Protease x Trypsin

「侃侃而言」 分析蛋白酶的底物序列偏好对于了解蛋白酶的生物学功能、和设计蛋白酶抑制剂至关重要。近日，上海药物所陈士羽、陆晓杰等团队联合报道了一种快速、高通量的蛋白酶非典型底物特异性分析策略——利用DNA编码的非典型底物文库（DENSL）来鉴定由典型、和非典型氨基酸序列组成的蛋白酶底物。 这种策略使用DNA编码的多肽库，并在N端引入生物素分子，将该多肽库固定在固体载体上。蛋白酶水解后，可以对底物肽释放的DNA标签进行测序，以确定底物结构。 作者利用这种方法进行蛋白酶的分析、和底物共价抑制剂的设计，发现目标蛋白酶高效、非典型序列抑制剂。为开发新的蛋白酶底物和抑制剂提供了一种快速、高效的方法。 文末点击“阅读原文”查看期刊原文。 ChemBioChem 2024, e202400559 DOI:10.1002/cbic.202400559 DNA编码非典型底物文库（DENSL) 蛋白酶在所有生命形式中发挥重要作用，参与多种病理过程，如病毒前多肽成熟、肿瘤转移、炎症、血管生成等。人类基因组中有超过500种蛋白酶，相比于其它种类，了解蛋白酶底物的偏好对于确定它们调节各种生物过程的机制至关重要。 传统发现特定蛋白酶底物的方法是基于凝胶电泳的分析方法，然而，此法对于低丰度的底物效率低，并且不能提供关于蛋白酶底物偏好的完整信息；此外，也开发了几种解决限制的新技术，如基于蛋白质片段的方法、噬菌体辅助肽库技术等，以及合成多肽微阵列、和基于多肽核酸（PNA）的多肽库，也被用于分析蛋白酶底物偏好。 相关家族的蛋白酶与相同天然底物结合的活性位点高度保守，识别相似的多肽底物。结构多样的非典型氨基酸促进与相关蛋白酶活性位点的差异性结合，多用于区分高度相关的蛋白酶。因此，合成非典型底物多肽也被用于分析蛋白酶，但是，这些技术由于低通量、高成本，限制了广泛的应用。而DNA编码化合物库（DEL）技术素来以高通量、低成本为技术亮点为人所知。在本文中，经作者团队对传统DEL的文库构建和靶标亲和力筛选过程加以修饰改进，称之为“DNA编码非典型底物文库，DENSL”，用于蛋白酶底物偏好性分析。 DENSL将非典型多肽的生成、与相分离筛选技术结合，用以确定最佳的蛋白酶底物偏好性多肽序列。 如下图A，DENSL分子与传统DEL分子相似，由一段headpiece连接多肽库和DNA标签序列，用以构建、编码多肽文库；不同的地方是DENSL在多肽库的N末端安装引入了生物素分子。 该技术将DEL技术结合了相分离筛选的过程，主要有以下步骤： 固载DENSL分子：通过多肽库N末端的生物素，将DENSL分子固定在固体载体上，如上图B，亲和素磁珠； 蛋白酶水解、分离特异性底物：利用底物水解过程中肽链的断裂，蛋白酶特异性底物多肽的标签被释放，并与非特异性底物分离； DNA标签回收、测序、分析、重合成、验证：识别富集的DNA序列，进而解析特异性底物序列信息，在经过一系列分析、多肽重合成、蛋白酶消化验证，从而发现高效、选择性好的蛋白酶特异性底物。 基于DENSL多肽库发现蛋白酶底物序列有许多好处： （1）DENSL多肽库，非典型氨基酸构建模块连接效率高，掺入非典型氨基酸序列的多肽具有更大的潜力，来区分具有微小的构象差异的蛋白酶底物口袋与天然底物； （2）多样性高，提高发现不同蛋白酶靶标家族底物的效率； （3）通过“拆分-合并”的组合策略合成，高通量文库合成便利； 研究人员利用上图中25个经典/非经典氨基酸，通过如下图的流程，构建了一个4循环的DENSL文库，包含约390,625个DENSL分子。 筛选条件优化：为了减少背景信号，研究人员对洗涤、洗脱条件进行了优化，如下图。 基于DENSL的蛋白酶分析 研究人员首先以胰蛋白酶作为模型蛋白酶，进行DENSL的初始筛选，如下图是筛选后的富集数据分析、和重合成底物表征、鉴定验证。 为了更好地研究DENSL的效率，研究人员又选择了成纤维细胞激活蛋白α（FAP）作为第二个研究靶标。如下图是筛选后的富集数据分析、重合成验证、和确定鉴定。 基于这种方法，研究人员确定了胰蛋白酶、FAP酶对底物每个位置的底物偏好。两种酶均能够识别非典型氨基酸序列。而且非典型氨基酸序列表现出高特异性和效力。 动力学分析与共价抑制剂设计 为了阐明基于DENSL开发的蛋白酶底物的物理性质，研究人员又进行了动力学试验，如上图。在确定了有效的识别肽基序后，研究人员利用其进行FAP共价抑制剂设计，如图E。进而，研究人员还研究了抑制剂与靶标的相互作用的动力学研究，如下图。 总结与展望 通过以上研究表明，DENSL是一种很好的分析底物偏好的工具。它具有效率高、分析周期短、成本低、能够掺入各种非天然氨基酸等优点。与其他方法相比，DENSL筛选在识别非典型肽方面表现出显著的效率。此外，通过底物分析，发现的抑制剂对蛋白酶调节剂的开发和蛋白酶在各种疾病中的功能评估有重要贡献。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要:流感仍然是一个严重的全球健康问题，每年造成重大的发病率和死亡率。疫苗接种对于减轻其影响至关重要，但需要快速高效的制造策略来应对时间和供应问题。传统上依赖于基于鸡蛋的生产，该领域已经见证了向基于细胞培养的方法转变，这提供了增强的灵活性、可扩展性和流程安全性。本综述提供了可用细胞基质和技术进步的简洁概述。我们总结了向流程强化的关键步骤——从滚筒瓶生产到载体上的动态培养，从批量模式的悬浮培养到使用各种细胞保持装置的高细胞密度灌注。此外，我们比较了一次性使用和传统系统，并解决了包括干扰粒子缺陷在内的挑战。总的来说，我们描述了当前基于细胞培养的流感病毒生产的最先进技术，以可持续地满足疫苗需求，保证及时供应，并应对季节性流行病和全球大流行的挑战。 1.引言 呼吸道疾病，如流感，仍然是一个严重的全球健康和经济负担。流感疫苗包括灭活疫苗（IIV）、减毒活疫苗（LAIV）和重组疫苗（RV）等几种接种方式，这些疫苗获得了许可，构成了全球流感预防策略的基石。此外，基于核酸的平台技术正在开发中。通常，流感疫苗设计为三价或四价组合，包含一种/两种流感A型和B型病毒（IAV, IBV）株，根据国际卫生组织每年的推荐。生产传统上基于将目标株注入受精鸡蛋的过程，让它们复制。这种方法虽然广泛使用（约占全球IIV生产能力的84.5%），但耗时且易受鸡蛋供应短缺的影响，且难以处理废物。相比之下，基于细胞的生产提供了更快的时间线、改善的抗原匹配和效力、更好的可扩展性，并且不依赖于鸡蛋的可用性。因此，人们越来越感兴趣转向基于细胞培养的方法，这是由于需要更高效和灵活的制造平台来满足全球需求并应对短缺。 基于细胞培养的流感疫苗的早期开发可以追溯到20世纪中叶，当时越来越多的连续细胞系变得可用，一些创新已经实施用于动物疫苗的生产。但直到21世纪，生物加工技术的重大进步才使得它们广泛用于人类疫苗使用。最初用于小规模生产的静态细胞培养，为后续在生物反应器设计、培养基配方和流程优化方面的创新提供了基础。静态培养的固有限制，包括低细胞密度批处理和高效放大的障碍，促使探索动态培养系统以提高生产力和可扩展性。同时在适应细胞系悬浮生长、建立设计细胞系和改进培养基配方方面的进展，最终实现了高产生产系统，并允许进一步的流程优化和强化措施以提高生产力、可扩展性和流程稳健性。图1展示了使用MDCK细胞为例的技术进步及其在IAV基于细胞培养的过程中的应用的概述。通过实施高细胞密度（HCD）培养策略，可以克服传统批处理过程的限制。特别是，近年来已经有效地解决了实施进料批处理和灌注策略的几个工程挑战。 在接下来的部分，我们将描述可能鼓励进一步流程开发的关键步骤和创新，建立具有改进的流程效率、疫苗效力和降低生产成本的流感病毒生产的上游流程。我们涵盖了适合的宿主细胞系的识别和选择、使用静态培养的早期制造方式、过渡到悬浮培养，以及涉及粘附和悬浮细胞系的流程强化选项。我们探讨了技术进步的基本原理，以及每种方法相关的挑战。此外，我们讨论了一次性使用（SU）与常规不锈钢（SS）技术的适用性。通过理解正在开发和制造中的新方式，我们可以识别进一步优化和创新的机会，以满足日益增长的疫苗需求并增加全球可及性。 本综述的重点将是哺乳动物和禽类细胞培养基流感病毒生产；不考虑植物和昆虫细胞。当然，重要的是要承认优化的上游处理只是疫苗制造的一个方面。疫苗生产过程中的下游处理、混合和配方阶段同样至关重要。虽然认识到整个过程的重要性，但这方面的内容在本文中将不再进一步讨论。 图1. 使用MDCK细胞的基于细胞培养的流感病毒生产过程的技术进步。自20世纪40年代以来，传统的基于鸡蛋的过程就已经可用（红色箭头）。从1958年Madin和Darby从一只健康的可卡犬肾脏中分离出MDCK细胞开始，就建立了各种基于细胞培养的生产方法。培养基开发的进步和MDCK细胞适应悬浮生长的改进，为建立更高效和更密集的过程打开了可能性。对于依赖悬浮细胞系的灌注过程，生物反应器系统与细胞保留装置相连，该装置可以是基于膜的，或者是倾斜沉降器（重力）或声学过滤器。自千禧年之交以来，基于MDCK细胞的过程已获得许可，用于生产人类流感疫苗（蓝色箭头）。BR：生物反应器；CSTR：连续搅拌罐反应器。 2.基于细胞培养的流感病毒生产 开发基于细胞培养的流感病毒生产过程的关键是选择合适的宿主细胞系，它可以有效支持病毒复制并满足监管要求。细胞系通常带有推荐的生长培养基，支持粘附或悬浮细胞生长，但可以从那里进行调整和优化。组成是关键，确保营养和基本因素的平衡，允许快速的细胞生长，倍增时间少于30小时，以及高病毒复制。传统上，细胞在含有血清的培养基（SCM）中培养，因为它提供了所有必要的生长因子和营养物质。然而，血清容易引入批间变异，现在更倾向于使用无动物成分的过程，以最小化外来因子污染的风险。因此，现代选择包括无血清（SFM）或化学定义培养基（CDM），因为它们提供了更安全和一致的性能。然而，在这些培养基中实现可比较的细胞生长和病毒产量需要仔细优化配方和补充生长因子。培养基设计本身是一门艺术，为特定细胞系和目标病毒开发培养基大多超出了范围。因此，通常使用现成的培养基并结合使用，即使它们没有完全为预期的过程优化。根据组成和细胞的代谢，这可能导致不希望的次级副产品，如氨和乳酸，积累到对细胞生长和病毒生产产生不利影响的浓度。此外，细胞系、培养模式和系统决定了各种流程参数的最佳设计空间，这些参数应该在整个过程中严格控制。我们小组之前总结了适用于基于细胞培养的病毒生产的流程参数和强化策略的一般考虑。对于流感，温度通常保持在32°C和37°C之间，pH值在7.2和7.6之间，溶解氧浓度超过30%。在感染时，通常与蛋白酶（如胰蛋白酶）一起添加种子病毒，以增强病毒进入细胞。必须仔细调整蛋白酶的浓度和活性，以确保最佳病毒复制，而不会导致过度的蛋白质消化，导致粘附细胞培养中的细胞脱落甚至细胞死亡。同样重要的是准备种子病毒，考虑到可能适应特定细胞系，并确保感染性与非感染性颗粒的高比例。虽然众所周知，在胚蛋中病毒传播可能导致抗原编码基因的突变，从而对疫苗效力产生不利影响，但在使用MDCK细胞的序列分析研究中没有观察到细胞特异性适应性突变。在这里，通过MDCK细胞传代的种子病毒代表了在人类中分离的病毒。通常，种子病毒的传代次数限制在五次。虽然细胞特异性适应需要2-3个步骤，但仍有放大的空间。然而，我们清楚地看到需要通过测序和抗原性特征化，在大规模生产过程中持续监测种子病毒的遗传稳定性。一个非常有效和可靠的工具，用于监测从种子病毒到最终收获甚至下游纯化的糖组成是CGE-LIF（毛细管凝胶电泳与激光诱导荧光检测）。 流感病毒的最佳收获时间通常在感染后36至72小时，这时病毒滴度达到高峰。然而，这可能因细胞系、流程参数和使用的病毒株而异。特别是对于流感病毒生产，种子病毒输入不仅对复制速度至关重要，也对缺陷干扰粒子（DIPs）的出现至关重要。因此，感染的多重性（MOI），通常在10到10-5之间，需要根据研究目的仔细考虑。 以下，我们概述了基于细胞培养的流感病毒生产的当前最先进技术，首先关注细胞系的选择，然后详细讨论流程策略选项，最后讨论（一次性使用的）培养系统的选择。 2.1.用于流感病毒生产的粘附和悬浮细胞 目前，基于细胞培养的病毒生产没有普遍适用的解决方案或平台流程。这种限制主要源于病毒能够有效感染的宿主物种数量有限，这一属性被称为宿主范围。此外，不同宿主细胞系的病毒产量可能差异巨大，细胞系可能因疫苗安全性的高要求（例如肿瘤原性和外来因子）而不符合疫苗生产资格。因此，历史上建立的、但往往表现不佳的细胞系被广泛使用，需要系统地筛选监管当局批准用于疫苗生产的宿主细胞，以选择理想的候选细胞。识别是一个劳动密集型的挑战，涉及导航包括培养基选择、培养模式和流程条件在内的几个障碍。此外，潜在细胞系的商业甚至学术使用通常由于知识产权和许可问题而受到限制，这也可能限制筛选选项。 除了病毒产量和流程生产力，考虑因素还应包括疫苗产品的抗原匹配和免疫原性，因为几项研究表明，根据生产系统（鸡蛋或特定细胞系）的不同，存在明显差异。选择最佳宿主细胞系的标准之前已经概述，适合流感生产的候选细胞已经在接受过彻底审查的综述中进行了检查。已经评估了几种传统或设计细胞系用于流感病毒生产，包括MDCK、Vero、HEK293、AGE1.CR、PER.C6、EB66、CAP、DuckCelt-T17或PBG.PK2.1细胞。尽管这些候选宿主细胞系有多种好处，但只有少数已经合格并用于基于细胞培养的流感疫苗的生产，包括用于IIV和LAIV的MDCK和Vero细胞，以及用于RV的Sf9衍生细胞。事实上，行业的专有数据和这种选择性使用背后的决策过程没有向公众披露，这也限制了我们对为什么某些细胞系最终被选为疫苗生产的理解。从学术角度来看，我们可以假设包括监管批准、既定生产协议、市场首推决策和成本效益在内的障碍。 在一项头对头比较中，Genzel等人阐明了粘附MDCK或Vero细胞是否是流感疫苗生产最合适的细胞基质的问题。尽管在优化的小规模条件下（滚筒瓶、T型瓶），两者在上清中可以获得类似的病毒滴度，但在微载体上的生物反应器中，MDCK细胞表现更优。随着先进培养基开发和细胞系工程，现在有多种悬浮MDCK细胞可用，为生物过程操作和可扩展性提供了巨大优势。相比之下，Vero悬浮细胞的开发是一个更具挑战性的任务，已经吸引了多个研究小组超过三十年。在这里，迄今为止报告的最大细胞浓度高达8×106细胞/毫升；然而，这只是在13天的摇瓶培养中通过三次完全更换培养基才达到的；否则在批处理中达到约2×106细胞/毫升，在3升生物反应器灌注培养中达到6.8×106细胞/毫升。此外，倍增时间超过40小时和频繁形成聚集体仍然是重大问题，从而限制了有效或强化流程的选项。因此，MDCK细胞主要占据工业制造。 2.2.MDCK细胞在流感病毒生产中的作用 早在1958年，MDCK细胞就被SH Madin和NB Darby从一只健康的可卡犬的肾脏中分离出来，几年后存放在美国典型培养物收藏所（ATCC）。由于非常适合作为极化细胞的模型，MDCK细胞系成为最广泛研究和良好特征化的上皮细胞系之一，用于细胞生理学和病毒学调查。全球领先的研究机构已经使用粘附MDCK细胞进行人类流感病毒的分离和复制，主要用于流行病学研究和诊断目的。除此之外，MDCK细胞也主导了基于细胞培养的流感疫苗制造，因为它们对所有流感亚型都易感，并能产生各种高滴度的病毒株。因此，自上个世纪末以来，一直在努力利用MDCK细胞进行人类流感疫苗制造，而不是使用鸡蛋，这导致了广泛的安全性分析，以消除关于肿瘤原性和致癌性的担忧。 此外，学术和工业努力已经做出，以提高细胞特异性病毒产量（CSVY）和整体生产力。这些努力包括适应悬浮生长而不是将细胞粘附到微载体或瓶表面，这可以通过转染粘附MDCK细胞与人类siat7e基因或遵循先进的培养基开发来实现。此外，应用了提高细胞浓度、实时监测病毒感染动态以及时收获病毒、开发多尺度模型以改善流程理解或获得主要表达人类流感受体的细胞系的遗传操作等策略。最后，选择高产细胞克隆对于提高上游制造过程中的生产力具有重要潜力。这似乎特别相关，因为MDCK细胞显示出广泛的细胞间异质性，在形态、电生理和生化特性、碳水化合物表示以及最重要的病毒生产能力方面存在显著差异。 在单细胞水平上的研究可以揭示后代病毒产量和细胞内病毒RNA水平之间高达大约1000倍的差异。尽管如此，揭示这种异质性背后主要驱动因素的努力尚未得出一个简单的答案。然而，最近的转录组分析表明，抑制宿主细胞功能以转移细胞资源和维持足够活动以进行病毒复制之间的平衡是一个相关因素。由于多个学术和工业研究小组的这些密集努力，几种具有不同特性的MDCK细胞系变得可用，其中大多数细胞系源自存放在ATCC的CCL-34谱系。 2.3.涉及粘附细胞系的流程 如今，在许多生物处理环境中，悬浮细胞因能够支持高细胞密度生长、易于放大、灵活性、成本效益和流程控制选项而受到青睐，而不是依赖锚定的细胞。然而，悬浮细胞并不总是可用的，对于一些细胞系来说，适应或工程化它们以支持悬浮生长仍然是一个挑战。由于涉及这种依赖锚定的细胞的流程总是受到可用表面积的限制，过去已经做出了大量努力来优化生产以实现最大效率。这可以通过T型瓶、滚筒瓶、细胞工厂的表面积，或者在固定床反应器中或使用的微载体数量来确定。其中一些静态细胞培养系统不仅在表面积上有限，而且缺乏流程控制选项。尽管在滚筒瓶中可以实现适当的培养基混合和气体扩散，但并未对诸如pH和pO2等关键参数进行控制。然而，病毒生产可以轻松实现高滴度，并且只需要最少的操作者交互。在之前的研究中，涉及滚筒瓶中粘附MDCK细胞的流程产生了1.0×109 PFU/ml的A/PR/8/34 (H1N1)。尝试通过使用培养基中的丙酮酸代替谷氨酰胺来绕过氨积累以优化这种静态生产过程，并未导致显著更高的产量。相比之下，实施载体技术已经可以帮助缓解表面积限制并获得更多流程控制，同时拥有更小的占地面积。在批处理模式下，使用2 g/L的微载体浓度，MDCK细胞可以达到3.2×106细胞/mL的细胞密度，产生了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 µL)。实施波纹生物反应器允许更高的细胞密度和更好的附着，相比之下搅拌罐生物反应器（2 g/L Cytodex 1, 2 L规模），然而最大滴度仍然在3.3 log10(HAU/100 µL)范围内。使用重复进料批处理策略，可以实现11.2×106细胞/mL的高细胞密度，12.5 g/L Cytodex 1，产生了2.8 log10(HAU/100 µL)。在灌注中，甚至可以达到更高的总病毒滴度3.3 log10(HAU/100 µL)，在最大细胞浓度为5.5×106细胞/mL（10.5 g/L Cytodex 1）时。尽管微载体培养显示出多个优于静态培养的优势，剪切力、需要灭菌和清洁程序可能限制其使用。此外，并非所有细胞在SFM中培养时都表现出良好的附着。或者，在固定床生物反应器中，细胞被固定在生物反应器内的松散包装基质上，这提供了大表面积、高氧气转移和作为一次性选项的可用性。使用30 mL小规模模型，Sun等人报告了3.2×1010细胞的数量，提供了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 μL)和7.8×107 TCID50/mL，在感染后3天（MDCK细胞，A/New Caledonia/20/99 (H1N1)）。此外，实施中空纤维（HF）生物反应器可能是使用粘附细胞进行病毒生产时的一个有前景的方法。这些系统由一个装有数百个毛细管的盒组成，其中细胞在毛细管外的空间生长并产生病毒，而营养物质和氧气通过毛细管内的空间不断供应。在这里，可以实现最大总病毒滴度3.53 log10(HAU/100 μL)，单次收获步骤，这对应于1,604–3,209病毒/细胞的细胞特异性病毒产量（CSVY）（毛细管外空间1–2×109细胞/mL，A/PR/8/34 (H1N1)）。使用多次收获步骤和调整的条件，甚至可以达到更高的CSVY 4,055–8,110病毒/细胞。最近的发展，如一次性固定床生物反应器系统（scale-X, Univercells或iCELLis, Pall），允许克服先前描述的静态培养的几个限制。这些系统提供从2到600平方米的生长表面，提供可扩展的流程与自动化流程控制（pH, DO, 液体流速），同时作为预过滤器保留细胞碎片和杂质。例如，Berrie等人报告了10平方米单元的多达1×1010细胞，并且使用scale-X生物反应器与烧瓶和细胞工厂相比，使用Vero细胞生产的水泡性口炎病毒产量提高了两到四个数量级，然而，目前尚无流感数据。 2.4.涉及悬浮细胞系的流程 悬浮细胞作为病毒生产的宿主的可用性为流程开发和放大提供了许多新的可能性。为了满足对可持续和成本效益流程的日益增长的需求，已经出现了向开发强化和集成生产方法的转变。因此，现在有高通量筛选和流程优化的缩放模型以及具有小占地面积的准连续生产系统可用于大规模制造。产生悬浮细胞系可以通过适应适当的培养基或通过遗传工程来实现。现代培养基甚至允许MDCK细胞悬浮生长到高细胞浓度。然而，并非每种培养基都直接支持单细胞生长，细胞形成簇或聚集体。以下，我们总结了这种流感病毒生产的流程优化和强化策略，展示了这些方法的潜力。 2.5.简单直接：批处理培养 在批处理模式下进行病毒生产时，向生物反应器中添加有限数量的培养基，并将细胞生长到所需的细胞浓度。随后用种子病毒感染，启动病毒复制，当滴度达到最大时，通过收获步骤结束生产周期。清洁和消毒后，生物反应器可以为下一批操作做准备。大多数工业疫苗生产过程仍然以批处理模式运行，因为设置和维护相对容易，独立批次的生产有助于减轻安全性和批次放行的风险。不幸的是，这些行业流程的数据并不完全公开。然而，有学术描述在实验室规模上涉及悬浮HEK-293或MDCK培养的流感疫苗生产的潜在流程。在这里，Bissinger等人展示了一个集成的IAV生产流程的良好性能，其中MDCK悬浮细胞在化学定义培养基中培养。使用快速生长的MDCK细胞在1 L STR中感染流感A/PR/8/34 H1N1病毒，可以达到高达3.6 log10(HAU/100 µl)的滴度，细胞浓度高达9.5×106细胞/mL。上游生产能力估计为600剂/L。假设下游处理中总回收率为50%，大约每升生物反应器收获液可获得300剂单价疫苗（每剂15 µg）。相比之下，使用滚筒瓶只能获得大约10.4剂/L的单价疫苗，而根据制造商和株，需要3-4个鸡蛋来获得三价或四价疫苗剂。 2.6.迈向流程强化的第一步：进料批处理培养 虽然批处理过程易于设置和维护，但在大流行期间，当增加产量和速度的需求增加时，它们可能会受到限制。那时，更有效地利用生物反应器容量，从而进行强化变得至关重要。 采用进料批处理方法，包括初始生长阶段，然后逐步添加新鲜培养基，可以稀释积累的氨和乳酸（抑制病毒生产和细胞生长的代谢物），并补充消耗的营养物质，从而提高细胞浓度，并导致更高的病毒产量和特定病毒生产力。在进料批处理模式下，HEK293SF细胞中A/PR/8/34 (H1N1)的生产导致空间时间产量（STY）提高了2.7倍。然而，在涉及PBG.PK2.1细胞的研究中，采用进料批处理策略无法与批处理过程的结果竞争。然而，无论是否进行稀释步骤，进料批处理模式的操作仍然可能导致代谢副产品如乳酸和氨的积累达到抑制水平，特别是当使用浓缩饲料时，从而阻碍病毒生产。 2.7.流程强化的下一阶段：灌注培养 真正的连续流程对溶瘤病毒生产提出了挑战。因此，灌注策略的实施已成为流感病毒生产中的一项基本进步，通过提高细胞浓度、病毒产量和整体效率来强化流程。要实现高细胞密度（HCD）和高生产力，必须为细胞提供最佳代谢环境。这可以通过不断供应新鲜培养基，同时移除等量的耗尽培养基来实现。这种交换不仅为细胞生长提供营养物质，还允许部分移除不利的代谢副产品（例如乳酸和氨）或蛋白酶抑制剂、细胞产生的二氧化碳和用于pH控制添加的碱基中的碳酸氢盐。 与真正的连续培养不同，在培养系统中保留细胞是一个关键的技术方面，通常通过膜、沉降或离心来实现。Chotteau等人和Göbel等人的文献提供了现有技术的全面概述。 流程控制可以通过手动干预或自动化实现。对于后者，实时监测细胞生长和病毒生产的关键阶段，例如使用电容法，对于实现精确控制和优化培养条件（例如动态进料制度或收获时间点）非常有用。 半灌注培养提供了在小规模评估细胞是否可以在HCD下生长的最简单方法。在这里，细胞在摇瓶中生长，通过离心定期交换一定量的培养基，通常由细胞特定的灌注率指导。通过这种培养方式，Bissinger等人在化学定义培养基中达到了高达60×106细胞/mL的MDCK细胞浓度。然而，当细胞在40×106细胞/mL时感染A/PR8/34 (H1N1)，达到了最高滴度，总病毒滴度为4.2 log10(HAU/100 µL)，对应于近4.5 log10 (HAU/100 µL)的累积滴度和近1010 TCID50/mL的传染性滴度。对于生物反应器操作，通过离线离心保持细胞无菌性和连续性面临挑战，并且需要大量投资，特别是在大规模时。 对于使用生物反应器的放大，通常在工业中考虑使用基于膜的系统进行细胞保留，如旋转过滤器、切向流过滤（TFF）或交替切向流过滤（ATF）。在这里，ATF和TFF模式更受青睐，因为与细胞肉汤对过滤面的正交流相比，切向流可以防止膜污染。有多种报告使用ATF或TFF系统在悬浮MDCK、AGE1.CR、CAP和PBG.PK2.1中生产流感病毒，强调与批处理生产相比病毒生产的改善。 使用PBG.PK2.1细胞，Gränicher等人在ATF培养中达到了高达50×106细胞/mL的细胞浓度和最大HA滴度3.93 log10(HAU/100 µL)；然而，CSVY低于优化批处理或进料批处理培养获得的值。相比之下，在最大MDCK细胞浓度45×106细胞/mL时，Wu等人展示了非常高的滴度4.42 log10(HAU/100 µL)，对应于4.5 log10 (HAU/100 mL)的累积滴度和1.8×1010 TCID50/mL的传染性滴度（A/PR8/34 (H1N1)）。在这种培养中，可以确定非常高的产量：CSVY为11,690病毒/细胞；STY为8.0×1013病毒/L/d；体积生产力为1.02×1013病毒/L/d。对于CSVY低得多的禽细胞系（AGE1.CR.pIX），Vazquez-Ramirez等人（2019年）提出了一种混合进料批处理/灌注策略，使用ATF系统。通过这种组合策略，达到了3.3 log10(HAU/100 μL)的滴度，与仅参考灌注培养相比增加了5倍，与传统批处理过程相比增加了7倍。尽管培养基消耗增加，但混合策略实现了与传统批处理过程相似的体积生产力（5.4×1011 vs. 6.5×1011病毒/L/d）。总之，这证明了整合不同培养策略以实现最佳病毒产量和流程效率的潜力。 然而，由于溶瘤性质、大尺寸（痘病毒高达360 nm）和病毒的独特表面特性，传统的基于膜的细胞保留在病毒生产中面临挑战。病毒感染后的细胞凋亡和溶解缩短了流程时间，但增加了杂质水平，因为细胞碎片、蛋白质和宿主细胞DNA积累，导致常见的缺点，包括膜堵塞和生物反应器内不希望的病毒积累。尽管流感病毒颗粒直径仅在80至120 nm之间，但几项研究在使用50 kDa、0.2 µm和0.5 µm截止的ATF膜时观察到病毒保留和膜堵塞。 最近，出现了允许连续病毒收获的基于膜的技术，这可能通过缩短生物反应器内的停留时间来提高CSVY和产品质量。例如，Hein等人建立了一个自动化灌注过程，使用约10 µm孔径的管状膜（VHU）在ATF模式下连续生产和收获IAV DIPs。DIP生产在大约20×106细胞/mL的细胞浓度下启动。虽然细胞有效地保留在生物反应器中，但100%的产生的病毒颗粒通过了膜，并且没有观察到污染。在控制过程中，使用常规HF膜（孔径0.2 µm），大多数IAV DIPs保留在生产容器中。切向流深度过滤（TFDF）技术（Repligen）可能也是一个选项。在这里，使用2-5 µM孔径的膜在TFF模式下有效保留细胞，同时深度过滤允许通过过滤器收获病毒颗粒。Silva等人最近使用TFDF进料批处理/灌注设置在HEK293SF细胞中生产IAV，展示了病毒生产和通过膜的有效收获，而没有面临病毒保留、膜堵塞或增加剪切力的问题。我们实验室也使用这项技术在MDCK细胞中获得了有希望的IAV生产结果；然而，数据尚未发表。TFDF模块是可扩展的，并且从试点到2,000 L规模商业化，可能会推动疫苗流程开发朝着集成的连续下游处理发展。 克服膜污染和病毒保留问题的另一种选择是依靠重力或声波的细胞保留装置，这两种方法都已应用于流感病毒生产。声波和倾斜沉降器都允许连续病毒收获，优先保留活细胞，并且与基于膜的系统相比，施加的剪切力较低，这一点尤其关键，因为感染的细胞对剪切更为敏感。 使用声波沉降器，Petiot等人在浓度高达18×106细胞/mL的HEK293细胞中获得了有希望的结果。与批处理过程相比，灌注模式的滴度几乎高出一个数量级。随后，Granicher等人（2020年）比较了在浓度介于25至50×106细胞/mL的AGE1.CR.pIX细胞培养中声波沉降器的性能与ATF培养。由于能够连续收获病毒，至少实现了1.5倍的CSVY增加和高达3倍的体积生产力提升。这些结果再次强调了连续病毒收获对流感生产流程的重要性，并展示了声波沉降器应用的潜力。然而，这些设备主要在实验室规模上建立，在商业制造中较少见。类似地，Coronel和Gränicher等人使用倾斜沉降器在高达50×106 AGE1.CR.pIX细胞/mL的培养中达到了高细胞密度。连续收获病毒导致CSVY为3474病毒/细胞，与ATF对照培养相比增加了4.7倍，体积病毒生产力也提高了2.2倍。然而，该设备的局限性在于灌注率容量、缺乏现成的工业规模解决方案、高停留时间和温度梯度。总的来说，所有讨论的发现都强调了流感病毒生产中灌注策略的复杂进步，因为它们为细胞生长和病毒生产阶段提供了明显改善的代谢环境。 2.8.强化病毒生产的挑战：连续培养 近年来，对于各种生物制药应用，人们越来越感兴趣地使用连续制造方法替代批处理模式。在稳态下进行这样的操作可以允许延长生产阶段，同时可能导致提高生产力和效率。对于重组蛋白或非溶瘤病毒的生产，这可以通过化学计量器过程实现，其中维持进料和产品收获的均匀流速，确保一致的工作体积和营养供应。相反，许多病毒如流感是溶瘤的，需要在不同的容器中分离细胞生长和病毒传播，以避免凋亡和细胞溶解的影响。这种级联可以在最简单的情况下通过两级连续搅拌罐反应器（CSTR）系统实现。从专门用于细胞生长的初级STR，细胞被连续转移到仅用于感染和病毒传播的次级STR。 Frensing等人最初尝试在CSTR系统中连续在AGE1.CR细胞中生产IAV，未能达到预期的效益。相反，生产导致病毒滴度出现周期性振荡，与批培养相比显著降低了体积生产力。这种波动被描述为“von Magnus效应”，可以归因于DIPs的出现。DIPs本身不复制，但与感染性流感病毒颗粒的复制竞争和干扰，这可能严重限制连续流程用于IAV或其他产生DIPs病毒的生产。然而，随着管状Plug-flow生物反应器系统的发展，Tapia等人能够规避这些限制，并在AGE1.CR.pIX和MDCK细胞中展示稳定滴度的IAV生产。该系统由一个用于细胞生长的CSTR和一个用于病毒传播的105米长的管状Plug-flow生物反应器组成。通过这种方式，省略了滴度振荡，并实现了与传统批培养相比约2倍的STY。 然而，DIPs并不总是被视为IAV生产中不想要的副产品，因为它们也显示出作为预防性和治疗性抗病毒的潜力。为了进一步探索DIPs的演变，应用数学建模来描述在次级STR中不同停留时间的两个CSTR培养的实验结果。此外，Pelz等人最近使用简化的半连续设置来模拟小规模的连续病毒传播。而不是级联STRs，使用两个不同的摇瓶用于悬浮MDCK细胞的扩增和IAV生产。在21天的培养期内，由于DIPs和感染性颗粒的竞争动态相互作用，再次观察到病毒滴度的强烈周期性振荡。随后，使用下一代测序来加深对DIP形成的理解，并确定有前途的抗病毒治疗候选物。此外，这些研究还展示了DIPs在流感病毒种子病毒生产中的重要性。 尽管连续生产可能承诺与批处理相比在占地面积和制造成本上大幅减少，但进一步的限制包括对技术人员的高资质要求，以及由于设置的复杂性和延长的过程时间而增加的污染风险。因此，连续流感生产并不一定能超过提供极大灵活性和控制的批处理过程的优势。 图2. 用于流感疫苗制造的可用培养系统比较，包括贴壁细胞或悬浮细胞。STR：搅拌罐生物反应器；OSB：轨道摇动生物反应器（一次性使用）；Wave生物反应器（一次性使用）；摇瓶半灌注；ATF：交替切向流过滤；TFF：切向流过滤；TFDF：切向流深层过滤；AS：声学沉降器；IS：倾斜沉降器；HFBR：中空纤维生物反应器；半连续：两阶段半连续摇瓶培养系统；CSTR：两阶段连续搅拌罐培养系统。 2.9.一次性技术在流感病毒生产中的应用 一次性使用（SU）技术的实施在生物制药行业中逐渐获得普及，COVID-19大流行情况甚至加速了生物加工中对SU设备需求的稳定增长。根据最近的一项调查，临床上游处理中使用SU设备的运营从2014年的38.6%增加到2022年的62.9%。如今，市场上有多种生物反应器操作的SU选项，然而，决定疫苗生产中使用SU还是不锈钢（SS）技术涉及仔细平衡优势和挑战。由于它们的低周转时间，SU系统提供了极大的灵活性、快速的可扩展性和增加的生产率，使它们特别适合应对多样化市场需求和有效调整生产活动。此外，这些系统是扩大全球生产能力的关键因素，因为它们可以由于较低的资本投资、工程和运营成本而在不太发达的地区轻松建立。然而，大流行表明，当需求增加时，SU设备的供应和灭菌尤其有限。相比之下，以耐用性、安全性和适用于长期生产而闻名的SS反应器，适合可预测的大规模生产。SU与SS的可持续性问题和可提取物仍然存在争议。同样，一些SU设备由新公司提供，而这些公司并不总是在市场中保持存在。然而，特别是疫苗制造过程需要维持多年的生产，并且需要提供备选方案。因此，需要保证SU设备的质量，以允许长期供应和生产相应的疫苗。流程中的任何变化都需要证明产品质量的充分性。最后，临床和商业制造中SS系统的放大和适应性挑战可能会限制灵活性和对市场变化需求的响应能力。 对于流感病毒生产，迄今为止已经评估了几种一次性系统，包括中空纤维（HF）、固定床、轨道摇动、振荡和搅拌生物反应器系统。SU生物反应器系统的设计在质量传递和混合原理、规模和应用领域（研发或制造）方面差异很大。近年来，SU微生物反应器系统，如Sartorius的ambr系统（15 mL wv）或Merck的Erbi Breez（2 mL wv, 灌注）在早期开发中越来越受欢迎。在我们的实验室中，使用ambr15系统在微反应器规模上筛选多个单克隆MDCK细胞系进行流感病毒生产时取得了有希望的结果。平行运行多达48个SU容器，并在控制条件下自动采样，可以快速生成多个流程变化的数据。 将SU系统用于灌注模式的生产流程增加了另一层优势。例如，Coronel等人研究了在与基于膜的细胞保留装置耦合的SU轨道摇动生物反应器中的IAV生产。在比较分析中，采用ATF或TFF系统的灌注策略可以明显优于参考批处理过程。由于简单的袋式设计，无需耦合或搅拌器，系统设置容易实现，适合剪切敏感细胞，即使在高细胞密度下，AGE1.CR.pIX细胞的氧气需求也能得到满足。此外，该系统适用于放大，因为商业上可用的工作体积在1.5 L到2,500 L之间（Kühner）。许多其他供应商也提供高达6,000 L的SU系统（例如ABEC）。 总的来说，SU系统可以提供灵活、完全可扩展的即插即用生物反应器操作，特别是高效的灌注流程与一次性设备的有限体积容量完美契合。它们已经普遍用于重组蛋白的制造；我们在基于细胞培养的疫苗生产领域看到了类似的潜力。 3.展望和结论 在过去二十年中，为了建立和加强基于细胞培养的流感疫苗制造流程，已经取得了许多技术进步。从传统的基于鸡蛋的生产向基于细胞培养的方法转变似乎越来越不可避免，特别是随着准连续流程的选择，旨在提高效率和降低成本。然而，剩余的挑战包括优化细胞系和培养基以获得更高的病毒产量、实施先进的在线监测工具以及适应新方式的下游处理。实现具有高病毒生产力的小占地面积的稳健和可扩展的灌注策略可能是满足日益增长的疫苗需求的关键。然而，疫苗生产中批处理和连续模式之间的选择取决于多个因素，包括生产规模、成本效益、流程控制、产品质量和监管考虑。在某些情况下，具有高性能细胞系的稳健批处理过程仍然可以胜过灌注过程，并且以更简单的设置和较少的工程和运营任务要求而更具说服力。此外，行业正在积极探索在研发和制造两个领域整合SU技术。在这里，技术进步和加强流程的结合可以导致有效的上游流程，这些流程可以逐步使用更小的设备完成，这有利于SU技术的实施，除了提高灵活性和降低污染风险。随着基于细胞培养的流感疫苗生产的进展，解决这些挑战对于实现这种方法的全部潜力至关重要，最终可能取代基于鸡蛋的生产。这包括完善流程强化策略、建立平台流程、确保产品一致性以及优化整个生物加工工作流程，以满足大规模疫苗生产的需求和对新出现的流感毒株的快速响应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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中文摘要弗林蛋白酶是一种宿主丝氨酸蛋白酶，在多种生理功能中发挥重要作用，是人体正常发育所必需的蛋白酶，与多种病毒的细胞入侵、感染性、毒力等密切相关。冠状病毒为单股正链RNA病毒，外膜有蘑菇状刺突蛋白（spike，S），弗林蛋白酶的切割位点广泛存在于冠状病毒S中。弗林蛋白酶对于冠状病毒入侵宿主细胞起着至关重要的作用。此文重点综述弗林蛋白酶切割位点对各种冠状病毒入侵宿主细胞的影响，总结了该酶作为病毒入侵潜在药物靶点的最新进展，为其在病毒感染中的机制研究以及作为靶点的药物研发提供理论支持。正文弗林蛋白酶是真核生物细胞普遍表达的一种丝氨酸蛋白酶，在胚胎发育、促进卵母细胞成熟、维持免疫稳态和外周免疫耐受等多个生理过程中发挥重要作用。真核细胞多种前体蛋白需经弗林蛋白酶切割才能形成具有生物活性的多肽和蛋白。同时，弗林蛋白酶在多种病原体感染宿主细胞的过程中起着重要作用。弗林蛋白酶可裂解HIV-1的糖蛋白gp160为2个功能亚基，介导病毒附着以及膜融合，使其具备感染宿主细胞的能力[1]。弗林蛋白酶对禽流感病毒血凝素和新城疫病毒融合蛋白的切割与病毒毒力高度相关[2]。埃博拉病毒的糖蛋白GP0同样需弗林蛋白酶裂解为GP1/GP2，然后输出到质膜以启动病毒感染[3]。迄今为止，已有包括新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）在内的7种冠状病毒可感染人类并引发疾病。多个研究表明，冠状病毒的刺突蛋白（spike，S）中广泛存在弗林蛋白酶切割位点，其与病毒的细胞入侵、宿主和细胞嗜性以及细胞毒力相关。本文详细综述了弗林蛋白酶生物学特征、切割位点及其对冠状病毒入侵细胞的影响、作为病毒入侵潜在药物靶点的最新进展，以期为弗林蛋白酶在病毒感染中的机制研究以及作为靶点的药物研发提供理论支持。1弗林蛋白酶概述弗林蛋白酶存在于所有脊椎动物与部分无脊椎动物细胞中，为Ⅰ型跨膜蛋白，由794个氨基酸组成，属于枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶超家族中的前体蛋白转化酶。弗林蛋白酶定位于高尔基体反面的网状结构，是分泌途径的主要加工酶，可切割多种蛋白，包括病毒包膜糖蛋白、细菌外毒素、受体、激素、生长因子、凝血因子、血清蛋白等的前体。如图1所示，弗林蛋白酶催化结构域中的D153残基对其催化活性有重要影响；N端抑制前肽即使在蛋白水解裂解后，也可阻断弗林蛋白酶的催化活性，需要被降解才能使弗林蛋白酶具有功能活性；P结构域代表可调节前蛋白转换酶结构域；SR683残基则是弗林蛋白酶脱落的蛋白水解位点[4]。弗林蛋白酶对底物的切割具有高度特异性，切割位点为含有成对精氨酸残基的独特多元基序。弗林蛋白酶最小的切割序列是R-X-X-R↓，核心序列的顺序为P6-P5-P3-P4-P3-P2-P1↓P1'P2，可对含有序列基序R-X-[R/X]-R的位点优先识别。其中，P1位和P4位为精氨酸（R），若P4位不是R，则P2及P6位必须为碱性氨基酸才能保证弗林蛋白酶的切割。当P1和P4位均为R时，P2位的碱性氨基酸虽不是必需的，但其会将弗林蛋白酶的切割效率提高10倍左右。若P1'处是疏水或脂肪族氨基酸则会阻碍弗林蛋白酶的切割[5-6]。弗林蛋白酶作用环境的pH以及一些离子的浓度会对弗林蛋白酶的切割效率造成影响。一般pH在6.0~8.5范围时，弗林蛋白酶能保持催化活性。作为Ca2+依赖性蛋白，Ca2+的浓度对弗林蛋白酶的活性也具有一定影响。研究发现，Mg2+可以选择性激活弗林蛋白酶，对于其识别裂解病毒包膜糖蛋白和真核前蛋白具有一定影响，可能会造成病毒包膜糖蛋白的突变。当Mg2+存在时，这种突变增加了细胞对于弗林蛋白酶的易感性，从而使病毒的感染力也相应提高[7]。2弗林蛋白酶对冠状病毒入侵细胞的影响2.1弗林蛋白酶与SARS冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）SARS-CoV的S中不存在弗林蛋白酶切割位点，在插入弗林蛋白酶切割位点后，虽然没有影响SARS-CoV的感染力，但是会提高细胞的融合能力，影响病毒入侵靶细胞的过程[8]。SARS-CoV可以在没有蛋白水解的情况下启动膜融合，并且在S1、S2亚基没有分离的情况下完成构象变化，这可能是由于其缺乏有利的弗林蛋白酶切割位点[9]。Follis等[10]设计了 SARS-CoV的3个突变体，来研究弗林蛋白酶的水解切割是否影响SARS-CoV S介导细胞-细胞融合和病毒感染的能力。通过实验发现，在SARS-CoV S中插入弗林蛋白酶切割位点以后，该突变体产生的糖蛋白增加数倍，插入序列的细胞与细胞的融合能力显著增强。Simmons等[11]进一步证明，在R667和758序列位点引入弗林蛋白酶共有序列时，对细胞融合性的增强更加明显，可见引入弗林蛋白酶切割位点对病毒的影响还与插入的序列位置相关；然而通过萤光素酶基因的表达测定病毒入侵情况时，发现插入了弗林蛋白酶切割位点的病毒与正常病毒的感染力相同，证实插入弗林蛋白酶切割位点对病毒感染力没有影响。弗林蛋白酶对SARS-CoV的影响与插入切割位点的序列位置相关，这也提示了弗林蛋白酶若作为药物靶点，其疗效与其作用的基因序列有关。2.2弗林蛋白酶与中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）研究表明，MERS-CoV具有和SARS-CoV-2相似的弗林蛋白酶切割基序，一些实验证明，弗林蛋白酶切割序列可以增强MERS-CoV的感染力[9]。MERS-CoV的S上有2个弗林蛋白酶的切割位点，均含有RXXR序列。一个位于S2'（RSAR），一个位于S1/S2接口（RSVR），而在MERS-CoV的S1/S2 接口处有类似于SARS-CoV-2的680SPRRAR↓SV687切割基序[12]。Millet和Whittaker[13］的实验发现，用干扰小RNA干扰宿主细胞的弗林蛋白酶，MERS-CoV对宿主细胞的感染力下降。另外，通过引入弗林蛋白酶抑制剂可以减少MERS-CoV S介导的入侵并降低MERS-CoV活病毒与假病毒的感染力。这些研究表明弗林蛋白酶切割识别位点可以提高MERS-CoV对靶细胞的感染力。但也有实验发现，即使MERS-CoV与SARS-CoV-2有着相似的切割基序，弗林蛋白酶对于两者感染力的影响却并不相同[14]。首先，两者的S1/S2位点仍存在不同。SARS-CoV-2的切割位点上游存在精氨酸，而此P3位的精氨酸对于体外切割具有S1/S2位点的底物非常重要。实验发现，如果将精氨酸引入MERS-CoV S1/S2的P3位（RSVR到RRVR），可以显著提高弗林蛋白酶切割速率。同时，MERS-CoV不仅具有弗林蛋白酶的切割位点，它还可被跨膜丝氨酸蛋白酶（transmembrane protease serine，TMPRSS）2识别。TMPRSS2是MERS-CoV感染人体时的靶向分子，且较弗林蛋白酶活性更强。弗林蛋白酶切割S1/S2位点之后，通过TMPRSS2的作用完成S2'的切割。这表明，MERS-CoV的RXXR序列切割位点中可能存在其他影响弗林蛋白酶切割的因素。2.3弗林蛋白酶与SARS-CoV-2SARS-CoV-2具有弗林蛋白酶切割位点，这增强了其对靶细胞的亲和力。SARS-CoV-2的入侵过程与大多数冠状病毒类似，都是通过借助宿主蛋白酶在S上的S1/S2和S2'切割位点进行剪切以激活S。激活后的S有利于S1亚基中的受体结合域（receptor binding domain，RBD）重排以结合宿主细胞的血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体，进而转变S2构象来启动膜融合的过程[15]。研究发现，与其他SARS相关冠状病毒不同的是，SARS-CoV-2 S在S1和S2交界处插入了4个氨基酸残基，形成了1个RRAR多碱性弗林蛋白酶切割位点，见图2。这个独特的切割位点使得SARS-CoV-2的RBD与ACE2亲和力发生改变，S1可以改变自身构象来更好地适应宿主受体[16]。SARS-CoV-2进入气道细胞需要弗林蛋白酶裂解，从而实现膜融合[17］。同时，SARS-CoV-2 S RRAR切割位点中最后一个R和S中的R815分别对应SARS-CoV中胰蛋白酶切割位点[18］。这些位点提高了SARS-CoV-2侵染宿主细胞的效率。表面等离子共振实验表明，SARS-CoV-2的RBD与ACE2的解离平衡常数较SARS-CoV小，亲和力更高[19]。另外，Cantuti-Castelvetri等[20]的实验证明，神经磷脂-1与弗林蛋白酶切割位点的底物结合后，能够增强SARS-CoV-2的感染力。这个独特的弗林蛋白酶识别位点可能是导致SARS-CoV-2具有高传染性的重要因素。SARS-CoV-2的S被弗林蛋白酶切割后会产生预激活效应，扩大了病毒的宿主嗜性。这一预激活效应可以与TMPRSS2以及组织蛋白酶B/L切割S1/S2、S2'位点对膜融合的激活效应相累加，降低SARS-CoV-2的膜融合对细胞表面蛋白酶的依赖性，使其在TMPRSS2等蛋白酶表达较低的细胞中也能完成入侵［21］。预激活效应降低了 SARS-CoV-2对于感染靶细胞的选择性。由于弗林蛋白酶在人体的分布范围较TMPRSS2更广，因此SARS-CoV-2的宿主细胞种类更多，这可能是SARS-CoV-2传播能力大于SARS-CoV的原因之一。除高传播性外，弗林蛋白酶可能与SARS-CoV-2致病性密切相关。病理学中，炎症细胞因子在SARS-CoV-2致病过程中发挥了重要作用。研究者纳入SARS-CoV-2感染者和健康对照来探究弗林蛋白酶水平与疾病严重程度和炎症之间的关系，发现弗林蛋白酶会加剧SARS-CoV-2的感染和炎症反应，存在一定的正相关性。弗林蛋白酶可以成为SARS-CoV-2感染者疾病严重程度的预测指标[22］。弗林蛋白酶抑制剂的运用不仅可以直接降低病毒侵染细胞的效率，甚至可以降低病毒合胞体的数量，说明弗林蛋白酶抑制剂具有一定的抗病毒活性[23］。近期研究发现了位于SARS-CoV-2 S的第2个功能性弗林蛋白酶切割位点[24］。当RRAR多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除后，弗林蛋白酶仍然增加了 SARS-CoV-2对宿主细胞的感染性。该功能性弗林蛋白酶切割位点的发现为弗林蛋白酶抑制剂的研发提供了新的思路。2.4弗林蛋白酶与其他冠状病毒在冠状病毒家族中，弗林蛋白酶切割位点广泛存在于α和γ属成员上。弗林蛋白酶切割位点为β属冠状病毒S中的重要突变，在大部分β属冠状病毒中并不存在。弗林蛋白酶切割位点的存在可能是SARS-CoV-2的传播能力显著大于SARS-CoV的原因。值得注意的是，在HCoV-NL63这种人冠状病毒中，存在弗林蛋白酶切割位点S2'，而与其蛋白序列同源性达63.8%的HCoV-229E则没有这一位点[25]。弗林蛋白酶对不同冠状病毒的宿主细胞感染力均有一定的影响。在MERS-CoV、鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）等冠状病毒中，弗林蛋白酶切割位点参与扩大宿主与细胞嗜性。在γ属冠状病毒IBV的S2'位点引入弗林蛋白酶切割位点会使其破坏宿主的血脑屏障，增强IBV对于神经元的感染力，引起鸡的脑炎[26]，说明弗林蛋白酶切割S对IBV的致病性有明显的调控作用。同时，鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus，MHV）进入靶细胞依赖于溶酶体蛋白酶水解处理的S，而在紧邻融合肽上游的S中插入弗林蛋白酶切割位点后，MHV便不再需要被溶酶体蛋白酶处理即可入侵靶细胞[27]。这说明弗林蛋白酶改变了MHV的入侵途径，影响了其感染力。3弗林蛋白酶作为药物靶点的可能性通过干扰弗林蛋白酶对冠状病毒S的切割过程，可使病毒无法形成S1、S2活性片段，进而阻碍冠状病毒的入侵和膜融合过程。在人体中，弗林蛋白酶的分布范围比TMPRSS2更广，这为弗林蛋白酶抑制剂阻止冠状病毒侵染不同部位宿主细胞提供了可能。在多碱基切割序列的C端和N端的癸酰基上添加1个氯甲基酮基团，通过竞争性抑制可以不可逆地阻断弗林蛋白酶活性。同时细胞实验表明，肽基氯甲基酮可抑制弗林蛋白酶介导的病毒糖蛋白的切割和融合活性，减少病毒产生和细胞病变作用[12]，从而增强宿主细胞抵御病毒的能力，病毒感染率随之下降。肽基氯甲基酮和α-1抗胰蛋白酶抑制剂已被用于体外抑制弗林蛋白酶，而肽基氯甲基酮已被证明可以抑制SARS-CoV-2的加工[28]。纳米颗粒、高效价的弗林蛋白酶抑制剂避免了蛋白质、肽类抑制剂的缺点，是更好的替代品；小分子弗林蛋白酶抑制剂作为治疗药物也拥有广阔前景 [29]。以上对弗林蛋白酶抑制剂的研究为临床治疗应用提供了支撑。4挑战与展望弗林蛋白酶可影响冠状病毒入侵机制，这一发现极大地促进了对冠状病毒复制、致病、免疫应答等机制以及相关药物靶点的研究进展。虽然现有研究已经对弗林蛋白酶切割位点在冠状病毒感染宿主细胞中的作用有了部分明确，但在一些病毒感染的作用机制研究中仍存在争议,需要更进一步的研究。弗林蛋白酶对于SARS-CoV-2入侵宿主细胞有重要影响，其可能是抗SARS-CoV-2治疗的潜在药物靶点。SARS-CoV-2主要感染人体的黏膜细胞，而弗林蛋白酶在人体各种组织和细胞系中广泛存在，如何特异性地抑制SARS-CoV-2的靶细胞中弗林蛋白酶作用，有待进一步研究。弗林蛋白酶的特异性抑制剂仍是今后药物开发的重要研究方向。同时，由于弗林蛋白酶在细胞分泌和内吞途径中负责多种前体蛋白的水解成熟，因此在药物研发过程中要避免某些全身不良反应。以宿主蛋白为靶点进行药物筛选和设计可以有效规避冠状病毒变异快的劣势，弗林蛋白酶具备成为良好的药物靶点的可能，在病毒感染机制和特异性治疗、药物开发等方面有重要的研究价值。作者吕淑娴1  刘可欣1  杨祺凤1  陈昶倚1  黄靖雯1  郑旭2  丁翠玲31海军军医大学基础医学院，上海  200433；2南开大学生命科学学院，天津  300071；3海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室，上海  200433通信作者：丁翠玲，Email：cuilingding@163.com；郑旭，Email：764994029@qq.com引用本文：吕淑娴，刘可欣，杨祺凤，等. 弗林蛋白酶切割位点影响冠状病毒细胞入侵的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(4): 215-219.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221031-00075今年是COVID-19大流行趋于稳定后的第一年，人民生活逐渐走向正轨，经济也在缓慢但有力的复苏之中，而各抗体企业也依然在不断奋进、不断突破、不断超越，使抗体领域蓬勃发展，硕果累累。为促进抗体行业的交流与创新，2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间：2023年10月14-15日地点：苏州（酒店定向通知）规模：600-800人主办单位：生物制品圈、抗体圈指导单位：康维讯生物、夏尔巴生物会议费用：免费FREE!（仅收取50元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），9月15日报名定金提高到100元，先到先得，报完即止，超过9月20日预登记将收取会议费！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。