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▎药明康德内容团队编辑   早在古希腊时期，哲学家希波克拉底和柏拉图就在探讨禁食的健康益处。近年来的研究发现，间歇性禁食通过对代谢的重新布局，使得身体的能量供应从葡萄糖转换为酮体，从而带来减轻体重、减少炎症等一系列健康收益。 此外，同样以生成酮体为目的的“网红”饮食方式——生酮饮食，也能取得与间歇性禁食相似的效果。生酮饮食摄入的主要能量不再是碳水化合物，取而代之的是大量脂肪。这样一来，身体就会以脂肪代替葡萄糖作为能量供给，靠肝脏分解脂肪产生酮体，为生命活动提供燃料。 现在，科学家发现禁食与生酮饮食的这种特质，还能为“癌症之王”胰腺癌的治疗带来新的希望！在近期上线的《自然》论文中，加州大学旧金山分校Davide Ruggero教授带领的团队发现，在使用一种临床试验阶段癌症新药的同时通过生酮饮食喂养，可以“饿死”小鼠体内的肿瘤，让胰腺癌停止生长。 虽然禁食对代谢的影响早已有所发现，但一直以来，禁食信号如何在蛋白质组水平上改变基因表达、从而重塑代谢，却缺乏足够的理解。在这项研究中，Ruggero教授团队首先发现，真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）的磷酸化在禁食过程中被诱导。 自从被发现以来，eIF4E磷酸化的生理功能始终是未知数。而最新研究揭示了eIF4E如何改变身体代谢，从而在禁食以及生酮饮食期间转换为消耗脂肪来供能。eIF4E磷酸化控制了参与脂质分解代谢以及酮体生成的基因翻译。在禁食或生酮饮食期间，eIF4E磷酸化会通过特定的翻译调控元件来调控肝脏中的信使RNA。相反，抑制eIF4E磷酸化则会损害禁食和生酮饮食引起的酮体生成。 ▲在禁食期间，通过eIF4E磷酸化调控了生酮过程（图片来源：参考资料[1]） 有趣的是，研究还发现脂肪酸在这个过程中扮演了意想不到的角色。在禁食或生酮饮食期间，游离的长链脂肪酸含量上升，它们充当了信号分子，激活了营养传感器——AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶），AMPK进一步增强了MNK（MAP激酶的相互作用激酶）的磷酸化，而MNK又是eIF4E磷酸化的激酶。 到这里，一条由脂肪酸介导的完整信号通路水落石出——AMPK-MNK-eIF4E轴调控着生酮过程，也将生酮与翻译控制联系了起来。 图片来源：123RF 在找到这条信号通路后，Ruggero教授意识到，这些发现与癌症治疗产生了奇妙的联系。此前Ruggero教授与合作者共同开发出了一款癌症候选药物——tomivosertib（eFT508）。这种药物分子目前仍在临床试验阶段，其作用原理是MNK1与MNK2抑制剂。科学家们试图将eFT508用于胰腺癌治疗，通过阻断eIF4E的生成，来阻止肿瘤生长。然而，由于葡萄糖、碳水化合物可以维持能量供应，因此胰腺癌可以继续生长。 既然如此，通过改变饮食策略、借助使用脂肪供能的生酮饮食，是否可以阻断癌细胞的能量供应、提升eFT508的治疗效果呢？ ▲生酮饮食与eFT508联合抑制肿瘤生长的机制（图片来源：参考资料[1]） 在最新研究中，Ruggero教授团队开展了小鼠实验。研究团队首先对小鼠采用生酮饮食，迫使胰腺肿瘤仅消耗脂肪，然后使用癌症药物eFT508。在这种情况下，药物切断了癌细胞仅有的营养供应，肿瘤也缩小了。 在此前的临床试验中，eFT508对人体的安全性已经得到证实。现在，最新研究揭示通过eFT508与生酮饮食的联用，能够精确消除胰腺癌。 由此，这项研究揭示了胰腺癌的全新弱点，并且发现eIF4E磷酸化的抑制剂可以靶向这一弱点，为饮食干预和小分子药物的联合疗法提供了理论基础。研究团队也推测，在胰腺癌之外，大多数其他癌症也具有各自的弱点，因此将来有望找到更多包含了饮食策略的癌症精准治疗策略。 参考资料： [1] Yang et al. Remodelling of the translatome controls diet and its impact on tumorigenesis. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07781-7 [2] A ketogenic diet could improve the response to pancreatic cancer therapy. Retrieved Aug. 14, 2024 from https://www.eurekalert.org/news-releases/1054236 本文来自药明康德内容微信团队，欢迎转发到朋友圈，谢绝转载到其他平台。如有开设白名单需求，请在“学术经纬”公众号主页回复“转载”获取转载须知。其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 点个“在看”再走吧~

根据不完全统计，今年3月和4月共有13项临床研究宣告失败。比如，艾伯维与MacroGenics合作开发的ADAM9 ADC IMGC936止步I期研究；Amylyx的渐冻症新药Relyvrio因III期研究失败面临退市，还引发了公司生存危机，裁员70%；K药联合奥拉帕利一线治疗转移性非鳞状非小细胞肺癌的III期KEYLYNK-006研究错过双重主要终点……为大家筛选其中10项失败临床研究，以供参考。3月和4月失败临床研究1.varoglutamstat治疗阿尔兹海默病IIb期研究3月4日，Vivoryon Therapeutics公布了口服谷氨酰胺酰环化酶（QPCT）抑制剂varoglutamstat（PQ912）治疗早期阿尔茨海默病（AD）IIb期VIVIAD研究的初步结果。Varoglutamstat是一种针对有毒的pE3-Aβ（也就是礼来donanemab靶向的pGlu3-Aβ）开发的差异化口服小分子药物，其设计目的是在以淀粉样蛋白（Aβ）抗体为重点的治疗方法之前针对AD病理进行治疗。Varoglutamstat可阻断谷氨酰胺酰环化酶（QPCT）及其同工酶 QPCTL。QPCT催化pE3-Aβ的形成，pE3-Aβ是一种神经毒性特别强的Aβ变体，只存在于注意力缺失症患者体内，健康人的大脑中不存在这种变体，或与斑块沉积有关。此外，varoglutamstat还能影响突触损伤。通过另一种作用机制，即通过 QPCTL抑制CCL2的完全成熟，varoglutamstat可以调节促炎信号传导和tau病理学，从而同时解决AD的多种特征。然而，结果显示，VIVIAD研究未达到其主要终点，也未显示出认知能力随时间推移而发生变化的显著统计学差异。此外，该研究未达到测量认知能力、日常生活活动工具问卷和脑电图 全局θ功率的关键次要终点。Varoglutamstat的耐受性总体良好，严重和重度治疗紧急不良事件 （TEAE）发生率与安慰剂相似，不良事件导致的停药率较低，在临床环境中未发现有症状的 ARIAs（淀粉样蛋白相关成像异常）。此消息一出，Vivoryon公司股票当天暴跌90%。值得注意的是，先声药业于2021年6月与Vivoryon达成超5亿美元的合作，获得了包括varoglutamstat在内的2款阿尔茨海默病治疗药物在大中华区开发的权益。2.ADAM9靶向ADC I期研究3月7日，MacroGenics在2023年财报中透露将终止IMGC936的开发，原因是没有达到预期内的安全性和有效性目标。IMGC936是MacroGenics开发的第1款ADAM9靶向ADC，由高亲和力的人源化单克隆抗体、美登木素生物碱微管抑制剂载荷和稳定的三肽接头组成，DAR为2。在与艾伯维的共同合作下，ImmunoGen领导了临床开发，并完成了最初的I期剂量递增和剂量扩展研究。不过，MacroGenics和艾伯维都不打算进一步开发IMGC936，因为该分子没有达到预先建立的临床安全性和有效性基准。ADAM9（一种解整合素和金属蛋白酶结构域9）是ADAM多功能1型跨膜蛋白家族的成员，在肿瘤发生和癌症进展中发挥作用，并在多种癌症中过表达。MacroGenics认为，ADAM9仍然是一个有前途的替代细胞毒性有效载荷的靶点，并开发了第2款ADAM9 ADC药物MGC028，其有效载荷为拓扑异构酶I抑制剂SYNtecan E，DAR约为4。3.渐冻症药物III期研究3月8日，Amylyx Pharmaceuticals宣布Relyvrio（AMX0035）用于治疗肌萎缩侧索硬化（ALS）成人患者的III期PHOENIX研究未达到主要终点。4月，Amylyx还宣布将把该药物撤出美国和加拿大市场，并裁员约70%，以将其现金跑道延长至2026年。ALS，俗称渐冻症，是一种进行性神经退行性疾病，临床主要表现为进行性发展的骨骼肌萎缩、无力、肌束颤动，患者生存时间平均为3~5年，最常见的死因是呼吸衰竭。SOD1-ALS是ALS的一种罕见遗传性形式，仅占全球约16.8万ALS病例的2%，大多患者疾病进展迅速，发病后生存期不超过3年。PHOENIX研究共招募了664例ALS患者，结果并未达到主要终点，第48周时，与安慰剂组比，AMX0035治疗组肌萎缩侧索硬化功能评定量表（ALSFRS-R）评分较基线变化不具有显著统计学差异（p=0.667）。此外，该研究也未达到患者报告的生活质量结果评估、总生存期以及慢肺活量（SVC）衡量的呼吸功能等次要终点。受此消息影响，Amylyx股价当天暴跌83.5%。不过，AMX0035在III期研究中遭遇失败似乎意料之中，此前II期研究数据就曾面临过专家的质疑，上市之路颇为坎坷。AMX0035是一种由苯丁酸钠和牛磺酸二醇组成的专有口服固定剂量复方制剂。二者联合使用，靶向肌萎缩侧索硬化症和其他神经退行性疾病中的内质网和线粒体依赖性神经元退行性通路，减少神经元死亡和功能障碍。2022年9月，AMX0035获FDA批准上市，是首款在随机、安慰剂对照临床试验中显著延缓ALS疾病进展并能延长生存期的治疗药物，也是116年以来FDA批准的第3款ALS治疗药物。财报显示，2023年该产品销售额达3.8亿美元。2022年3月，FDA召开的外周和中枢神经系统药物咨询委员会（PCNSDAC）曾以6:4的投票，表达了对AMX0035现有数据说服力的怀疑——包括试验规模小、缺失数据、用于分析主要终点的统计方法的适当性以及随机化方案等问题。这些最终指向了一个结论——II期结果虽然具有统计学意义，但仍不足以确定AMX0035可以改善疾病进展。在II期CENTAUR试验中，研究人员在137名ALS患者中测试了AMX0035与安慰剂为期六个月的治疗效果，研究的主要终点是ALS功能评定量表总分的下降率。结果显示，接受AMX0035治疗的患者平均得分高出2.32分，下降速度减缓25.3%，具有统计学意义。长期随访研究表示，3年左右时AMX0035仍可表现一定生存益处。与安慰剂相比，AMX0035可将死亡风险降低约44%。但在6个月的随机期间，Amylyx没有发现统计学上显著的生存差异。2022年6月，FDA通知Amylyx，将AMX0035的PDUFA日期延长至2022年9月29日，以便有更多时间审查AMX0035临床研究数据的额外分析。2022年9月8日，PCNSDAC以7:2的投票结果赞成AMX0035的现有研究数据足以支持其用于治疗肌萎缩侧索硬化的上市申请。PCNSDAC的投票结果虽不具有约束力，但FDA批准AMX0035的上市申请应予以考虑了专家组的建议。随着III期验证性研究的失败，AMX0035的上市旅程终是被摁下了终止健。4.pimavanserin治疗精神分裂症阴性症状III期研究3月11日，Acadia Pharmaceuticals公布了pimavanserin治疗精神分裂症阴性症状的III期ADVANCE-2试验的最新结果。ADVANCE-2是一项为期26周的双盲、随机、安慰剂对照研究，454例患有主要阴性症状的精神分裂症成年患者分别接受了34mg的pimavanserin和安慰剂治疗，这些患者在接受抗精神病治疗后阳性症状得到了控制。在研究的主要终点，即阴性症状评估-16（NSA-16）总分从基线到第26周的变化上，pimavanserin与安慰剂相比没有显示出统计学上的显著改善（-11.8 vs. -11.1；P=0.4825）。Pimavanserin的安全性和耐受性与之前的临床试验一致，不良事件发生率为 30.4%，而安慰剂组为40.3%。Pimavanserin是一种选择性5-羟色胺（5-HT）反向激动剂和拮抗剂，优先靶向5-HT2A受体，于2016年4月获批，商品名为Nuplazid，是首款治疗与帕金森病精神病（PDP）相关的幻觉和妄想的药物。2023年，Nuplazid全球销售收入达5.49亿美元。在适应症拓展上，pimavanserin的开发之路走得并不顺利。此前，pimavanserin用于治疗与阿尔茨海默症精神病相关幻觉和妄想的补充新药上市申请（sNDA）已遭FDA两次拒绝。5. K药联合奥拉帕利一线治疗非鳞NSCLC III期研究3月21日，默沙东宣布其PD-1疗法Keytruda联合维持性PARP抑制剂Lynparza（奥拉帕利）一线治疗某些转移性非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）患者的III期KEYLYNK-006试验未达到总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的双重主要终点。在KEYLYNK-006试验中，与Keytruda联合化疗（培美曲塞+卡铂或顺铂）之后进行Keytruda+维持性化疗（培美曲塞）相比，Keytruda联合化疗随后进行Keytruda+维持性Lynparza不符合研究预先规定的OS或PFS统计标准。该试验中Keytruda和Lynparza的安全性与先前报道的单独治疗研究中观察到的结果一致。对这项研究数据的全面评估正在进行中。默沙东表示将与研究人员合作，与科学界分享研究结果。这已经不是Keytruda+奥拉帕利联合疗法失败的首个III期研究了。去年12月7日，默沙东宣布终止Keytruda与Lynparza（奥拉帕利）联合治疗转移性鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）患者的III期KEYLYNK-008试验，原因是研究没有显示出OS的改善。6. S1P受体调节剂治疗克罗恩病III期研究3月28日，BMS宣布ozanimod用于中重度活动性克罗恩病的III期YELLOWSTONE项目中第一个为期12周的诱导研究未达主要终点。Ozanimod是一款1-磷酸鞘氨醇（S1P）受体调节剂，能够抑制一个特定亚组的活化淋巴细胞从淋巴结迁移到中枢神经系统，从而缓解免疫系统对神经髓鞘的攻击。目前，该产品已在美获批治疗多发性硬化症、溃疡性结肠炎。本次公布的III期YELLOWSTONE研究项目包含两项为期12周的诱导研究、一项为期52周的维持研究和264周的开放标签扩展研究，旨在评估ozanimod较安慰剂的安全性和有效性。其中，诱导研究主要终点为患者临床缓解情况，即克罗恩病活动指数（CDAI）评分低于150的患者比例。不过，这项诱导研究（n=600）结果显示，第12周时未达到临床缓解主要终点。7. 个性化癌症疫苗II期研究4月1日，Gritstone bio宣布其个性化癌症疫苗GRANITE在一线转移性微卫星稳定结直肠癌（MSS-CRC）中正在进行的II/III期研究的II期部分的数据。总体来说，该癌症疫苗未能触发循环肿瘤DNA（ctDNA）的变化，导致II期试验未达主要终点。具体来说，公告显示：GRANITE组观察到无进展生存（PFS）获益的早期趋势，所有患者的风险比为0.82，高危患者的风险比为0.52，中位PFS分别为12个月(GRANITE组) 和7个月(对照组)；长期循环肿瘤DNA（ctDNA）反应与PFS趋势一致，GRANITE组患者优于对照组患者；但由于诱导化疗后意想不到的持续ctDNA下降，短期分子反应无法提供信息；GRANITE组总体耐受性良好，不良事件可控；没有患者因不良事件而停药。研究人员随机选择了104例转移性MSS-CRC患者，让他们从两种一线疗法中选择一种。所有患者均接受诱导和维持化疗。在维持阶段，约一半的受试者还接受了Gritstone的个性化新抗原癌症疫苗、BMS的Yervoy、罗氏的Tecentriq。该试验主要终点是观察ctDNA的变化，而不是大家广泛接受和应用的PFS，Gritstone首席执行官Andrew Allen博士为此解释道，“假性进展的证据（evidence of pseudo progression）使我们对PFS‘有点怀疑’，所以将ctDNA设置为主要终点。”虽然这项研究没有达到主要终点，但Andrew Allen博士认为PFS数据结果“非常令人鼓舞”，在6个月和9个月后，疫苗组的PFS率高于对照组，他表示，“我们只是搞错了分子反应的定义，化疗后两组患者的ctDNA水平下降的时间比我们预期的要长，这在两组患者中产生了相似的短期分子反应率，使得我们对ctDNA变化的方案测量无法提供信息。”Gritstone成立于2015年，2018年9月IPO，是一家临床阶段的生物技术公司，通过创新载体和有效载荷来训练免疫系统的多个分支来攻击关键的疾病靶点。公司的管线专注于癌症疫苗和传染病疫苗。临床数据公布的同一天（4月1日），Gritstone宣布了公开募股计划，拟以1.65美元/股的价格出售3250万美元。但投资者似乎并不买账，次日（4月2日）股价下跌48.94%，仅1.2美元/股。Gritstone 2023年底的资金为7920万美元，该公司表示，这笔资金将用于2024年第3季度的运营。现在Gritstone的现金快用完了，此次募股也是无奈之举。Gritstone表示，预计将在2024年第3季度公布GRANITE的成熟的PFS数据，2025年上半年公布总体生存数据。8. MNK1/2抑制剂联合K药一线治疗NSCLC II期研究4月4日，eFFECTOR Therapeutics公布了tomivosertib的一项随机、安慰剂对照II期KICKSTART研究的主要分析结果。Tomivosertib是MNK1和MNK2的强效、高选择性小分子抑制剂，通过抑制肿瘤驱动的T细胞衰竭来激活对癌症的免疫反应，可抑制MNK依赖性的多种免疫抑制蛋白的过度产生，包括PD-1和LAG3。KICKSTART研究旨在评估tomivosertib与K药联用一线治疗PD-L1≥50%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的有效性与安全性。基于36个事件，采用分层考克斯比例危险模型计算的无进展生存期（PFS，该研究的主要终点）危险比为0.62（95%Cl：0.3-1.3），tomivosertib更优。基于分层对数秩检验，PFS双侧P值为0.21，未达到p≤0.2的预设阈值。Tomivosertib组的中位生存期为13.0周，安慰剂组的中位生存期为11.7周。总生存期结果仍不成熟，但没有观察到有利于tomivosertib的趋势。在tomivosertib组中，发生3级或3级以上治疗突发不良事件的比例为67%，而安慰剂组为37%。eFFECTOR总裁兼首席执行官Steve Worland博士表示：“虽然有证据表明tomivosertib具有一定的活性，但根据目前掌握的全部数据，我们认为继续开发tomivosertib治疗一线NSCLC的前景并不明显。”9. dalzanemdor治疗帕金森病II期研究4月17日，Sage Therapeutics公布了PRECEDENT研究的初步结果，该双盲、安慰剂对照II期研究旨在评估潜在同类首创NMDA受体正变构调节剂dalzanemdor在帕金森病（PD）轻度认知障碍（MCI）患者中的有效性与安全性。PRECEDENT研究未达到其主要终点，即在第42天时，接受每日一次dalzanemdor治疗的患者相较于接受安慰剂治疗的患者在WAIS-IV测试得分方面未显示显著统计学差异。Dalzanemdor的耐受性总体良好，没有发现新的安全性信号。根据数据，Sage不计划在PD中进一步开发dalzanemdo。“我们对II期PRECEDENT研究的结果感到失望，因为轻度认知障碍给PD患者及其家庭带来了沉重负担。”Sage公司首席执行官 Barry Greene 表示：“虽然认知障碍在神经退行性疾病中很常见，但PD的基本病理生理学和症状学是与众不同的，这些结果并不一定能预测dalzanemdor在其他神经退行性疾病中的治疗效果。我们期待着今年晚些时候亨廷顿氏病和阿尔茨海默病II期研究的初步数据。”10. CLK/DYRK激酶抑制剂治疗膝骨关节炎III期研究4月18日，Biosplice Therapeutics 宣布最近完成了CLK/DYRK激酶抑制剂lorecivivint治疗膝骨关节炎的两项III期试验，即OA-07长期结构、疼痛和功能研究以及OA-21短期疼痛研究。最初于2023年11月报告的OA-07研究的初步结果表明，患者关节结构实现了具有统计学意义和临床意义的改善。对OA-07结果的最终分析证实了这一结构上的获益，并进一步表明患者的疼痛也实现了统计学意义上的显著减轻（以第6个月和第12个月的WOMAC疼痛度量），功能也有了显著改善（以第12个月的WOMAC功能度量）。然而，关于较短期的OA-21研究，初步分析表明，该研究没有达到第12周疼痛减轻的主要终点。与已发表的关节内OA试验和Biosplice之前的试验相比，公司在这项试验中观察到了异常高的安慰剂反应。Biosplice目前正在分析这些初步的OA-21试验结果。Lorecivivint是一种Biosplice正在开发的拟应用于改善骨关节炎的药物，并有可能成为近年来首个获批用于骨关节功能改善的新机制创新药。2021年9月，海思科与Biosplice就lorecivivint达成了合作，交易条款总价值最高可达1.4亿美元，包括首付款和注册里程碑共2000万美金，以及一定的销售里程碑加上未来销售的特许权使用费。海思科获得独家负责lorecivivint在中国的开发、注册和商业化。Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved.欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

共价探针与化学蛋白质组学相结合是研究小分子和蛋白质相互作用的有力方法。然而，在各种配体中创建反应性弹头以形成共价探针的过程通常较为困难，缺乏简便高效的构建共价探针的方法，此外，当前被报道的反应性弹头大多以靶向半胱氨酸残基为主，因此，需要开发新型的亲电试剂并开发一种方便有效的方法将这种潜在的亲电试剂引入配体，特别是可以高效用于后期蛋白质组学分析，并发掘激酶活性口袋内潜在的可共价修饰的氨基酸位点，希望为开发系列新型共价抑制剂提供重要基础。近日，暨南大学药学院李正球研究员、丁克教授、谭毅副研究员等作为共同通讯作者在Nature子刊Communications Chemistry上发表了题为：“Catalyst-free late-stage functionalization to assemble α-acyloxyenamide electrophiles for selectively profiling conserved lysine residues”的文章。作者发展了一个简捷高效的一步偶联反应，该反应可以在无任何催化剂的情况下将生物活性分子中的羧酸基团转变为高活性亲电基团--α-酰氧烯酰胺，可以帮助目标蛋白质的配体选择性标记。通过该方法合成了含有α-酰氧烯酰胺亲电基团的小分子探针、并成功嵌入针对EGFR L858R的激酶抑制剂erlotinib、广谱激酶抑制剂和天然产物当中，其中探针E3可以共价结合EGFR L858R突变体ATP结合口袋附近的赖氨酸残基K728，广谱激酶抑制剂探针可以结合一系列激酶的活性位点如CDK1、CDK2、CDK5的K33等，并且这种方法在天然产物中应用定量蛋白质组学技术同样成功鉴定了一系列重要赖氨酸残基。发现的可修饰保守赖氨酸残基将为构建新型靶向共价抑制剂（TCI）提供重要基础。近年来，靶向共价抑制剂（TCIs）因其显著的药物特性而受到广泛关注。与非共价抑制剂相比，靶向共价抑制剂具有更强的效力、出色的选择性和更长的作用持续时间。然而，这些抑制剂的反应活性通常仅限于α，β-不饱和酰胺，靶点仅为半胱氨酸残基。由于半胱氨酸残基及其突变的高反应性，患者在治疗过程中经常发生获得性耐药。此外，许多蛋白质结合口袋缺乏可靶向的半胱氨酸，因此有必要开发新的亲电试剂，这些亲电试剂可以靶向其他的亲核残基，如保守的赖氨酸和谷氨酸或天冬氨酸，并鉴定可配体的保守残基。共价化学与化学蛋白质组学相结合已成为原位条件下研究小分子-蛋白质相互作用的有力手段，它不仅可以识别结合口袋附近的可结合位点，还可以促进对天然蛋白质功能和小分子生物特性的理解。为了产生共价探针，通常需要将高度活化的亲电试剂如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、磺基四氟苯基（STP）酯等嵌入药效团，使周围的氨基酸残基在配体结合后被选择性标记。然而，在将亲电弹头结合到各种非共价配体的过程中通常会遇到困难，特别是复杂的天然产物。因此，非常需要开发一种方便有效的方法，用于在后期将潜在亲电试剂引入配体中。为了解决上述问题，作者在前期研究的基础上发展了一步偶联反应，在无任何催化剂的情况下将生物活性分子中的羧酸转变成潜在的亲电弹头-α-酰氧基烯酰胺，并将其引入共价抑制剂和天然产物。作者首先合成一系列小分子共价探针A1-A4，并采用pull-down/MS研究其在活细胞中的共价结合能力，结果表明A1可以共价标记多种癌细胞中的蛋白质，并且标记程度具有良好的浓度依赖性和时间依赖性，随后结合LC-MS/MS和pChem进行进一步分析，表明α-酰氧基烯酰胺弹头主要靶向赖氨酸残基，且A1可以共价结合MDA-MB-231活细胞中的蛋白激酶PFKAP的K688残基，NDKA的K12残基等，这些结果表明α-酰氧基烯酰胺是一种有效的可以共价修饰活细胞的蛋白质赖氨酸残基的亲电弹头。作者进一步评估了该弹头在共价激酶抑制剂中的应用。首先将该弹头引入EFGR L858R的非共价抑制剂erlotinib中合成一系列探针E1-E5，综合探针对EGFR激酶的抑制活性（IC50）的标记能力，E3具有较强的共价结合能力（IC50=8.283 nM），与母体erlotinib抑制活性水平相当，pull-down/WB结果显示E3具有更强的EGFR L858R共价标记能力。随后在erlotinib的竞争下进行靶蛋白鉴定，在erlotinib的存在下，E3对EGFR L858R的结合能力显著降低。进一步的LC-MS/MS实验也表明E3可以共价结合EGFR L858RATP结合口袋附近的K728，证明通过引入α-酰氧基烯酰胺亲电弹头可以将非共价抑制剂erlotinib转变为共价抑制剂并且可结合到新的赖氨酸位点，K728可能是开发新的靶向激酶抑制剂的赖氨酸残基。作者另外在广谱激酶抑制剂的基础上进行了验证，首先在广谱激酶抑制剂的母体化合物中不同部位引入α-酰氧基烯酰胺亲电弹头，形成新的共价探针X1-X4，随后在K562细胞中进行了标记验证，结果表明，探针X1-X4可以成功标记活细胞中的多种蛋白质，在较低浓度下可以观察到在～35kDa、～45kDa处探针有较明显的特异性标记，为了验证该特意标记的蛋白条带，作者进行了pull-down/LC-MS/MS实验进行鉴定，结果分析这两条特异性标记条带分别为激酶CDK1和MEK2，此外四个探针在10 µM浓度下共检测到了91个蛋白激酶，显示了探针对激酶的高标记能力，进一步采用pull-down/WB实验验证了探针对两种激酶共价标记，并且在洗涤一段时间后X1对激酶CDK1的标记能力仍旧没有减弱。作者进一步分析了探针用于分析全蛋白质组中激酶的保守赖氨酸残基的能力，结果表明四个探针共结合了不同激酶的64个赖氨酸残基，其中CDK1、CDK2、CDK5的K33、PAK2的K278、MKNK1的K78、MP2K2、MP2K1的K97、K101、NDKB的K12、AAPK1、AAPK2的K45和K56以及CSK21、CSK22、CSK23的K68（K69是ATP结合位点）。KPYM的K270是底物结合位点，发现一小部分已鉴定的位点（例如PGK1的K216或CDK1的K20）位于ATP结合口袋中，表明这些可能是共价修饰的位点并影响激酶功能。CDK1、CDK2、CDK5的K33、MEK2的K101、CHK2的K249、STK38的K118、MKNK1的K78突变为精氨酸后导致探针与相应激酶的标记谱降低，表明修饰主要发生在催化残基处。这些实验结果表明基于α-酰氧基酰胺的探针适用于分析整个蛋白质组中激酶的可结合保守赖氨酸残基。最后作者评估了α-酰氧基酰胺亲电弹头在天然产物中的应用。首先利用无催化的一步偶联反应和天然产物配体合成一系列的探针，随后进行了抗增值活性评估，结果显示含α-酰氧基酰胺的探针比含NHS的探针发挥出了更高的效力，也表明α-酰氧基酰胺的存在可以增强探针的抗癌效果。作者采用定量蛋白质组学进行了进一步的分析，结果表明，基于α-酰氧基酰胺的探针（Ar-2/3、BA-3、MA-2/3、UrA-2/3）比基于NHS的探针（Ar-1、BA-1、MA-1、UrA-1）产生更高的同位素比率，显示出对这些保守赖氨酸残基的优异标记能力。从这些探针中检测到不同的配体赖氨酸残基亚组，MA-3的修饰数量最高。用NHS-biotion的竞争性标记谱图显示Ar-2、MA-2、UrA-2、UrA-3剂量依赖性地阻断标记，证明这些探针确实与鸟氨酸转氨酶蛋白结合。MDA-MB-231活细胞中MA-1/3的结合位点图谱显示，两种探针均可成功识别已知靶标IMPDH2，标记位点K438是结合口袋中的相邻残基。这些结果再次证明，α-酰氧基酰胺亲电试剂可以应用于各种生物活性分子中，以分析已知或未知的靶标和相应的可配基保守赖氨酸残基，从而促进新的靶向共价抑制剂的开发。总之，本研究引入了一个简捷高效的一步偶联反应，在合成的后期将生物活性分子中的羧酸基团转化为高活性的亲电试剂α-酰氧基酰胺。这一过程与药效团中的各种功能基团兼容，从而具有广泛的应用。所得亲电试剂对蛋白质中的赖氨酸残基表现出显著的反应性。通过将这种强效亲电试剂整合到特异性激酶抑制剂厄洛替尼和广谱激酶抑制剂中，成功开发出能够共价结合目标蛋白的探针，鉴定了一系列不同激酶的可修饰保守的赖氨酸残基，为开发新的靶向共价抑制剂提供了有价值的线索。此外，这种方法的效用扩展到了天然产物中，它能够对未知靶标进行靶标分析和结合模式表征，并且可以作为NHS弹头的补充。研究含α-酰氧基酰胺探针与各种蛋白质靶标相互作用的能力为了解它们的生物活性开辟了新的途径。这些发现证明了生物活性分子中α-酰氧基酰胺亲电试剂在研究靶标结合和分析保守赖氨酸残基方面的多功能性和实用性。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓