Rab-7a

摘要：外泌体逐渐被认为是细胞间通讯的重要媒介。它们将活性生物分子传递给目标细胞，并在多种生理和病理过程中发挥重要作用，展现出作为疾病新治疗策略的巨大潜力。方法：在这篇综述研究中，我们研究了过去二十年间发表的关于外泌体在不同疾病中应用的文章，以及这一领域的视角和挑战。结果：外泌体的主要临床应用包括将其用作生物标志物、无细胞治疗剂、药物传递载体、外泌体动力学的基础分析以及癌症疫苗。来自人类或植物的不同来源的外泌体被用于各种临床试验中。大多数研究人员使用循环系统中的外泌体进行生物标志物实验。间充质干细胞（MSCs）和树突细胞（DCs）是两种广泛认可的外泌体来源。MSCs衍生的外泌体通常用于炎症治疗和药物传递，而DCs外泌体用于在癌症患者中诱导炎症反应。然而，外泌体的临床应用面临各种问题和挑战。此外，基于外泌体的临床试验的转化需要符合特定的良好生产规范（GMP）。在这篇综述中，我们根据应用类型和疾病对临床试验中的外泌体进行了总结。我们还讨论了关于外泌体动力学和临床应用的主要问题和挑战。结论：外泌体是临床试验中治疗许多疾病的有希望的平台。这个令人兴奋的领域正在迅速发展，对外泌体发挥各种作用的潜在机制的理解还远远不完整，需要在这些小囊泡的研究中进一步进行多学科研究。 背景 细胞外囊泡（EVs）是由大多数细胞通过多种机制产生的异质性细胞衍生囊泡，通过转移生物信号如许多非编码RNA、编码RNA、DNA链、片段和脂质到对应细胞，促进细胞间通讯。EVs还可以通过许多体液传递其货物/信息，包括循环系统、唾液、脑脊液（CSF）、尿液、牛奶和支气管肺泡灌洗液（BALF）。一旦传递到目标细胞，EVs可以通过驱动不同的信号通路来调节受体细胞的命运和形态，这可能导致正常生理或病理学，具体取决于EVs的来源和细胞状态。越来越多的证据表明，EVs在一系列细胞过程中发挥关键作用，包括增殖、生长、发育、血管生成、免疫调节、感染、转移、重编程和重塑。已经记录了三种主要的EVs亚类，包括微囊泡（MVs）或外泌体、凋亡体和小外泌体（图1）（表1）。MVs指的是由质膜产生的EVs，大小范围为100-1000纳米，通过一个复杂的机制，称为脱落或质膜的芽生，类似于病毒向外芽生细胞膜。另一种越来越吸引科学家注意的EVs是小外泌体，大小范围为30-150纳米。这些囊泡据报道在大小和货物上也是异质的，因此在目标细胞信号上发挥着不同的功能。小外泌体的起源是参与内吞作用途径的囊泡，是一种称为多囊泡体（MVBs）的晚期内吞体开始产生小外泌体。EVs的最新进展表明，小外泌体的生物生成可能与另一个内膜系统相互作用，以维持细胞稳态。例如，正常生理和几种疾病中报道了小外泌体信号通路和自噬之间的串扰。在过去的十年中，寻求改善治疗结果并专注于精准医疗的外泌体的转化医学有了显著增加。外泌体具有独特的性质，吸引了研究人员使用它们来治疗许多疾病，包括退行性疾病和癌症。到目前为止，已经使用不同来源的外泌体进行了许多临床试验来治疗各种疾病。尽管这种方法很有趣，临床试验也显示出满意的结果，但这个领域存在一些挑战和限制，需要进一步的调查来验证这些结果，并为基于外泌体的研究引入一个黄金标准。系统地检查外泌体的效率和安全性需要确定它们的个性和纯度。国际细胞外囊泡协会（ISEV）通过在2014年和2018年发布MISEV指南，启动了EVs分离和表征程序的标准化，这些指南讨论了在基于EVs的研究中必须考虑的最重要的特征。此外，EV-TRACK数据库成立于2017年，为研究人员在发表前提供他们的纯化和表征方法，并就实验计划的可能限制提出建议（https://evtrack.org/about.php）。本文概述了外泌体的潜在临床应用以及在这条路线上的挑战和问题。 图1 细胞外囊泡(EVs)的生物生成。EVs的两个主要亚类是外泌体和微囊泡(MVs)。外泌体的生物生成过程复杂，发生在细胞质中位于多囊泡体(MVBs)内。ESCRT复合体和不同的分子以依赖ATP和不依赖ATP的方式，促进外泌体的装载、排序和形成。外泌体的货物来自高尔基体、内体途径和细胞质。Rab蛋白介导内体室和外泌体的细胞内运输。MVBs已报道能与质膜、溶酶体或两栖体融合。当MVBs与质膜融合时，外泌体被释放到细胞外环境中。有证据表明外泌体生物生成途径可能与自噬通路存在交叉。MVBs可能与自噬体融合形成称为“两栖体”的混合囊泡，这些囊泡最终与质膜或溶酶体融合。MVs比外泌体大，通过向外芽生和脱落过程从质膜形成。EVs可以通过三种可能的方式影响目标细胞的命运和信号通路，包括内吞作用、受体-配体相互作用，以及与质膜的直接融合。 外泌体 外泌体是指许多细胞释放到细胞外基质中的膜结合囊泡。主要思想是这些纳米颗粒在细胞内生成，在多囊泡体（MVBs）内，通过MVBs膜的内陷，导致在MVBs内生成腔内囊泡（ILVs）（图1）。 这些囊泡可能被称为前外泌体，当MVBs与细胞膜融合后，它们可以被分泌出细胞；现在被称为外泌体。MVBs总是不将ILVs排出细胞外，而是它们可能与溶酶体融合，随后ILVs及其货物被降解以供回收和重复使用，以维持细胞稳态。此外，有证据表明MVBs可能与自噬途径的自噬体融合，并生成称为“两栖体”的混合囊泡，随后，两栖体现在可能与血浆膜融合并分泌带有其他货物的外泌体。了解MVBs如何以及为什么与不同的膜融合一直是一个长期目标，因为这对区分外泌体的异质性以及相关的生理后果、调节它们在临床使用中的产生以及监测病理条件至关重要。MVBs膜上存在各种分子和复合物，它们介导货物装载和向内芽生膜的排序，并使新形成的ILVs掐入MVBs。例如，一个由四个复合物组成的与ESCRT相关的机制，以调节的方式使用ATP分子介导生物生成和装载ILVs，或者涉及一个不依赖ESCRT的机制。许多与MVBs相关的Rab蛋白以不同的方式促进MVBs的运动。其中，Rab7、Rab8、Rab11、Rab27和Rab35在调节外泌体途径中的作用已被认可。SNARE蛋白是短分子，它们促进MVBs和细胞质膜的融合。分泌到细胞空间后，外泌体与目标细胞相互作用，这些细胞要么靠近，要么远离。有人提出，外泌体或其他EVs利用三种机制来影响受体细胞的功能，包括内吞作用（例如吞噬作用和胞饮作用）、受体-配体相互作用和直接融合，这些机制导致细胞和生物过程的变化，参与正常生理或恶化病理条件。这是外泌体的旅程；然而，需要进一步的调查来确定外泌体是如何为一个明确的目的而产生的。外泌体的货物包括来自细胞膜、内体室、细胞质和来自内膜系统的分子，如高尔基体[7,18]。外泌体在干燥过程中呈现特定的双凹形或杯状，而在透射电子显微镜下它们呈现球形[26]。这些囊泡的密度为1.08-1.19 g/ml，具有常见的外泌体标记物，如CD9、CD63、CD82、CD81、Alix和Tsg101。成千上万种类型的生物分子存在于外泌体中，包括蛋白质、众多RNA和脂质，这些数据被各种数据库收集和呈现，如Vesiclepedia（http://www.microvesicles.org）、Exocarta（http://www.exocarta.org）和中国的一个生物信息学实验室（http://bioinfo.life.hust.edu.cn）。了解驱动外泌体生物生成和装载的机制，以及外泌体的货物和外泌体被其他细胞摄取的方式，将支持科学家实现精细和高效的转化医学。值得一提的是，完全理解外泌体的性质、纯度和来源对于下游实验至关重要。例如，来自干细胞的外泌体可能参与再生和正常生理，而来自感染或癌细胞的外泌体则介导病理学（图2）。 图2 外泌体的临床应用。在临床试验中，外泌体被用作生物标志物、无细胞治疗（外泌体治疗）、药物输送系统和癌症疫苗。来自植物细胞、间充质细胞、T细胞和树突细胞的外泌体被用于治疗不同的疾病。此外，这些来源的外泌体是药物输送系统的有希望的载体。在直接方法中，外泌体被装载治疗剂，而在间接方法中，适当的细胞通过基因工程改造或与治疗剂共培养以产生人工外泌体。 临床试验 已经很好地建立起来，外泌体是治疗许多疾病的理想候选者。在临床试验之前，许多临床前实验已经证实了外泌体治疗许多疾病的优势，从再生医学领域到癌症。近年来，外泌体在临床试验中进行了研究，总共有两种类型的外泌体在临床试验中使用，具体来说，人类细胞/样本和植物标本的外泌体。对ClinicalTrials.gov（https://clinicaltrials.gov/）的调查显示，外泌体的主要应用是生物标志物、外泌体治疗、药物输送系统和癌症疫苗（图3）。此外，一些试验旨在分析不同条件下人类样本中的外泌体。分析显示，共记录了116项试验，其中58项（50%）属于生物标志物应用（图3）。在外泌体治疗方面，已注册了33项（28.44%）研究（图4）。在药物输送系统试验中，有6项（5.17%）研究，而在外泌体基础分析方面，已注册了17项（14.66%）研究（图4）。最后，有2项临床试验（1.72%）与外泌体疫苗研究相关。临床试验中的外泌体需要符合良好生产规范（GMP）。GMP等级外泌体生产方法包括细胞类型、培养环境、培养系统和培养基。生产后还需要进一步纯化，通常分为三个步骤。GMP外泌体的第三个主题是建立表征和鉴定方法，包括物理配置和生物活性功能特征。此外，欧洲药品管理局（https://www.ema.europa.eu/en）发布了关于先进治疗药物产品分类的科学建议。该机构描述了细胞和分子生物技术的新科学进展导致了先进治疗的发展，如基因治疗、体细胞治疗和组织工程。这个生物医学的新兴领域为治疗人类疾病和功能障碍提供了新的机会。此外，它为研究人员提供了先进治疗药物产品的指导方针、建议和标准，并修订了指令和法规。 图3 基于外泌体的临床试验分析 图4 外泌体治疗产品当前良好生产规范（GMP）生产流程图 生物标志物应用 如上所述，外泌体存在于许多生物液体中，可能为监测正常生理状态下的细胞状态或病理条件发生时提供了一个新的窗口。通过简单的液体活检，如血浆、血清、尿液、唾液等，外泌体和其他细胞外囊泡可用于分析它们的货物，用于诊断、预后、进展和化疗抗性生物标志物应用。尽管大多数细胞类型都会释放外泌体，但有证据支持在几种病理条件下，如癌症，外泌体分泌上调。外泌体在大多数体液中是稳定的，并能保护生物分子免受降解。在病理条件下，细胞变化可以反映在细胞释放的外泌体的生物成分中。外泌体的货物改变可以通过转录组学、蛋白质组学和脂质组学研究进行鉴定和分析；因此，特定分子水平的差异对于生物标志物应用将是有用的。不同的实验室已经显示了癌细胞及其体外外泌体的miRNAs差异表达，此外，一些在体外和动物癌症模型上进行的研究表明miRNAs表达水平的改变。不同的miRNAs正在开发中，包括miRNA-200-5p、miRNA-378a、miRNA-139-5p和miRNA-379用于肺癌，miRNA-21用于食管鳞状细胞癌，被建议作为非侵入性诊断生物标志物。此外，外泌体蛋白对许多癌症具有生物标志物潜力。在癌症的情况下，早期发现肿瘤对于有效治疗至关重要。如图4A和B所示，其中43项（74.13%）临床试验与癌症生物标志物研究相关，其余属于其他疾病（约25.87%）。深入了解外泌体货物排序机制及其分泌、通过特定体液的转移以及在生理设置和不同疾病背景下的稳定状态水平，将产生更强的生物标志物，用于监测疾病的发生和发展。此外，进一步的研究对于验证外泌体生物标志物与传统癌症生物标志物相比的特异性和灵敏度至关重要。 药物输送应用 外泌体作为用于输送治疗剂的生物纳米平台已在临床前和临床实验中进行了研究。在纳米技术领域，设计智能载体进行靶向药物输送是黄金标准。外泌体可能是将几种药物输送平台制剂转化为临床应用的良好申请者。从药物输送的角度来看，外泌体在磷脂结构方面类似于脂质体。然而，外泌体可以从各种体液和细胞中收集，具有不同脂质和表面蛋白和受体的复杂结构；这些生物分子可能有助于组织和细胞靶向，而一些则保证最小的非靶向相互作用。这些独特的蛋白质装饰的磷脂膜可能具有与邻近和远距离目标相互作用的理想条形码。尽管进行了广泛的研究，基于外泌体的药物输送系统相对于其他合成纳米载体（如脂质体）的优越性，以及相关的利益风险比仍然是辩论的问题。治疗剂，包括核酸、蛋白质和药物，至少可以通过两种通用方法插入外泌体，然后被运送到特定目标。这些方法是直接方法或外源性方法，其中药物通过几种方法加载到分离的外泌体中；以及间接方法或内源性方法，其中亲本细胞被加载药物或基因改造以表达所需的蛋白质、受体和RNA。如果亲本细胞正确产生所选分子的外泌体，则内源性方法具有较低的复杂性水平。或者，有一种称为外泌体启发的脂质体的方法，其中一个所需的脂质体与外泌体融合以构建混合载体。正在进行的临床试验表明，外泌体被用于输送治疗剂，例如，在ClinicalTrials.gov资源中有六项临床试验注册（https://clinicaltrials.gov/ct2/home）。在两项临床试验中，作者旨在通过直接方法将姜黄素封装到植物衍生的外泌体中，用于治疗结直肠癌和肠易激综合症（NCT01294072和NCT04879810）。此外，三项临床试验旨在修改间充质干细胞（MSCs），以产生过度表达的外泌体（表2）。这些试验都没有完成，到目前为止结果尚不可用。值得一提的是，一些临床试验使用来自肿瘤细胞的微粒来输送药物（例如NCT02657460和NCT01854866）。这些研究使用了微粒而不是外泌体的术语，并且在ISEV基于EVs研究的指南之前就已经记录了。 尽管研究人员已经努力利用外泌体的独特属性来推进智能药物输送系统，这些系统在药代动力学、靶向和安全性方面显示出可观的利润，与合成纳米载体相比，临床转化这些结果面临挑战。由于外泌体本身的特征复杂性、尺寸异质性和自然（批次到批次）的差异贯穿其组装过程，其固有的生物发生过程风险高于原始合成制造方法。此外，需要技术上可行且可重复的方法来用治疗药物加载它们。尽管脂质体的加载方法已经优化并在工业环境中使用，但外泌体仍然需要这样的方法。当前的细胞培养和外泌体纯化方法限制了标准化和大规模生产外泌体的实施。因此，要使外泌体被视为可靠的治疗载体，需要可扩展的制造工艺，以快速、成本效益和可重复的方式生产外泌体。 外泌体治疗 如今，人们对使用细胞衍生物（如外泌体）而非干细胞进行治疗的兴趣日益增加。来自干细胞的外泌体代表了与干细胞相同的治疗和临床益处。目前，已知许多来自原生干细胞的外泌体已被证明能够恢复不利条件和受损组织。一些实验室采用了提高外泌体产量和改善外泌体治疗潜力的策略，包括干细胞的预处理、干细胞的遗传修饰以及外泌体与生物材料的结合。例如，使用去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺来促进间充质干细胞（MSCs）分泌外泌体，而不影响其调节能力。其他物理策略包括将干细胞与低氧、酸性介质和脂多糖共同孵育。除了动物细胞，微生物和植物衍生的外泌体也被认为具有。然而，这些外泌体/EVs的安全性需要评估。在临床背景下，外泌体已注册用于治疗多种疾病。近年来，由于COVID-19肺炎的爆发；由于其免疫调节和再生潜力，MSCs衍生的外泌体正日益受到检验。根据ClinicalTrials.gov资源（https://clinicaltrials.gov/ct2/home），共有33项外泌体治疗临床试验注册，其中20项临床试验使用了MSCs衍生的外泌体（60.60%）。研究人员还使用植物、T细胞和DCs衍生的外泌体治疗不同疾病。大多数研究（9项临床试验）属于SARS-CoV-2肺炎治疗（图4）。这些结果表明，来自MSCs的外泌体经常用于再生医学。然而，一些研究表明，MSCs外泌体治疗有时被视为“双刃剑”。与令人满意的结果相反，外泌体治疗的安全性、副作用和不良结果尚不完全清楚。一项临床研究旨在调查植物（葡萄）外泌体预防头颈部癌症放化疗相关口腔粘膜炎的能力（NCT01668849）。最近，FDA指出，内布拉斯加州接受未经批准产品治疗的患者报告了严重的不良反应，这些产品被宣传为基于外泌体的产品。该机构强调，目前没有监管批准的外泌体产品，患者被一些诊所欺骗，以预防和治疗多种疾病。除了外泌体的产量，许多其他属性也受到选择的分离方法的影响。外泌体的纯度和物理化学属性是受不同分离方法影响的主要因素。可以使用不同的方法，如超滤、尺寸排除色谱、水相两相系统和基于聚合物的沉淀，用于外泌体的大规模生产。达到临床使用的大规模所需外泌体是一个主要挑战。外泌体的产量通常少于1 µg外泌体蛋白/mL培养基，而大多数研究中外泌体的有益剂量约为10-100 µg外泌体蛋白/小鼠。在临床试验中使用外泌体需要符合GMP。在GMP中，外泌体的显著问题普遍存在。首先，大规模生产。实现基于外泌体的治疗的一个主要问题是外泌体的低生产力。其次，收集高质量和统一的外泌体。外泌体的物理化学和纯度属性是受不同分离方法影响的主要问题。第三，标准化储存条件。第四，开发外泌体的治疗潜力。对于外泌体的压倒性低效率，阐明它们的治疗潜力可能是一种可能的解释。过度表达或富集治疗性生物分子是提高治疗潜力的简单方法（图5）。此外，将外泌体输送到目标组织/细胞是一个关键问题。由于外泌体的生物学效应是通过它们被目标细胞摄取来实现的，因此澄清和控制外泌体的生物分布对于临床治疗应用是必要的。骨髓来源的MSCs、人类心脏祖细胞、单核细胞来源的DCs、脂肪组织来源的干细胞和HEK293细胞等五类细胞已在GMP中用于生产外泌体。尽管已有几项实验研究报告，但关于植物衍生外泌体的GMP生产证据较少。总的来说，一个正常的临床试验项目和监督监测值得注意，以确认患者在接受干细胞和外泌体治疗时的安全性。 图5 分析基于外泌体的生物标志物临床试验(A, B)以及针对不同疾病的基于外泌体治疗的临床试验(C) 外泌体疫苗 肿瘤细胞衍生的外泌体已被用于治疗以引发强烈的抗肿瘤免疫反应。此外，基于外泌体的疫苗对几种传染病显示出了希望的结果。来自先天免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体有潜力被用作癌症疫苗（图2）。外泌体上的几种活性分子，如MHC和共刺激分子，促进免疫细胞的抗肿瘤反应。最近在分析外泌体货物方面的进展也导致了活性剂的增加，这些活性剂可能被用于癌症免疫疗法。基于对外泌体在癌症免疫疗法中功能的广泛研究，已经使用外泌体进行了许多临床前研究。在接受抗Survivin免疫疗法的胶质母细胞瘤患者中，CD9+/SVN+和CD9+/GFAP+/SVN+外泌体的低水平与患者持续生存相关。此外，肿瘤细胞衍生的外泌体含有DNA链，这些DNA链可以通过STING/cGAS途径诱导免疫细胞反应，因此，这些外泌体可能在免疫检查点治疗中调节肿瘤免疫。来自癌症患者的DCs衍生外泌体在一些小规模临床试验中被证明是安全和可行的用于免疫疗法。DCs外泌体免疫疗法在精确和精确的免疫反应方面优于其他疗法。此外，DCs外泌体免疫疗法具有更高的生物稳定性和生物利用度，成本更低。在第一阶段I临床试验(NCT01159288)中，作者使用自体DCs衍生外泌体进行疫苗接种，以对抗转移性黑色素瘤，并展示了它们的安全性。然而，他们没有观察到深刻的CD4+或CD8+T细胞反应；仍然需要检查疫苗抗原分布背后的机制。此外，在另一项研究中，DCs衍生外泌体已被证明可以增加NSCLC患者的NK溶解活性并诱导MAGE特异性T细胞反应。在一项免疫疗法II期临床试验中，作者旨在通过使用IFNγ DCs外泌体来增强进展期NSCLC患者的T细胞和NK免疫反应。作者报告说这些外泌体可以增强患者的NK细胞的抗肿瘤免疫。然而，关键的临床结果，无进展生存期(PFS)的50%，没有实现，研究中没有描述出色的免疫反应。最后一个可信的选择是将DCs外泌体疫苗与基于NK的疗法相结合，以产生针对NK依赖性肿瘤的协同免疫原性结果。此外，似乎构建一种经过修饰的永生化DC系库，该库被修饰以表达单一MHC II分子和/或没有MHC蛋白，可以使DCs外泌体的恒定生产变得有希望，减少治疗成本和细胞培养时间间隔。在对免疫细胞招募有抵抗力的脑癌中，DCs外泌体在小鼠模型中已被证明对胶质瘤有希望，表明这些外泌体免疫疗法可以成为胶质母细胞瘤的新疗法。根据目前的研究结果和临床试验，外泌体被认为将成为各种癌症的免疫治疗疫苗。临床试验管理了符合当前GMP标准的自体DCs外泌体。迄今为止的临床试验对于证明自体外泌体管理的可行性和短期安全性非常重要，但基于外源性外泌体产品的疗法的安全性问题将更加严格。尽管一些研究已经描述了大量外泌体生产的协议和生物相容性的发展，但需要额外的临床前和临床审查以确认。最后，相对较小的尺寸和统一的形状使外泌体能够成功逃避单核吞噬系统的清除，不仅延长了它们的循环时间，也暗示了它们在细胞-细胞通信中的优越性。 结论 在过去二十年中，EVs/外泌体领域取得了惊人的进步。许多研究人员正在进行外泌体的发现和应用，为人类健康提供帮助。然而，指导方针、标准化、命名和动力学仍需取得更一致的方法。外泌体在体内转移的事实以及货物通过体液传递和送达目标的机制存在不足，是我们建议需要进一步考虑的领域。我们主要鼓励来自不同学科的研究人员，如临床医生、细胞生物学家、技术权威和计算机专家的合作，可以在外泌体假定的任何领域带来重大飞跃。在这项研究中，我们根据潜在应用和疾病类型，认真审查了外泌体的治疗应用和最近临床试验的现状。尽管临床前研究描述了有希望的结果，但获得更大成果需要对外泌体基础治疗进行许多改进。人类和衍生的植物外泌体已在临床试验中记录。来自人类细胞的外泌体占大多数，并与植物相比有完整的报告。外泌体的临床应用包括用作预后和诊断疾病的生物标志物、药物输送载体、无细胞治疗和癌症疫苗。所有这些应用都伴随着挑战和限制，需要更多的探索和标准化。进一步的研究表明，符合GMP的人类外泌体可以满足临床试验的使用需求。我们认为，外泌体在疾病管理中的有效性主要取决于技术进步，这些技术进步允许它们的发现、对不同疾病发展的敏感性和特异性。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 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病毒和细胞外囊泡（EV）共享许多特性。细胞用于制造、包装和释放EV的机制同样被病毒利用来实现其复制、组装和释放。病毒可能通过增加EV的产生或操控EV来传播其遗传物质或蛋白质，而EV则可能携带免疫调节分子和病毒抗原，从而激活抗病毒免疫反应，对调节病毒感染具有关键作用。这种相互作用是极其复杂的，它不仅揭示了EV和病毒在多种疾病发展中的相关性，还为联合治疗提供了新的视野。本文将概述病毒与EV的相互关系，并讨论近五年来在病毒-EV治疗工程方面的主要进展。 多细胞生物依赖细胞间的通讯来调控其生理学的多个方面。这种通讯定义了细胞生长和行为的微环境，对于集体防御病原体至关重要。大多数细胞间通讯是通过生物活性分子的运输实现的，这些分子可以通过被动扩散或通过载体如EV来运输。EV是细胞分泌的膜囊泡，具有不同的大小、成分和来源，能够通过传递生物活性分子来诱导受体细胞产生生理变化。EV中包含的生物分子种类繁多，根据其来源组织、免疫状态和细胞环境的不同而异，目前通过ExoCarta、Vesiclepedia和EVpedia等在线数据库进行记录。 EV的来源多样，包括多泡体（外泌体）、质膜（微泡）以及其他细胞器，如自噬体。微泡的直径通常在50至1000纳米之间，通过肌动蛋白-肌球蛋白网络的ATP依赖性收缩从质膜释放。外泌体是直径在30至150纳米之间的EV，最初在多泡体内形成，随后在多泡体与质膜融合后释放。与外泌体不同，微泡的分泌依赖于特定的细胞信号通路。微泡和外泌体的膜组成有许多共同特征，包括四跨膜蛋白、磷脂酰丝氨酸脂质、细胞粘附蛋白和细胞内运输蛋白。受体细胞对它们的摄取遵循相似的途径和机制。自噬体衍生的EV则是自噬体非经典加工的结果，它们通过与内体或多泡体融合，或直接与质膜融合来释放。 EV在免疫反应中发挥着重要作用，它们可以携带抗原和免疫刺激因子，激活针对病原体和肿瘤的免疫反应，同时通过排出有害物质如细胞质中的核DNA来维持细胞稳态。在妊娠、干细胞分化和损伤修复中，EV也扮演着关键角色。例如，脂肪间充质干细胞分泌的EV对控制细胞增殖、迁移和凋亡至关重要，并且在血管生成、神经再生和免疫反应中也发挥着重要作用。尽管许多EV调节的信号通路对细胞稳态和宿主免疫有益，但在某些情况下，EV也可能传播或加剧病理状况，如携带与神经退行性疾病相关的错误折叠蛋白，或促进肿瘤进展和炎症反应。 EV与病毒之间的联系非常紧密。病毒可以利用EV途径来促进其生命周期的各个方面，包括进入宿主细胞、排出以及调节宿主的免疫反应。同时，EV也可以作为警告宿主细胞病毒感染并激活抗病毒反应的工具。病毒和EV之间的相互作用对病毒的发病机制具有重要影响。例如，通常用于警告周围细胞病毒感染并激活抗病毒反应的EV，可能被某些病毒劫持，从而降低邻近细胞的免疫反应，使它们更易感染。 在这篇综述中，我们将重点讨论过去十年来关于EV和病毒相互作用的发现。我们将首先描述EV的生物合成途径，并探讨病毒如何为了自身利益而利用或操纵这些途径。接着，我们将研究EV在病毒传播和发病机制中的作用，以及EV、病毒和免疫系统之间的相互关系。最后，我们将关注EV在病毒相关疾病中的作用，并探讨将病毒和EV结合作为治疗方法的有前景的策略，特别是针对肿瘤的治疗。 病毒和 EV 相互交织的细胞内途径 EV生物合成途径 EV 由细胞多泡体 (MVB) 中包含的腔内囊泡 (ILV) 分泌。生物合成途径始于内体成熟为 MVB，此时膜货物招募诱导内体膜内部出芽和 ILV 形成的因子。这些货物可能包括蛋白质、核酸、代谢物和脂质。根据货物类型及其与EV包装复合体的相互作用，货物的吸收由不同的机制控制。 将蛋白质包装到 EV 中取决于翻译后修饰（主要是泛素化，在某些情况下还包括苏素化），以及与插入 MVB 内的脂质和蛋白质的特定相互作用。泛素化蛋白的摄取已被广泛研究，并由运输（ESCRT）机制所需的内体分选复合物介导。泛素化蛋白与 ESCRT-0 相互作用，后者招募 ESCRT-I，包括 TSG101 亚基。ESCRT-I 依次招募 ESCRT-II 和 -III。总而言之，ESCRT 机制在液泡蛋白分选相关蛋白 4 (VPS4) 的帮助下介导 MVB 的内陷和 ILV 的分裂。然后需要去泛素化来对 EV 内的蛋白质进行分类（图 1 A）。在某些情况下，SUMO 化还介导 ESCRT 机制对蛋白质的摄取。例如，Kunadt等人研究表明，α-突触核蛋白的苏酰化对于其与 ESCRT 复合物的相互作用以及将其包装到 EV 中是必要的。 图 1. 病毒和 EV 使用相互交织的生物发生途径。( A ) EV生物合成途径：从MVB形成到EV释放。EV 的形成需要 ESCRT 复合体将 ILV 中的货物内化到 MVB 内，Rab-GTPases-11、-27 和 -35 将 MVB 运输到质膜，以及 SNARE 复合体用于 MVB 与质膜融合并释放 ILV，成为EV。MVB 膜中的泛素化货物招募 ESCRT-0，ESCRT-0 又招募 ESCRT-I、-II 和 -III，介导膜内陷。ESCRT-III 复合物在 VPS4 的帮助下形成细丝诱导 ILV 建模和断裂。( B ) 病毒劫持 EV 生物合成途径。( B1 )HAV衣壳进入MVB，在EV中分泌并形成“准囊膜”病毒。HAV 病毒衣壳结构域 VP2 和 VP1pX 招募 ALIX、ESCRT-III 和 VPS4 进入 MVB。MVB 与质膜融合后，准囊膜的 HAV 被释放。有囊膜病毒SARS - CoV-2、HCMV 和HBV也进入MVB ，在那里它们获得病毒囊膜。( B2 ) HIV 通过劫持 ESCRT 复合物获得其囊膜。HIV 囊膜蛋白 (Env) 招募与二聚化病毒 RNA 相关的 Gag 和 Gag/Pol 多蛋白。然后，Gag p6 结构域从质膜招募 ESCRT 复合物、ALIX 和 VPS4 以及芽。( B3 )HSV-1通过劫持ESCRT复合物逃离细胞核。插入内核膜的 HSV-1 病毒核包络复合物 (NEC) 会招募 ESCRT-III 和 VPS4 并在核囊膜内出芽。然后，含有HSV-1衣壳的囊泡与外核膜融合，并在胞质溶胶中释放HSV-1衣壳。HSV-1 随后通过在反高尔基体囊泡内出芽，然后通过胞吐作用获得病毒囊膜。( B4 )祖先逆转录转座子Arc蛋白募集ALIX并被分泌。Arc 编码衣壳 GAG 结构域，该结构域自组装成包含 Arc mRNA 的病毒样衣壳。衣壳可能会招募 ALIX，从而增强质膜的出芽以及含有 Arc 衣壳和 mRNA 的 EV 的分泌。 蛋白质可以通过不依赖于ESCRT复合体的非经典途径被分选入EV中。例如，ALIX能够绕开ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II，直接在多泡体（MVB）内结合并运输未泛素化的货物。此外，ALIX还能被细胞质蛋白Syntenin招募，后者与MVB膜上的Syndecan结合，形成多聚糖-蛋白复合物，通过部分ESCRT独立途径促进内体小泡（ILV）的形成。同时，蛋白质还可以通过鞘脂依赖性、ESCRT独立机制被包装进ILV。MVB膜含有鞘脂，可被中性鞘磷脂酶-2（n-SMase-2）水解生成神经酰胺，神经酰胺的插入可诱导MVB膜形成负曲率，进而形成ILV。神经酰胺进一步转化为1-磷酸鞘氨醇（S1P），可增强S1P受体的活性，参与ILV内货物的分类。 与蛋白质相比，核酸如何被包装进EV的过程尚不完全清楚，但可能涉及多种机制。miRNA等小RNA分子根据RNA结合蛋白识别的序列基序被包装进EV，这些RNA结合蛋白包括异源核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）、突触结合蛋白结合胞质RNA相互作用蛋白（SYNCRIP）、Argonaute2、Y-Box结合蛋白1（YBX-1）、MEX3C、主要穹窿蛋白（MVP）和La蛋白。这些RNA结合蛋白与MVB膜蛋白如Caveolin-1（Cav-1）、n-SMase-2和VPS4相互作用，促进miRNA进入MVB。例如，苏酰化的hnRNPA2B1可结合特定miRNA序列（GGAG），然后被招募到MVB。在细胞应激时，Cav-1从质膜小窝重新定位到MVB，导致hnRNPA2B1被吸收。基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA（mtDNA）也可能被分选进MVB。受损的gDNA可通过微核被转运出细胞核，最终释放到细胞质中。同样，在细胞应激时，mtDNA可能渗漏到细胞质中，然后被MVB吸收。 四跨膜蛋白在EV生物合成中也起着重要作用。这些蛋白参与多种生理过程，如细胞迁移、粘附和信号传导。多种四跨膜蛋白，如CD63、CD9和CD81，位于MVB内，支持蛋白质和核酸货物的运输、选择和分类到ILV，以及受体细胞对EV的摄取。例如，CD63在微核膜上被发现，可促进gDNA从微核分选到ILV。 一旦货物被包装进ILV，MVB要么与溶酶体融合被降解，要么移动到质膜并在那里通过SNARE复合物调节的过程释放ILV到周围环境中，形成EV。MVB向质膜的转运由Rab GTP酶介导，Rab-11和Rab-35介导不依赖于ESCRT的MVB分泌，而Rab-27在依赖于ESCRT的途径中发挥作用。其他Rab蛋白如Rab31也被发现参与EV生物合成，通过独立于ESCRT的途径促进ILV的货物摄取，并抑制MVB与溶酶体的融合。 分泌的EV可在多种体液中发现，如血液、尿液、唾液等，其在体内的半衰期受多种因素影响。一些研究表明，EV在小鼠体内的半衰期可能很短，静脉注射后30分钟内可检测到。EV可扩散到同一组织中的周围细胞，也可分布到远处组织。EV对特定细胞类型的选择性由产生它们的细胞决定，甚至可能影响它们在特定器官中的积累。基质内因素也影响EV的流动性和分布。EV通过EV相关跨膜分子被特定受体细胞内化，如ICAM-1、整合素等。EV的内化机制包括膜融合、网格蛋白介导的内吞作用等，受EV纯度、尺寸、丰度和局部环境等因素影响。 病毒劫持 EV 生物合成途径 病毒已经采取了劫持EV生物合成机制的策略，以帮助其生命周期的各个阶段。RNA 和 DNA 病毒都可以通过使用 ESCRT 复合物和 Rab-GTP 酶获得病毒囊膜。有囊膜病毒在进入 MVB 时可以获得病毒囊膜，如人类巨细胞病毒 (HCMV)、人类疱疹病毒 6 (HHV-6)、SARS-CoV-2、登革热病毒 (DV) 和乙型肝炎病毒 (HBV) 中所观察到的那样。例如，HBV 大乙型肝炎表面蛋白 (LHB) 劫持 Rab5B，导致其从内质网转运至 MVB。在那里，LHB 招募 HBV 衣壳和 TSG101 并在 MVB 内出芽。然后，HBV 劫持 Rab7a 和 Rab27，从而增强 MVB 成熟并与质膜融合。 无囊膜病毒也会劫持 ESCRT 复合体，并在 EV 内分泌其病毒颗粒或病毒基因组，正如在甲型肝炎病毒 (HAV)、戊型肝炎病毒 (HEV)、肠道病毒 71 (EV71) 和蓝舌病毒中观察到的那样 。这些所谓的准囊膜病毒可以避免免疫识别并增强其对不同细胞类型的趋向性，同时以非溶细胞方式离开细胞。HAV 衣壳招募 ESCRT-III、VPS4 和 ALIX，使病毒衣壳在 MVB 内向内出芽，并随后在 EV 内释放。HEV 蛋白 pORF3 与 TSG101 相互作用，导致病毒衣壳募集并将其包装到 MVB 中，然后再进行 HEV-EV Rab27a 依赖性分泌。EV71 衣壳和 RNA 也在 EV 内部以非裂解方式释放。最后，蓝舌病毒包装到 EV 中是由非结构病毒蛋白 NS3 介导的，NS3 是与 TSG101 相互作用所必需的并允许在 MVB 内摄取（图 1 B1）。 此外，一些病毒还劫持 ESCRT 和 Rab-GTPase 蛋白以在不进入 MVB 的情况下完成其复制周期。首先，病毒招募 ESCRT 复合物来获得病毒囊膜。例如，人类免疫缺陷病毒 (HIV) 招募 ESCRT-I、-II、-III、ALIX 和 VPS4 从质膜中出芽（图 1 B2）。同样，黄热病病毒 NS3 蛋白通过结合 ALIX 介导内质网 (ER) 内的病毒出芽，从而可能招募 ESCRT 复合物。其次，一些在细胞核内形成衣壳的病毒通过劫持 ESCRT 复合物到达细胞质。例如，插入内核膜内的单纯疱疹病毒 1 (HSV-1) 核包络复合物 (NEC) 会募集 ESCRT-III 并结合成熟的衣壳。这允许 HSV-1 衣壳以 ALIX、TSG101 和 ESCRT-II 独立的方式在核膜内内部出芽。然后病毒衣壳通过与外核膜融合而释放到胞质溶胶中。HSV-1 随后通过在跨高尔基体囊泡内出芽获得最终的囊膜，并通过胞吐作用分泌（图 1 B3）。其它病毒也会劫持 Rab-GTP 酶来运输其病毒物质，例如带有 Rab10 的流感病毒 (IAV)，或增强其复制周期，如丙型肝炎病毒 (HCV) 和 Rab27a 所观察到的。最后，病毒可以劫持 ESCRT 机制，形成病毒复制酶复合物。例如，番茄丛状突瘤病毒 p33 复制蛋白劫持 VPS4、ESCRT-I 和 ESCRT-III，并介导过氧化物酶体内病毒 RNA 基因组的排序，病毒在过氧化物酶体内复制并免受细胞免疫监视。 来自病毒感染细胞的 EV 有助于促进健康细胞的感染 EV 在病毒传播和健康细胞的感染性中发挥着重要作用。许多病毒通过胞外囊泡将传染性颗粒或遗传物质传递到周围细胞。这可以为囊膜病毒和非囊膜病毒提供一层外衣，使其免受免疫监视，同时允许病毒传播，如前文所述 HCMV、HHV-6、SARS-CoV-2、DV、HBV、HAV、HEV、EV71 和蓝舌病病毒。例如，含有病毒样颗粒的 DV-EV 将病毒转移到未感染的蚊子细胞中。此外，病毒-EV还运输可以诱导受体细胞主动感染的病毒基因组。来自人类pegivirus感染受试者的血清含有EV样颗粒，其将pegivirus RNA基因组转运至受体T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并介导这些细胞内病毒RNA的主动复制（图2A）。 图 2. 病毒-EV 增加受体细胞对病毒的摄取。( A ) 病毒-EV 增加受体细胞的病毒摄取和主动感染。有囊膜 [HCMV、HHV-6、Sars-CoV-2、DV、HBV] 和无囊膜 [HAV、HEV、EV71、蓝舌病毒] 病毒均分泌在病毒 EV 内，并诱导受体细胞主动感染。病毒基因组在病毒 EV 内的运输也可以诱导受体细胞的主动感染 [Pegivirus]。此外，病毒-EV可以在其表面呈现PS，从而增强其对受体细胞的摄取[HAV、EBV、寨卡病毒、HIV、柯萨奇病毒B3、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒。病毒-EV 还以不依赖于受体的方式诱导受体细胞的主动感染，如含有病毒基因组和蛋白质、病毒衣壳和蛋白质或与宿主 miRNA 和蛋白质相关的病毒 RNA 的病毒-EV 所观察到的那样 [EV71 、HCV、HBV、SFTS 病毒]。( B ) EV 介导的病毒感染性增强。一些病毒-EV 在受体细胞之间转移病毒受体，增加这些细胞对病毒的摄取[Sars-CoV-2、HIV]。其它含有病毒基因组、病毒 RNA 和蛋白质以及宿主粘附蛋白（ICAM-1 及其受体 LFA-1，整合素）的病毒 EV 增强病毒的细胞间传播 [HTLV-1] 。含有宿主粘附蛋白、抗原呈递受体、细胞因子和病毒 RNA 的病毒 EV 不会直接导致感染，而是以非病毒受体的方式增强病毒传播 [HIV-1]。病毒-EV 还可以通过抑制病毒复制来增强潜伏感染 [HSV-1]。( C ) EV 介导病毒在宿主之间的传播。单一病毒-EV可以运输和递送多种病毒颗粒至受体细胞，从而增强病毒感染[脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒B3、诺如病毒、轮状病毒。其中一些病毒-EV介导病毒粪口传播[诺如病毒、轮状病毒]。蚊子产生的病毒 EV 含有病毒基因组、病毒 RNA 和蛋白质，并呈递 PS [寨卡病毒] 或人类 CD63 四跨膜蛋白直系同源物，诱导哺乳动物细胞主动感染。 一些病毒改变 EV 的脂质和蛋白质组成，以增加新细胞的结合和摄取。例如，HAV、肠道病毒、EBV、寨卡病毒和HIV感染的细胞会分泌富含PS的EV。HAV-EV 富含 PS 和胆固醇。PS 结合 HAV 细胞受体 1 (HAVCR1) 并介导内吞作用，而胆固醇则结合 NCP1 内体蛋白并融合内体和 EV 膜，从而在细胞内释放 HAV 衣壳和基因组。同样，肠道病毒（脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒和柯萨奇病毒 B3 (CVB3)）被包装在富含 PS 的类自噬体细胞器内，PS 以病毒受体依赖性方式介导病毒进入。在潜伏感染期间，由于 PS 与 DC 上的 TIM-1 受体结合，含有病毒 miRNA 的 EBV-EV 被受体 DC 摄取。同样，感染 EBV 的淋巴瘤细胞分泌含有病毒 miRNA 和 PS 的 EV，并由单核细胞整合（图 2 A）。 EV 的独特组成还可以允许以不依赖于受体的方式摄取病毒并改变病毒向性，正如在 EV71、HCV、HBV 和血小板减少综合征 (SFTS) 病毒严重发烧中所观察到的那样。包含病毒基因组的 EV71-EV 由受体细胞以不依赖于受体的方式整合，因为病毒受体的敲低并不意味着受体细胞会摄取病毒。同样，HCV-EV包含病毒RNA和宿主miR-122和Ago2蛋白，这两者都是HCV复制时劫持的宿主因子。这些 HCV-EV 以不依赖于受体的方式诱导肝细胞主动感染。事实上，针对 HCV 糖蛋白 E1 或 E2 或参与 HCV 进入细胞内的宿主蛋白（SB-RI、ApoE、CD81）的抗体的存在并不会削弱病毒感染。SFTS-virus-EV 含有病毒 NS 蛋白和病毒颗粒，并以不依赖于病毒受体的方式诱导受体 HeLa 细胞的主动感染，正如缺乏抗 SFTS 病毒抗体的作用所表明的那样。此外，尽管 HBV 对肝细胞具有趋向性，但 HBV-EV 仍含有 HBV DNA、RNA 和蛋白质，可被自然杀伤 (NK) 细胞整合（图 2 A）。 EV还通过将病毒靶向宿主受体转运至通常不高水平表达它们的细胞来增加细胞对病毒感染的易感性。例如，EV在未感染的内皮细胞之间运输 SARS-CoV-2 病毒受体 ACE2和四跨膜蛋白 CD9。CD9 促进 ACE2 在受体细胞表面聚集，从而增强其对 SARS-CoV-2 感染的敏感性。同样，HIV-1 病毒受体 CCR5 在微粒内转移到外周血单核细胞 (PBMC)，但也转移到不内源表达 CCR5 的内皮细胞，从而允许 HIV-1 感染内皮细胞（图 2 B）。 含有病毒RNA的病毒EV也可以促进受体细胞的感染。HIV 感染的单核细胞衍生的巨噬细胞分泌含有 HIV-1 RNA、潜在的 HIV 逆转录酶、宿主细胞因子（白细胞介素 (IL) -3、-4、-8、-17、瘦素、肿瘤坏死因子 α (TNF- α))、抗原呈递受体和粘附因子（HLA、CD14、CD74、CD44R5、Fc 受体、纤连蛋白和半乳糖凝集素-3），并具有特定的脂质成分 (PS)。这些 HIV-1-EV 通过不依赖 CD4 的网格蛋白介导的内吞作用控制受体 T 细胞的感染。Narayanan等人研究表明，T 细胞系分泌的 HIV-1-EV 含有病毒 TAR RNA、Gag 和 Gp160 蛋白以及宿主 miRNA 机械蛋白。HIV-1-EV 转移 TAR RNA 通过下调 Bim 抑制细胞凋亡，从而促进 HIV-1 感染受体 Jurkat T 细胞。此外，人类 T 淋巴细胞病毒 1 型 (HTLV-1)-EV 含有病毒 RNA 和蛋白质，但也含有以下粘附蛋白：CD45、ICAM-1及其受体 LFA-1。这些 HTLV-1-EV 不会主动感染受体 T 细胞，而是增强受体细胞之间的细胞间接触。已知 CD45 和 ICAM-I/LFA-1 分别支持病毒生物膜和病毒突触的形成，从而促进病毒感染。病毒EV还可以促进潜伏感染并增强病毒在宿主之间的传播。例如，HSV-1-EV 包含控制 HSV-1 复制的病毒 miRNA（miR-H28 和 -H29），并下调 IFN 基因刺激剂 (STING)，这是一种激活抗病毒先天免疫的细胞质 DNA 传感器（图2B）。 病毒-EV 通过包装多个病毒颗粒来增强病毒颗粒的转移。这种包装能够将多种病毒基因组和蛋白质转移到受体细胞，从而提高细胞抗病毒免疫反应的存活率并增加整体感染性。在脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒和柯萨奇病毒 B3 (CVB3) 的自噬体衍生的 EV以及诺如病毒的 MVB 衍生的 EV 和轮状病毒的质膜衍生的 EV中观察到了这一点（图 2 C）。 病毒EV增强宿主之间的病毒传播 EV 中病毒颗粒的封装通过在宿主之间提供安全传输来提高病毒传播率。例如，当诺如病毒和轮状病毒在EV内部受到保护时，它们在通过粪便和胃肠道时不会被降解。这改善了这些病毒的主动粪口传播。另一个例子是 DV，它在节肢动物（白纹伊蚊和埃及伊蚊）的EV内传播到哺乳动物宿主。感染 DV 的蚊子细胞分泌的 EV 含有病毒 RNA（全长病毒基因组、病毒衣壳 mRNA）和蛋白质（病毒糖蛋白 E 蛋白），可促进蚊子细胞、小鼠细胞、人类皮肤角质形成细胞和血液内皮细胞的主动感染。有趣的是，这些 DV-EV 富含一种含有四跨膜蛋白结构域的蚊子糖蛋白 Tsp29Fb，它是人类 CD63 的推定直系同源物。Tsp29Fb 与 DV E 蛋白的相互作用对于节肢动物 DV-EV 被人类受体细胞摄取和主动感染是必需的。感染寨卡病毒的蚊子细胞分泌含有PS、病毒糖蛋白E蛋白和病毒RNA的EV，介导蚊子和哺乳动物细胞（猴内皮Vero细胞、人单核细胞、内皮血管细胞）的主动感染（图2C） 。 细胞根据祖先逆转录病毒序列产生 EV 生殖细胞的逆转录病毒感染导致宿主基因组的长期修饰，其中原病毒成为内源性逆转录病毒。内源性逆转录病毒与长末端重复（LTR）反转录转座子非常相似，因为它们都编码gag样、pro样和pol样基因，进行逆转录并整合到宿主基因组中。这些发现表明这两个元素之间存在潜在的共同祖先。有趣的是，一些 LTR 逆转录转座子还介导病毒样颗粒的形成，从而实现细胞间的生理通讯。 例如，哺乳动物基因 PEG10 和神经元基因 ARC 都是编码 GAG 类似物的 LTR 逆转录转座子。它们在分泌到 EV 中之前自我组装并封装自己的 mRNA。PEG10 基因编码衣壳、核衣壳、蛋白酶和逆转录酶 GAG 结构域。Segel等人研究表明，侧翼目的基因与 mPEG10 的非翻译区域允许在 EV 中运输目的 mRNA 并在组织内转移，这可用于基因治疗递送。ARC 基因编码衣壳 GAG 结构域，该结构域封装 Arc mRNA 并在分泌到 EV 中之前劫持 ALIX。然后，这些 EV 可以靶向神经元细胞，Arc mRNA 在神经元细胞中积极翻译。有趣的是，Arc 通过控制长期抑制和增强所需的蛋白质的合成来调节突触可塑性。因此，这种 Arc mRNA 在神经元之间的转移可能在哺乳动物的认知功能中发挥了原始作用（图 1 B4）。 此外，通过 EV 转移逆转录因子可以增强肿瘤发生。肿瘤细胞分泌富含人内源性逆转录病毒 (HERV) 元件（例如 Alu 和 LINE-1）的 EV，这些元件可促进受体细胞的肿瘤发生。例如，皮肤T细胞淋巴瘤分泌含有编码合胞素-1的HERV W元件的EV。EV 接收后，合胞素-1 介导受体细胞之间的膜融合，并可以改善细胞之间肿瘤信号的传递。 原文：C.Moulin, M.J.F.Crupi, C.S.IIkow, et al., Extracellular Vesicles and Viruses: Two Intertwined Entities. International Journal of Molecular Sciences, 2023. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:双特异性抗体-药物偶联物（BsADCs）代表了一种创新的治疗类别，将抗体-药物偶联物（ADCs）和双特异性抗体（BsAbs）的优点结合起来。作为下一代ADC方法的定位，BsADCs有望改善与ADCs相关的现有临床挑战，特别是涉及内吞作用不佳、非靶向毒性和药物抗性等问题。目前，有十种BsADC正在进行临床试验，初步结果强调了持续改进的必要性。这篇综述首先深入探讨了BsADCs的具体设计考虑因素，包括目标选择、抗体格式和连接-有效载荷复合物。随后的部分概述了BsADCs遇到的现有进展和挑战，通过相关案例研究进行说明。将BsAbs与ADCs结合提供了解决ADCs现有临床限制的前景解决方案。然而，BsAb、连接物和有效载荷之间的共生相互作用需要进一步的优化和协调，超越简单的“1+1”，以有效地克服BsADC领域面临的现有挑战。 1.引言 抗体-药物偶联物（ADCs）由抗体、连接物和细胞毒素有效载荷组成。利用ADCs靶向肿瘤预计可以减少与常规化疗相比的系统性毒副作用，提供更宽的治疗窗口和更高的治疗指数。在过去的十年中，ADCs在实体瘤和血液瘤的治疗中逐渐成熟，成为抗肿瘤药物研究领域的一次革命。随着T-DM1和DS-8201对HER2阳性乳腺癌的批准，ADCs的商业临床管线稳步增长。目前，有超过140种ADC处于临床开发阶段，其中15种已获得批准。 尽管ADC开发取得了显著的成功，但意外的毒性出现、载荷毒性特征的有限提高以及抗性的产生提出了严峻的挑战。各种因素促成了现有的临床困境，特别是在实体瘤的背景下：(1) 实体瘤的异质性限制了单一抗原靶向的临床效果；(2) 治疗压力引起抗原下调、表位突变和旁路途径的激活，导致显著的ADC抗性；(3) 正常组织中目标抗原表达、连接物不稳定和其他变量等因素导致有效载荷释放不精确，引起非靶向毒性；(4) 目标抗原对内吞作用的抗性阻碍了足够致命效果的发挥。这些未解决的问题阻碍了ADCs的临床进展。抗体、连接物和载荷的战略优化成为下一代ADCs的有希望的途径，有可能克服当前的临床挑战。 ADC毒性的主要来源在于连接-有效载荷复合物，而抗体与抗原的结合也对药物效果产生重大影响。解决上述临床挑战的前瞻性方法涉及将双特异性抗体（BsAbs）与连接-有效载荷复合物结合，产生了双特异性抗体药物偶联物（BsADCs）的概念（图1）。BsAbs是能够结合到同一或不同抗原上的两个不同表位的抗体。目前，超过400种不同形式的BsAbs正在进行III期临床试验，其中10种已获得批准。与传统ADCs相比，BsADCs独特的双重表位/目标结合模式不仅可以增强选择性，通过结合实体瘤中共表达的抗原，还可以显著提高内吞作用。这些独特的优势使BsADCs成为下一代ADCs领域的重要力量。目前，有10种BsADC正在进行临床试验（表1），一些早期临床试验结果在最近的AACR和ESMO会议上提出。尽管取得了进展，但安全性和有效性未能达到理论预期，强调BsADCs的设计不仅仅是“1+1”。BsADCs的结合模式变化影响整体效果，强调了对BsAbs、连接物和载荷进行全面协调和优化的必要性。BsADCs面临的持续挑战包括有限的抗体框架、异质的偶联方向、不一致的双特异性抗体生成、两个目标之间的未知参数和潜在的安全问题。这篇综述系统地概括了BsADCs的设计策略，包括组成、设计考虑因素以及当前的进展和挑战，旨在为下一代ADCs的设计铺平道路。 图1 BsADCs 的概念和设计考虑。(1) 抗原结合位点：抗原结合位点的关键考虑因素包括选择抗原组合、结合模式、交联内化和细胞运输；(2) Fab 和 Fc 区域：Fab 和 Fc 区域中的相关问题包括解决链结合挑战、BsAb 生成、扩大抗体骨架，以及探索与 FcgR 和 FcRn 的组合；(3) 连接子-载荷复合物：连接子-载荷复合物需要进一步优化，以提高其在 BsADC 设计中的有效性。 2.BsADCs的设计考虑 目前已知的BsADCs BsAb骨架范围相对有限，目标主要集中在HER2、EGFR和c-MET上。尽管BsAbs数量众多，但仍需要进一步探索以确定它们是否适合构建BsADCs。ADCs的模块化组件——抗体、连接物和载荷——需要独立优化，特别是考虑到不同的肿瘤亚型。这些关键组件的微小修改可能导致临床特征的大幅变化。仅仅用BsAbs替换抗体是不足以完全表征适用的BsADCs。在设计未来的BsADCs时，抗体的替换、连接-载荷复合物的优化和偶联策略应被视为相互联系的网络，需要整体方法。 2.1. BsAbs目标的设计考虑 构建BsADCs的首要考虑在于明智选择适当的目标组合。目标选择是ADCs成功开发的基本原则，对最终的治疗窗口和系统毒性产生关键影响。鉴于传统ADCs面临的普遍非靶向毒性和临床抗性挑战，以下标准应指导目标选择：(1) 传统指导原则涉及识别具有良好内吞作用、在正常组织上表达相对较低、在肿瘤上高表达的抗原。(2) 承认实体瘤的异质性，必须确定各种肿瘤亚型和部位的目标表达水平，促进最佳实施定制药物传递，而不是依赖单一的“神奇子弹”方法。(3) 由于BsADCs独特的双重靶向特性，全面考虑抗原组合的深层效应至关重要。这包括内吞作用、循环、周转率、溶酶体降解和强制性机制等因素。深思熟虑地整合这些考虑因素对于有效的BsADC设计至关重要，确保对抗原与细胞过程之间的动态相互作用有细微的理解。 在目标结合后，ADC-抗原复合物的内吞作用是决定药物传递的关键过程。抗原的类型、抗体的属性和结合模式共同影响ADCs的内吞作用及其发生的速度。关键的抗体属性，如价态、形状、大小、等电点和疏水性，产生深远的影响。此外，结合模式和位点进一步塑造了内吞作用过程。例如，在Hung等人的研究中，设计了十种PD-L1抗体以识别糖基化位点，只有那些识别N192和N200的才显示出内吞作用。这意味着，即使针对同一抗原，ADCs的内吞作用也可能从极好到不可接受不等。BsADCs通过强制性机制（例如，劫持和抗原聚集）提供了增强内吞作用的有效途径。快速周转目标可以显著提高内吞速度，即使在肿瘤上表达较低的情况下（例如，HER3和催乳素受体）。利用快速周转受体作为BsADCs目标可以显著提高整体内吞效果。此外，BsADCs独特的双重结合模式促进了膜上较大的抗原-抗体复合物的形成，从而诱导大量内吞作用和目标下调。这种对内吞作用动态的细微理解强调了BsADCs通过战略设计考虑优化药物传递的潜力。 快速周转受体和大的抗原-抗体复合物的形成可以将内吞复合物重定向到溶酶体而不是循环利用，正如在某些情况下观察到的。内吞后，ADCs必须穿过内吞体才能到达溶酶体以实现有效的载荷释放。来自ADCs的治疗压力可以改变跨内吞体的运输，导致溶酶体传递减少，并增加分布到其他细胞隔室或增强循环。这不仅降低了疗效，也促进了对ADCs的药物抗性。 ADC-抗原复合物可以通过多种机制进行内吞，包括Fc介导的非特异性内吞，clathrin介导的内吞，caveolin介导的内吞，以及胞饮作用。其中，clathrin介导的内吞被认为是ADC内吞的主要途径。在BsADCs的背景下，它们在clathrin介导的内吞过程中被定向到排序内吞体和内吞循环隔室，这一过程由RAB和ARF（ADP-核糖基化因子）家族的小GTP结合蛋白调节。这种内吞机制的复杂相互作用强调了理解和优化BsADCs的内吞旅程对于有效药物传递和减轻抗性风险的重要性（图2A）。从早期内吞体（pH约6.0-6.5）开始，快速循环受体（例如，EGFR39,40和TGF-bR41）通常通过依赖RAB4的快速循环和依赖RAB8和RAB11的慢循环回到细胞膜。相反，快速周转受体，如PRLR24，通过依赖RAB7的降解途径被运输到晚期内吞体（pH约5.0-6.0），然后是溶酶体（pH < 5）。内吞复合物的命运——无论是被循环利用还是被定向到溶酶体进行降解——取决于蛋白质的细胞质域中特定序列（基序）与包被坑元素的相互作用。含有泛素化信号和YXXØ共识基序的膜受体可以招募clathrin和clathrin适配蛋白2（AP2）到质膜，AP2识别并促进运输到溶酶体。 图 2 (A) BsADCs 在促进内化和溶酶体降解方面具有独特的优势，这一过程涉及介导的网格蛋白内吞和非网格蛋白介导的内吞。(1) 针对快速周转受体（图 2A 中的浅绿色受体）的 ADCs，带有信号基序（例如，YXXØ）可以通过网格蛋白介导的内吞作用（黑色箭头）进行内化。内吞的抗原-抗体复合物在 RAB5 的引导下进入分拣内体（也称为早期内体，pH 约为 6.0-6.5）。随后，它可能通过 RAB4 和 RAB11 介导的循环过程，或者选择 RAB4 和 RAB35 介导的快速循环过程返回到细胞膜表面（pH 约为 7.4）。(2) 另外，ADCs 也可以通过非网格蛋白介导的内吞作用进行内化（绿色箭头）。(3) 在分拣内体中，抗原-抗体复合物通过 ESCRT 介导被分类到晚期内体。然后复合物在 RAB7 的引导下进入溶酶体（pH < 5），在那里 ADC 发生降解，释放载荷。需要注意的是，提供的 pH 值和 RAB 关联是一般的，实际值可能因细胞类型而异；(B) Fc 与 FcRn 的结合对 ADCs 的血液稳定性至关重要。当 ADC 被血管内皮细胞或单核细胞摄取时，ADC 中的 Fc 片段与 FcRn 结合，导致其循环回细胞外空间。这个循环过程有助于防止早期降解，有助于 ADCs 的血液稳定性。 为了解决由于内吞途径重定向导致的疗效下降和药物抗性问题，一种策略是设计在到达溶酶体之前在弱酸性环境中（排序内吞体、内吞循环隔室和晚期内吞体）降解以释放载荷的BsADCs。另一种方法是选择含有YXXØ基序（例如，CD63和APLP2）的膜受体，泛素化信号（例如，PRLR）或其他溶酶体排序信号作为其中的一个目标。早期内吞体处理和溶酶体劫持使具有循环潜力或内吞作用较差的受体成为BsADCs的可行目标，显著扩大了ADC目标的选择范围。ADCs的完整内吞运输过程，特别是在非clathrin介导的内吞中，仍然不够了解，需要进一步深入研究。 抗体的属性和抗体-抗原结合相互作用需要仔细考虑。与传统ADCs相比，BsADCs具有双特异性结合属性，引入了强制性机制（图3C）。这提供了一个决定性的优势，通过同时阻断两个（或更多）目标，超越了传统ADCs的能力，并从传统化疗扩展到混合疗法的治疗效果。此外，双特异性靶向有助于通过生物屏障。例如，靶向转铁蛋白受体和Ephrin A2（EphA2）可以介导有效的跨细胞运输，为构建通过血脑屏障靶向脑肿瘤的BsADCs提供了一个有希望的途径。 双特异性靶向特性在克服由于内吞作用不良、下调、结合位点突变和旁路途径激活引起的多机制药物抗性方面起着关键作用。为了促进细胞表面抗原聚集，结构分析至关重要。两个结合位点和表位之间的距离应该仔细考虑，以防止在同一抗原上结合。T细胞重定向BsAbs有潜力将T细胞重定向到肿瘤微环境（TME），为设计T细胞重定向BsADCs开辟了途径。这有可能显著扩大免疫治疗选择，特别是在血液肿瘤治疗方面。实体瘤的异质性在精确靶向T细胞和肿瘤的两个臂上提出了挑战。此外，针对非内吞目标（例如，TME和免疫细胞）的BsADCs在药物释放方面需要关注。利用可切割连接物和可渗透载荷设计非内吞BsADCs的策略是一个有希望的方向。 图 3 BsADCs 中 BsAb 类型的设计考虑。(A) BsADCs 的双表位和双靶标结合模型；(B) 可能的 BsADC 设计的 BsAb 类型；(C) BsAbs 的双靶标机制为 BsADCs 提供了强制性机制。 2.2. BsAbs格式的设计考虑 抗体由两个重链和轻链组成，包括Fc区域和Fab区域。在构建ADCs时，抗体骨架的基本要求包括适当的循环半衰期和低免疫原性。BsADCs的一个主要分类标准是它们是否包含Fc区域。缺乏Fc区域的抗体由两个抗体的可变VH和VL域组成，或基于Fab片段。由于缺乏Fc区域，构建更加方便，较小的分子量增强了渗透。同时，失去了与FcgR的结合能力，减少了Fc介导的非特异性药物摄取。相反，失去了与新生儿Fc受体（FcRn）的结合，导致血浆中相对短的半衰期（图2B）。不包含Fc的BsADCs的设计面临稳定性低、聚集问题和缺乏偶联位点等挑战。另一方面，包含Fc的BsADCs带来了额外的优势，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）、免疫吞噬作用和细胞因子释放，这些都有助于肿瘤杀伤。然而，在内吞过程中与FcgR的结合可能导致BsADCs在正常组织中的内吞，导致非靶向毒性。总之，Fc区域构建的策略包括：（1）Fc工程：这涉及Fc区域的氨基酸修饰、突变引入和糖基化修饰。这些方法可以帮助减轻由与FcgR结合引起的非靶向毒性；（2）保留ADCC和CDC：双目标结合模式有助于六聚体形成，并可以增强CDC效应。而ADCC可以提高肿瘤杀伤效果；（3）保留FcRn结合或应用抗体工程有助于提高半衰期和安全性。 此外，BsAbs的生成对于BsADC设计也至关重要。这旨在避免链关联问题，简化生产过程，降低开发成本，提高产品稳定性。在这方面需要进一步评估和探索，最近的综述提供了这方面的详细见解，我们将在观点部分探讨。 BsADCs可以根据其结合模式进行分类，包括同时结合两种不同抗原（双抗原结合模式）或结合同一抗原上的两种不同表位（双表位结合模式）（图3A）。这两种结合模式深刻影响BsADCs的药效学（PD）和药代动力学（PK）特性。双抗原结合模式不仅增强了选择性，还有潜力阻断信号通路，克服药物抗性，并提供协同杀伤效果。在这种模式下，特定的目标选择可以改善内吞作用，药物效果，并减少药物抗性。例如，靶向快速周转受体，如PRLR，可能增强内吞作用并劫持溶酶体运输。构建针对c-MET和EGFR的BsADCs可以有效克服与EGFR单一治疗相关联的药物抗性。为了开发有前景的双目标BsADCs，仔细调节两个目标的亲和力比例至关重要，确保同时结合而不触发目标激活。需要进一步分析以确定目标的表达阈值，以确保有效的肿瘤杀伤。因此，更精确地表征癌细胞上的阳性抗原以指导未来的临床应用是必要的。 2.3. 连接物-有效载荷复合物的设计考虑 BsADCs中的连接物作为抗体和细胞毒素有效载荷之间的关键连接，对有效载荷的释放和药物稳定性起着至关重要的作用。理想的连接物应在血浆中表现出稳定性，同时在肿瘤中促进有效释放。目前，ADCs中的连接物可以分为可切割和不可切割连接物。 不可切割连接物以在血浆中高稳定性为特点，只能在溶酶体中降解以释放有效载荷。这种类型的连接物导致较低的非靶向毒性，增加的血浆半衰期和提高的安全性。然而，由于内吞作用和溶酶体运输的障碍，可能会产生潜在的药物抗性。基于不可切割连接物的BsADCs应专注于进一步优化内吞作用，以及随后的内吞体运输和溶酶体降解。 与不可切割连接物相比，基于可切割连接物的ADCs应用更广泛。可切割连接物主要通过利用体循环和肿瘤之间的微环境差异来控制有效载荷的释放。可切割连接物的主要挑战在于非特异性释放导致的非靶向毒性。可切割连接物可以分为化学可切割连接物（例如，酸性和GSH可切割连接物）、酶可切割连接物（例如，cathepsin可切割连接物）以及其他类型（例如，光响应和生物正交可切割连接物）。为了设计不依赖溶酶体的BsADCs，某些可切割连接物（例如，Val-Cit，VC连接物）可以在早期和晚期内吞体中有效促进有效载荷的释放。有证据表明，细胞外存在化学或酶促切割触发器，导致近年来提出了非内吞ADCs的概念。非内吞ADCs可以靶向TME中的抗原和血管系统，激活旁观者杀伤效应。通过使用可切割连接物和旁观者有效载荷，有潜力设计非内吞BsADCs。 连接物和偶联方法中的新兴策略塑造了抗体-药物偶联物的设计。在BsADC设计中广泛使用的Val-Cit-p-氨基苄基氨基甲酸酯连接物展示了可接受的稳定性，但与剂量限制的不良效应相关，这阻碍了临床应用。为解决这个问题，在VC连接物中引入极性残基替代和模拟肽增强了血浆稳定性和溶酶体切割能力。目前的工作集中在探索新型连接物，如legumain敏感和串联可切割连接物，以实现在目标细胞中足够的药物释放和改善的水溶性。有希望的是，正在进行的新型酶候选物的鉴定，如在特定肿瘤类型中过度表达且具有高切割效率的α-L-艾杜糖苷酶，正在进行中。除了连接物创新，关于偶联位点的化学和结构动态的全面讨论在塑造ADCs的属性方面起着重要作用。 细胞毒素有效载荷是BsADCs不可或缺的一部分，在决定整体抗肿瘤效果和潜在不良反应方面起着至关重要的作用。理想的ADC有效载荷需要在纳摩尔到皮摩尔水平上表现出高药物效果，考虑到ADCs的低渗透性。此外，这些有效载荷应具有足够的血浆稳定性、低免疫原性和适当的水溶性。最后，有效载荷应具有可用于与抗体偶联的可用基团。ADC有效载荷包括微管抑制剂、DNA/RNA损伤剂、免疫靶向剂和新型有效载荷。我们在最近的综述中总结了ADC有效载荷的进展。在构建连接物-有效载荷复合物时，进一步的考虑对于设计理想的BsADCs至关重要： 主要考虑因素包括选择合适的偶联方法和药物抗体比率（DAR），即连接到给定抗体的连接物-药物的数量。ADCs的不同药物携带形式（DAR从0到8）在体内药代动力学上有显著差异。对于BsADCs，DAR通常在2到4之间，以在肾脏清除和效力之间取得最佳平衡。在使用毒性较低的药物时，如使用PROTACs108和拓扑异构酶抑制剂，可能需要更高的DAR值才能达到足够的细胞杀伤效果。然而，简单地在高DAR下增加载荷偶联可能导致偶联物的疏水性，从而导致聚集、快速清除和效力下降。此外，特别是在高DAR下，有效载荷与抗体残基的不完全偶联可能导致偶联异质性，使表征复杂化，并可能引起毒性问题。传统上对BsAbs表面赖氨酸残基的非特异性衍生不仅会引起偶联异质性，还可能影响双目标结合效果。均一偶联策略，如位点特异性偶联技术和基于酶的偶联方法，可以应用以生产均匀且可纯化的BsADCs。这些方法最大限度地减少了药物偶联对双目标结合的潜在影响。 BsADCs中有效载荷的旁观者杀伤效应是一个值得进一步讨论的关键方面。旁观者杀伤效应指的是有效载荷释放后能够杀死邻近未被靶向的细胞。这对ADCs的PK/PD特性是一把双刃剑。虽然旁观者杀伤效应可以增强ADCs在肿瘤异质环境中的整体疗效，但它也存在对肿瘤周围正常组织中非靶向细胞的杀伤风险。这种效应依赖于可切割连接物和疏水性有效载荷。如果其中一个目标抗原在正常组织中有一定程度的表达，例如c-Met，BsADCs应避免应用具有旁观者效应的有效载荷。如前所述，有效载荷的旁观者杀伤效应使得构建非内吞BsADCs,成为可能。总之，旁观者杀伤效应为克服肿瘤异质性、肿瘤屏障和内吞作用不佳的BsADCs提供了希望。然而，与非靶向效应相关的潜在安全问题需要仔细解决。 ADCs面临剂量限制毒性的挑战，这突出了创新有效载荷的需求。新型药物有效载荷对BsADC开发至关重要。通过将POI与E3连接酶连接，PROTAC诱导POI泛素化，随后在蛋白酶体中降解，使POI在较低剂量下实现有效目标蛋白降解——使PROTACs成为BsADCs的理想有效载荷。抗体-PROTAC偶联物，或DACs，在体内增强了PROTAC的传递效率。双特异性DACs在靶向蛋白降解中有广泛的应用潜力。此外，对于自身免疫和炎症性疾病的免疫刺激有效载荷，如Toll样受体激动剂、STING激动剂和糖皮质激素受体调节剂，也是有希望的。此外，新兴的有效载荷，如铁死亡诱导剂、寡核苷酸和DNA框架，为BsADC领域的药物选择提供了扩展。新型药物的开发可以显著丰富BsADC领域的可选药物类型。 3.BsADCs的当前进展和问题  3.1. 靶向HER2的BsADCs  约20%至25%的乳腺癌患者通过免疫组化和荧光原位杂交技术观察到HER2过表达，将他们归类为HER2阳性。临床上批准的靶向HER2的单克隆抗体（mAbs）和ADCs，如T-DM1和DS-8201，旨在阻止侵袭性肿瘤生长。靶向HER2的治疗显著改变了HER2阳性乳腺癌的治疗选择，带来了临床益处。然而，某些临床挑战仍然存在。HER2表达的异质性限制了当前抗HER2疗法在相对较低HER2水平情况下的效力。这不仅缩小了HER2治疗的适应症范围，而且在治疗压力下促进了药物抗性。此外，HER2对内吞作用的潜在抗性降低了药物效力。总之，药代动力学限制、肿瘤内异质性和缺乏旁观者效应阻碍了靶向HER2药物的高级临床应用。 除了乳腺癌外，HER2过表达也可能发生在其他实体瘤亚型中，如胃癌、非小细胞肺癌和结直肠癌。然而，临床试验表明，靶向HER2的药物并未显著改善这些癌症中HER2阳性患者的预后。例如，一项III期试验显示，使用pertuzumab加曲妥珠单抗和化疗治疗HER2阳性转移性胃癌或胃食管结合部癌，并未显著改善生存率和临床益处。这种改善的缺乏可能归因于与其他实体瘤亚群相比，HER2阳性乳腺癌中HER2表达相对较低。因此，内吞作用不佳和分化机制可能导致临床益处不足。幸运的是，BsADCs的双结合模型为当前HER2靶向治疗中内吞作用不佳和药物抗性的挑战提供了有希望的解决方案。BsADCs有潜力通过改善内吞作用效果并展现有利的PK/PD特性，增强其他肿瘤亚型中的抗肿瘤活性（图4）。 图 4 ZW49 和 MEDI4276 的结构；39S 和曲妥珠单抗的表位位于 HER2 分子的两端（超过 90 埃）。MEDI4276 中使用的连接子几乎无法覆盖 60 埃的距离，这阻止了与同一抗原分子的同时结合（PBD 编号：3BE1）。 3.1.1. 靶向HER2的双表位BsADC ZW49。为了解决HER2靶向治疗中潜在的效力不佳和临床药物抗性问题，已经对双表位HER2抗体Zaniditamab进行了表征。Zaniditamab通过多种机制增强抗肿瘤效果，包括目标抗原中和、激活细胞介导的细胞毒性以及CDC。通过在细胞外域2（ECD2）结合域的Fab段引入突变，其独特的双表位结合模式可以有效地诱导目标抗原交联，导致受体驱动的内吞作用和增加的受体下调。使用IgG1样异二聚体Azymetric™ Fc平台，将抗HER2-ECD4单链可变片段（scFv）连接到重链1，将抗HER2-ECD2 Fab域连接到重链2。原始前体双表位分子的scFv和Fab臂分别以1和15 nmol/L的KD结合到HER2 ECD。机制分析显示，Zaniditamab可以通过跨受体结合模型结合两个HER2，诱导形成大型、极化的聚集簇。这不仅改善了内吞作用效果，还促进了抗体六聚体化，实现了增强的CDC效果。Zaniditamab已经通过了I期和IIb期试验，显示出有利的临床益处。作为具有强大肿瘤杀伤效果的优秀内吞抗体，它有利于进一步设计为BsADCs的抗体组分。基于Zaniditamab设计的抗HER2双特异性ADC，ZW49，利用链间二硫键半胱氨酸和可被蛋白酶切割的连接物。ZW49结合了一种新型有效载荷，N-酰磺胺奥瑞他汀，使其具有良好的耐受性。ZW49的双特异性抗体特性使其具有比曲妥珠单抗更优越的内吞作用。其Fc区域赋予了ADCC、ADCP和CDC效果，而HER2的六聚体模式增强了CDC和内吞作用140。这种设计满足了表达HER2的患者的几个未满足的临床需求。临床前数据显示，ZW49表现出强大的肿瘤杀伤效果和良好的耐受性，同时不损害HER2的亲和力（最高非严重毒性剂量Z 18 mg/kg）。目前，ZW49正在进行I期临床试验。截至2022年9月，ZW49是第一个披露临床试验数据的BsADC，表现出优越的内吞作用效果。在晚期HER2表达实体瘤患者中的目标反应率（ORR）为31%，尽管其眼部毒性特征（角膜炎42%）不容忽视。 MEDI4276。T-DM1和DS-8201在HER2表达水平较低的情况下面临疗效挑战，原因是它们对内吞作用的抗性。BsADCs的双特异性结合模式有望增强细胞内药物传递、克服抗性，并扩大在更广泛的癌细胞群体中的适用性。通过杂交瘤技术衍生的抗体39S，与曲妥珠单抗相比，针对HER2的不同表位。利用39S和曲妥珠单抗的可变域序列构建了一种双表位抗体，在39S IgG1的重链N端结合了曲妥珠单抗的scFv。这种BsAb保留了HER2结合特异性，并从两个臂的协同效应中受益，有效阻断了HER2同源或异源二聚体化。结构分析表明，这种结合模式有助于在细胞表面促进大量HER2交联，显著增强内吞作用和随后的溶酶体定位。这显著促进了内吞作用以及随后的溶酶体定位。这些发现强调了双特异性抗体适用于BsADC设计。随后，在Fc区域引入了三种突变——L234F、S239C和S442C。每个重链上的两个工程化半胱氨酸残基（S239C和S442C）实现了通过马来酰亚胺己酰连接子将微管聚合抑制剂tubulysin弹头定点偶联到抗体上。这种定点偶联策略确保了均一BsADCs（DAR约4）的形成。L234F突变的引入有效降低了FcgR结合，导致非特异性摄取和非靶向毒性降低。MEDI4276的临床前数据表明，它在诱导对T-DM1耐药的细胞系的细胞死亡方面具有有效性，突出了旁观者杀伤效应。此外，MEDI4276在不符合当前HER2靶向治疗条件的患者群体中具有应用潜力，提供了一个具有可接受安全性的有希望的途径。然而，I期数据显示MEDI4276具有相对严重的副作用和较差的PK特性。与ZW49的安全性概况相比，MEDI4276较低的最大耐受剂量（MTD）可能受到其价数、有效载荷和抗体配置的影响，表明需要进一步优化。虽然在实验层面改善内吞作用显示出前景，但将理论药物设计策略转化为临床益处需要进一步研究。总之，具有独特优势的双表位HER2靶向BsADCs，能够互补性地靶向HER2的不同表位，在细胞表面诱导抗体-受体聚集。这种增加的内吞作用可以有效地降解和下调受体，有助于安全性和效力，同时克服潜在的药物抗性。对临床益处的进一步探索是有希望的。 3.1.2. 靶向HER2的双抗原BsADC 除了内吞作用的抗性外，内吞的HER2-ADC复合物可能被循环回质膜，同时逃避溶酶体降解。优化HER2靶向ADCs的内吞作用和溶酶体运输潜力，可以增强细胞毒性并降低临床应用中HER2的阈值。经批准的HER2 ADC T-DM1使大约一半的HER2阳性患者受益（HER2过表达定义为IHC3+或FISH扩增比率≥2）。即使在HER2高表达（>106）的情况下，只有一小部分会经历内吞作用和降解以释放有效载荷。优化内吞作用和溶酶体运输可以提高HER2靶向ADCs的治疗效力。在这种情况下，同时靶向HER2和快速周转受体（如CD63和PRLR）的双靶BsADCs，提供了一种有希望的策略，可以显著改善细胞内药物传递。这种方法可能潜在地扩大HER2靶向治疗的临床适用性，并提高其在不同HER2表达水平的患者中的有效性。 BsADC在HER2-CD63上。CD63是四跨膜蛋白超家族的成员，表现出广泛但不是普遍的表达。它主要定位在细胞表面、晚期内吞体和溶酶体。CD63的细胞质域包含一个YXXØ共识基序，使其能够与Aps相互作用并招募clathrin外套。这种与AP2/AP3和clathrin的相互作用使CD63作为适配蛋白，有助于将相关蛋白从细胞表面运输到晚期内吞体溶酶体隔室。CD63在这些细胞隔室中的存在使其成为旨在增强内吞作用和溶酶体运输、最终改善药物传递和治疗效果的BsADCs的潜在靶点。 在CD63特异性单克隆抗体2192的可变重链和轻链域中引入组氨酸替代物的方法是一种战略举措，以调节对CD63的亲和力，从而确保肿瘤特异性。通过将这种低亲和力突变臂与来自HER2抗体的另一个Fab臂结合，创建了一种靶向HER2-CD63的BsAb。这种设计利用抗体依赖性受体交联来增强HER2的有效内吞作用，并促进溶酶体共定位。随后，BsHer2-CD63通过VC连接子与抗有丝分裂剂duostatin-3偶联。然而，观察到在低HER2肿瘤中缺乏效力表明需要进一步优化，包括潜在地提高DAR和解决肿瘤异质性。 BsADC在HER2-PRLR上。催乳素受体（PRLR）作为恶性乳腺上皮细胞中过表达的靶点，可以通过自泛素化和刺激AP2复合物的招募，有效地介导依赖clathrin的初始内吞作用和溶酶体运输。低PRLR表达水平（10^4-2×10^4）足以有效内吞PRLR靶向ADC。为了解决低/中HER2表达患者未满足的临床需求，PRLR上的BsADCs可以非共价交联质膜上的HER2和PRLR，并在溶酶体中触发HER2降解。 通过“knobs-into-holes”方法，设计了带有HER2臂和PRLR臂的BsAb。BsADC通过表面赖氨酸偶联和不可切割连接子（琥珀酰亚胺酸-4-[马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯，SMCC）与DM1（一种美登素衍生物有效载荷）偶联，平均DAR为3.324。与高度表达的HER2（w10^6）相比，细胞表面表达较低（w10^4）的PRLR足以引导组成性内吞作用和随后的溶酶体降解。这表明高周转表面靶点可以介导良好的内吞作用和溶酶体降解，从而提高BsADCs的效力，即使表达水平较低。 BsADC在HER2-APLP2上。APLP2细胞质尾部的酪氨酸包含重叠的基于酪氨酸的NPXY和YXXØ基序。类似地，APLP2可以与AP-2结合，通过clathrin介导的内吞作用有效地介导内吞作用，并直接运输到溶酶体降解途径。APLP2可以通过全长双特异性抗体技术，将一个aHER2（Herceptin）臂和一个aAPLP2抗体臂的BsAb设计出来，可以同时结合APLP2和HER2的重组ECD。通过谷氨酰胺转氨酶的定点偶联策略确保稳定性，AmPEG6-MMAD以DAR为2或4与BsAb偶联。APLP2靶向可以有效将循环靶点重定向到溶酶体以释放有效载荷。 AACR最近的一篇摘要还报告说，靶向HER2-TROP2的BsADC在共表达HER2/TROP2的肿瘤细胞中显示出更高的内吞作用和药物效果。这些BsADCs已经证明，靶向快速组成性周转靶点可以快速在溶酶体中积累并释放有效载荷，依靠共表达。双靶点结合策略还允许其他内吞作用不佳的靶点设计未来的BsADCs，扩大可能的靶点选择。 靶向HER2的ADCs已经彻底改变了乳腺癌的化疗策略，特别是T-DM1和DS-8201。当前的HER-2靶向ADCs仍然面临未解决的挑战：（1）对HER2高表达水平的需求阻碍了进一步的广泛应用；（2）需要进一步阐述和解决毒性状况、反应和药物抗性；（3）除了单一靶向，扩大HER2之外的产品线是有希望的。有效内吞的BsADCs对HER2表达低或ERBB2突变的癌症有效，超出了传统的HER2阳性乳腺癌。此外，独特的双特异性靶向可以扩大ADC设计中可选择的靶点范围，例如，Trop-2（如图5所示）。 图 5 HER2 上的双抗原 BsADC 的设计 3.2. 靶向EGFR和MET的BsADCs EGFR是ERBB受体酪氨酸激酶家族的成员，在调节上皮恶性肿瘤的基本功能中发挥关键作用，从而引起稳态失衡。在临床应用中，通常使用酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）和单克隆抗体（mAbs）来阻止EGFR的活性。值得注意的是，针对EGFR的mAbs，如西妥昔单抗和帕尼单抗，已经在多种EGFR扩增的癌症中进行了临床评估。然而，临床药物抗性的出现导致了中位无进展生存期不到12个月。在抗EGFR抗体治疗期间，导致抗性的主要原因是治疗压力诱导的获得性基因组改变（Acq-Gas）。具体来说，RAS、BRAF或EGFR外细胞域的突变，以及ERBB2（HER2）或MET的扩增，已成为主要因素。Depatuxizumab mafodotin是一种针对EGFR的ADC，被开发用于治疗胶质母细胞瘤。然而，临床数据未能证明其在总生存期方面的显著改善。临床试验已经探索了在EGFR突变和MET失调的患者中联合使用MET抑制剂的潜力，作为克服药物抗性的策略。 BsADCs在解决抗EGFR抗性机制方面展现出前景，包括敏感突变和旁路途径的激活。 3.2.1. 靶向EGFR的双表位BsADC 接受Cetuximab或Panizumab临床治疗的患者经常表现出Acq-Gas，如S492R、G465R、G465E和I491M，导致与EGFR靶向ADCs的相互作用被取消，并产生抗性。为了减少药物抗性的出现，开发了一种双表位抗体，该抗体针对两个不同的表位。这种双表位抗体是通过融合针对EGFR上不重叠表位（9G8和7D12）的纳米抗体而设计的。通过在97m偶联物的7D12部分的工程化表面半胱氨酸S7C将MMAE偶联到BsAb上，证明了四价双表位ADC具有均匀的DAR。随后，在Fc区域引入了E430G突变，以增强补体介导的免疫反应。作为一种四价双表位BsADC，7D12扰乱了EGFR信号级联，而9G8稳定了EGFR ECD的拴系构象，立体阻止了二聚体化。此外，7D12和9G8对不同的EGFR突变细胞系表现出效力，在诱导对野生型EGFR或表现出西妥昔单抗抗性突变的NIH-3T3细胞的更强CDC效应方面表现出效力。四价双表位BsADC证明了其能够克服与西妥昔单抗抗性突变相关的有限组合界面，展现出增强的内吞作用、偶联效率和治疗效果。在BsAbs中使用双表位结合模式设计多价ADCs是规避临床药物抗性突变的有希望的策略。 3.2.2. 靶向EGFR的双抗原BsADCs 靶向EGFR-HER3的BsADC。EGFR靶向治疗的抗性也可能通过ERBB受体的补偿性信号传导发生，涉及HER2和HER3等受体，表明了联合治疗的潜力。然而，临床数据显示，帕妥珠单抗和西妥昔单抗的联合使用导致重叠的毒性，使联合治疗难以忍受。HER3在EGFR抗性癌细胞系中显著过表达，有助于EGFR的内外抗性，同时激活PI3K。认识到HER3是克服EGFR抗性的一种新靶点，正在评估同时靶向EGFR和HER3的治疗组合，包括BsADCs。通过使用抗EGFR Fab和抗HER3 scFv构建了一种名为SI-B001的BsAb，该BsAb同时靶向EGFR和HER3。通过使用新型可切割AC连接子将拓扑异构酶I抑制剂（TOPIi）ED04偶联到SI-B001的半胱氨酸位点，设计了一种名为BL-B01D1的新型BsADC，DAR约为8。SI-B001在靶向EGFR和HER3方面表现出特异性，提高了安全性。反过来，BL-B01D1通过其双靶标的交联促进协同内吞。通过将SI-B001与小分子毒素结合，BL-B01D1实现了对EGFR依赖性肿瘤的靶向杀伤，减轻了由HER3引起的药物抗性。在最近的会议上，实体瘤患者（NCT05194982）的I期试验显示了有希望的疗效和有利的安全性。特别是在EGFR突变的NSCLC患者中，ORR达到了63.2%，证明了对各种药物抗性突变的治疗效力。此外，EGFR野生型NSCLC的ORR达到了44.9%。最常见的TRAEs（>10%，所有等级/G3）是白细胞减少症（60%/30%）、中性粒细胞减少症（51%/34%）、贫血（45%/15%）、血小板减少症（44%/19%）、脱发（30%/0%）、恶心（29%/<1%）、呕吐（28%/0%）、乏力（21%/<1%）、食欲减退（22%/<1%）、乏力（21%/<1%）、厌食（16%/0%）、腹泻（15%/2%）、口腔溃疡（15%/<1%）和皮疹（13%/0%），没有报告间质性肺病的病例。2023年11月，BL-B01D1成为首个进入III期试验的BsADC（NCT06118333）。尽管这些结果令人鼓舞，但根据早期数据进一步进行安全性评估和优化仍然至关重要。 靶向EGFR-c-MET的BsADC。已有几种靶向c-MET和EGFR的BsAbs被报道，它们在抑制肿瘤增殖和转移方面显示出协同效应。在设计BsADCs时，仔细选择适当的表位组合至关重要，以避免完全或部分激活c-MET。鉴于这些靶标在全身的广泛表达，针对肿瘤特异性表位并优化双臂亲和力以提高肿瘤选择性变得至关重要。通过对具有不同亲和力和表位的EGFR和c-MET抗体进行筛选，观察到EGFR臂的较低亲和力与更高的肿瘤选择性和改善的内吞作用效果相关。增强内吞作用的具体机制尚不清楚，但可能与c-MET和EGFR的交联以及双靶标结合模式的共内吞效应有关。与c-MET上的B10和B10v5重叠表位的抗体也可能有助于促进内吞作用。利用链交换工程域（SEED）技术，通过结合抗c-MET Fab和抗EGFR scFv构建了c-MET * EGFR BsAb，同时避免轻链错配。鉴于产生的BsAb表现出良好的肿瘤选择性和适当的内吞作用效果，MMAE被用于通过蛋白酶可切割的VC连接子在两个重链上进行C末端Sortase介导的偶联，DAR为2。最近报告了靶向c-MET  EGFR的BsADC AZD9592的摘要。BsAb是在DuetMab平台上产生的，通过引入Fab二硫键重新设计以防止轻链错配。调整c-MET与EGFR（c-MET：EGFR = 15）之间的亲和力关系已被证明可以减少与EGFR靶向相关的副作用。通过可切割连接子将TopIi AZ14170132偶联起来设计BsADC，在体外研究中表现出良好的选择性、效力和安全性。目前，AZD9592正在进行I期临床试验。对于靶向EGFR * c-MET的BsADCs，一个关键考虑因素是如何将体外选择性转化为体内安全性。这种转变需要使用适当的模型进行进一步的稳定性和药代动力学研究，以确保在实际生理环境中的疗效和安全性。 3.2.3. MET 上的双表位 BsADCs 肝细胞生长因子（HGF）-间充质-上皮转换因子（MET）通路在各种肿瘤类型和阶段的癌症发展中发挥着重要作用，从起始到转移。MET 的上调和扩增被认为是在抗 EGFR 治疗期间的主要逃逸途径。C-MET 可以与 EGFR 交叉反应，赋予对 EGFR 靶向治疗的抗性，使抑制 c-MET 成为克服 EGFR 抗性的有效策略。MET 靶向 TKIs 在治疗携带 MET 外显子 14 突变的 NSCLC 中的最新成功，提升了 MET 作为一个有吸引力的治疗靶点的地位。特别是选择性 MET TKI 和 ADCs 的 MET 靶向治疗正在取得进展。 尽管取得了进展，MET 抑制剂的临床结果面临着挑战。最新的 II 期临床数据显示，针对 EGFR 突变且 MET 过度表达的患者，抗 c-MET ADC Teliso-V 的活性有限。当前临床对 MET 靶向 ADCs 的困境包括：（1）缺乏对 MET 拷贝数最佳诊断截断点的共识；（2）MET 激酶域的二次突变或旁路信号的改变促进了抗性；（3）需要进一步优化内化、运输和降解效率。这些挑战突出了开发有效的 MET 靶向治疗的复杂性以及解决各种因素以增强其临床效用的重要性。 与传统的 MET 靶向 ADCs 相比，设计一种双表位 MET 与 MET BsADC 提供了创新的解决方案来克服现有的挑战。MET 双表位抗体有能力形成 2:2 抗原-抗体复合物，促进有效的 MET 内化和溶酶体运输，使其成为 ADC 设计的理想候选者。通过将 Maytansinoid 载荷 M114 通过蛋白酶可切割的连接子共轭到 MET BsAb 的表面赖氨酸，REGN5093-M114 的平均 DAR 被表征为 3.1。可切割的 VC 连接子有利于在弱酸性环境中的晚期和循环内体释放载荷。考虑到 MET 在正常组织中的表达，缺乏旁观者杀伤的载荷可能表现出较低的副作用。临床前数据表明，REGN5093-M114 显著抑制 MET 过度表达的 NSCLC 细胞的增殖。它有望评估 MET 表面表达水平作为接受 MET 靶向治疗的标准。已启动一项 I 期、剂量递增和剂量扩展研究，以评估 REGN5093-M114 在 MET 过度表达的晚期癌症成年患者中的疗效（NCT04982224）。REGN5093-M114 预计将在 MET 扩增和 EGFR 抗性患者中发挥治疗效果，尽管与 EGFR 靶向药物联合应用的耐受性需要进一步评估。 在解决 Acq-Gas 之外的挑战时，EGFR 和 MET 的抗体靶向治疗必须应对额外的复杂性。鉴于 EGFR 的广泛表达，设计具有不同亲和力的 EGFR 抗体以减轻系统性毒性副作用变得至关重要。在肿瘤发生于 KRAS 突变等下游刺激的情况下，阻断 EGFR 的药物被证明是无效的。当前的策略包括增强 EGFR 抗体的 Fc 区域的功能，特别关注 ADCC。此外，EGFR 的临床观察到的突变，如外显子 20 的插入，提出了新的挑战。识别和开发针对这些罕见驱动突变的新疗法具有临床意义。 MET 的独特 SEMA 域在 HGF 激活后比 EGFR 更容易二聚化。随后，激活的 MET 二聚体在细胞内激酶域和底物对接位点的酪氨酸残基上发生自体磷酸化。MET 抗体的二价结构可能促进二聚化，可能导致次优的治疗效应。在未来设计双表位 MET 与 MET BsADC 时，仔细考虑适当的表位选择和抗体构建策略是避免不必要的二聚化和自体磷酸化的关键。在设计针对 MET 与 EGFR 的 BsADCs 时，关键是防止 EGFR 和 MET 的磷酸化。这涉及到调整两个臂的亲和力比例，同时确保最佳的结合效果。此外，确定 BsADCs 的临床适用人群需要对临床肿瘤中 MET 和 EGFR 的表达水平进行详细讨论。这种考虑对于优化这些创新治疗方式的治疗潜力至关重要（见图 6）。 图 6 EGFR 和 MET 上的 BsADC；7D12（蓝色 PBD 编号：4KRL）、9G8（棕色 PBD 编号：4KRP）和西妥昔单抗（黄色 PBD 编号：1YY9）与 EGFR 外细胞域的相互作用。 3.3. 超越传统范式的新型 BsADCs BsADCs 在潜在靶标和支架方面的应用范围显著扩展，超越了传统范式。目前大多数 ADCs 针对的是肿瘤表面抗原，但它们在正常组织中的表达可能导致非靶向毒性。针对主要组织相容性复合物蛋白（pMHC）的抗体，被称为 TCR 模拟（TCRm）抗体，提供了一个有希望的解决方案。TCRm 抗体能够在肿瘤细胞上识别低水平表达的肿瘤抗原，而在正常组织中则不存在。一些报道的 TCRm BsAbs 显示出显著减少非靶向毒性的抗肿瘤潜力。然而，pMHC 的低表位密度（数十到数千）导致 TCRm 抗体和 ADCs 的效果次优。 为了提高 TCRm-ADC 的效力，采用了双特异性抗体策略。WT1 和 ny-eso-1 抗原在实体瘤中过度表达，具有重叠的表达谱和强大的免疫原性，被 TCRm 抗体靶向。利用“旋钮到孔”技术，将两个 TCRm 抗体的 Fab 臂结合起来。随后，通过 Sortase A 产生的位点特异性共轭到 MMAE，设计了 Bi-TCRm-ADC。Bi-TCRm-ADC 与 TCRm-ADC 相比显示出显著提高的效果（IC50 = 50 nmol/L，DAR = 1.2）。TCRm 不针对正常组织，导致非靶向毒性大幅降低。与 TCRm-ADC 相比，Bi-TCRm-ADC 预计将解决 pMHC 通常低表达导致的低药效问题。然而，寻找同时在肿瘤上高表达的两种 pMHC 的挑战仍然是未来发展的关键考虑因素。 事实上，BsADCs 提供了一种有效手段，将非内化抗原转化为内化抗原。例如，EphA2 以其快速内化而闻名，而活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）是一种非内化或缓慢内化抗原，被用来生成 BsAb。有趣的是，当细胞表面上 EphA2 与 ALCAM 的比例超过 0.2 的阈值时，双特异性抗体显示出有效的内化。相反，当比例低于此阈值时，内化受到阻碍。MC-VC-pab-MMAF 载荷复合物通过半胱氨酸残基位点特异性共轭。在 BsADCs 的双特异性结合背景下，同时靶向邻近抗原的内化效应可以显著影响，这取决于它们的表达比例。这种能力扩大了抗原选择的范围，包括内化能力较差的类型，用于设计 BsADCs。这种创新方法为提高某些抗原的内化潜力提供了一种微妙的策略，有助于 BsADCs 在针对更广泛肿瘤抗原方面的多功能性和效力。 2022 年，FDA 加速批准了新型 ADC IMGN853（ImmunoGen™），靶向叶酸受体 alpha（FRa）。为了增强中/低 FRa 水平患者的疗效，设计了一种双表位 ADC，IMGN151。IMGN151 保留了 IMGN853 的 Fab，采用基于 VL-Linker-VH-Fc 格式的 scFv 构建 BsAb。为了防止 scFv 的聚集形成，实施了分子优化，包括 VH44-VL100 半胱氨酸突变。此外，Fc 中的 C220S 突变旨在减少游离 Cys。Maytansinoid 衍生物 DM21 通过稳定的可切割肽连接子与 BsAb 链接。DM21-L-G 连接子-载荷复合物有助于其膜穿透和药代动力学特性。IMGN151 对四种 FRa 中等细胞系的活性比 IMGN853 高达 200 倍。此外，IMGN151 在高/中/低 FRa 表达水平下诱导完全肿瘤消退，耐受性良好，目前正在进行 I 期临床试验。在 ADCs 之外，靶向 FRa 的双特异性配体药物结合物也显示出前景，CBP-1018 和 CBP-1008 是临床试验中的先驱。这些进展代表了靶向治疗药物开发的重要步伐，为治疗具有不同 FRa 表达谱的癌症提供了新的途径（见图 7B）。 图 7 超越传统范式的新型 BsADCs。(A) 超越传统靶标范式的 BsADCs，靶向 EphA2 和 pMHC；(B) 针对新型 FRa 的 BsADC，IMGN151，以及双特异性配体药物偶联物的示意图；(C) 超越传统抗体范式的新型 BsADCs，包括 PEG 共轭 BsADC 和 LITE 平台。 各种新技术的引入彻底改变了 BsADCs 的产生，超越了传统的 ADC 范式，呈现出独特的优势。一个值得注意的进步是 PEG 共轭-BsADC（P-BsADC），它不仅确保了均匀的耦合生产，而且由于其小分子量和缺乏 Fc 片段，表现出高内吞效率、组织穿透力和降低的毒性。另一种值得注意的方法是使用由 8 臂 PEG 创造的双特异性肽-聚合物，同时共轭 PD1 结合肽和 PDL1 结合肽。此外，配体诱导的短暂参与（LITE）多个抗体域是一种尖端技术，结合了生物药物的长期半衰期优势和小分子活性的精确时间控制。这些创新策略在实现治疗效果的同时最小化非靶向效应方面具有巨大潜力，代表着 BsADC 技术发展的一个重大进步。 4.结论和展望 BsADCs，体现了“1 + 1”模型，代表了一种新型的治疗类别，融合了 ADCs 和 BsAbs 的优势。这种融合利用了 ADCs 的抗肿瘤机制，同时通过 BsAbs 的多功能性解决了传统 ADCs 通常与临床相关的挑战。BsADCs 呈现出显著提高传统 ADCs 疗效的有希望的途径，超越了常规目标和支架范式。最近的进步推动了 BsADCs 进入 I/II 期临床试验，标志着它们的发展取得了实质性进展。尽管如此，挑战依然存在，主要归因于实体瘤的复杂性，包括因素、区域异质性、组织紊乱和渗透性差。必须完善 BsADCs 的设计策略以克服这些挑战。在这篇综述中，我们总结了 BsADCs 的最新设计考虑和进展，目标是为未来的药物设计指明方向。虽然现有的进展值得注意，但 BsADCs 的持续发展和应用在以下方面面临独特挑战。 4.1. 扩大抗体骨架 BsADCs 的当前目标选择仍然有些有限，主要关注 HER2、c-MET 和 EGFR。然而，双特异性策略有潜力扩大目标范围，包括那些内化能力差或表达水平低的目标。考虑到 BsAbs 的多样性，进一步丰富 BsADCs 的抗原选择可以多样化抗肿瘤机制。有希望的途径包括基于 T 细胞参与或 PD-L1 靶向 BsAbs 的免疫调节 BsADCs。抗体骨架有限的原因可能是找到合适的共表达抗原组合的困难。有限的抗体骨架选择可能源于找到合适的共表达抗原组合的挑战。用 BsAbs 的一个臂靶向特定表达或高度内化的抗原可以增强整体药效。利用适度稳定的可切割连接子和旁观者效应载荷设计非内化 BsADCs，通过将可选目标扩展到细胞外间隔，显示出前景。除了 IgG 类似 BsAbs，非 IgG 类似 BsAbs（缺乏 Fc 区域）提供了简单结构、良好的渗透性和低免疫原性等优势。通过聚乙二醇修饰和 Fc 片段融合等长期平台技术解决其半衰期挑战，是值得进一步探索的途径。作为 BsADCs 的特异性，多特异性抗体，特别是三特异性和四合一抗体，代表了一个新机会。这些预计将解决受体冗余、非靶向毒性和实体瘤异质性的挑战。这种方法还有潜力满足未来更个性化和精确治疗的需求。 4.2. 清除异质的耦合方向 通过基于功能团的随机化学耦合来构建 BsADCs，存在异质耦合方向的风险。这种异质性可能破坏双特异性结合模式，并改变 BsADCs 的物理和药代动力学（PK）属性。位点特异性共轭策略可以产生具有均匀药物抗体比（DAR）的 BsADCs。在随机耦合的背景下，评估耦合策略对抗体结合模式潜在影响至关重要。这种细致的评估预计将有助于改善由于随机耦合导致的不均匀 DAR 引起的副作用和药效不佳问题。均匀 DAR 不仅提高了药物递送的精确性，还确保了治疗反应的一致性，这是 BsADCs 设计和开发中的关键考虑因素。需要强调的是，位点特异性共轭的基础在于精心选择共轭位点，这是影响 ADCs 药效的关键因素。 4.3. 统一双特异性抗体的生成 在利用杂交瘤技术构建 BsAbs 过程中，重链和轻链之间的结构不一致性在链的组装中提出了挑战，导致产量和纯化效率降低。现代基因工程技术的出现，特别是“旋钮到孔”策略，在克服这一挑战方面取得了显著突破。随后，蛋白质工程成为 BsAb 生成的综合方法，尽管它具有固有的复杂性和成本增加。复杂的生产过程反过来导致了以低产量、变化的质量以及不可忽视的杂质为特征的广泛筛选。与蛋白质工程相比，抗体的化学修饰作为一种新颖的、模块化的、可复制的生产策略出现。这种化学策略展示了良好的产量，能够快速生成稳定、均匀且定义精确的 BsAbs。此外，探索创新的 BsAb 生成平台有着有希望的前景。 4.4. 阐明两个目标之间的参数 BsADCs 的多价结合模式和参数对彼此施加了相互限制和依赖。两个目标之间的设计考虑需要仔细审查，特别是关于亲和力大小、表达和价的变化。双特异性结合模式不仅通过价相互影响，还通过交叉臂结合影响整体内化。抗体结构和结合表位之间的分子距离进一步促成了结合动态，影响抗原-抗体复合物的特性和随后的治疗活性。除了亲和力，癌细胞系表面抗原的表达阈值在决定整体药效方面发挥关键作用。解决这些关键点需要对具有不同亲和力的结合臂组合进行全面筛选，以实现最佳生物活性。尽管工作量很大，但 AI 和机器学习技术，如 RF 扩散模型的整合，预计将在基于不同结合臂生成和评估 BsAbs 方面带来新的优势。 4.5. 利用和劫持运输 BsAbs 可以通过利用 BsAb 的初始特异性仅作为第二特异性的运输方式，这种现象本质上是义务的，并且依赖于顺序结合，被称为“piggyback”或“hijacking”。一个说明性的例子是利用低亲和力转铁蛋白受体的 BsAb 平台，以 piggyback b-分泌酶抗体，促进有效通过血脑屏障。我们报道了靶向 CD63、PRLR 和 APLP2 的 BsADCs 证明了劫持溶酶体运输的能力。此外，EphA2 的靶向不仅促进了 BsADCs 通过血脑屏障，还增强了药物内化，强调了其作为 BsADCs 首选目标的效力。在这些策略的基础上，设计能够熟练穿越生物屏障和逃避溶酶体降解的 BsADCs 有希望。 4.6. 解决潜在的安全性问题 虽然 BsADCs 致力于提高特异性，从而减少非靶向毒性和副作用，但早期临床数据，如 ZW49、MEDI4276 和 BL-B01D1 所展示的，其临床安全性概况并不像预期的那样有希望。非靶向毒性成为与 ADC 相关的毒性中的一个主要特征。然而，仅依靠 BsAbs 可能不足以充分解决减少非靶向毒性的迫切需求。除了抗体创新外，围绕连接子-载荷复合物的关键讨论也是不可或缺的，包括连接子稳定性、均匀共轭策略、DAR 和旁观者杀伤效应的考虑。鉴于与 BsADCs 相关的潜在毒性的多方面原因，优化抗体、连接子和载荷组分的协同作用变得至关重要。除了载荷-连接子复合物外，剂量优化策略和给药方法，如皮下给药，有望解决 BsADCs 的剂量依赖性毒性问题，提高治疗指数。在早期临床试验中纳入药物基因组学分析是识别在接受 BsADCs 治疗后有更高不良事件风险的患者人群特征的有希望的途径。 总结来说，独特的双特异性靶向模式的出现为 ADC 领域注入了新的创新，标志着新一代 ADC 的到来。尽管仍处于发展初期阶段，BsADC 呈现出具有相当潜力的新颖方法。然而，早期临床试验遇到了重大挑战。人们高度期待上述策略的实施将导致创新 BsADCs 的成功设计。这一成就对于克服传统 ADCs 面临的现有临床挑战以及创造更精确靶向药物具有重要意义。除了 BsADCs，一系列下一代策略有望对新型 ADC 设计做出划时代的贡献。这些包括具有双重载荷的 ADCs、免疫调节 ADCs、放射性药物偶联物、掩蔽 ADCs、ADC 组合疗法和肽-药物偶联物。未来将评估这些策略的应用，无论是单独还是组合，用于新型 ADC 的设计，为该领域的进展提供了重要的前景。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。