞中表达转基因，特别是抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DCs）。这导致肿瘤抗原（TAs）向细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的呈递增加，从而更频繁和强烈地攻击肿瘤细胞。抗原由疫苗载体表达。 病毒可以自然感染人类细胞并引发T细胞和体液反应，使它们适合作为疫苗递送方法。某些病毒可以被修改为特别针对肿瘤细胞或具有固有的溶瘤特性。溶瘤病毒疗法（OVT）被广泛用于癌症治疗，因为它可以选择性地裂解肿瘤细胞并诱导对病毒和肿瘤抗原的免疫反应，导致长期记忆T细胞的产生。溶瘤病毒不仅可以直接裂解细胞，还可以被基因修改为疫苗疗法的递送载体。腺病毒、单纯疱疹病毒、副粘病毒、弹状病毒、牛痘病毒和其他病毒株是递送机制的可行选择。 腺病毒已被广泛研究作为治疗乳腺癌的溶瘤病毒平台。这是因为与健康组织相比，乳腺癌细胞中E2F-1的表达更高。腺病毒基因组策略性地位于E2F-1启动子下游，允许通过整合免疫调节元素IL-15进行选择性病毒疗法。Yan等人通过创建一个整合E2F-1启动子和IL-15的重组腺病毒载体来证明这种复制选择性病毒疗法。由Zhu等人开发的另一种重组腺病毒，通过hTERT启动子控制腺病毒E1A基因，并通过缺氧响应元素（HRE）启动子控制腺病毒E1B基因。这种重组腺病毒还包括IL-24基因，它诱导肿瘤特异性凋亡并抑制肿瘤细胞生长。 逆转录病毒，特别是RNA病毒，可以被用作DNA递送载体来管理恶性肿瘤，当病毒蛋白gag、pol和env被移除时。重组逆转录病毒载体有能力表达肿瘤细胞特有的转基因。GDEPT（基因导向酶前药疗法）利用重组逆转录病毒将非活性药物转化为肿瘤细胞内特有的活性有毒代谢物。MetXia-P450逆转录病毒载体在减少MDA-MB-231乳腺癌异种移植模型中恶性组织的生长并对T47D乳腺癌细胞对环磷酰胺（CTX）敏感方面显示出有希望的结果。Rexin-G是一种单独的疫苗方案，用于治疗包括乳腺癌在内的各种实体癌。它基于重组复制无能逆转录病毒载体，并表达促进凋亡和抑制血管生成的合成人类cyclin G1转基因。 TLRs 3和9可以被细小病毒-H1利用以刺激人类免疫系统，这触发了一个NF-κB依赖的适应性免疫反应。从乳腺癌患者的肿瘤中分离出的原发性乳腺癌细胞比正常细胞对H1PV有更高的亲和力。重组HIPV也已被用于癌症免疫疗法。具有增加的炎症细胞因子（IFN-γ和TNF-α）转基因的基因修饰HIPV显示出治疗益处。 病毒载体-DC疫苗和病毒载体-CAR T是病毒介导疫苗递送的两种关键方法。用转基因技术靶向DC已被证明是引导免疫反应朝向耐受或免疫的有效策略。使用病毒载体遗传修饰DC的关键优势是通过这种方法实现的DC成熟度增强。在Chen等人的一项体外研究中，与Ad5一起传递ErbB-2/neu基因的DCs导致了对过度表达该基因的乳腺癌细胞系的治疗性和保护性免疫。 最近对癌症疗法的研究集中了很多注意力在使用CAR修饰的T细胞和溶瘤病毒一起针对和指导实体瘤。已经探索了将基于基因的疫苗或治疗性转基因递送到实体恶性肿瘤的肿瘤微环境（TME）的潜力。病毒载体与肿瘤特异性T淋巴细胞的相互作用被发现可以增强它们的效应能力。患有血液学恶性肿瘤的患者从CAR修饰的T细胞中显示出显著的好处。根据Bajgain等人的发现，共表达倒置的细胞因子受体（4/7ICR），它连接IL4受体外域和IL7受体内域，通过转化抑制性IL4信号，增强了CAR T细胞在体内乳腺癌模型中的抗癌活性。 2.2.1.2.细菌载体 Busch和Fehleisen首次建立了癌症和细菌（化脓性链球菌）之间的联系。他们发现在癌症患者中由该生物引起的丹毒感染抑制了肿瘤生长。在19世纪，William Coley利用减毒的粘质沙雷菌和化脓性链球菌组合来治疗骨骼和软组织肉瘤。这种混合物被命名为Coley毒素。这一发现激励研究人员专注于寻找和利用细菌菌株或其产品来治疗不同的癌症。实际上，某些细菌成分，包括外毒素，已被发现能直接启动对肿瘤细胞的抗癌作用，而不是间接效果。使用细菌作为具有治疗价值的转基因递送系统提供了许多好处。在恶性细胞的厌氧条件下，像梭菌这样的特定细菌种类非常活跃和移动性强。由于它们能够到达难以接触的肿瘤区域，以及肿瘤细胞的高代谢活性使它们对化疗产生抗药性，细菌被认为是递送抗癌药物或基于基因的疫苗以治疗恶性肿瘤的潜在选择。 用于乳腺癌疫苗的最常见细菌种类包括鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、新威氏梭菌、丁酸梭菌、长双歧杆菌、青春期双歧杆菌和大肠杆菌。鼠伤寒沙门氏菌和梭菌据报道被用作溶瘤载体。在引入抑制的S. Typhimurium和长双歧杆菌以及合成TRAIL等分子的载体后，显著减缓了肿瘤的生长，显示出宿主基因组中凋亡基因（自杀基因）的转录增加。通过破坏细胞周期并触发细胞死亡，通过产生p53和Bax，由铜绿假单胞菌产生的阿祖林蛋白破坏恶性细胞并阻止乳腺癌和黑色素瘤的生长。为了测试细胞因子LIGHT（也称为TNFSF14或HVEM-L）在Balb/c小鼠D2F2乳腺癌模型中的有效性，Loeffler等人创建了一个嵌合的S. Typhimurium VNP20009菌株。S. typhimurium RE88与表达Fra-1和IL-18的DNA疫苗联合使用，预防了乳腺癌的生长和转移，这激活了免疫细胞（T细胞、自然杀伤（NK）细胞和DC）并阻断了血管生成。通过口服给予转基因S. typhimurium SL3261和人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF），体内减缓了4 T1乳腺癌的进展。经过减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株通常被用作人类和兽医学中的活载体。已经证明人类对用于疫苗管理的减毒沙门氏菌（S. typhimurium和S. typhi）反应良好。革兰氏阳性细菌单核细胞增生李斯特菌可以利用溶血素、李斯特菌溶素O和磷脂酶等形成孔的酶从吞噬体中逃逸并进入细胞胞质。这为疫苗递送提供了一个多功能的载体，并实现了更有效的基因转移。许多研究表明L. monocytogenes作为癌症治疗递送系统的效力。在Wood等人的一项研究中，使用针对CD105（Lm-LLOCD105A和Lm-LLOCD105B）的基于李斯特菌的疫苗治疗了乳腺癌小鼠模型。PROSTVAC疫苗，也称为PSA-TRICOM，包括重组禽痘-PSA-TRICOM增强剂和重组牛痘-PSA-TRICOM（前列腺特异性抗原加上三个共刺激分子的TRIad）的初始注射。在II期临床试验中，患有转移性、激素难治性前列腺癌的个体接受了PSA-TRICOM。 2.2.1.3.类病毒颗粒（VLPs） 被称为VLPs的高度结构化的、极其重复的结构，由病毒衣壳蛋白包装而成。这种衣壳蛋白的高密度提供了许多构象病毒表位，可以诱导强大的免疫反应。重要的是，VLPs是由病毒衣壳蛋白自行组装而成，没有任何病毒致病核酸。由于它们无法复制，它们提供了一种相对于通常用于免疫的减毒病毒的潜在更安全的选择。第一个基于VLP的疫苗针对乙型肝炎病毒（HBV）。在20世纪60年代末，Baruch Blumberg博士偶然发现了急性和慢性乙型肝炎患者血清中的独特澳大利亚抗原。他还提供了VLP生产的初步具体证据。在随后的年份中，电子显微镜被用来研究病毒形态，在20世纪80年代初，使用酵母表达系统首次组装了HBV VLPs。 伽马疱疹病毒EBV是人类发现的第一种致癌病毒，它攻击上皮细胞和B细胞。EBV与多种恶性肿瘤有关，包括淋巴瘤、胃癌和鼻咽癌，这些疾病可能发生在免疫功能正常和免疫功能低下的个体中。EBV也是单核细胞增多症的主要原因。为了开发另一种EBV疫苗模型，将EBV的gp350/220与新疾病病毒的融合F蛋白融合，使得gp350/220外域以VLP颗粒形式呈现。利用中国仓鼠卵巢细胞生产EBV-VLPs，并对BALB/c小鼠进行免疫。这导致了持久且针对性的抗体反应，即使不使用佐剂，也能在体外抑制EBV感染。为了创造一种多价疫苗，将对EBV入侵至关重要的糖蛋白gH/gL或GB、EBV核抗原1和表达在所有EBV感染细胞表面的潜伏膜蛋白2（LMP2）也纳入VLPs中。gH/gL-EBNA1和GB-LMP2 VLPs成功地在CHO细胞中生产，无需使用佐剂，并证明了它们在BALB/c小鼠中诱导高中和抗体滴度或EBV特异性T细胞反应。因此，这些EBV-VLPs可以作为治疗EBV相关恶性肿瘤的有效治疗性疫苗，以及预防EBV感染的预防性疫苗。表1.1显示了一些作为CV递送剂的VLPs的例子。 2.2.1.4.病毒体 这些极小的圆形单层脂质膜囊泡（150纳米）缺乏通常包含原始病毒遗传物质的核衣壳。然而，它们装满了病毒膜蛋白，如流感病毒中的血凝素和神经氨酸酶。这些蛋白使病毒体膜能够通过与免疫系统细胞融合，直接将其内容物——特定抗原——传递给靶细胞。这一过程即使在免疫原性较弱的病原体存在的情况下也能触发特定的免疫反应。一旦抗原被传递，细胞内的病毒体被完全消除。与其他脂质体和蛋白脂质体载体系统不同，病毒体的免疫学特性受到夹在磷脂双层之间的病毒蛋白的强烈影响。这种插层不仅为病毒体配方提供了结构稳定性和均匀性，而且还决定了抗原的表位是否位于病毒体表面（PeviPROTM）或内部，从而影响病毒体配方诱导的免疫反应类型（PeviTERTM）。使用PeviPROTM会触发免疫学体液反应，导致由于细胞内体中抗原的分解而呈现MHC II抗原。除了在体内引起CD4+和CD8+阳性反应外，PeviTERTM产生的抗原还可以产生强烈的CTL反应。病毒体封装确保通过MHC I途径正确呈现抗原，因为抗原自然地被送入抗原呈递细胞的细胞质中。 2.2.2.非病毒载体 2.2.2.1.阳离子和可生物降解聚合物 最近，制药研究和工业利用阳离子和其他碳水化合物聚合物的能力来调节药物、蛋白质、抗生素、肽、DNA或疫苗的分布。近年来开发了多种系统，如聚赖氨酸及其共轭物、壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）、脂多胺、二乙基氨基乙基-右旋糖酐（DEAE-右旋糖酐）、聚酰胺胺（PAMAM）树状聚合物、右旋糖酐过氧物酶多阳离子和右旋糖酐过氧物酶多阳离子。包括树状聚合物（高度分支的PAMAM）和壳聚糖（一种可生物降解的线性氨基多糖）在内的许多阳离子聚合物，已被检查其基因转移能力。此外，壳聚糖可以通过静电相互作用与带负电的DNA（多聚体）形成复合物。最近，使用基于渗透的方法生产了壳聚糖和壳聚糖/DNA纳米球。PEI和聚（L-赖氨酸）（PLL）作为基因治疗的聚合物进行了广泛研究。由于它们的性质，可以在PEI聚合物的表面附加靶向配体和/或PEG，为基因载体提供立体稳定性。当聚乙二醇化PEI多聚体与肿瘤特异性配体共轭并静脉给药时，转染效率比聚乙二醇化（无转铁蛋白）PEI多聚体提高了五倍。研究人员研究了阳离子多聚电解质对体外恶性细胞和植入艾氏肉瘤或引起腹水的小鼠白血病（L5178Y）的影响。在肿瘤移植后5天，高分子量PEI、聚乙烯胺和PPI在中性pH下给药，导致实体艾氏肉瘤小鼠的肿瘤生长减少了10%到40%。唯一能延长由白血病细胞引起的腹水小鼠寿命的物质是PPI。因此，阳离子聚合物可能通过直接与肿瘤细胞静电相互作用并诱导宿主的一般免疫反应而有用。2013年，一种溶瘤腺病毒（Ad-DB7-U6shIL8）（oAd/PNLG）被涂覆了聚合物N-（2-氨基乙基）-2-氨基乙基甲氧基聚（乙二醇）-b-聚-N-L-谷氨酸（PNLG）聚合物。2014年，另一种阳离子聚合物被创造出来，这次特别设计了精氨酸部分以促进低水平和高水平的CAR表达。mPEG-PEI-g-Arg-S-S-Arg-gPEI-mPEG（PPSA）具有生物可还原的二硫键以减少细胞毒性，并具有几个精氨酸功能部分以增加转基因表达。溶瘤腺病毒（DWP418）在与PPSA复合后（DWP418/PPSA），被瘤内注射到CAR阴性MCF7异种移植小鼠中。结果表明，与裸露的DWP418相比，DWP418/PPSA提供了更强的抗肿瘤效果。 2.2.2.2.微粒（MPs）作为疫苗递送载体 作为疫苗递送工具，微尺度颗粒或胶囊相较于可溶性抗原具有优势。通过使用MPs，它们还可以提供持续的抗原释放、延长的抗原呈递，以及将抗原和佐剂同时传递给同一APC，大量抗原可以被传递给APCs。佐剂和抗原可以被共同封装在单个颗粒中、分开放置，或集体附着在其表面。能够增强和延长免疫反应的疫苗分布的最佳尺寸范围仍然不明确，如引用研究的发现所示。文献中包含许多使用各种可生物降解颗粒配方作为CVs的临床前研究。这些用于CVs的颗粒已使用众所周知的基于聚(α-羟基酸)的聚合物制成，如聚乳酸(PLA)和PLGA，以及更多实验性的聚合物，如聚酸酐。来自聚酸酐的MPs被报道具有固有的免疫佐剂属性。这类聚酸酐的例子包括2,6-二氧杂辛烷和1,8-双(p-羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷(p-羧基苯氧基)己烷。合成佐剂CpG和OVA使用双乳液溶剂蒸发技术共载于聚酸酐颗粒（直径1-3微米）。这些MPs提供了额外的预防性保护，以对抗表达OVA的肿瘤威胁，证据是与用可溶性OVA和CpG免疫的小鼠相比，肿瘤生长更慢，小鼠死亡率得到改善。接受这些MPs免疫的小鼠也显示出比用可溶性OVA和CpG免疫的小鼠更高水平的OVA特异性CD8+ T细胞。在肿瘤裂解物的背景下，CpG在另一种基于颗粒的疫苗配方中显示出有益效果。通过反复冷冻和解冻肿瘤细胞（无论是自体还是异体）得到的粗TA制剂，可以作为可溶性疫苗使用，或封装在颗粒中。目前正在研究利用肿瘤裂解物的潜在癌症疫苗。根据De Temmerman等人的研究，小鼠被腹腔注射含有肿瘤裂解物（来自B16.F1黑色素瘤）和CpG的PLGA（75:25）MPs。结果，脾脏中的T细胞数量显著增加。研究表明，腹腔中的树突状细胞（DCs）吞噬了MPs并将它们运输到脾脏，在那里它们触发了TH1免疫反应，证据是分离的脾细胞中IFN-γ产量增加。正在探索以碳酸钙或二氧化硅为基础的无机MPs作为疫苗载体。人类EGFR 2抗原已被装载到直径1微米、高400纳米的多孔硅MPs上。用抗原装载的硅MPs免疫刺激了肿瘤特异性CTL反应的发展，CD11c+ DCs的广泛浸润，以及肿瘤内I型IFN和MHC II表达的增加。此外，多孔二氧化硅MP载体（MSV）能够同时给同一DCs施用源自B16的抗原酪氨酸相关蛋白（TRP）2和TLR激动剂如CpG或MPLA。基于二氧化硅MPs的免疫可能通过协调有效的宿主免疫反应显著增加荷瘤小鼠的中位生存期。无机CaCO3 MPs也已开发用于封装肿瘤裂解物，目的是用于个体化抗癌疫苗。由于APCs吸收TLR激动剂的速率更高，TLR配体吸附和抗原封装的CaCO3 MPs在激活APCs和增强CV效果方面优于TLR激动剂和抗原的可溶性混合物。 2.2.2.3.纳米颗粒作为疫苗递送系统 利用纳米颗粒（NP）系统作为疫苗载体有潜力通过增加抗原递送到特定免疫细胞的效率来增强免疫细胞的免疫反应。目前，口服纳米颗粒系统用于疫苗被认为是最有希望的方法。事实上，控制时间释放剖面对于免疫刺激可能不像在更高剂量下产生药理反应那样关键。通过化学修饰，疫苗抗原可以被压缩在NPs内部或共轭在NPs表面。使用NPs递送的抗原已被证明比其他方法更有效，这可能导致快速抗原解体或减弱的免疫反应。表1.2列出了一些用于癌症递送的NPs。此外，除了抗原的定向释放外，某些复合NPs还实现了抗原的持续释放，以增强免疫系统的暴露。此外，几种NPs RNA干扰治疗目前正在进行人类临床研究，以评估其有效性和安全性。图1.3展示了用于心血管（CV）递送的不同NPs。 图1.3 用于癌症疫苗递送的不同纳米颗粒。 1.聚合物纳米粒子：壳聚糖、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）、HT，以及其他合成和天然聚合物，如PEI、PLA、聚丙烯硫化物、丙烯酸基聚合物和PLGA等被包含在内。包括PLGA、PEI和壳聚糖在内的聚合物的使用在临床前和临床试验中显示出巨大潜力。与聚-L-赖氨酸和PEI相比，壳聚糖显示出更低的毒性。PLGA/PLA颗粒作为肿瘤疫苗和免疫疗法的主要优势在于它们能够作为一种无毒的治疗载体，同时递送抗原和佐剂，并且可以分散在长时间内。壳聚糖纳米粒子展示了肿瘤细胞选择性。越来越多的研究集中在修饰壳聚糖以增强壳聚糖纳米粒子的选择性和生物利用度。修饰后的壳聚糖纳米粒子表现出靶向精准、pH敏感性和热敏感性等特点。体外抗肿瘤测试表明，500 mg/L浓度的壳聚糖纳米粒子抑制了宫颈癌Hela细胞27%，肝癌SMMC-7721细胞23%，胃癌BGC-823细胞29%，乳腺癌MCF-7细胞55%。当树突状细胞（DCs）暴露于可溶性抗原、PLGA修饰颗粒或含有抗原的PLGA纳米粒子时，Shen等人研究了抗原吸收和CD8+ T细胞激活。Reddy等人开发了通过激活补体级联反应和产生原位危险信号来激活DCs的普朗尼克稳定的聚丙烯硫化物纳米粒子。刘等人描述了基于纳米粒子的多佐剂全细胞肿瘤疫苗用于癌症治疗。他们还使用PLGA纳米粒子作为全细胞肿瘤疫苗的递送系统，并证明了有效抑制肿瘤生长。为了应对这些挑战，目前正在探索聚合物纳米粒子包裹的姜黄素，或纳米姜黄素。在小鼠模型中，静脉注射携带TAA肽（TRP-2）和TLR-4配体（7-酰基脂质A）的PLGA颗粒显示出用两剂抑制肿瘤生长的效果。Bourquin和同事扩展了他们早期的研究，利用装载CpG的阳离子明胶纳米粒子。他们证明了用OVA和这些纳米粒子免疫的小鼠能够产生专门和保护性的抗肿瘤免疫反应。纳米乳液疫苗被用来递送肿瘤特异性抗原，结果在小鼠中引发了强烈的肿瘤靶向抗体和CTL反应。这最终提供了对肿瘤生长的保护。魏和同事开发了靶向黑色素瘤的纳米乳液疫苗，包裹TAAs，MAGE-1和/或MAGE-3。此外，他们的配方包括SEA和HSP70，这被认为可以增强肿瘤特异性免疫的发展。史等人创建了一种免疫刺激疫苗以预防胃癌，递送CpG和MG7抗原。在最近的一项研究中，小鼠被接种了装载TAA EphA2的γ-PGA纳米粒子，以评估诱导对EphA2表达肿瘤细胞的保护水平。用EphA2-PGA纳米粒子免疫的小鼠显示出增加的EphA2特异性CD8+ T淋巴细胞刺激，目标细胞分解和减少的整体肝脏生长，作为肿瘤保护的指标。 2.无机纳米粒子：尽管无机材料的生物可降解性差，但基于无机材料的疫苗已经得到了广泛的研究。无机颗粒被用作佐剂和抗原递送载体以增强免疫反应。疫苗中使用的四种最常见的无机颗粒类型是铝、Ca3(PO4)2、二氧化硅和金。 研究表明，铝颗粒既可以作为载体也可以作为佐剂来刺激免疫系统，尽管它们可以安全地与抗原结合并改变它们的结构，从而降低疫苗的有效性。李等人使用OVA和炭疽保护抗原蛋白作为模型抗原，开发了表现出增强抗原-抗体反应的氢氧化铝纳米粒子。磷酸钙颗粒由于其生物可吸收性、无毒性、佐剂特性和易于抗原装载，成为疫苗应用的有吸引力的选择。胶体金，由金纳米粒子（AuNPs）组成的溶液，已被用作免疫诊断标记和癌症治疗的治疗剂。作为一种有效的癌症疫苗（CVs）递送方法，Ojeda和同事开发了一种具有自组装单层碳水化合物抗原的AuNP系统，称为糖纳米粒子。根据Lee等人的说法，基于AuNP的CVs可以通过激活树突状细胞（DCs）上的Toll样受体9（TLR-9）来增强免疫反应。Kang等人研究了携带OVA的AuNPs对OVA运输到淋巴结（LNs）和激活CD8+ T细胞反应的影响。阴离子poly I:C和阳离子抗原肽自组装在金纳米粒子模板（iPEM-AuNPs）上，形成了一个无需溶剂或额外结构组件的免疫增强纳米系统，显著增加了抗原特异性CD8+ T细胞的数量。 基于硅的颗粒是疫苗开发中常用的一种无机颗粒，由于其生物相容性和在尺寸和形状方面的多功能性而受到青睐。已经证明，介孔硅颗粒在体内有效地作为持久的抗原载体。Kim等人使用OVA模型抗原和CSF佐剂开发了介孔硅棒作为控制的疫苗递送系统。介孔硅纳米粒子已被研究用于它们与各种细胞系的体外相互作用，包括HeLa细胞、3T3内皮细胞、人类间充质干细胞和人类结肠癌细胞。Myungi和同事在小鼠肿瘤模型中记录了使用硅纳米粒子作为疫苗递送技术增强抗原特异性B细胞和T细胞反应的生成，从而诱导保护性抗癌免疫。 3.磁性纳米粒子：Hai-Yan Xie、Wei及其团队报告了一种磁性癌症纳米疫苗，在磁场的影响下显示出显著改善的淋巴结保留，导致对癌的疫苗效果增强。当施加磁场时，淋巴结中的CD8+ DCs显示出对装饰有抗CD205的磁体素的摄取显著增加。 4.树状分子：这些是通常形成球形大分子的合成聚合物，并且具有由重复分支的链组成的结构。这些树状分子由三个不同的结构域组成：末端基团、重复分支单元和一个提供可变表面功能的中心核心。在各种树状分子类别中，基于PPI的树状分子和PAMAM被广泛使用，并引起了显著关注。Chahal等人通过用2-十三烷氧基环氧乙烷处理PAMAM G1树状分子，开发了新型烷基化树状分子，从而生产出包含脂锚定PEG和mRNA的纳米粒子。这项技术促进了特异性识别抗原的抗体和CTLs的产生。通过利用树状分子，将G250肾癌细胞特异性抗原与GM-CSF嵌合分子融合，创建了一种特别有效的疫苗，引发针对肾癌的特异性免疫反应。 2.2.2.4.脂质体和脂质纳米颗粒（LNP） 构成球形纳米囊泡的磷脂双层被称为脂质体。磷脂的头部是亲水的，而尾部是疏水的，使它们能够在水环境中自组装形成脂质体。基于脂质的技术，如脂质体，通常用于人类临床试验，特别是在癌症基因治疗中。通过调整脂质体的脂质组成、电荷、大小和表面特性，可以创建一个多功能的NP疫苗递送系统，提供一系列理想属性。脂质体已被用于运输RNA、DNA和抗原，增强对癌症疫苗目标抗原的免疫反应。脂质体纳米药物在癌症治疗、疫苗开发和胆固醇管理等领域的先进疗法中具有巨大潜力。 在1998年，Longenecker的研究团队描述了一种24-mer人类糖蛋白1（MUC1）肽脂质体疫苗。这种疫苗使用MPLA作为佐剂，比KLH偶联疫苗在小鼠中引起了更强的Th1反应并提供了保护。此外，HER-2/neu63-71与CpG的脂质体共包载导致显著的CD8+ T细胞反应和现有肿瘤的消退。与PLGA纳米粒、ISA-51和乳液相比，脂质体在诱导功能性抗原特异性T细胞方面更为有效，这一点由另一项研究所证实。Stimuvax，也称为BLP25脂质体疫苗或L-BLP25，是由Oncothyreon与默克公司合作开发的癌症疫苗。它针对MUC1的外源性核心肽以刺激免疫系统。MUC1是一种在包括前列腺、乳腺、肺和结直肠肿瘤在内的各种肿瘤中广泛表达的I型膜糖蛋白。VacciMax（VM）是另一种用于癌症肽疫苗的脂质体技术。包含MPLA和QS-21的AS01脂质体配方能够产生CD8+ CTL和抗原特异性抗体反应。将短MUC1表位、Th表位和激活TLR2的合成三酰化脂肽（Pam3CSK4）结合的三部分疫苗可以整合到脂质体中，在小鼠中产生高IgG抗体滴度，甚至无需外部佐剂。早期针对肺癌、肝癌、结肠癌和直肠癌的试验表明，含有muramyl二肽衍生物（ImmTher®）的传统脂质体增强了巨噬细胞对Ewing肉瘤的细胞破坏作用。开发了一种非紫外线活性的仙台病毒脂质体和复制蛋白抗原的组合。这些脂质体使得仙台融合蛋白能够添加到各种类型的哺乳动物细胞中，促进直接进入细胞质。与这些疫苗相比，传统脂质体的临床测试显示癌症风险较低。赵等人使用蛋白质抗原载体在小鼠模型的恶性肿瘤中增强免疫识别，使用DNA脂质体-多阳离子复合物。由于其高效率，最近作为疫苗佐剂在实验测试中被研究，用于传递与宫颈癌相关的抗生素蛋白HPV16 E7。为了创建pH敏感的融合性二油酰磷脂酰乙醇胺/蛋黄磷脂脂质体，Eiji Yuba及其同事使用了两种pH敏感的不同类型的聚（甘油醇）衍生物，它们具有线性（MGlu-LPG）结构或超支化（MGluHPG）结构。LNPs，与脂质体类似，是生物相容性和生物可降解药物管理的关键平台。徐等人开发了具有不均匀脂质双层和钙磷酸核心的钙磷酸脂质纳米粒，用作TRP2肽疫苗递送方法以治疗皮肤癌。脂质-钙磷酸疫苗刺激了与游离TRP2肽/CpG相比更强的抗原特异性CTL反应，导致在肺癌模型和B16F10 S.C.中肿瘤生长的更大减少。 2.2.2.5.免疫刺激复合物（ISCOM） 被称为免疫刺激复合物（ISCOM®）疫苗的颗粒状抗原递送载体由磷脂、胆固醇、免疫原和皂苷组成。在这项研究中，我们展示了利用ISCOM®技术开发具有抗癌特性疫苗的优势。通过使用动物模型和模型癌症抗原，观察到ISCOM®疫苗可以独立于CD4+ T细胞刺激CD8 T细胞反应，在三种不同的肿瘤模型中提供保护，并增强Th1偏向的免疫。此外，发现将疫苗抗原与ISCOM®结构耦合显著改善了免疫反应的前三个阶段。值得注意的是，ISCOM®疫苗激活的CD8 T细胞不受体内针对疫苗抗原的抗体存在的影响。虽然免疫接种已被证明对表达疫苗抗原的肿瘤有效，但对表达疫苗抗原阴性的邻近肿瘤细胞没有观察到活性。这表明，通过决定因素传递或旁观者激活并没有实现显著的抗癌作用。作为尚未经过大量人类测试的第三代抗肿瘤疫苗的一部分，正在开发各种合成的非活性佐剂和递送策略。这些包括ISCOM®疫苗、VLPs、脂质体、MF59和热休克蛋白（HREs）。另一类免疫刺激佐剂由植物提取物组成，而不是与细菌或病毒病原体相关的化学物质。南美洲的Quillaja saponaria树皮产生皂苷，它们是水溶性和结构多样的化合物，具有强大的促炎症活性。用于疫苗开发的最常用的RP-HPLC分数的Quillaja saponaria提取物是QS21。被假定为佐剂活性部位的三萜醛类，已在临床前研究中发现可诱导强烈的混合T辅助1（Th1）、体液和CD8 T细胞反应。ASC/NALP3炎症体途径将前IL1和前IL-18转化为它们的生物活性形式，QS21已被证明在很大程度上激活了这些。这证明了它与TLR4配体的组合，以触发前体的上游表达。然而，大量QS21可以引起细胞膜溶解和抗原呈递细胞（APCs）的死亡，表明由此产生的免疫反应的强度和意义与炎症体激活的程度没有直接关系。QS21在癌症免疫治疗疫苗配方中经过了广泛的测试，使用了神经节苷脂抗原（GD2、GD3或GM2）。尽管经常有强烈的体液反应，但没有个体细胞介导免疫的明确证据。QS21和MPLA在佐剂配方AS01和AS15中结合，类似于MAGE-A3癌症疫苗（GSK）。 2.2.2.6.肽和蛋白质偶联递送系统 与其他方法相比，肽疫苗具有几个优点。首先，自从1984年Merrifield因发明固相肽合成而获得诺贝尔奖以来，肽的制造和纯化过程不断发展并实现了自动化。因此，许多合同制造公司现在为研究和治疗目的提供高质量的合成肽，这些肽有详尽的描述且价格合理。与整个蛋白质或其他类型的抗原相比，肽更容易合成和放大。它们的合成简单直接，允许创建针对特定抗原靶标的肽疫苗。这消除了对蛋白质正确折叠或目标抗原位置的担忧，无论是表面结合还是细胞内。另一方面，CAR T细胞疗法需要关注表面抗原。其次，肽代表了癌症表位的最简单和最基本的生物学组成部分。通过使用肽疫苗，可以开发具有明确作用机制的疫苗策略。免疫反应可以精确针对所需的表位。相比之下，确定如肿瘤裂解物等疫苗的内容（包含一系列抗原、其他蛋白质和额外的肿瘤组分）可能具有挑战性甚至不可能。然而，肽疫苗的适度免疫原性可能是它们最大的缺点。肽通常与递送机制和/或佐剂结合使用，因为它们本身通常不足以引发足够的免疫反应。尽管这些系统正在进行研究，但仍需要改进。破伤风类毒素是另一种在肽偶联疫苗（CVs）开发中使用的载体蛋白。Kunz的研究团队描述了一种由破伤风类毒素和源自MUC1的肽组成的合成疫苗。这种疫苗显著增加了小鼠中抗原特异性免疫反应的水平。随后，研究人员将MUC1糖蛋白与Thomsen-Friedenreich抗原和破伤风类毒素的二氟衍生物结合起来，产生能够结合到MCF-7乳腺癌细胞系的MUC1特异性抗体。根据Tsuruma等人的说法，一项针对晚期或复发性结直肠癌患者的survivin衍生肽疫苗的I期临床试验。然而，这种仅含有源自survivin的肽的疫苗并没有显示出任何明显的临床效果。根据Jaeger等人的研究，肿瘤疫苗使用了酪氨酸酶、与黑素瘤相关的Melan A/MART-1肽、gp100/Pme117和流感病毒矩阵肽。自组装肽递送系统中的肽序列或修饰可以诱导超分子组装。例如，可以设计两亲性肽形成胶束、纳米颗粒、类似蠕虫的胶束、纤维状结构或水凝胶网络。刘等人开发了使用来自黑色素瘤的TRP2或来自HPV-16的E7肽的两亲性肽疫苗。这些疫苗与佐剂CpG结合时，有效地抑制了黑色素瘤肿瘤的进展，并分别诱导了大型TC-1肿瘤的持续消退。与它们的母体化合物相比，这些疫苗对身体的危害较小，并显示出增强的抗肿瘤效果。朱等人利用内源性白蛋白和自组装外源疫苗组分（CpG和SIINFEKL）生成了白蛋白/疫苗纳米复合物。这些纳米复合物显著增强了CpG和抗原在淋巴结中的积累。在他们的研究中，王等人得出结论，白蛋白提高了酸性细胞内隔室中抗原的稳定性，并促进了抗原呈递细胞（APCs）的内化。此外，白蛋白促进了抗原在引流淋巴结中的积累。 3.挑战与发展 尽管取得了许多进展和显著的临床结果，但仍有几个挑战需要解决。这些包括低抗肿瘤效果、昂贵的程序和不良反应。控制载体（CVs）必须具备安全、高效和成本效益的品质。纳米颗粒（NPs）由于其增强的免疫原性、能够靶向树突状细胞（DCs）、安全性、改善的抗原吸收和增加的生物利用度，显著有助于实现这些目标。各种物理和化学特性，如大小、靶向配体、颗粒刚度、zeta电位和内在免疫原性，已被证明对抗原呈递、细胞吸收机制、抗原分布以及免疫反应的类型和强度有显著影响。考虑这些因素对于最大化抗肿瘤反应至关重要。 然而，肿瘤生长涉及宿主免疫系统诱导抗肿瘤反应与免疫系统抑制性微环境之间的微妙平衡。CVs和减少癌症微环境（CME）的治疗方法可以结合使用，以增强免疫治疗效果。在这方面已经进行了临床前和临床研究。治疗选项包括适度的激酶抑制剂、抗体或RNA干扰，这些可以调节抑制性免疫环境，以及添加化疗药物如多柔比星、顺铂和多西他赛。 在本章中，我们描述了各种基于聚合物的系统，旨在增强前面提到的癌症免疫疗法的整体效果。这些系统可以通过使用合适的聚合物来解决上述免疫疗法的限制，进一步改善治疗效果、生物相容性和特异性。聚合物系统为结合免疫配体和装载免疫治疗药物提供了独特的递送策略，具有低毒性、高生物可降解性和可定制的表面及尺寸等优势。值得注意的是，聚合物系统可以保护生物活性分子免受不良免疫反应的影响，或促进有利于身体条件的免疫反应。然而，在这些基于聚合物系统的免疫递送方法在临床设置中实施之前，仍有挑战需要克服，包括治疗效果低、免疫疗法抗性、患者安全问题和高昂的治疗成本。因此，需要进一步的研究来增强当前的分布策略。此外，需要更多的研究来探索纳米医学的治疗潜力，考虑到它们的生物相容性以及不同聚合物系统对各种身体部位的影响。 此外，未来基于聚合物纳米粒子的免疫疗法类别应该是异常多功能的，具备目标定位、智能响应性和便于应用的能力。未来的研究趋势将主要集中在并特别看好利用聚合物纳米粒子的个性化免疫疗法。 基于肽的癌症疫苗可以安全、经济、有效地生产。它们已显示出在针对肿瘤特异性和肿瘤相关抗原方面的潜在效果。肽因其能够被用于多重技术中，针对多个表位并传达产生抗原特异性T细胞所需的最小生化信号而特别吸引人。解决低效力问题是肽药物载体可以解决的主要问题之一，以增强免疫反应刺激。大多数关于先进肽递送系统的临床前研究已经采用了一组经过良好表征的肽表位和癌细胞模型。 在临床和临床前研究中，努力标准化肽剂量可能有助于促进直接比较。 可以合成展示增强TCR结合和MHC结合的新肽变体。利用肽混合物可以引发多个CD8+ T细胞反应以及CD4+反应，从而增强T细胞免疫。在MHC限制方面，可以想象识别更大的肽序列或肽池，以适应更广泛的MHC反应性，可能使更多的患者群体受益。 在不久的将来，我们预计癌症肽疫苗的某些模式将持续存在。通过检查点阻断技术和新抗原靶向的进步，可以促进新型肽疫苗递送系统的发展。目前，有几项I/II期临床试验正在进行中，研究肽疫苗与检查点阻断抑制剂联合使用的情况。 疫苗递送系统的进步导致了NPs、自组装肽和无针递送方法的发展。在我们的I期临床试验中，SCIB1是使用EP给药的，以前的癌症和传染病疫苗也是如此。这些更近期的递送技术提供了优越的替代方案，尽管它们的实施受到EP给药不适和需要特定疫苗给药系统的限制。 由于其灵活性、高安全档案以及能够储存微小药物分子或RNA或肽抗原的能力，脂质体被用作递送载体。优化脂质体是必要的，以实现正确的电荷和粒径，以便有效地整合为载体并穿过细胞膜。可以通过各种方法针对癌症抗原，例如向佐剂中添加肽、将抗原封装在NPs中或修改遗传载体以增强局部免疫反应并增加流向LN的交通。 另一个关键的技术挑战是抗原疫苗递送的纳米载体的大规模生产。目前，大多数纳米载体在实验室中以小批量生产，然后扩大到更大的工业产能。鉴于扩大规模过程的高成本，必须密切评估直接影响治疗效果的规模依赖变量。此外，仔细评估扩大规模过程的经济可行性，以防止任何质量危机。 除了配方挑战外，重大的监管障碍阻碍了遗传疫苗在癌症治疗中的使用。要获得监管批准，解决与用于生成用于管理遗传疫苗的纳米系统的辅料相关的主要配方问题及其毒性概况至关重要。 4.结论 基因治疗的主要目标是开发高效且安全的基因载体，能够将外源性基因组分送入特定细胞类型，特别是肿瘤组织。开发和评估向癌细胞传递治疗基因的载体包括病毒和非病毒方法。各种病毒，如逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒，已被修改以消除毒性，同时保持它们强大的基因转移能力。由于与病毒载体相关的局限性，非病毒载体作为一种替代品受到了关注。可生物降解的阳离子聚合物如PEI、PLL、MPs、NPs、肽和脂质体是非病毒载体的例子。 为了提高转染效率，已经开发了几种创新的运输技术和对现有递送系统的改进。疫苗接种的给药方法也可以影响疫苗与注射部位不同抗原呈递细胞之间的相互作用，从而影响免疫系统反应的发展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在癌症治疗中，通过常规治疗方式诱导细胞凋亡，往往因治疗耐药性而受阻，这强调了探索替代细胞死亡途径的迫切需要。铁死亡是一种由脂质过氧化物在细胞膜上致命积累引发的调节性细胞死亡的铁依赖性形式，已成为肿瘤学中一个有前途的前沿领域。诱导铁死亡不仅可以抑制肿瘤生长，而且还具有增强免疫治疗反应和克服对现有癌症治疗的耐药性的潜力。本综述探讨了铁死亡在肿瘤抑制中的作用。 1. 铁死亡背景介绍 鉴于癌症作为主要死亡原因的持续全球影响，在肿瘤学领域寻求创新治疗策略仍然势在必行。虽然传统方法诱导常规细胞死亡，特别是细胞凋亡，但大量恶性肿瘤对诱导细胞凋亡的治疗表现出耐药性，因此需要探索诱导替代细胞死亡方式。近年来引起人们极大兴趣的一种方式是铁死亡，这是一种独特的铁依赖性调节细胞死亡形式，由脂质过氧化物在细胞膜上的过度积累诱导。铁死亡的调节取决于产生脂质过氧化物的促铁死亡细胞活动（方框1）和解毒这些过氧化物的铁死亡防御系统（方框2）之间的微妙平衡（图1）。当促铁死亡活性压倒铁死亡防御机制时，当这些防御在用铁死亡诱导剂 （方框2），脂质过氧化物在细胞膜上的过度积累会破坏膜的完整性，最终导致铁死亡（图1）。方框1 促进铁死亡的细胞活动 促进铁死亡的细胞活动包括各种正常的代谢过程，这些过程产生脂质过氧化物作为附带的副产物。这些过程涉及PUFA-PL的产生和过氧化以及铁和线粒体代谢（图1）。 多不饱和脂肪酸具有多个双键，在介导细胞信号传导和增强膜流动性方面起着关键作用;然而，它们也极易受到过氧化的影响。因此，具有高水平 PUFA-PL 的细胞膜对铁死亡敏感。PUFA-PLs的合成由ACSL4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）等关键酶协调（图2）。ACSL4 负责将游离 PUFA（如花生四烯酸）掺入其相应的 PUFA-CoA 中，而 LPCAT3 促进随后将 PUFA-CoA 整合到 PUFA-PL 中。PUFA-PLs的过氧化主要通过非酶促自氧化发生，涉及铁依赖性Fenton反应。铁也是促进脂质过氧化的酶的辅助因子，如细胞色素P450氧化还原酶和花生四烯酸脂氧合酶（图2）。 细胞通过调节铁的摄取、利用、储存和输出来细致地调节其细胞内不稳定的铁水平，这种平衡的变化决定了铁死亡的易感性。始终如一地，参与 PUFA-PL 合成、过氧化或细胞内不稳定铁水平降低的酶的遗传敲除或药理学抑制促进了癌细胞对铁死亡的抵抗力。癌细胞经常通过抑制这些促进铁死亡的代谢过程来规避铁死亡。 最后，线粒体内发生的代谢过程积极促进铁死亡。例如，电子传递链络合物的电子泄漏产生ROS，特别是超氧化物，随后通过超氧化物歧化酶转化为H2O2 。H2O2通过Fenton反应与不稳定的铁反应，生成催化脂质过氧化的羟基自由基。此外，线粒体内的多种生物合成和生物能量反应，如三羧酸循环和谷氨酰胺分解，也被确定为促进铁死亡的因素，可能是通过产生ROS和ATP。就ATP在铁死亡中的作用而言，ATP耗竭触发AMPK激活，进而通过限制特定PUFA-PLs的合成来抑制铁死亡;相反，ATP的产生抑制AMPK的激活，从而促进铁死亡。 方框2 铁死亡防御机制 铁死亡防御机制包括通过MUFA限制PUFA-PL合成，以及利用直接抵消脂质过氧化物的抗氧化防御系统（图1）。 油酸等MUFA含有单双键，使其具有抗过氧化性。MUFAs阻碍PUFA-PLs的产生及其随后的过氧化，可能通过从PL中置换PUFAs;因此，富含MUFA-PL的细胞膜表现出对铁死亡的抵抗力增强。MUFA-PL的合成受多种酶的调节：SCD1介导MUFA合成，而ACSL3和MBOAT 1/2促进MUFA随后掺入PLs中（图2）。抑制这些酶会使癌细胞更容易发生铁死亡。 细胞还进化出多种抗氧化系统，以有效中和脂质过氧化物，包括GPX4依赖性和不依赖性系统。GPX4依赖性系统被广泛认为是对抗铁死亡的主要防御系统，它依赖于SLC7A11促进的细胞外胱氨酸的摄取。在细胞内，胱氨酸转化为半胱氨酸，半胱氨酸是 GSH 生物合成的限速前体。GPX4利用GSH作为其主要辅因子直接淬灭脂质过氧化物，从而抑制铁死亡（图2）。 抑制SLC7A11介导的胱氨酸摄取的化合物（如erastin、IKE）或阻断GPX4活性或耗尽GPX4蛋白的化合物（例如RSL3、ML210、ML162、JKE-1674和FIN56），统称为FINs，可在许多癌细胞系中诱导强大的铁死亡细胞死亡。此外，其中一些化合物在各种临床前模型中表现出抗肿瘤作用，并有望用于癌症治疗。 不依赖 GPX4 的系统包含多种具有固有铁死亡抑制特性的自由基捕获抗氧化剂，包括还原形式的维生素 E 和 K、泛醇 （CoQH2） 和四氢生物蝶呤（BH4 ）（图 2）。这些自由基捕获抗氧化剂的铁死亡抑制潜力进一步受到负责其产生的大量代谢酶的控制。例如，FSP1、DHODH 和甘油-3-磷酸脱氢酶 2 将泛醌 （CoQ） 转化为其还原形式 CoQH 2 。VKORC1L1 和 FSP1 从各自的氧化对应物中产生还原形式的维生素 K，而 GTP 环水解酶 1 在产生 BH 4 中发挥作用（图 2）。这些酶的敲除或药理学抑制使癌细胞在不同情况下对铁死亡敏感。 图1. 促铁死亡和抗铁死亡活性影响肿瘤结局的动力学。 铁死亡具有独特的形态学和机制特征，使其有别于其他程序性细胞死亡途径，包括细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡。在形态学上，铁死亡细胞表现出线粒体萎缩、线粒体膜密度增加和线粒体嵴减少。从机制上讲，程序性细胞死亡途径涉及独特的细胞信号级联，并由成孔蛋白和/或细胞死亡执行蛋白（例如，细胞凋亡中的半胱天冬酶、坏死性凋亡中的 MLKL 和细胞焦亡中的 gasdermin 蛋白）的激活触发。相反，铁死亡是由含有多不饱和脂肪酸 （PUFA-PL） 的氧化磷脂的致死性积聚引发的，这是由细胞代谢失衡引起的，而没有明显的成孔蛋白或细胞死亡执行蛋白的参与。因此，靶向铁死亡诱导的癌症疗法具有克服传统疗法所观察到的耐药性的潜力，这些疗法旨在触发其他程序性细胞死亡途径，例如在具有沉默半胱天冬酶表达和对细胞凋亡诱导疗法具有耐药性的肿瘤中。 2. 肿瘤抑制和铁死亡 越来越多的证据强烈支持铁死亡作为一种自然的抗肿瘤机制，通过与多种肿瘤抑制基因的相互作用发挥其抗肿瘤作用（图2）。有趣的是，特定肿瘤原癌基因的突变似乎为癌细胞获得了规避铁死亡的独特优势（图2）。此外，由癌症淋巴转移和肿瘤进展驱动的癌干细胞（CSCs）过程与抑制铁死亡密切相关。 图2：肿瘤抑制基因和癌基因在铁死亡调节网络中的作用 2.1 在铁死亡中促进肿瘤抑制因子的活性 TP53是最常见的突变肿瘤抑制基因，是将铁死亡与肿瘤抑制联系起来的突出例子之一。TP53通过直接结合到SLC7A11启动子或与泛素特异性蛋白酶7相互作用，降低SLC7A11的表达，从而促进铁死亡（图2）。此外，TP53可以通过调节其他参与细胞代谢的基因的表达，如精胺/精胺N1-乙酰转移酶1、铁氧还蛋白、谷氨酸酶2和维生素K氧化还原酶复合物亚基1样1（VKORC1L1），来增强铁死亡。有趣的是，无法诱导细胞凋亡、衰老或细胞周期停滞的乙酰化缺陷突变体的TP53仍然保留促进铁死亡和抑制肿瘤生长的能力。相反，无法诱导铁死亡的其他TP53突变体也失去了它们的肿瘤抑制功能。这些研究强调了TP53在铁死亡介导的肿瘤抑制中的关键作用。 然而，进一步的研究揭示了TP53在铁死亡调节中更为复杂的作用。研究表明，TP53可以增加非钙依赖磷脂酶A2β（iPLA2β）的表达，这是一个负责从磷脂酸甘油酯（PLs）的甘油骨架上切除酰基的酶（图2）。iPLA2β在脂质代谢中的作用导致氧化性PL水平降低，并增强癌细胞对铁死亡的抵抗力。因此，在这种情况下，TP53介导的iPLA2β表达上调似乎对抗TP53的促铁死亡功能，而不是促进铁死亡。此外，在其他癌细胞环境中，TP53甚至可能对铁死亡产生抑制作用。通过促进p21-谷胱甘肽（GSH）轴或抑制二肽基肽酶4（DPP4）活性来实现这种抑制。这些观察结果表明，TP53在调节癌细胞对铁死亡的敏感性方面具有双重作用，并且这种双重作用取决于环境。 其他肿瘤抑制蛋白对SLC7A11的负调节进一步突出了铁死亡调节在肿瘤抑制中的关键作用（图2）。BAP1去除SLC7A11启动子上的H2A单泛素化，抑制半胱氨酸摄取，促进铁死亡。这种机制有助于BAP1介导的体内肿瘤抑制。同样，肿瘤抑制因子AMER1已被证明与SLC7A11和铁蛋白轻链相互作用，促进它们的蛋白质降解，并使结肠癌细胞易于铁死亡。AMER1缺乏增强结肠癌细胞对铁死亡的抵抗力，从而促进转移。 由于像KEAP1和ARF这样的肿瘤抑制因子对NRF2的控制，进一步阐明了铁死亡与肿瘤抑制之间的联系（图2）。KEAP1将NRF2定位到蛋白酶体降解，而ARF抑制NRF2的转录活性。KEAP1或ARF的丢失导致NRF2活化，通过协调多个与铁死亡防御和铁代谢相关的基因的调节来提供对铁死亡的保护。KEAP1或ARF介导的抑制NRF2对铁死亡的活化可能是一个重要的肿瘤抑制机制。 非经典的肿瘤抑制因子也已被证明促进癌细胞铁死亡。例如，最近的研究揭示了赖氨酸甲基转移酶2B（MLL4）在铁死亡介导的肿瘤抑制中的作用，这是一种在人类癌症中频繁突变的激酶。在分子机制上，MLL4缺陷导致铁死亡相关基因（如ALOX12、ALOX12B和ALOXE3）的表达减少，同时增加了与铁死亡抵抗蛋白（如SLC7A11和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4））的表达（图2）。这种分子重编程增强了癌细胞对铁死亡的抵抗力，促进了肿瘤的发展。 2.2 癌基因介导的对铁死亡的规避 许多癌基因突变已被证明通过加强抗氧化防御系统来增加癌细胞对铁死亡的抵抗力，这些系统抑制了脂质过氧化或限制了促进脂质过氧化的细胞代谢过程，包括不稳定铁池的生成、PUFA-PLs的合成和线粒体活性氧（ROS）产生（图1）。 增强细胞防御系统，特别是通过SLC7A11介导的半胱氨酸摄取，是促进癌细胞规避铁死亡的关键机制。一个显著的例子是RAS癌基因家族。RAS突变的癌细胞表现出SLC7A11转录增加、细胞内半胱氨酸和GSH水平升高（图2）。抑制或基因消融SLC7A11极大地影响KRAS突变肿瘤的生长，突显了SLC7A11在促进突变KRAS驱动的肿瘤规避铁死亡和后续生长中的关键作用。 尽管野生型p53作为肿瘤抑制因子功能，但某些p53突变蛋白（如p53 R273H和p53 R175H）获得了促进肿瘤生长的增益功能。与预期的抗铁死亡功能相反，之前的研究表明，p53 R273H和p53 R175H突变体表现出与NRF2相互作用来抑制SLC7A11表达和促进铁死亡的矛盾能力。然而，值得注意的是，最近的研究提出了相反的发现，表明p53 R273H突变体通过与BTB和CNC同源1相互作用来上调SLC7A11的转录，从而抑制铁死亡。这种抗铁死亡功能至少部分地有助于p53 R273H突变体促进肿瘤生长的能力。这种有趣的p53突变体双重功能强调了p53在调节铁死亡中的角色的复杂性。 在癌症中，通过其他癌基因突变驱动的后转录机制也可以实现SLC7A11的上调。例如，RAS癌基因家族的RAS突变已被证明通过增强MEK-ERK信号转导通路来促进SLC7A11的转录，从而增强癌细胞对铁死亡的抵抗力。 3. TME中的铁死亡 TME是一个由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和其他细胞组成的多方面生态系统。这些成分不仅共存，而且还参与复杂的相互作用，显着影响肿瘤的生长和进展。铁死亡和TME以复杂的方式连接（图3）。一方面，癌细胞中的铁死亡可能会激发或调节TME中的免疫反应。另一方面，TME中免疫细胞对铁死亡的敏感性差异很大，不同类型的免疫细胞可以增强或抑制癌细胞的铁死亡。 图3. 铁死亡在肿瘤微环境中的复杂作用 3.1 铁死亡癌细胞的免疫原性 铁蛋白癌细胞，特别是那些在FIN治疗后早期阶段的癌细胞，因其释放多种免疫刺激信号而值得注意，包括高迁移率盒1蛋白、钙网蛋白、ATP和氧化PL。这些免疫刺激信号代表了免疫原性细胞死亡的特征性标志物。这些信号有助于树突状细胞的成熟，并提高巨噬细胞吞噬铁细胞下垂癌细胞的效率。例如，位于铁死亡癌细胞表面的氧化PL物质:1-硬脂酰基-2-15-HpETE-sn-甘油-3-PE可以被巨噬细胞上的Toll样受体2识别，从而促进铁细胞的吞噬作用。 这些相互作用不仅驱动巨噬细胞向 M1 表型极化，而且还促进肿瘤内 T 细胞浸润和活性。甚至可以触发类似疫苗的反应，激活抗肿瘤免疫力。相反，抑制铁死亡会导致 T 细胞浸润和 TME 活性降低，最终抑制 T 细胞介导的抗肿瘤反应。这一证据将铁死亡定位为免疫原性细胞死亡的一种潜在形式。 3.2 TME组分在铁死亡调节中的作用 TME中的各种细胞成分可以通过增强或抑制铁死亡来影响癌细胞对铁死亡的敏感性（图3）。一个典型的例子涉及CD8 + T细胞，其干扰素γ（IFNγ）的分泌部分解释了它们促进癌细胞中的铁死亡。IFNγ对癌细胞的铁死亡具有双重影响，通过下调SLC7A11表达和增强ACSL4表达来抑制胱氨酸摄取，从而促进ACSL4介导的PUFA-PLs（特别是含有花生四烯酸的PUFA-PLs）的合成;因此，IFNγ 不仅通过抑制细胞对铁死亡的防御，而且通过放大驱动这一过程的代谢活动来促进脂质过氧化并诱导癌细胞的铁死亡。 同样，TME内不同细胞类型分泌的各种细胞因子能够促进或抑制铁死亡。例如，TGFβ1 通过 SMAD 介导的信号转导增强肿瘤细胞铁死亡， 而白介素-1β 通过增强烟酰胺核苷酸转氢酶乙酰化来抑制铁死亡，以促进 NADPH 产生和铁硫簇稳态。此外，TME中一种独特的代谢特征是乳酸过剩和葡萄糖的可用性受限。葡萄糖耗竭通过激活 AMP 活化蛋白激酶 （AMPK） 介导的乙酰辅酶 A 羧化酶磷酸化来保护癌细胞免于铁死亡。同样，癌细胞利用免疫抑制性乳酸来抵消铁死亡，通过提高癌细胞内的 MUFA-PL 合成或增强 TME 内的酸度。然而，另一项研究表明，n-3 和 n-6 多不饱和脂肪酸 （PUFA） 选择性诱导酸性 TME 癌细胞的铁死亡;因此，在这种特定情况下，肿瘤酸中毒似乎具有促进铁死亡的作用。 3.3 TME中的铁死亡和先天免疫：抗肿瘤免疫的微妙平衡 先天免疫系统包括巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤 （NK） 细胞，在抗肿瘤防御中起着关键作用。这些细胞不仅直接靶向癌细胞，还增强适应性免疫，其反应受到铁死亡及其细胞副产物的显着影响（图3）。 在 TME 中，肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 主要表现出免疫抑制性 M2 表型。癌症免疫学研究旨在根除 M2 TAM 和/或将其转化为更具抗肿瘤性的 M1 表型。最近的研究表明，M1 TAMs比M2 TAMs表现出更大的铁死亡抵抗力。从机制上讲，这种增强的耐药性至少部分归因于M1 TAM中诱导型一氧化氮合酶的表达升高和一氧化氮自由基（NO·）的产生增加;这些NO自由基能够解毒15-LOX反应过程中产生的脂质自由基，从而保护M1 TAM免受铁死亡。此外，与 M2 巨噬细胞相比，M1 巨噬细胞表现出铁蛋白重链 1（负责铁蛋白形成和细胞内铁螯合）的表达增加和铁转运蛋白（一种将铁输出出细胞的转运蛋白）的表达降低。这些改变可能导致 M1 TAM 内不稳定的铁池减少，因此可能有助于它们对铁死亡的抵抗力。 与 M1 TAM 相比，在 M2 TAM 中观察到的铁死亡敏感性更高，这表明铁死亡诱导疗法可能选择性地靶向和消除 M2 TAM，而不影响 M1 TAM。这种疗法可以有效地将M2 TAMs重编程为M1表型，从而为克服免疫抑制TME和提高癌症免疫治疗的疗效提供了一种有前途的策略。根据这一概念，各种研究表明，已知诱导铁死亡的铁纳米颗粒也可以将M2 TAMs重新编程为M1表型，从而增强其抗肿瘤特性。 尽管如此，其他研究揭示了TAMs和铁死亡之间更复杂的相互作用。例如，研究表明，铁死亡实际上可以促进 TAM 向 M2 表型的募集和极化;相反，抑制铁死亡似乎可以抵消胶质母细胞瘤中免疫抑制表型的发展。此外，已经观察到促铁死亡条件，如高铁饮食或 GPX4 耗竭，可以通过 STING 依赖性 DNA 感应途径调节巨噬细胞的浸润和极化，影响 M1 和 M2 巨噬细胞。这反过来又促进了胰腺癌的进展。总的来说，这些发现说明了在抗肿瘤免疫的背景下，铁死亡和巨噬细胞之间复杂且看似矛盾的关系。 髓源性抑制细胞 （MDSC） 是 TME 中另一种相关的免疫细胞类型，以其强大的免疫抑制功能而闻名。MDSCs还表现出对铁死亡的抵抗力，主要归因于抑制由n-酰基鞘氨醇酰胺水解酶2（ASAH2）介导的p53-血红素加氧酶1信号转导轴。ASAH2 的抑制已被证明可以诱导 MDSC 中的铁死亡，从而增强 CD8 + T 细胞的肿瘤浸润能力，从而增强它们对肿瘤生长的抑制。另一项研究进一步强调了将铁死亡诱导与MDSC阻断相结合以提高癌症免疫治疗有效性的潜在益处。在这项研究中，肝细胞癌小鼠模型中的Gpx4缺陷不仅导致CD8 + T细胞浸润增加，而且上调了肿瘤细胞上的程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）表达，并促进了多形核（PMN）-MDSCs浸润到TME中。这些具有免疫抑制作用的后一种表型似乎有助于在具有 Gpx4 缺陷的肝细胞癌模型中观察到缺乏肿瘤抑制。因此，将 GPX4 抑制剂与阻断 MDSC 募集的治疗策略相结合，可显著提高抗 PD-1 治疗的疗效，从而延长患有肝细胞癌的 Gpx4 野生型小鼠的生存期。 NK细胞在抗肿瘤免疫中起着核心作用。TME 中的 NK 细胞功能障碍与脂质过氧化驱动的氧化应激有关;NRF2 转录因子的激活已被证明可以挽救 NK 细胞功能和抗肿瘤活性。与此一致，铁死亡抑制可增加肿瘤中NK细胞的存活率。总体而言，这些发现表明NK细胞对TME内铁死亡的潜在脆弱性。 总之，这些研究揭示了铁死亡对TME中多种先天免疫细胞类型的复杂影响（图3）。它们强调了免疫抑制性 M2 TAM 和肿瘤浸润性中性粒细胞以及免疫刺激性 NK 细胞对铁死亡的脆弱性。相反，免疫抑制性MDSC似乎表现出铁死亡抵抗性或易感性，具体取决于具体情况。更全面地了解TME内铁死亡与先天免疫系统之间错综复杂的相互作用，对于改进和扩展癌症免疫治疗策略至关重要。 3.4 铁死亡是TME适应性免疫的一把双刃剑 适应性免疫系统主要由 B 细胞和 T 细胞组成，它们在 TME 内进行重编程，以对肿瘤进展施加额外的控制。经历铁死亡的癌细胞释放的产物，如脂质过氧化物，可以影响适应性免疫细胞的活性及其识别肿瘤抗原的能力（图3）。与先天免疫细胞一样，适应性免疫细胞对铁死亡的敏感性因环境而异（图3）。 B细胞在抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用，主要是通过产生抗肿瘤抗体及其对T细胞反应的影响。与滤泡 B2 细胞相比，包括 B1 和边缘区 B 细胞的先天样 B 细胞表现出活跃的脂质代谢。GPX4 对于维持这些细胞的抗体反应和整体功能至关重要，使它们对 GPX4 缺陷诱导的铁死亡敏感。虽然这一发现可能为靶向某些B细胞恶性肿瘤中的GPX4开辟新的治疗途径，但需要进一步研究以充分了解铁死亡对B细胞介导的抗肿瘤免疫的影响。 一些研究表明，T细胞在各种模型中对铁死亡具有相对的抵抗，从而支持铁死亡可以在癌细胞中选择性诱导，而不会显着损害T细胞介导的抗肿瘤免疫。例如，小鼠中的Slc7a11缺失抑制了肿瘤生长，而不影响体内T细胞增殖和抗肿瘤免疫，同时还增强了临床前模型中免疫检查点阻断的功效。同样，通过胱氨酸耗竭或花生四烯酸补充诱导的铁死亡会阻碍肿瘤生长，而不会影响（有时甚至增强）TME 中的 T 细胞增殖和功能。相反，阻断 ACSL4 介导的铁死亡会降低 T 细胞介导的抗肿瘤免疫。此外，GPX4 抑制或敲除已被证明可以增强三阴性乳腺肿瘤小鼠的 CD4 + 和 CD8 + T 细胞群。此外，各种纳米颗粒介导的诱导铁死亡的方法有助于增强TME中T细胞浸润。这些发现共同强调，通过各种方法诱导铁死亡对T细胞无害;相反，它似乎增强了T细胞对肿瘤的免疫反应，至少在某些情况下是这样。 然而，其他研究发现，T 细胞容易受到 GPX4 抑制诱导的铁死亡的影响。缺乏 Gpx4（来源于 T 细胞特异性 Gpx4 缺失的小鼠）的 T 细胞在其细胞膜内迅速积累脂质过氧化物并最终死于铁死亡。特别是CD8 + T细胞已被证明比癌细胞更容易受到GPX4抑制剂诱导的铁死亡。 此外，CD36 的表达升高，以其在促进肿瘤浸润 CD8 + T 细胞中脂肪酸摄取的作用而闻名，可诱导这些 T 细胞中的脂质过氧化和铁死亡，导致其抗肿瘤活性受损。相反，CD36 的遗传消融或抑制 CD8 + T 细胞中的铁死亡可恢复其抗肿瘤活性。 GPX4介导的铁死亡防御作用也延伸到CD4 + T细胞。其中，T reg 细胞代表具有免疫抑制活性的亚群，阻碍了对肿瘤的保护性免疫监视。Treg 细胞具有对铁死亡的内在抗性，可能是因为它们的 GPX4 表达增强;因此，Treg 细胞中 Gpx4 的特异性缺失诱导铁死亡，进而增强抗肿瘤免疫反应。除 T reg 细胞外，滤泡辅助性 T （TFH ） 细胞（促进抗肿瘤免疫的 CD4 + T 细胞的另一个亚群）表现出对铁死亡的易感性。GPX4 表达已被证明对其存活和功能至关重要。尽管如此，TME内铁死亡和TFH 细胞之间的相互作用值得进一步研究。 总的来说，SLC7A11缺乏或GPX4缺乏诱导的铁死亡对T细胞功能和抗肿瘤免疫有明显的影响。与SLC7A11相比，T 细胞似乎更依赖 GPX4，这可能是由于 T 细胞中 SLC7A11 的表达相对较低且非必需功能。通过SLC7A11抑制和/或补充花生四烯酸诱导铁死亡似乎不会阻碍CD8 + T细胞的抗肿瘤免疫反应，在某些情况下甚至可能增强。另一方面，不同的 T 细胞亚群表现出 GPX4 抑制诱导的铁死亡的不同作用：免疫抑制性 Treg 细胞中的 GPX4 抑制进一步增强抗肿瘤免疫，而 CD8 + T 细胞和 TFH 细胞中的 GPX4 抑制会损害抗肿瘤免疫。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓