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摘要:登革热是世界上最普遍的蚊媒传播疾病之一，据模型估计，每年约有3.9亿人受到影响。在过去的二十年中，开发安全有效的疫苗以预防登革热病毒（DENV）感染的努力面临了若干挑战，这些挑战大多与进行长期研究以评估疫苗的效力和安全性有关，以排除疫苗诱导的DHS/DSS的风险，特别是在儿童中。至少有七种DENV疫苗已经进行了不同阶段的临床试验；然而，只有三种疫苗（Dengvaxia®，TV003和TAK-003）显示出了有希望的结果，并在本综述中就其分子设计、效力和免疫原性进行了详细讨论。在DENV疫苗开发过程中与安全性相关的挑战也进行了讨论。 关键点:登革热疫苗的开发具有挑战性，因为需要提供针对所有四种登革热血清型的保护，以避免在进一步感染中可能引起抗体依赖性增强。Dengvaxia®是目前唯一获得许可的疫苗，但另外两种疫苗TV-003/TV-005和TAK-003的第三阶段临床试验目前正在进行中，并显示出有希望的结果。 1.引言 登革热对全球公共卫生系统构成了巨大负担，被认为是世界上热带和亚热带地区最普遍的蚊媒传播疾病，由于气候变化、与无控制的城市化相关的森林砍伐、人口过剩以及蚊子对常见杀虫剂的抗性出现等多种因素，每年都在迅速扩大。登革热由登革热病毒（DENV）引起，该病毒属于黄病毒科黄病毒属，由伊蚊属蚊子传播，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊。已报告有四种遗传上不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4）在全球人类中共同循环。登革热的临床表现范围很广，从轻微的发热疾病到严重的登革热，增加了发展为登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）的风险。第二次DENV感染（例如，暴露于异型血清型）是严重疾病的最大风险因素，因为抗体依赖性增强（ADE）现象。简而言之，首次暴露于DENV血清型后产生的交叉反应性抗体与第二种DENV血清型结合，形成传染性免疫复合物，进入带有Fc受体的细胞。因此，感染的细胞数量和每个细胞产生的病毒量增加。因此，DENV疫苗必须能保护免受所有四种血清型的感染，以避免ADE。 至少有七种基于不同平台的DENV疫苗，包括活减毒病毒、灭活病毒、嵌合活减毒病毒、DNA和重组蛋白，已经开发出来，目前正在进行不同阶段的临床试验（表1）或正在进行临床前研究。在本综述中，我们讨论了三种最先进的DENV疫苗（Dengvaxia®，TV003/TV005和TAK-003）的最新进展（表2），重点讨论了每种疫苗的分子特征（图1）以及它们效力和免疫原性的临床数据。最后，我们强调了与疫苗诱导的DHS/DSS风险相关的安全性挑战。 图1 处于临床开发高级阶段的抗登革热病毒（DENV）疫苗的分子设计。A Dengvaxia®基于黄热病病毒（YFV）的骨架，其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因已被四种DENV血清型中每一种的同源基因所取代。B TV003/TV005是通过在DENV-4和DENV-1的3′-UTR的TL2茎环中删除30个核苷酸（172-143）（rDEN4∆30和rDEN1∆30）构建的，DENV-2和DENV-3组分是从rDEN4∆30骨架构建的。C Tak-003/DENVax基于一种活减毒的DENV-2株（PDK-53-V），其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因已被四种DENV血清型中每一种的同源基因所取代。 为了本综述，我们系统地搜索了PubMed、Web of Science和clinicaltrial.gov，以获得有关疫苗、试验以及登革热疫苗安全性和免疫病理学等特定主题的结果。我们为这份文件选择了最合适的参考文献。 2.登革热病毒（DENV）疫苗的开发和临床前评估 2.1.Dengvaxia® 这种疫苗最初由国立卫生研究院（NIH）、圣路易斯大学和Acambis Inc在2000年代初开发，并随后由Sanof Pasteur许可，利用了ChimeriVax™技术。基于黄热病病毒（YFV）的疫苗株（17D），其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因被来自泰国和印度尼西亚1978年至1988年间获得的DENV分离株的同源基因所取代，这项技术使得产生了四种嵌合的YF-DEN病毒，用于配制四价DENV疫苗（ChimeriVax™ DENV 1-4）。 四价ChimeriVax™ DENV 1-4疫苗的临床前安全性和免疫原性评估显示，与亲本黄热病病毒（YFV）疫苗株（YF-VAX）相比，小鼠的神经毒力降低。此外，在猕猴中进行的神经毒力测试证实，四价ChimeriVax™ DENV 1-4疫苗的神经毒力显著低于亲本YF-VAX株。此外，该疫苗在狨猴中一次给予高剂量或低剂量后，对所有四种DENV血清型产生血清转换和强烈的中和抗体反应，并与亲本DENV株相比，病毒血症有限。有趣的是，挑战研究表明，92%的接种猴子对野生型DENV 1-4的挑战受到保护。 2.2.TV003/TV005 自1996年以来，国家过敏和传染病研究所（NIAID）传染病实验室（LID）开始开发称为TV003/TV005的活减毒DENV疫苗。考虑到非翻译区（UTRs）对DENV基因组复制的重要性，最初的减毒策略集中在从DENV-4的3'-UTR的TL2茎环中删除30个连续核苷酸（172-143）（rDEN4∆30）。同样，也为DENV-1构建了缺乏相同同源基因组区域的突变株（rDEN1∆30）。两种突变株均表现出减毒表型，其感染力降低，并在猕猴中诱导产生强烈的中和抗体反应，与用野生型DENV-1和DENV-4挑战时的保护相关。 为了实现四价DENV疫苗的进一步努力，通过使用rDEN4∆30的骨架生成了减毒DENV-2组分，生成了两个减毒DENV4-DENV2嵌合病毒，其中DENV-4的膜和包膜基因（rDEN2/4 ∆30 (ME)）或衣壳、膜和包膜基因（rDENV2/4 ∆30 (CME)）被DENV-2的同源基因所取代。两种嵌合体的临床前评估表明，它们在SCID-HuH-7小鼠和猕猴中均表现出高度减毒的表型，嵌合和∆30缺失是累加的，使病毒对猴子不具传染性。生成了包含原始30 nt缺失的DENV3-DENV4嵌合病毒（rDEN3 ∆30 (ME)），并通过引入不连续的31 nt缺失（258-228）（rDEN3 ∆30/31）进一步修改。在非人灵长类动物中对突变病毒rDENV3 ∆30/31的临床前评估显示了理想的安全性，病毒血症不可检测，以及强烈的中和抗体反应，足以保护接种的猴子在用野生型DENV-3挑战时。 2.3.TAK‑003 (DENVax) DENVax疫苗的开发始于1980年代末，当时泰国曼谷玛希隆大学的研究人员从患有登革出血热的患者的血清中分离出DENV-2株（DENV-2 16681）。通过在原狗肾细胞（PDK细胞）中进行53次连续传代，获得了DENV-2 PDK-53-V株，与亲本DENV-2 PDK-53株相比，该株在5'UTR和NS1基因中具有与减毒相关的突变，并且在NS3基因中还具有额外的非同义突变。DENV-2 PDK53-V株在乳鼠中显示出降低的神经毒力，在C6/36细胞中的复制率较低，并被进一步用作生成DENVax疫苗的骨架。 用于配制四价DENVax疫苗的DENV-1、DENV-3和DENV-4疫苗株是通过用野生型DENV株的prM和E基因替换DENV-2 PDK53-V株的prM和E基因而生成的。嵌合DENVax病毒在LLC-MK2细胞中复制时显示出“小斑块”和温度敏感表型，与亲本野生型株相反。含有四种DENVax疫苗株（DENV 1-4）的四价配方在新生ICR小鼠中显示出降低的神经毒力，并在AG129基因敲除小鼠中显示出免疫原性，诱导产生针对四种DENV血清型的高滴度中和抗体（1:320–1:2560）。在狨猴（Macaca fascicularis）中对四价DENVax疫苗的临床前评估显示了良好的疫苗安全性概况，并且通过皮下途径给药时耐受性良好，而在用高剂量方案的5:5:5:5配方的每种DENVax株（DENVax 1-4）进行两次免疫后，可诱导对四种DENV血清型的保护（通过保护病毒血症来衡量）。 3.DENV疫苗的临床评估 迄今为止，Dengvaxia®是唯一获得许可的DENV疫苗，但TV-003/TV-005和TAK-003的第三阶段临床试验目前正在进行中，并显示出有希望的结果。然而，正如我们所讨论的，疫苗接种者的年龄和血清状态的差异已被证明直接影响疫苗的效力和安全性。迄今为止，大多数关于DENV疫苗的安全性问题来自第三阶段的儿童临床试验，只有Dengvaxia®和TAK003（DENVax）已在儿童中进行了测试，结果参差不齐（图2）。 图2 拉丁美洲和亚洲儿童中抗登革热病毒（DENV）疫苗的效力试验概述。Dengvaxia和DENVax的III期临床试验结果不一。TV003/TV005目前正在进行III期临床试验。*在II期临床试验中观察到的TV003/TV005的血清转换率如图所示。**图中描绘的效力范围的较低值对应于在泰国进行的IIb期试验中观察到的效力。***DENVax在血清阴性个体中仅对DENV-1和DENV-2有效。 3.1.Dengvaxia® 早期的I期和II期临床试验评估了Dengvaxia®（TDV）四价制剂在健康成年人（18至45岁）中的安全性、免疫原性和反应原性，这些研究在美国、菲律宾、澳大利亚、墨西哥、越南、新加坡和印度进行；其中一些研究还包括了2至18岁的儿童人群。对成年人中Dengvaxia®疫苗的主要安全性评估显示，该疫苗在0、3-4和12个月的三剂接种方案中安全且耐受性良好，引起轻度至中度的短暂局部和全身不良事件，如注射部位疼痛、头痛、不适和低烧等，没有报告与疫苗相关的严重不良事件（SAEs）。对疫苗诱导的细胞反应的评估显示，该疫苗没有诱导促炎细胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70）的释放，而诱导了DENV血清型特异性T辅助反应。观察到对用作ChimeriVax™病毒骨架的YFV-17D株的NS3蛋白的CD8反应。在预先存在DENV免疫的个体中，该疫苗诱导了更广泛的中和抗体反应，并增强了针对DENV非结构蛋白的特定CD8+反应，特别是NS3，在未接触的个体中不引起反应。尽管大多数评估Dengvaxia®效力的III期临床试验是在儿童（<18岁）中进行的，但在澳大利亚对健康成年人进行的评估疫苗批间一致性的随机III期临床试验显示，尽管未接触的个体在接受一剂疫苗后对所有四种DENV血清型产生了中和抗体，但唯一产生的血清型特异性中和抗体是针对DENV-4的。相反，DENV 1-3被交叉反应性抗体中和，揭示了疫苗中DENV-4组分的免疫优势。此外，在未接触登革热的个体在接受一剂疫苗后，通过RT-PCR观察到每个疫苗组分的不同病毒复制率：DENV-4（44%）、DENV-3（12%）、DENV-1（7%）和DENV-2（0%），这可能使血清阴性个体在感染DENV-2时发展为疫苗增强疾病的风险。关于Dengvaxia®在儿童人群中的效力和安全性的最具信息性的研究是在35,000名2至16岁的儿童中进行的。该研究显示，效力与年龄相关，9岁以上儿童为65%，9岁及以下儿童为45%。令人担忧的是，9岁以下儿童在自然接触病毒后免疫接种后发展为严重登革热的趋势，这种效应特别是在未接触登革热的儿童中观察到。评估Dengvaxia®效力的儿童研究显示，效力在不同DENV血清型和年龄组之间变化。在泰国进行的IIb期试验中，对4002名4至11岁儿童的Dengvaxia®效力进行评估，结果显示针对DENV-4和DENV-3的疫苗效力较高（分别为100%和75.3%），而针对DENV-1和DENV-2的效力较低（分别为55.6%和9.2%）。在五个登革热流行拉丁美洲国家进行的更大规模的儿童III期临床试验中，对20869名9至16岁的健康儿童进行了评估，结果显示针对DENV-3和DENV-4的效力较高（分别为74.0%和77.0%），而针对DENV-1和DENV-2的效力较低（分别为50.3%和42.3%），证实了疫苗效力在血清型之间变化，并且与年龄相关。这一点后来在一项更大的III期临床试验中得到证实，该试验评估了Dengvaxia®在拉丁美洲和亚洲2至16岁健康儿童中的效力。这项研究的结果表明，在25个月的随访期间，9岁以上儿童的临床登革热总效力（65.6%）高于9岁以下儿童（44.6%）。此外，9岁以下儿童因登革热需要住院的相对风险（1.58）高于9岁以上儿童（0.5）。进一步的试验表明，9岁以下儿童因登革热需要住院的观察到的年龄依赖性风险可能与预先存在的抗DENV免疫有关。一项分析了三项不同效力试验数据的队列研究显示，2至16岁血清阴性疫苗接种者的住院率（3.06%）高于血清阴性对照组（1.87%），这种趋势也观察到在9至16岁血清阴性疫苗接种者中（血清阴性个体1.57%，血清阳性个体1.09%）。尽管在不同的临床试验中观察到Dengvaxia®的高疫苗效力，但使用菲律宾超过800,000名儿童接种的数据进行的最新数学模型估计，在接种后4年内，无论是血清阴性还是血清阳性个体，都将有超过1000例因严重登革热住院的病例。这些模型以及在9岁以下儿童中观察到的高住院率，这些儿童被错误地认为是疫苗失败的病例，强调了在批准和部署疫苗之前，在接种Dengvaxia®的儿童中进行增强的IV期监测研究的重要性，以便更好地评估疫苗在登革热流行国家的有效性。 3.2.TV003/TV005 在其临床开发的早期阶段，进行了几项I期临床试验，使用DENVax疫苗候选物的单价制剂评估安全性概况、各个DENVax病毒的复制能力，以及从接种个体到Toxorhynchites splendens蚊子的传播性。 在这些初步研究之后，选择了六种单价DENVax疫苗候选物进行进一步的临床评估，配制成五种四价混合物（TV-001至TV-005）。两种疫苗候选物（TV003和TV005），含有rDEN1D30 rDEN2/4D30, rDEN3D30/31, 和 rDEN4D30，但rDEN2/4D30组分的量不同（TV003为103PFUs/mL，TV005为104PFUs/mL），在诱导针对四种DENV血清型的最平衡的中和抗体反应后被选中进行进一步的临床评估。 在对黄病毒未接触的受试者进行的两项随机安慰剂对照试验中评估了TV003和TV005的安全性和免疫原性，结果表明TV003和TV005均耐受性良好，显示出良好的安全性概况，其中76%的参与者报告了低级别的皮疹作为最常见的不良事件。TV003的单剂量诱导了针对四种DENV血清型的平衡中和抗体反应，血清转换率在64%（DENV-2）到100%（DENV-4）之间，而TV005疫苗在单剂量后对DENV-2的特定反应有所提高（84%）。 TV003接受一剂后对DENV-2产生血清转换的参与者比例较低，导致了使用原始rDEN2D30作为挑战病毒的DENV-2挑战模型的开发，该模型在接种疫苗后6个月使用，因为它诱导的病毒血症比疫苗株（rDEN2/4D30）高100倍。结果显示所有参与者都产生了针对DENV-2的保护性反应，并诱导了针对DENV-2的特定中和抗体。 这些结果导致TV003疫苗被巴西布坦坦研究所授权，以Butantan DV的名称生产，这是一种冻干的四价DENV疫苗，并在18至59岁的155名DENV未接触和145名DENV暴露的健康个体中进行了两步、双盲、随机、安慰剂对照的II期临床试验。该疫苗安全且耐受性良好，并在两种DENV未接触和DENV暴露的参与者中诱导了强劲的平衡中和抗体反应，四种DENV血清型的血清转换频率均高于78%。在接种Butantan-DV疫苗一剂后的第91天，DENV未接触和DENV暴露的参与者中观察到显著的T-CD8反应，这表明与基于结构性DENV蛋白表达的四价疫苗相比，这种疫苗在成人中诱导了更广泛的保护性免疫反应。目前正在巴西进行一项随机、多中心、双盲、安慰剂对照的III期临床试验，以评估Butantan-DV疫苗，共有16,944名参与者，分为三个年龄组（18-59岁，7-17岁，和2-6岁）；这项试验的结果尚未公布。 3.3.TAK‑003 (DENVax) DENVax的临床评估始于武田在哥伦比亚里奥内格罗进行的一项随机、双盲、剂量递增的I期临床试验，旨在评估18至45岁DENV未接触成人通过皮内（ID）或肌肉内（IM）接种两剂DENVax的安全性和针对四种DENV血清型的免疫原性。该疫苗在研究参与者中安全且耐受性良好，诱导了短暂的局部反应原性和轻度系统性不良事件。疫苗接种诱导了针对四种DENV血清型的中和抗体的产生，但参与者中针对DENV-3和DENV-4的抗体滴度较低。由于针对DENV-4的抗体反应较低，DENVax（现在称为TDV）被重新配制以增加DENVax4组分的量，并在一项随机、多中心、Ib期研究中测试了不同的配方和剂量计划，该研究在美国进行，涉及140名18至45岁的DENV未接触个体。研究参与者中观察到的血清转换率分别为84-100%（DENV-1），96-100%（DENV-2），DENV-3：83-100%（DENV-3），和33-77%（DENV-4）。 在波多黎各、哥伦比亚、新加坡和泰国进行的随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验中，评估了TDV疫苗两剂方案（0, 90天）在DENV暴露个体中的安全性和免疫原性，使用了更高滴度的DENVax3和DENVax4组分的“高剂量”疫苗，结果显示无论先前是否接触过DENV，疫苗诱导的针对DENVax4组分的中和抗体反应都较低。 目前正在进行一项大规模的III期临床试验，以评估DENVax在来自拉丁美洲和亚洲登革热流行国家的20,071名4至16岁健康儿童中的效力。接种疫苗后12个月的主要结果显示，根据DENV血清型，效力变化为：DENV-2为97.7%，DENV-1为73.7%，DENV-3为62.6%，而DENV-4的效力结果不确定。有趣的是，基线时血清阴性和血清阳性参与者的总疫苗效力相似（分别为74.9%和82.2%），并且与年龄范围无关。总体疫苗效力针对导致住院的登革热分别为血清阴性个体95.4%和血清阳性个体94.4%。 同一试验在接种疫苗后18个月的数据揭示了血清阳性个体的总疫苗效力为76.1%，血清阴性个体为66.2%，针对不同DENV血清型的总体效力从针对DENV-2的95.1%到针对DENV-3的48.9%不等。针对需要住院治疗的登革热的总体效力为90.4%，针对DHF为85.9%。然而，按年龄组分层时，先前血清阴性的4至5岁儿童的疫苗效力显著较低（59.1%），同样年龄的血清阳性儿童预防住院的效力为51.6%。 DENVax疫苗接种后3年的累积效力数据最近发布，显示针对病毒学确诊登革热（VCD）的总体疫苗效力为62%，显著低于接种后18个月观察到的效力。针对需要住院治疗的登革热的总体效力也从90.4%降低到83.6%。在基线时血清阳性的个体中，针对VCD的疫苗效力在DENV-3为52.3%和DENV-2为83.4%之间变化，然而，在基线时血清阴性的个体中，疫苗只对DENV-1和DENV-2有效（分别为43.5%和91.9%），对DENV-3没有观察到效力。在血清阳性个体中，针对需要住院治疗的登革热的效力保持较高，但在血清阴性个体中则不然，疫苗只对DENV-1和DENV-2有效。有趣的是，观察到的疫苗效力并没有显示出与参与者年龄相关的任何明显模式。 在相隔18个月进行的疫苗效力评估中出现的这些显著变化，应在长期IV期监测试验中进一步分析，以排除观察到的保护效力是由于交叉保护，并可能随着时间而下降，正如在儿童自然感染期间所观察到的那样。 4.登革热疫苗开发的挑战 免疫病理事件是DENV感染的共同特征，有几种潜在的机制，如过度活跃的促炎性免疫反应（细胞因子风暴），其特征是几种促炎性细胞因子的血浆浓度升高，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激生长因子（GM-CSF）、巨噬细胞炎性蛋白1 beta（MIP-1β）、干扰素γ（IFN-γ）和白介素10 IL-10，最终导致血管渗漏、出血和其他一些血栓形成事件。分子模拟涉及E和NS1病毒蛋白，也已被记录激活针对血小板和内皮的交叉反应性抗体，导致严重登革热。此外，自然感染一种DENV血清型的个体，显示低水平的抗DENV抗体（<1:80）在继发感染异型DENV血清型时遭受并发症。在感染期间产生的特异性抗体构成了免疫反应以中和入侵者的重要部分；然而，对于像DENV这样的病原体，在某些条件下，初次接触中产生的抗体可能增强进一步的感染。有趣的是，产生高滴度抗DENV抗体（>1:320）的患者表现出对进一步的有症状DENV感染的保护。 已知登革热中的感染增强过程称为抗体依赖性增强（ADE），但登革热中这一事件的细节仍然难以捉摸。病毒进入已知是通过Fcγ（图3）促进的，介导T细胞激活和TNF-α及其他细胞因子的释放，导致内皮功能障碍。因此，有效的DENV疫苗必须诱导针对所有四种DENV血清型的强烈且高度中和的反应，以避免疫苗诱导的免疫病理事件。证据表明，这一过程可能主要通过抗prM抗体而被增强。prM存在于未成熟病毒颗粒中。像抗prM这样的抗体不仅促进Fc的摄取，而且这些高浓度的抗体也较差地中和病毒。存在不同的IgG亚类（IgG1-4），它们在半衰期、血清水平、补体激活和Fc受体结合方面表现出不同的特性。因此，不仅目标病毒蛋白，而且IgG亚类也可能有助于更好地理解如何倾向于中和/保护而不是ADE/免疫病理。在疫苗接种者中ADE的发生必须考虑不仅IgG亚类，还有糖基化阶段，以区分保护性与免疫病理事件。这是因为糖基化可能改变对Fc受体的亲和力，正如已记录的。 似乎所有针对登革热的活减毒疫苗都显示出诱导针对prM和融合环表位的抗体的能力，导致血清型交叉反应性增加，并增加ADE的风险。一个新的重要问题是，个体将如何对登革热疫苗做出反应，这在受寨卡病毒（ZIKV）影响的地区引起关注。在以前感染过ZIKV的个体中，也报告了ADE。在动物模型中使用活减毒疫苗时，已显示出DENV和ZIKV的这一事件。无效的先天免疫反应随后产生亚中和抗体和超反应性T细胞反应，可能会促成免疫病理事件，无论是在登革热感染的个体还是疫苗接种者中，但这些事件必须在疫苗接种者和自然感染的个体中仔细分析，以评估生物学意义。已在狨猴中开发了针对高度中和抗体的表位图谱；然而，需要在人类中进行类似的研究，并且这些数据必须考虑在未来疫苗开发中。 图3 抗体依赖性增强（ADE）在登革热病毒（DENV）感染中的示意图。针对一种DENV血清型的低水平抗DENV抗体（<1:80）在继发感染异型DENV血清型时促进病毒-免疫复合物的形成。这些病毒-免疫复合物通过Fcγ受体被单核细胞、巨噬细胞和树突细胞内吞，促进病毒释放到细胞质中。病毒-免疫复合物调节先天免疫途径，促进病毒复制和释放。 5.针对登革热疫苗的安全性问题 开发针对登革热的疫苗很重要的一点是，这些疫苗必须能够识别现有的四种血清型；三种更先进的疫苗在设计时已考虑了这一点（表3）。在自然感染中的一个重要考虑因素是，初次感染一种DENV血清型将建立对该特定血清型的长期记忆，但可能对其他血清型产生短期、亚中和和增强的反应。由于以前异型暴露，随后的登革热感染中不同DENV血清型可能会出现增强现象，避免这些事件是登革热疫苗领域的持续关注点。 因此，从一开始，就认识到对所有四种DENV血清型进行四价、同样有效的免疫是设计和开发中最重要的挑战。后来出现了其他关注点，如刺激高滴度中和抗体而不是那些使个体敏感并增强DENV感染的抗体。 Dengvaxia®，登革热疫苗中最先进开发之一，当数据显示未接触疫苗接种者在自然感染暴露时住院风险增加时，引起了严重的安全关注。武田疫苗TAK-003仍在III期试验中，已被证明是安全的，并且在独立于接种个体的血清状态的情况下，对登革热相关住院治疗的保护效力约为75-80%。这种活减毒疫苗仍在全球不同年龄组人群中进行许多II期研究。然而，III期试验仍在进行中，关于这种疫苗的效力、副作用或罕见不良效应的最终结论尚未得出。 关于TV003/TV005，这是国家过敏和传染病研究所开发的另一种活减毒疫苗，数据显示这些疫苗不允许四种血清型中的任何一种表达免疫优势，从而产生理想的免疫反应。此外，初步报告显示，单剂量具有保护作用，并且在首次免疫后6-12个月的第二剂中几乎实现了无菌免疫。这种疫苗已被不同制造商许可，布坦坦研究所开始了III期试验以评估其效力。 其他有希望的发展使用不同疫苗平台的临床试验数据仍然必要，但许多工作正致力于改进现有的疫苗。开发者旨在确保疫苗对所有四种血清型产生广泛且持久的高滴度中和抗体反应。然而，细胞反应也必须在疫苗接种者中得到评估，并与抗体反应一起有效以确保理想的保护。最重要的是，疫苗不应给未接触或以前接触过DENV的个体带来发展严重疾病的风险。因此，科学界仍在努力开发世界需要的安全和通用的登革热疫苗。 6.挑战和机遇 审查当前登革热疫苗的临床数据，显然这些疫苗对开发者构成了独特的挑战，因为必须平等地为所有四种血清型实现保护，而不在随后的DENV接触中引起任何潜在的免疫病理事件。尽管付出了所有努力，登革热流行病的数量和频率都有所增加，并正在影响新的地理区域，因此至关重要的是在登革热区域大大改进控制措施，并开发一种通用且高效的疫苗作为对抗登革热的重要措施之一。由于安全性仍是一个关注点，因此获得一种有效且安全的登革热疫苗的竞赛继续是一个迫切的需要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

根据广东疾控发布的数据，9月9日至15日，全省新增报告775例登革热病例，较上周增加73例，环比增加10.4%。无新增重症病例、死亡病例。目前，广东省已进入登革热流行季，疫情传播风险逐步增高。2024年8月，广东报告登革热1220例，相比7月（233例）增至近6倍。 实际上，今年以来，全球登革热疫情形势严峻。根据《柳叶刀》发表的一篇社论，2024年是有记录以来登革热感染最严重的一年。WHO已将登革热重新归类为3级紧急事件，需要公共卫生部门采取重大到最大程度的应对措施。所以带大家一起来了解登革热疫苗在研发过程中遇到的一些挑战。 摘要：登革热病毒（DENV）是蚊媒传播病毒中对人类健康构成最大威胁的病毒。登革热病毒有四种血清型（1-4），它们在流行地区共同循环。每种DENV血清型都能单独引起从自限性的登革热到更严重的登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）的全谱疾病。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的数据，感染登革热的人群中有四分之一会生病。在那些出现症状的人中，症状可以从轻微到严重不等。症状可以从皮疹、眼部疼痛到更严重的登革热表现的更强烈症状。大约每20个生病的人中就有1个会发展成严重登革热，这可能导致休克、内出血和死亡。目前尚无针对登革热的特定治疗方法，仅有一种疫苗（Dengvaxia）在少数几个国家获得9至16岁儿童的许可使用。尽管Dengvaxia获得了临床使用的许可，但在儿童和未感染过登革热的个体中效果不佳，并且关键的是，在年轻的接种者中增加了发展成严重登革热的风险。目前，有多种新策略用于登革热疫苗的开发。在这篇综述中，我们对DENV疫苗领域进行了详细的概述，重点关注了9种处于研发管线中的疫苗，以提供对针对DENV疫苗策略中最先进技术发展的全面概述。 引言 登革热病毒（DENV）是全球近一半人口面临感染风险的节肢动物传播病毒中对人类健康影响最大的。登革热病毒通过感染的埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。目前，全球范围内尚无针对所有四种DENV血清型（DENV 1-4）的抗病毒治疗或疫苗获得许可。DENV的流行病学是多方面的，临床表现范围广泛，从无症状疾病到危及生命的DHF和DSS。四种DENV血清型中的每一种都能引起全谱疾病。此外，与异源DENV血清型的二次感染可能导致感染增加和疾病加重，这是通过一种称为抗体依赖性增强（ADE）的机制。感染一种DENV血清型会提供对该血清型的长期抗体（体液）和T细胞反应（细胞免疫）保护。在ADE中，随后暴露于不同的DENV血清型会导致预先存在的DENV抗体与新血清型结合，形成病毒-免疫复合物，可以通过Fcγ受体促进进入免疫细胞，导致病毒复制和病毒血症增强。由于ADE现象，开发疫苗或治疗药物时必须单独考虑每种DENV血清型。Dengvaxia已在墨西哥、菲律宾、印度尼西亚、巴西、萨尔瓦多、哥斯达黎加、巴拉圭、危地马拉、秘鲁、泰国和新加坡获得许可，2019年获得FDA许可，并经CDC ACIP批准使用，前提是所有接种者在接种疫苗前都必须显示为登革热血清阳性。尽管Dengvaxia已经商业化，但结果显示严重的副作用和低效。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，将于2023年在印度尼西亚获得许可。因此，全球范围内仍迫切需要一种获得许可且有效的抗DENV疫苗。 登革热疫苗开发 已有多次尝试开发针对DENV的疫苗，包括减毒嵌合重组病毒、减毒活病毒、灭活病毒、重组蛋白和mRNA疫苗。每种疫苗原型在减毒特性、效力和免疫原性方面各不相同。本综述将详细讨论每种登革热疫苗的特点、效力和局限性。 Dengvaxia Sanofi Pasteur的Dengvaxia是第一个也是唯一一个商业许可的登革热疫苗，目前被20个国家推荐和使用。该疫苗是四价配方，由Sanofi Pasteur黄热病疫苗（YFV 17D）骨架组成，DENV的PrM和E蛋白取代了YFV 17D的PrM和E蛋白（图1a, b）。作为针对DENV的先锋疫苗，Dengvaxia的临床试验和现场结果受到了密切监测，特别关注ADE的可能性。在III期临床试验中，9岁以下儿童接种了三剂Dengvaxia，接种间隔为0、6和12个月（图1c）。通过在接种12个月后的25个月监测有症状的登革热感染来监测疫苗的效力。Dengvaxia在9岁以上的儿童中显示出65.6%的效力，在9岁以下的儿童中显示出44.6%的效力。Dengvaxia完成了III期效力试验，结果参差不齐。就住院治疗而言，9岁及以上的儿童住院率为80.75%，而9岁及以下的儿童住院率为55.9%。这些数据表明，Dengvaxia在9岁以下儿童中引起的保护效力较差。此外，Dengvaxia在提供保护方面的能力在四种DENV血清型方面也有所不同，就病毒学确认的有症状登革热而言。Dengvaxia对DENV1的效力为50.3%，对DENV2为42.3%，对DENV3为74.0%，对DENV4为77.4%。 图1. 由Sanofi、NIAID/Butantan、Takeda和美国陆军医疗研究物资司令部开发的减毒活疫苗。(a) Sanofi疫苗的开发。使用黄热病疫苗病毒17D (YFV 17D) 作为嵌合病毒生成的主干。YFV 17D包膜蛋白被野生型DENV血清型替换。(b) 组成Dengvaxia的四种DENV疫苗病毒的遗传构建表示。(c) 基于三剂计划的Dengvaxia免疫方案。(d) NIAID/Butantan疫苗的开发。通过在DENV1 WP、DENV2 NGC和DENV4 814669的3' UTR中引入30个核苷酸缺失，生成减毒活疫苗病毒。对于DENV3 Sleman-78株，在3' UTR中额外引入了31个核苷酸缺失。(e) LATV TV003/TV005的DENV2组分是通过嵌合生成的，其中将DENV2 NGC的prM和E基因引入DENV4Δ30的主干中。(f) 组成NIAID/Butantan LATV TV003和TV005疫苗的四种DENV疫苗构建物的表示。(g) NIAID/Butantan疫苗的接种方案。(h) Takeda减毒重组疫苗的开发。(i) Takeda DENV1、DENV3和DENV4疫苗株是通过将每种DENV血清型的prM和E蛋白引入DENV2 PDK53疫苗病毒而生成的。(j) Takeda疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。(k) Takeda的免疫接种时间表。(l) TDEN疫苗配方的开发，其中四种DENV株在PDK细胞中连续传代。(m) TDEN疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。图表是使用Biorender设计的。 疫苗效力因DENV血清型、接种者年龄、血清状态和接种时间而异。重要的是，DENV2的效力在CYD23临床试验中没有达到统计学意义（9.2%；95%CI −75至51.3）或在CYD14试验中（35%；95%CI：−9.2至61）。数据还显示，接种时DENV血清阴性的疫苗接种者的效力显著降低（表1）。 Dengvaxia试验的第一年长期安全性研究结果显示，Dengvaxia对住院治疗的效力是有希望的，但有一个主要的警告，即结果高度依赖于接种时的DENV暴露血清状态以及接种时的年龄。需要进一步研究以了解为什么Dengvaxia在接种时血清阴性的受试者中效力降低，以及为什么在9岁以下儿童中住院风险增加。到目前为止，这些问题仍然不清楚，并且是进一步调查的主题。 总的来说，该疫苗对DENV1和DENV2的保护较低，并且主要产生针对DENV4的抗体反应。因此，Dengvaxia实际上只作为针对DENV4的单价疫苗起作用。数据表明，Dengvaxia引起的感染性和产生的免疫原性可能不平衡。这种不平衡是由需要在12个月内给予三剂疫苗的需求所表明的。大多数通过注射给药的疫苗，包括YFV和日本脑炎病毒（JEV）以及麻疹、腮腺炎、风疹（MMR）等多价疫苗，都是作为单一主要剂量给药的。对于第一剂没有反应的接种者，可以在以后的时间进行复种。使用单一疫苗剂量的主要原因是，主要剂量引入了复制疫苗病毒，引发了能够阻断后续活病毒剂量感染和复制的中和抗体。有趣的是，如果第二剂确实引起了抗体滴度的显著增加，那可能是因为初次反应不足，无法中和疫苗病毒，随后允许在第二剂后复制。最终，一个弱的初次剂量将无法在用活疫苗病毒挑战时保护免受感染。对四种DENV血清型的血清转化频率差异很大；DENV-1为33%，DENV-4为8%，DENV3为80%，DENV4为85%。研究中的一部分接种者进一步检查了接种后病毒血症的水平。在接种后第7天，57.7%的疫苗接种者检测到病毒血症，其中86.7%是由于Dengvaxia的DENV4成分。只有1/25的接种者在单剂后恢复了Dengvaxia的DENV2成分。值得注意的是，没有任何接种者恢复了Dengvaxia的DENV1成分。疫苗中DENV血清型的感染性不平衡可能是疫苗对DENV1和DENV2效力较低的原因，并且可能是在接种时被假定为血清阴性的2-5岁接种者在第三年随访中看到住院风险增加的潜在原因。 最终，Dengvaxia临床试验的结果提出了一个问题，即Dengvaxia是否能有效提供针对DENV的异型保护，并表明仍需要一种更有效的疫苗，能够产生针对所有四种DENV血清型的异型中和抗体。此外，目标年龄组，9岁以下儿童无法接种Dengvaxia，使这一脆弱群体无法得到登革热的保护。 LATV TV003/TV005 美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）在过去15年中一直处于开发减毒四价疫苗（LATV）的前沿。鉴于对DENV的部分免疫可能会增加随后感染更严重疾病结果的风险，评估了多种单价和四价DENV疫苗，以确定具有最佳安全性、感染性和免疫原性特征的候选疫苗，总体目标是开发一种能够通过单剂量诱导对所有四种DENV血清型产生保护的LATV。通过实施重组DNA技术，采用了两种主要的减毒策略来生成疫苗病毒。第一种策略是在3'非翻译区（UTR）中包含缺失，第二种策略是生成结构基因嵌合体（图1d）。原型单价疫苗候选物rDEN4Δ30是通过在3'UTR中引入30个核苷酸（Δ30）缺失而生成的。rDEN4Δ30包含野生型DENV-4的所有结构和非结构蛋白，但通过在3'UTR中引入30个核苷酸缺失而减毒（图1f）。为了生成其他DENV疫苗，采用了类似的减毒机制。对于DENV2疫苗血清型（rDEN2/4Δ30），采用了嵌合策略，将DENV2新几内亚C病毒的prM和E基因引入rDEN4Δ30疫苗候选物（图1e）。总共评估了九种单价疫苗候选物在黄病毒素未暴露的成年志愿者中。在临床研究中评估了五种不同的四价混合制剂。对单价病毒进行的试验提供了对选择疫苗病毒至关重要的信息，这些信息涉及临床、病毒学和免疫学表型。这些信息用于指导LATV疫苗的最终开发。在这些早期研究中，观察到一些重要的发现，其中一个发现是嵌合策略对病毒复制具有高度减毒作用，同时允许一些必要的病毒复制以诱导免疫反应。当作为单价病毒测试时，rDEN2/4Δ30候选病毒在103 pfu剂量下感染了100%的受试者，但在组合成四价配方（rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30/3Δ31, rDEN4Δ30）时，其感染性最低。 为了确保四价疫苗的所有四个组分都能诱导出对每种DENV血清型的同型抗体，平衡感染性特征至关重要。为了生成更平衡的感染性特征，开发了两种策略。第一种策略是将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍。这种策略在TV005配方中实施。TV003和TV005具有相同的四种单价组分，并且在rDEN2/4Δ30的剂量上有所不同，TV003在103 pfu给药，TV005在104 pfu给药。第二种策略是将血清学评估的时间从接种后42天增加到90天。将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍足以补偿疫苗组分的更高HID50。接种TV005的受试者在接种后血液中可检测到病毒的比例明显高于接种TV003的受试者。血清转化的频率从接受TV003的76%提高到接受TV005的97%。此外，单剂量疫苗后四价抗体反应的总体频率从TV003的74%提高到TV005的90%。 在接种后的抗病毒反应方面，可以定义为“抑制或中和随后感染所接种病毒”的无菌免疫。尽管无菌免疫并不总是实现减少疾病和发病率的最终目标所必需的，但它可以是一个可量化的临床结果，并且是疫苗成功诱导足够免疫反应的指标。如前所述，Dengvaxia需要三剂，并且必须在12个月内给药。在第一剂后观察到病毒血症，特别是在DENV-4成分后，第二剂和第三剂后较少。Dengvaxia的第二剂和第三剂导致DENV-1、DENV-2和DENV-3血清型的抗体滴度增加。这些数据表明，当给登革热血清阴性的个体接种时，Dengvaxia不能诱导对后续感染的无菌免疫。为了确定Dengvaxia观察到的突破性感染是否会发生在LATV中，TV003和TV005的第二剂在第一剂后6个月给药。在TV003的初始剂量后，75%的疫苗接种者血液中产生了可检测水平的疫苗病毒，62%的疫苗接种者出现了登革热感染特征性的皮疹。在第二剂给药后，即在TV003/TV005初始剂量后6个月，没有观察到皮疹或病毒血症。在第二剂后，只有一名受试者在24小时内产生了可检测的病毒水平。在第二剂疫苗后，对四种DENV血清型的抗体滴度平均增加了不到两倍。 在接种后180天测量了对TV003和TV005的中和抗体反应和T细胞反应，并证明足以阻止随后疫苗接种后的增强，如抗体滴度没有进一步增加所测量的。为了评估抗体水平是否能保护自然DENV感染，开发了人类DENV-2挑战模型。在十名健康的黄病毒素未暴露的受试者中评估了挑战株rDEN2Δ30。为了量化TV003对DENV-2感染的保护效力，受试者在接受TV003后6个月接受了rDEN2Δ30挑战。TV003对由rDEN2Δ30引起的病毒血症、中性粒细胞减少和皮疹提供了完全保护，并且也在评估DENV-3挑战模型，结果正在发布过程中。此外，巴西布坦坦研究所与NIAID合作，在登革热流行国家进行TV003的II期和III期临床研究。这些结果对于这种LATV在已经接触过一种或多种DENV血清型的个体中预防登革热的潜力非常令人鼓舞。 TAK-003 TAK-003（TDV）是由武田制药公司生产的减毒四价登革热疫苗，最初由美国疾病控制和预防中心矢量传播疾病司的科学家设计和构建。该疫苗基于减毒病毒和使用重组DNA技术构建的嵌合病毒。TAK-003基于减毒DENV-2病毒，为所有四种疫苗病毒提供遗传骨架。第一个重组疫苗候选物是通过将DENV-1 16 007病毒的prM和E蛋白嵌合到DENV2 PDK-53病毒中生成的。通过结合不同的野生型病毒和PDK减毒疫苗病毒，生成了各种疫苗构建体（图1h-j）。 九种嵌合病毒是通过引入DENV-1 (16007)、DENV-3 (16562)或DENV-4 (1036)的prM和E蛋白与DENV-2 (16681)以及两种遗传变体(PDK53-E和PDK53-V)来生成的。DENV-2 PDK-53即使联合给药也能均匀复制，据推测能诱导对所有四种血清型的平衡免疫。TAK-003采用0个月和3个月的剂量计划（图1k）。I期和II期研究已经证明TAK-003耐受性良好，能够诱导针对DENV 1-4的体液反应、长期抗体持久性和交叉反应以及多功能细胞反应。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，并将于2023年在印度尼西亚获得许可。采用0-3个月剂量计划进行的临床试验显示，TAK-003在接种前血清阴性的疫苗接种者中总体效力为66.2% (95% CI, 49.1–77.5%)。针对住院登革热的效力为90.4%，针对登革出血热(DHF)的效力为85.9%。在一项探索性分析中，累积效力被分为三个部分进行评估。第一部分在第二剂后12个月进行随访以评估主要终点，第二部分增加6个月以评估次要终点，第三部分是对长期效力和安全性进行持续3年的评估。对DENV-1 (69.0%)、DENV-2 (90.8%)、DENV-3 (51.4%)和DENV-4进行了累积血清型特异性效力分析，后者显示结果不确定。疫苗效力在不同年龄组之间差异很大。在6-11岁的儿童中，效力为75.4%，而在4-5岁的儿童中效力为55.9%。在第一年，TAK-003对病毒学确认的登革热(VCD)的总体效力为80.2% (95 CI, 73.3–85.3%)。在第二年，针对VCD的总体效力下降到56.2%。在第二剂后长达2年的时间里，共报告了15例严重登革热或DHF病例，针对DHF的累积效力为81.2%。在基线血清阴性组中，从9、15和27个月的几何平均抗体滴度分析显示，随时间推移DENV-2的几何平均滴度呈下降趋势(GMT)。DENV-1、-3和-4的GMT在疫苗接种者中保持稳定。血清阳性率在9个月时为91.3%，在27个月时为85.9%。总体而言，在4-16岁的儿童中，在接种疫苗后27个月，TAK-003预防了72.7%的有症状登革热病例、89.2%的住院登革热和81.2%的DHF。在基线血清阴性的疫苗接种者中，累积效力为67%，在血清阳性个体中为74.8%。至关重要的是，针对构成TAK-003基础的DENV-2的效力下降不容忽视，这表明TAK-003可能无法完全复制自然感染所提供的保护。此外，第二年的数据表明，在6-11岁(60.6%)和12-16岁(71.2)的儿童中，与4-5岁(24.5%)的儿童相比，效力更高。 TDEN F17/F19 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)与葛兰素史克公司(GSK)合作开发了一种减毒四价登革热(TDEN)疫苗。该疫苗由四种DENV菌株组成，DENV-1 (45AZ5)、DENV-2 (S16803)、DENV-3 (CH53489)和DENV-4 (341750)（图1l, m），并以6个月间隔给黄病毒素未暴露的成人接种两剂（图1n）。所有四种病毒都是从自然感染中获得的，通过在C6/36细胞中分离并通过在PDK细胞中连续传代而减毒。总共有16种四价配方，其中13和14号配方被选中进行进一步评估。为了优化中和抗体反应，开发了一种新配方F17pre，该配方使用了更高代PDK细胞传代的DENV-1和更低代PDK细胞传代的DENV-4。F17pre被设计为F17配方的前体。F13、F14和F17pre进行了II期临床试验。在初次接种后第10天，分别有75%、31%和31%的受试者出现病毒血症。在接种第二剂疫苗后，没有检测到任何受试者的病毒血症。对配方进行了中和抗体反应测量，分别有36%、40%和63%的接种者在接种两剂13、14和F17后产生了四价中和抗体。在波多黎各进行的一项随机II期临床试验中，F17在第二剂后引发了更高滴度的中和抗体，并在初次接种的受试者中实现了对所有血清型的100%血清转化。为了评估TDEN F17疫苗的安全性和免疫原性特征，在对DENV 1-4和JEV未暴露的6-7岁泰国儿童中进行了一项试点研究。研究结果显示，该疫苗安全且具有免疫原性，因此该研究推进到12-15个月大婴儿的I/II期试验。总共有52.6%的疫苗接种者对四种DENV血清型产生了血清转化。TDEN F17已被证明在12个月至50岁的疫苗接种者中安全且能引发免疫反应，当以两剂方案给药时。TDEN F17目前正在对6至9岁的儿童进行I/II期临床研究，这些儿童之前已接种过该疫苗。5年的随访将评估两剂方案的免疫原性，以及在第二剂后1年接种的第三剂的免疫原性。 DPIV 四价登革热纯化灭活疫苗(DPIV)由沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)开发，并由WRAIR试验生物生产设施生产，并由葛兰素史克(GSK)佐剂系统佐剂。该疫苗以28天间隔分两次给药（图2c）。最初的疫苗开发始于DENV-2 S16803菌株，该菌株是从患者身上分离出来的，并在Vero细胞中扩增。这种纯化灭活病毒(PIV)在给小鼠接种时是安全的，小鼠在第二剂后实现了100%的血清转化。PIV随后在恒河猴上进行了测试，结果证明是安全且具有免疫原性的。随后，基于灭活病毒的四价配方被开发出来，使用DENV-1 Westpac 74、DENV-2 S16803、DENV-3 CH53489和TVP360作为DENV-4组分（图1a, b）。病毒在Vero细胞中扩增，经过甲醛灭活，并使用0.01%明矾(氢氧化铝)作为佐剂。免疫接种计划包括一剂TPIV，然后是一剂四价减毒活疫苗(TLAV)的加强剂量。TPIV/TLAV的组合在接种后8个月对DENV-3挑战提供了完全保护。在随后的实验中，用TPIV初免引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体。在对四种DENV血清型中的每一种进行挑战后，接种疫苗的动物没有出现病毒血症。为了找到DPIV的最佳佐剂，疫苗开发商使用了AS01E (3-O-desacyl-单磷脂A)和AS03B (油包水)来克服因灭活引起的免疫原性问题。在一项I期临床试验中，用AS01E/AS03B佐剂的DPIV发现疫苗在登革热血清阴性成人中引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体反应，但这种反应随时间减少。观察到的两剂疫苗接种的体液反应是强大的，但目前尚不清楚DPIV是否能够提供针对DENV的持久免疫。疫苗的灭活性质可能会在非结构蛋白的免疫反应方面产生障碍。 在进行的一项研究中发现，接种DPIV后，免疫系统仅针对包膜和衣壳蛋白。最终，疫苗无法在接种疫苗的恒河猴中进行的挑战试验中控制DENV感染。重要的是，接种DPIV导致接种的猴子出现病毒血症、AST、IL-10、IL-18水平增加。这些数据表明，接种疫苗可能触发了DENV感染的抗体依赖性增强。 TVDV 四价登革热DNA疫苗（TVDV）由美国陆军医疗研究与物资司令部开发[49]。TVDV是一种基于DNA的疫苗，其中prM和E蛋白编码序列克隆在VR1012质粒中，并与VAXFECTIN作为佐剂共同给药（图2d, e），采用三剂免疫方案（图2f）。DENV-1菌株是从西太平洋74菌株生成的，当克隆到VR1012质粒并给恒河猴接种时，被证明在挑战试验中保护猴子并在I期临床试验中被发现具有免疫原性。DENV-2抗原是通过替换原始DENV-2构建物中的DENV-2跨膜和细胞质序列为小鼠溶酶体相关膜蛋白的序列来生成的。DENV-3抗原来源于亚洲病毒株。临床前测试表明，DENV3疫苗株引发了中和抗体，适度水平的特异性IgG并在挑战试验中提供了部分保护。DENV-4的遗传结构与DENV-2相似，但缺乏关于DENV-4组分在其单价形式的临床前测试的报告。Vaxfectin被用作佐剂以提高疫苗的免疫原性。通过将编码DENV 1-4的prM和E基因的各个单价质粒等量结合并克隆到VR1012质粒中来制备疫苗构建物。在接受了两剂疫苗配方的白兔中对TVDV进行了安全性和免疫原性评估。动物显示出对所有四种DENV血清型的血清转化。在最新进行的40名黄病毒素未暴露的疫苗接种者中进行的I期临床试验中，TVDV被证明是安全的并引发了IFN-γ抗DENV T细胞反应。 V180 V180疫苗是一种基于DENV E和prM糖蛋白重组形式的四价疫苗。该疫苗目前处于I期临床试验中，由默克公司生产。每种DENV血清型的遗传构建是通过基于逆转录酶（RT）-PCR扩增编码prM和80% E蛋白（截断E蛋白）的病毒序列，然后克隆到pMttΔXho载体中（图2g, h）。使用的病毒株有DENV1 258 848和DENV1泰国AHF82-80，DENV2株PR159/S1，DENV3株CH53489和D3H87，以及DENV4株H241和多米尼加，疫苗采用三剂计划（图2i）。在一项评估疫苗安全性、耐受性和免疫原性的I期、随机、安慰剂对照、双盲研究中发现，两种未添加佐剂的V180和一种添加了铝佐剂的V180没有引发强烈的免疫反应，而与ISCOMATRIX联合给药的六种V180配方引发了强烈的免疫原性（GMT ≥150）。目前尚不清楚V180引发的抗体滴度水平是否会提供任何临床益处，因为尚未为疫苗定义抵御DENV所需的中和抗体的确切水平。 图2. 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)、美国陆军医疗研究与物资司令部和默克公司开发的减毒活疫苗。(a) DPIV的开发。每种DENV血清型都被纯化并通过甲醛灭活。(b) 产生的病毒粒子的表示。(c) 基于两剂计划的DPIV免疫方案。(d) TVDV疫苗的开发。代表DENV 1-4型的prM和E蛋白编码区域被克隆到VR1012质粒中，并与VAXFECTIN共同给药。(e) 表示产生的四个DENV质粒构建物的图解。(f) TVDV的疫苗方案，包括在第0天开始的三剂方案，第30天和第90天结束。(g) 默克公司V180疫苗的开发。为每种DENV血清型生成了病毒序列的遗传构建物，编码prM和80%的E蛋白。(h) 产生的蛋白被克隆到pMttΔXho载体中，并在果蝇细胞培养中培养，然后进行纯化。(i) V180的疫苗方案，采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，最后一剂在第90天。图表是使用Biorender设计的。 DSV4 DSV4是一种四价病毒样颗粒疫苗，旨在展示DENV包膜蛋白的域III。DSV4是通过使用所有四种DENV血清型和乙型肝炎表面（S）抗原的EDIII的框内融合而设计的，并与未融合的S抗原共同表达形成镶嵌病毒样颗粒（VLPs），并采用三剂计划（图3d, e）给予。DSV4在小鼠中诱导了针对所有四种DENV血清型的中和抗体水平，并在DENV4挑战中提供了保护。 E80 mRNA疫苗 E80 mRNA疫苗是由中国科学院开发的一种改良的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗。疫苗设计包括Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，3' UTR和3' polyA尾（图3a）。含有改良核苷1-甲基假尿嘧啶-5/-三磷酸的修饰RNA是化学合成的，并包装成LNPs（图3b）。LNP由四种脂质组成：d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。HEK293T细胞对E蛋白表达阳性率为52%。疫苗采用三剂计划（图3c）。E80-mRNA在小鼠中诱导了高水平的中和抗体滴度，平均PRNT50为13,000。E80-mRNA在接种疫苗的免疫能力小鼠中对DENV-2挑战提供了无菌免疫，并在感染DENV-1、DENV-3和DENV-4的K562细胞中引发了降低的ADE活性。 图3. E80-mRNA和DSV4疫苗的开发。(a) E80-mRNA的开发。RNA序列包含一个Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是一个人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，一个3' UTR和一个3' polyA尾。(b) 修饰RNA包装成LNP的表示。LNP由四种脂质组成，d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质。(c) E80-mRNA的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第14天，最后一剂在第28天。(d) DSV4疫苗的开发。DSV4是使用每种血清型DENV EDIII的框内融合和乙型肝炎表面（s）抗原设计，与未融合的S抗原共表达形成镶嵌病毒样颗粒(VLPs) (e) DSV4的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，第三剂在第90天。 DENV疫苗开发的挑战 开发有效的登革热疫苗取决于疫苗能够针对所有四种抗原不同的DENV血清型有效，同时引发对所有四种血清型的同等水平保护。疫苗无法引发对所有四种血清型的同等水平中和抗体可能导致ADE的诱导。因此，ADE在开发成功的DENV疫苗方面提出了挑战。已有报告称特定范围的DENV抗体滴度与严重登革热疾病的风险相关，但主要风险因素是人类以前感染过异源性DENV血清型。 目前用于研究登革热的动物模型包括非人灵长类动物（NHP）、免疫缺陷小鼠和人源化小鼠。在这些动物模型中，AG129免疫缺陷小鼠是最常用的，它们具有一定的抗病毒免疫能力，但先天免疫反应受到抑制，常用于研究体内病原机制和对DENV挑战的反应。AG129小鼠的一个主要挑战是它们缺乏干扰素（IFN）α/β和γ受体以及抗病毒免疫反应。由于无法发展出完整的免疫反应，AG129小鼠不是验证登革热疫苗效力和疫苗诱导的保护的合适模型，尽管它们在确定疫苗诱导的病毒血症水平方面非常有用。因此，缺乏一种能够重现对登革热病毒免疫反应的经济实惠的动物。 关于登革热疫苗接种期间如何引发抗体反应的关键问题仍然没有答案。除了T细胞反应外，细胞介导免疫（CMI）研究一直是登革热疫苗领域的讨论焦点。在2008年由世界卫生组织（WHO）牵头的咨询会议上，建议进行CMI的探索性研究。然而，对所有登革热疫苗实施单一通用标准以量化保护相关性是具有挑战性的。登革热疫苗之间的根本差异导致了为DENV感染定义适当的保护相关性的困难。例如，灭活疫苗可能与活疫苗相比引发根本不同的抗体反应，即使在两种不同疫苗的个体中实现了相同的中和抗体（nAb）滴度，这两种疫苗的保护功能和抗体反应的质量在体内可能不同。另一个关键区别是，一些DENV疫苗缺乏DENV非结构基因或衣壳蛋白。这一点至关重要，因为CD8+ T细胞主要针对非结构（NS）蛋白。不含DENV NS蛋白的减毒活疫苗在T细胞反应的质量和性质上有所不同。值得注意的是，包含所有DENV蛋白的减毒活疫苗已被证明能引发与自然感染诱导的反应类似的CD8+ T细胞反应。此外，CD4+ T细胞能够发挥细胞毒性功能，这可能在预防严重疾病中发挥关键作用。 最终评论 近几十年来，登革热对全球健康造成的负担急剧增加。对安全有效的登革热疫苗的需求从未如此迫切。在这一期“10Q in virology”特别问题中，我们对登革热疫苗开发的最新技术进行了全面审查，并强调了登革热领域仍然没有答案的最重要问题：每种血清型对DENV感染的严重性和疫苗效力的贡献是什么？理想的疫苗应该提供针对所有四种血清型的长期保护，在所有群体中有效，并能够安全地给无论血清状态如何的个体接种。 根据临床试验的现有数据，NIAID LATV TV003/TV005疫苗是开发中最有希望的疫苗。它在接种者中提供了强大的中和抗体水平，对所有四种血清型进行了血清转化，并且以单剂量给药，使其在发展中国家进行管理具有功能性。鉴于没有单一或通用的保护相关性来评估DENV疫苗的效力，使用挑战模型在评估疫苗效力时变得至关重要，我们建议使用挑战模型成为评估DENV疫苗保护相关性的标准。除了使用挑战模型外，NIAID LATV TV003/TV005还研究了每种单独疫苗成分在血清型背景下的免疫原性。 我们团队目前的研究正在评估每种疫苗血清型在先天免疫原性背景下的贡献。我们团队的成员能够确定定义对挑战病毒反应的先天免疫特征。先天免疫反应介导T细胞和B细胞记忆以及因此保护性免疫反应的质量和数量。DENV因其对抗先天免疫反应的能力而被广泛描述。有趣的是，先天免疫反应在DENV疫苗设计中历来被低估。在先天免疫的背景下，树突状细胞（DCs）在感应病毒病原体和通过刺激T淋巴细胞激活适应性免疫反应中起着关键作用。众所周知，在DENV感染期间，DCs成为感染的主要靶细胞。DENV的非结构（NS）蛋白已被描述为它们通过针对I型干扰素反应的机制（如cGAS-STING途径的拮抗作用等）来对抗人类细胞中的先天免疫反应。鉴于先天免疫反应的诱导对于适应性免疫的诱导是必要的，因此在疫苗设计中应考虑调节先天免疫反应的DENV NS蛋白的作用。除了DENV NS蛋白针对先天免疫系统外，DENV NS蛋白还包含针对CD8+和CD4+ T细胞的关键表位。CD4+ T细胞主要针对衣壳和E蛋白，而CD8+ T细胞主要针对NS3和衣壳。结构和非结构蛋白都诱导T细胞介导的免疫反应，因为T细胞表位分布在结构和非结构蛋白中。已经描述，在DENV疫苗接种期间，最初接种后引发高水平先天免疫细胞因子IP-10的个体在DENV挑战模型中对随后的DENV感染显示出更高水平的保护。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

登革疫苗的研发已经有百年的历史，即使已经有两款上市疫苗，其使用范围和作用效果仍然存在局限性。考虑到登革病毒目前的流行状况，我们仍期待受众广泛、高效持久、均衡免疫的登革疫苗的研发和问世。 蚊虫肆虐热带狂，登革发病急上升 登革热是登革病毒感染所致的急性病毒性传染病，主要通过伊蚊叮咬传播。近三十年来，登革热暴发和流行日益频繁，全球超过100多个热带和亚热带国家均有病例报道。据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年约四亿人感染，其中50万人发展为重症，死亡近两万人。2019年登革热被WHO列为“全球十大健康威胁”。 2023年以来，东南亚和南美的登革疫情持续高发。根据巴西卫生部数据，截至2024年3月，已有超过150万例疑似病例和500多例死亡病例，是2023年同期的四倍，预计2024全年将有超过400万例病例，创历史新高。 我国同样面临登革热的严重威胁，历史上曾暴发过波及百万人口的重大疫情。近年来，主要以境外输入引发本地传播为主，广东、云南等地是主要流行区。如2014年的广东疫情，发病人数超过五万。2023年全年报告近2万例。目前，登革热被国家卫健委列为法定报告的乙类传染病。 因此，我们需保持高度警惕，做好科学有序的疫情防范工作。 【自2023年4月以来报告登革热病例  的国家/地区（截至24年5月）】 （红色越深，代表感染人数越多） https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/countriesterritories-reporting-dengue-cases-april-2023-and-may-2024 登革热因登革毒，单是血清有四种 登革病毒是登革热的病原体，属于黄病毒科正黄病毒属，基因组为单股正链RNA，大小约为11 kb，含一个开放读码框，依次编码3个结构蛋白（C、prM和E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。 自然界存在四种血清型的登革病毒（1，2，3和4型），感染任何一种血清型均可导致疾病发生。不同型别登革病毒之间缺乏交叉保护，多次感染或同时感染不同血清型登革病毒的病例亦有报道。 登革病毒感染所致的临床表现复杂多样，多数为无症状感染。患者基于临床表现可分为登革热和重症登革。 前者一般表现为高热、头痛、关节痛、皮疹等感冒样症状，为自限性疾病； 后者可发展为出血、肝损害、休克等，病情危重，甚至威胁患者生命，如救治不及时病死率可达30%。 遗憾的是，目前临床上尚无特异药物治疗登革，主要采取对症治疗和支持疗法，抗病毒药物的研发尤为重要。最近，比利时杨森制药公司研发的抗病毒药物JNJ-1802已进入了临床II期，是目前进展最快的抗病毒小分子药物。登革病毒的单克隆抗体VIS513近期也完成了临床I期试验。 【登革病毒感染所致临床症状】 https://www.cdc.gov/dengue/Symptoms/index.html 减毒活疫苗已上市，更好的疫苗在路上 疫苗接种是消灭或控制传染病的最有效手段。登革疫苗的研发已有将近百年的历史，包括灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗、减毒活疫苗等先后应用于登革疫苗的研发。目前，已有两种登革四价减毒活疫苗在海外获批上市，还有一种已完成临床III期试验，而亚单位疫苗、DNA疫苗以及mRNA疫苗等仍处于临床前或临床研究不同阶段（表）。 目前登革疫苗的研发现状 登革四价减毒活疫苗Dengvaxia（CYD-TDV） 由法国赛诺菲巴斯德公司研制，是全球第一个上市的登革疫苗。目前，墨西哥、菲律宾和美国等国先后批准了该疫苗，用于年龄9-45岁（具体年龄限制取决于各国的监管批准）、有登革病毒既往感染史的人群。Dengvaxia采用三针免疫，每针间隔6个月。Dengvaxia在东南亚和拉丁美洲国家的整体保护效力分别达56.7%和60.8%。然而，Dengvaxia在特定人群中可能增加罹患登革热住院风险。 Qdenga（TAK-003）疫苗 第二个获批上市的登革四价减毒活疫苗，由日本武田制药公司生产，于2020年12月获得欧盟委员会批准，并在印度尼西亚、巴西、阿根廷、英国和德国等国家获得许可。Qdenga采用两剂免疫，间隔3个月。Qdenga具有良好的保护效力和耐受性，在第54个月随访时的整体保护效力达61.2%，且尚无疫苗接受者疾病加重的报道。然而，在登革血清阴性人群中，Qdenga对DENV3的保护效力并不明显，还可能导致更高的住院率。 四价减毒活疫苗TV003（DENV2/4Δ30）疫苗 该疫苗也完成了III期临床试验，该疫苗由美国国家过敏和传染病研究所、巴西布坦坦公司和美国默克公司共同开发。TV003采用单剂免疫，对接种前有无登革热暴露史的2-59岁受试者均耐受性良好，在第24个月随访时的整体免疫效力大于80%，对有登革热暴露史的受试者也能达74%。单剂免疫可降低接种成本，满足去流行区的旅行者或需快速保护的人群。然而，TV003对于2-6岁受试者的长期保护效果，以及接种后是否会出现突破感染等仍需进一步评估。 【登革四价减毒活疫苗的构建示意图】 （A）Dengvaxia（B）TAK-003（C）TV003 DOI: 10.1016/j.biopha.2021.112304 我国尚未批准任何登革疫苗，也没有任何品种进入临床研究阶段，多数品种研发均处于临床前研究阶段。例如，我国学者采用与Dengvaxia类似的策略，以乙脑减毒活疫苗SA14-14-2为骨架，成功构建了乙脑/登革嵌合减毒疫苗，单剂免疫小鼠及恒河猴即可诱导高效的免疫应答，对病毒攻击具有完全的保护作用，是国内唯一完成恒河猴保护实验的候选疫苗。首都医科大学安静团队开发了登革四价DNA疫苗，可在小鼠体内诱导出长效且均衡的保护作用。 国产疫苗亟待突破，集智公关是关键 两种登革四价减毒活疫苗Dengvaxia与Qdenga的上市给人类应对登革带来了希望，但其临床应用和作用仍十分有限。Dengvaxia仅适用于9-45岁曾感染过登革病毒的人群。而Qdenga则只被WHO建议纳入疾病高负担地区6-16岁人群的常规免疫规划。 考虑到登革的流行现状，理想的登革疫苗应安全、有效且可负担。未来，一方面要加强基础和转化研究，揭示登革病毒感染、传播和免疫激活的作用机制，阐明重症登革发病和转归的分子机制；同时，加强mRNA疫苗等创新技术的应用，推动动物模型、临床队列等平台资源建设，完善登革疫苗审评、监管和上市后评估体系；此外，作为被忽视的热带传染病，各国政府、国际组织和工业界的长期稳定的投入尤为关键。 理想的登革疫苗示意图 让我们携手并进，向着全球消除登革热的目标不断前行！ 供稿：邓永强  朱珠 供稿人简介：邓永强，军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所研究员，博士生导师。主要从事新突发病毒感染和致病机制研究，先后承担国家和军队课题10余项。以第一/通讯作者（含并列）在Cell、Nature和Science等国际知名杂志发表SCI论文40余篇。先后授权发明专利共6项，参编专著3部。先后获军队科技进步奖一等奖和二等奖、北京市自然科学一等奖和广州市科学技术进步一等奖各1项。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。