IL-2 x TLR7

摘要：疫苗是人类历史上最重要的发明之一，已经彻底改变了全球健康。通常，疫苗通过触发先天免疫反应和刺激抗原呈递细胞，引发针对特定病原体抗原的防御性适应性免疫反应。作为关键要素，佐剂是经常作为添加剂使用的化学物质，用于提高疫苗的效力和免疫原性。90多年来，佐剂一直是许多人类疫苗的重要组成部分，通过增强、调节和延长免疫反应来提高其效力。在这里，我们提供了一份及时且全面的佐剂历史发展和当前状态的综述，包括它们的分类、作用机制以及在不同疫苗中的作用。此外，我们对当前的许可程序进行了系统分析，并重点介绍了涉及疫苗佐剂的临床试验中的显著例子。展望未来，我们预计该领域的未来趋势，包括新佐剂配方的开发、创新佐剂的创造以及它们在系统疫苗学和疫苗输送的更广泛范围内的整合。文章认为，对生物化学、材料科学和疫苗免疫学的更深入理解对于推进疫苗技术至关重要。预计这些进步将带来更有效的疫苗的未来开发，能够对抗新兴传染病和增强公共卫生。 1.引言：疫苗佐剂的历史 疫苗佐剂研究领域自20世纪初诞生以来已显著进步（图1）。随着传染病的日益流行，免疫接种已成为限制其传播和减少相关伤害的最有效方法。然而，早期的疫苗往往证明是无效的，因为纯化的抗原本身无法引发足够强大的免疫反应。为了克服这一挑战，引入了佐剂的概念。佐剂是添加到疫苗中以增强其免疫原性，从而提高其效力的物质。 图1.疫苗佐剂发展的重大事件时间线。这一时间线展示了疫苗佐剂的逐步发展，从RNA和DNA等天然成分演变到合成工程佐剂。 现代佐剂的发展一直是一个缓慢而具有挑战性的过程。研究人员旨在创造既能够引发强烈免疫反应又保持安全有效的疫苗。这涉及到选择性地结合明确定义的分子和配方，并探索天然和合成化合物。正如图1所总结的，佐剂的组成随时间演变。它从早期的天然成分发展到当代的合成化合物。 尽管佐剂开发面临挑战，但目前有超过30种不同制造商的许可疫苗含有佐剂。铝盐是最早发现的佐剂，已被发现能够增强针对乙型肝炎、破伤风、白喉、百日咳和人类乳头瘤病毒等疾病的疫苗的免疫反应。铝盐的有效性归因于它们在注射部位形成储库、诱导炎症以及激活树突细胞和T细胞的能力。尽管铝盐在疫苗中使用已有七十多年，但其确切的免疫机制仍未完全理解。 20世纪90年代后期的佐剂发展包括油包水乳液。这些乳液有助于在较长时间内缓慢释放抗原，激活先天免疫系统，并诱导体液和细胞免疫反应。这种乳液的首次使用之一是在Fluad，这是一种针对65岁以上成年人的许可季节性流感疫苗。其他FDA许可的佐剂包括MF59（一种含角鲨烷、生物可降解油和表面活性剂的油包水乳液佐剂，用于流感疫苗）和AS03（由α-生育酚、角鲨烷和表面活性剂组成，用于H1N1流感疫苗和一些大流行流感疫苗）。AS01（一种脂质体和单磷脂A的混合物）已在RTS,S/AS01疟疾疫苗和带状疱疹疫苗中使用。 尽管许多其他佐剂在临床前模型中显示出高效力，但由于安全或耐受性问题，大多数尚未获得人类使用的许可。此外，包括铝盐、MF59和佐剂系统AS0佐剂在内的现有佐剂在人类中的作用分子机制仍不完全清楚。 2.佐剂的益处和效果 总体而言，疫苗佐剂在提高疫苗的有效性和可及性，以及减少全球传染病负担方面发挥着关键作用。它们的用途和其他实际应用如下（见图2）： 图2. 佐剂的潜在益处 1.缓解有限的疫苗供应：佐剂增强免疫反应，允许较少的疫苗剂量实现完全保护。这减轻了卫生系统的负担，并增加了那些无法接受多次剂量的人的可及性。佐剂还可以降低疫苗中必要的抗原剂量，从而可能减少副作用并增加可用性。例如，重组疫苗提供了显著的制造优势，但通常自身免疫原性较弱。将佐剂与重组大流行流感蛋白结合，可以大幅减少实现目标抗体水平所需的抗原量，从而显著增加生产能力。例如，AS03是一种油包水乳液佐剂，已在H1N1流感疫苗等疫苗中使用。它已被证明可以改善免疫反应，并允许抗原节约，这意味着可以使用较小量的疫苗抗原，同时仍然产生强烈的免疫反应，这有助于延长可用的疫苗供应。 2.快速启动免疫反应：佐剂刺激对疫苗抗原更强、更持久的反应，提供更好的保护。例如，将AS04佐剂加入GlaxoSmithKline（GSK）的乙肝抗原Fendrix中，实现了三剂方案减为两剂。Advax是一种基于δ-菊糖的佐剂，已被证明可以加速免疫反应。它激活先天免疫系统，并促进细胞因子和趋化因子的产生，这有助于增强适应性免疫反应。 3.扩大抗体反应：佐剂扩大对具有显著抗原漂移或株变异的病原体的抗体反应，对于流感、人类乳头瘤病毒（HPV）和疟疾寄生虫等疾病至关重要。例如，MF59是一种油包水乳液佐剂，已被证明可以增强细胞和体液免疫反应，并显著增加抗体滴度，改善抗体反应的质量。 4.加强抗体反应的幅度和功能性：佐剂不仅增加了抗体反应的幅度，还增加了它们的功能性、亲和力或免疫系统产生的功能性抗体数量。例如，AS04是一种将铝盐与单磷脂酸脂A（MPLA）结合的佐剂，MPLA是一种Toll样受体4激动剂。AS04已被证明可以增强抗体反应的幅度和功能性。它促进了高质量抗体的产生，包括增加抗体滴度和改善抗体亲和力和亲和力。 5.加强T细胞反应：正在开发新的疫苗候选物以改善T细胞反应，现有的人类使用批准的佐剂不能有效诱导这些反应。目标是诱导更有效的T辅助细胞参与，以优化抗体反应的质量和持久性，或诱导可以针对和消除细胞内病原体的效果CD4+或CD8+ T细胞。因此，新疫苗可能包括Toll样受体（TLRs）和其他先天免疫受体的激动剂，以促进T辅助细胞反应的产生。这种方法旨在克服传统佐剂的局限性，创造更有效的疫苗，可以提供长期保护，对抗更广泛的病原体。通过改善T细胞反应，这些疫苗也可能为免疫系统较弱的个体或对传统疫苗反应不佳的人提供益处。例如，CpG ODNs是含有特定免疫刺激性序列的合成DNA分子，作为Toll样受体9（TLR9）激动剂，已被证明通过促进抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的激活和分化来增强T细胞反应。它们诱导Th1型免疫反应，导致T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性T细胞活性增加。 6.开发新疫苗：佐剂在开发传统疫苗无效的疾病疫苗中至关重要，增强免疫反应并针对多种病原体株。它们可以增强对疫苗的免疫反应，并帮助针对病原体的多种株。例如，在流感疫苗的情况下，已使用佐剂创建可以针对不同流感病毒株提供更好保护的疫苗。此外，佐剂可用于开发针对尚未有效疫苗可用的病原体引起的疾病的疫苗，如HIV或疟疾。开发能够刺激针对这些病原体的强大和针对性免疫反应的佐剂是一个重要的研究领域。例如，在病毒样颗粒（VLP）佐剂中，VLP是自组装结构，模仿病毒的整体结构但缺乏病毒遗传物质，使它们无传染性。VLP可以作为抗原和佐剂。它们已被用于新疫苗的开发，以增强免疫反应，提高疫苗效力，并扩大对不同病毒株或亚型的免疫反应。 7.提高安全性：通过增强免疫反应，佐剂可以降低疫苗相关不良事件的风险。这是因为免疫系统能够更好地针对和消除抗原，降低可能导致副作用的过度免疫反应的风险。因此，在疫苗中使用佐剂已成为提高疫苗效力、安全性和可及性的重要策略。例如，病毒体是将病毒蛋白（如流感血凝素）纳入其结构的类脂质体颗粒。它们已被用作疫苗中的佐剂以提高安全性。病毒体提供了病毒的抗原性质，但没有传染性遗传物质，降低了疫苗相关不良事件的风险。病毒体佐剂已在流感和甲型肝炎等疾病的疫苗中使用。 3.佐剂的类别及其作用机制  在这一部分，我们讨论了典型的疫苗佐剂，包括它们的组成部分、功能机制、在疫苗中的应用以及它们的优点和缺点，以及与它们相关的挑战。 图3. 疫苗佐剂的类型 3.1.铝盐类佐剂 通常被称为明矾的铝盐类佐剂是第一种在许可的人类疫苗中使用的佐剂，并且仍然是使用最广泛的佐剂。它们由氢氧化铝、磷酸铝或两者的组合组成，已知能在注射部位形成储库，随时间缓慢释放疫苗抗原，从而产生更强和更持久的免疫反应。它们已被证明能增强对包括乙型肝炎、人类乳头瘤病毒（HPV）和肺炎球菌病疫苗在内的广泛抗原的免疫反应。由于它们经过验证的安全性记录、增强免疫反应的广谱能力以及易于制造，它们仍然是疫苗开发中一个有吸引力的选择。然而，人们对铝盐可能引起的不良反应，如注射部位的局部反应和罕见的过敏反应，也存在一些担忧。使用铝盐作为疫苗佐剂的好处通常大于风险。 铝盐类佐剂的确切作用机制尚未完全理解，但有几种提出的理论（图4a）。明矾作为佐剂之所以受欢迎的一个关键原因是它们能在注射部位形成储库。这个储库随时间缓慢释放疫苗抗原，使免疫系统长时间暴露于抗原。这种长时间暴露有助于增强免疫反应，导致更强和更持久的免疫力。 图4. 疫苗佐剂的作用机制。a) 基于铝盐的佐剂。b) 乳液佐剂。c) 基于TLR激动剂的佐剂。 此外，明矾还被认为是通过在注射部位诱导炎症来激活先天免疫系统。这种炎症被认为是由炎症体的激活触发的，炎症体是一种在先天免疫反应中起关键作用的蛋白质复合物。激活的炎症体释放促炎细胞因子，这有助于吸引免疫细胞到炎症部位并激活它们。 铝盐类佐剂还被认为是通过诱导促炎细胞因子的释放来激活树突状细胞，这些是专门呈递抗原给T细胞的免疫细胞，负责识别和攻击外来入侵者。铝盐类佐剂通过诱导释放促炎细胞因子，如IL-1β和TNF-α，吸引树突状细胞到注射部位并激活它们。反过来，树突状细胞促进效应T细胞的分化，这些细胞在诱导免疫中起着关键作用。 明矾还被认为是通过刺激CD4+ T细胞的分化和诱导B细胞产生抗体来发挥作用，这对于诱导免疫至关重要。这一过程是通过树突状细胞产生的IL-1β和IL-18来介导的，它们促进效应T细胞的分化。储库中抗原的缓慢释放也有助于延长B细胞对抗原的暴露，这可以增强抗体的产生。 总之，铝盐类佐剂通过在注射部位形成储库、激活炎症体、诱导促炎细胞因子的释放、吸引树突状细胞到注射部位以及增强B细胞产生抗体的作用来发挥作用。这些机制共同作用，增强了疫苗中抗原的免疫反应，提高了对目标疾病的保护。 3.2.无机纳米颗粒基佐剂 无机纳米颗粒基疫苗佐剂，如纳米铝、层状双氢氧化物（LDH）和纳米/介孔硅、纳米金刚石、量子点，已被研究其增强疫苗免疫反应的潜力。无机纳米颗粒提供了一个多功能的平台，用于表面修饰，允许精确控制大小和形状参数。这种多功能性有助于设计旨在引发特定免疫反应的定制结构。此外，这些纳米颗粒通常表现出强大的化学和物理化学稳定性，确保在储存和运输过程中不需要冷藏即可长时间保存。这些属性对于实际的疫苗部署和分发场景至关重要，特别是在资源有限的环境中，使它们成为储备疫苗以应对未来紧急需求的理想候选者。 无机纳米颗粒基疫苗佐剂的作用机制涉及它们与免疫系统的相互作用，以增强和调节对疫苗中抗原的免疫反应。无机纳米颗粒作为抗原的载体，确保它们有效地传递给抗原呈递细胞（APCs）。纳米颗粒被设计为被APCs，如树突状细胞和巨噬细胞，有效摄取。这种摄取是通过纳米颗粒的大小、表面电荷和表面修饰来促进的。一些无机纳米颗粒佐剂，如基于铝的佐剂，会在注射部位引起局部炎症。这吸引免疫细胞到该部位，并促进APCs的招募。无机纳米颗粒佐剂有助于发展持久的免疫记忆。这确保了免疫系统“记住”遇到的抗原，在随后暴露于病原体时提供保护。 其中，具有纳米纤维形态的γ相氧化铝水合物纳米颗粒（γ-AlOOH）被制备并用作人结核杆菌水热提取物的传递系统。由于其独特的介孔纤维结构，合成的γ-AlOOH显著增强了巨噬细胞样细胞的细胞摄取，与商业明矾相比增加了约两倍。 介孔硅具有有序的多孔结构，孔径在介孔范围内（2至50纳米）。这种结构提供了大的表面积和可调节的属性，使其适合于各种应用，包括药物传递和疫苗佐剂。介孔硅的表面可以被修饰以定制其属性，用于特定的疫苗配方和应用。介孔硅也可以被用来封装免疫调节剂，进一步增强佐剂效果。例如，无定形硅可以用作疫苗佐剂以增强免疫反应。纳米级和微米级硅都促进了髓系细胞中NLRP3炎症体的激活，而只有纳米级硅在角质形成细胞中激活了炎症体。 层状双氢氧化物（LDHs）是一种具有正电荷的类水镁石层和层间阴离子的材料，为包括药物传递和免疫调节在内的各种应用提供了独特的结构。由于其层状结构，LDHs对抗原具有高负载能力。LDHs可以设计成以控制的方式释放抗原，促进持久和延长的免疫反应。LDHs还可以表面修饰以整合额外的功能，如靶向配体或免疫调节剂，以进一步定制其性能。 总之，无机纳米颗粒作为疫苗佐剂是一个活跃的研究领域，它们在疫苗开发中的应用有望增强免疫反应，提高疫苗的整体有效性。 3.3.乳液佐剂 当两种液体混合在一起时，如果它们不能形成均匀混合物，就会形成乳液。抗原包含在这些水滴中，油则作为储库，缓慢释放抗原，并通过减少清除时间和延长抗原暴露来增强免疫反应。乳液是另一种已开发用于增强疫苗免疫反应的疫苗佐剂。乳液由两种不相溶的液体组成，通常是一个油相和一个水相，由表面活性剂稳定。乳液通过在油相中形成小的抗原滴液，然后将它们分散在整个水相中。 最早获得人类疫苗批准的水包油佐剂之一是MF59，它包含角鲨烷、聚山梨醇酯80、三油酸山道醇酯和脱水柠檬酸钠。MF59诱导ATP释放，并上调细胞因子和趋化因子以增强疫苗接种部位的抗原特异性免疫反应。它已被证明是安全且耐受性良好的。另一种基于水包油乳液的佐剂是AS03，它包含表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油，角鲨烷和DL-α-生育酚。欧洲委员会在2009年为AS03佐剂的Pandemrix授权上市，2013年FDA批准了AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗。AS03已越来越多地用于流感和疟疾疫苗。 乳液已被用于各种疫苗中，包括流感、乙型肝炎和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗。它们提高了疫苗的效力，特别是在可能对传统疫苗反应不佳的人群中，如老年人或免疫功能低下的个体。乳液佐剂通过几种机制增强对疫苗的免疫反应。图4b提出了几种理解基于乳液的佐剂如何工作的机制： 一个主要机制是抗原的缓慢释放延长了时间。乳液滴液的小尺寸允许延长的表面积体积比，这增强了抗原的呈现和抗原呈递细胞的摄取。这种抗原的缓慢释放可以在更长的时间内激活免疫系统，从而产生更强大和更持久的免疫反应。 乳液佐剂还激活了先天免疫系统。乳液滴液被免疫系统识别为异物，导致激活如树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等抗原呈递细胞。然后这些细胞产生促炎细胞因子和趋化因子的复合物，如TNF-α和IL-1β，这进一步激活免疫系统并吸引免疫细胞到注射部位，并形成一个免疫能力环境，以增强抗原向引流淋巴结的运输。 乳液佐剂的另一个重要机制是它们能够诱导体液和细胞免疫反应。乳液滴液可以被抗原呈递细胞摄取，然后将抗原呈递给T细胞和B细胞。T细胞负责直接攻击感染的细胞，而B细胞产生可以中和病原体的抗体。乳液佐剂已被证明可以激活T细胞和B细胞，导致更全面的免疫反应。 总之，乳液佐剂已成为疫苗开发中的重要工具。它们通过几种机制增强对疫苗的免疫反应，包括缓慢释放抗原、激活先天免疫系统以及诱导体液和细胞免疫反应。 3.4.Toll样受体（TLR）激动剂 Toll样受体（TLRs）是一种模式识别受体，对入侵病原体的先天免疫反应至关重要。TLRs是跨膜受体，主要由先天免疫系统的细胞表达。这些受体分为两组：细胞表面TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6）和细胞内TLRs（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9），它们表达在内体膜上。每个TLR都包含一个跨膜域、一个富含亮氨酸的重复（LRR）段，该段识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），以及一个Toll/白介素-1受体（TIR）域，该域启动下游信号转导并诱导炎症反应。因此，TLRs是佐剂刺激有效免疫反应的有吸引力的靶点，提供对病原体的长期保护。Toll样受体（TLR）激动剂作为疫苗中的佐剂对生命威胁和复杂疾病（如癌症、艾滋病和疟疾）非常有前景。 CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）是含有磷酸硫酯骨架的合成DNA分子，其中包含未甲基化的CpG基序。图4c描述了基于TRL的佐剂如何起作用：CpG ODN是一种有效的佐剂，诱导1型辅助T（Th1）反应，并促进细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌。CpG ODN通过TLR9激活增强了对抗原的特异性体液和细胞免疫反应。由于其独特的特性，CpG ODN可以作为通过肌肉注射、皮下、口服和鼻内途径的疫苗佐剂。作为有效的疫苗佐剂，CpG ODN可以促进抗原的免疫刺激效应，激活抗原呈递细胞（APCs），并加速免疫反应。CpG ODNs促进浆细胞样树突状细胞（pDCs）上主要组织相容性复合体（MHC）、CD40和CD86的表达，并增强抗原处理，导致强大和持久的免疫反应。 3.5.脂质体 脂质体是一种疫苗佐剂，由磷脂和胆固醇组成，是能够包裹抗原和其他免疫刺激性分子的小球形结构。它们是可生物降解的、生物相容的，并且允许进行多样化的结构修改，以实现可调节的特性和毒性。脂质体可用于将抗原传递给抗原呈递细胞，如树突状细胞，这些细胞可以激活免疫系统。此外，脂质体能够增强体液和细胞免疫反应，诱导对清除细胞内病原体和增强抗体反应至关重要的Th1偏向反应，使它们成为疫苗开发中具有吸引力的佐剂。脂质体的一个独特特性是它们能够被修改以针对特定的细胞类型。它们可以被修饰以带有针对树突状细胞上特定受体的抗体或肽，增加脂质体包裹的抗原的摄取。脂质体还可用于共同传递多种抗原或免疫刺激性分子，从而引发更强大的免疫反应，特别是对于可能需要多种抗原才能诱导保护性免疫反应的复杂病原体。 AS01是一种基于脂质体的佐剂系统，包含两种免疫刺激性剂，3-O-去酰基-4'-单磷脂A（MPL）和QS-212。使用AS01佐剂的疫苗包括新开发的疟疾疫苗RTS, S（Mosquirix），以及针对带状疱疹（HZ/su）、HIV和结核病的疫苗候选物。AS01可以促进产生抗原特异性抗体和抗原特异性CD4+ T细胞，这与其他佐剂不同。 3.6.其他佐剂 细胞因子——细胞因子是一类在免疫反应中起重要作用的信号分子。它们由免疫系统的各种细胞分泌，并作用于特定受体以介导一系列生物学功能，如炎症、细胞增殖和分化。根据它们的结构和功能，细胞因子可以分为不同的类别，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子。 聚合物——另一方面，聚合物是由共价键连接的重复单元组成的化合物。它们可以是天然的或合成的，在材料科学、医学和生物技术中有广泛的应用。在疫苗方面，聚合物可以用作载体，创建缓慢释放的储库，在其大的交联结构中包含抗原和其他免疫调节剂。这导致持续的抗原呈现和免疫系统的激活，可以导致更强和更持久的免疫反应。 皂苷——皂苷是具有两亲性质的天然化合物，即它们既有亲水区也有疏水区。它们在传统医学中已被使用数百年，并且有许多潜在的药物应用，包括作为疫苗中的佐剂。皂苷可以通过刺激树突状细胞等抗原呈递细胞以及促进细胞因子和趋化因子的产生来增强免疫反应。皂苷基佐剂的一个例子是QS-21，它与MPL（单磷脂A）一起在AS01佐剂系统中使用。AS01是一种有效的佐剂，已用于开发针对疟疾、结核病和带状疱疹等疾病的疫苗。 病毒体——病毒体由磷脂和病毒包膜蛋白组成，通常来源于不引起人类疾病的病毒。病毒包膜蛋白提供了一个免疫原性表面，可以激活免疫系统，而磷脂有助于稳定病毒体结构并增加其被抗原呈递细胞的摄取。 4.各种疫苗及其佐剂的作用 在本节中，我们讨论了佐剂在各种疫苗中的作用。图5总结了目前主要的已确认疫苗和正在开发的方法。这些包括全病毒疫苗（如减毒活病毒、灭活病毒和病毒载体疫苗）、亚单位疫苗和核酸疫苗（包括pDNA和mRNA）。 图5. 各种疫苗及其佐剂的总结 4.1.灭活疫苗 灭活疫苗通常由病毒感染的细胞生产而成，并经过灭活处理，确保病毒不再具有传染性，但保留了其抗原特性，使其能够用于产生免疫反应。可以向灭活疫苗中添加佐剂以增强免疫反应。铝盐，如氢氧化铝和磷酸铝，是灭活疫苗中最常用的佐剂。它们通过将抗原吸附到其表面来增强免疫反应，这允许抗原缓慢释放，并在更长时间内刺激免疫系统。灭活疫苗中使用的其他佐剂包括MF59、AS03和AS04。MF59是一种油包水乳液，通过在注射部位创建抗原库以及刺激先天免疫系统来增强免疫反应。这些佐剂已在H1N1流感疫苗和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗等疫苗中使用。在一项研究中，含铝佐剂的CoronaVac灭活疫苗对SARS-CoV-2显示出高效的中和效果。 4.2.减毒活病毒疫苗 减毒活病毒疫苗由于其在注射后能够在宿主系统中迅速扩增，从而实现有效的免疫接种，已成为一种成功的免疫策略。减毒活病毒疫苗是病毒的减弱形式，能够在体内复制但不会引起疾病。因此，它们能够引发强烈且持久的免疫反应。通常不与减毒活病毒疫苗一起使用佐剂，因为疫苗本身就是一种强烈的免疫刺激剂。然而，一些研究已经探索了在减毒活病毒疫苗中使用佐剂以可能增强其有效性。一个例子是使用油包水乳液MF59作为减毒流感疫苗的佐剂，已被证明可以改善老年人的免疫反应。然而，需要更多的研究来确定佐剂与减毒活病毒疫苗的安全性和有效性。 4.3.病毒载体疫苗 复制能力和非复制能力的腺病毒载体通常被用来表达其他病毒蛋白的抗原以进行免疫接种。可以与病毒载体疫苗一起使用佐剂来增强疫苗产生的免疫反应。例如，牛津-阿斯利康COVID-19疫苗是一种病毒载体疫苗，它使用一种弱化的黑猩猩腺病毒来传递SARS-CoV-2刺突蛋白的遗传物质。这种疫苗含有一种名为AS03的佐剂，这是一种由角鲨烷（一种天然油）、聚山梨醇酯80（一种洗涤剂）和维生素E组成的混合物。 4.4.病毒样颗粒疫苗 在这种策略中，结构病毒蛋白被共同表达以形成非感染性颗粒作为疫苗免疫原。它们类似于真正的病毒颗粒，但缺乏病毒基因组。在细胞中生产VLPs，然后进一步重建为稳定和免疫原性形式，是一个多阶段过程。可以在病毒样颗粒疫苗中使用佐剂来增强免疫反应并提高疫苗效果。病毒样颗粒疫苗中常用的佐剂包括铝盐、MF59（油包水乳液）和CpG寡核苷酸（TLR-9激动剂）。这些佐剂刺激免疫系统对VLP疫苗产生更强大和更持久的反应。在某些情况下，VLP本身可以作为佐剂，因为它已被证明可以通过多种途径刺激免疫系统。总的来说，在VLP疫苗中使用佐剂可以帮助增加其效力，减少所需剂量，并提高疫苗覆盖率。 4.5.DNA疫苗 DNA疫苗使用DNA质粒作为载体，将编码抗原的基因转移到宿主细胞中，特别是抗原呈递细胞。这些疫苗的基本原理依赖于将遗传物质传递到细胞核中，激活载体中的哺乳动物启动子，并通过宿主细胞机制启动目标基因的转录。然而，与其他疫苗类型相比，DNA疫苗通常具有有限的免疫原性，这可能限制了它们的有效性。佐剂可以帮助克服这一限制，通过增强对编码抗原的免疫反应。在DNA疫苗中已测试了各种佐剂，包括铝、CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）和脂质体。铝已被证明可以增强小鼠对DNA疫苗的免疫反应，但在人类试验中的成功有限。CpG ODNs是模拟细菌DNA的合成分子，可以通过与免疫细胞上的Toll样受体（TLRs）相互作用来激活免疫系统。脂质体是小的脂质囊泡，可以包裹DNA和佐剂，并将它们直接传递给抗原呈递细胞。基于脂质体的佐剂在DNA疫苗的临床前研究中显示出前景。 4.6.mRNA疫苗 mRNA疫苗涉及将mRNA分子直接注射到宿主细胞中，然后在细胞质中翻译成目标蛋白。这些疫苗通常包含一个带有3'聚腺苷酸尾部的开放阅读框（ORF），可以刺激细胞和体液免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA疫苗提供了许多优势，如安全性、灵活性、可扩展性和成本效益。mRNA疫苗通常不需要佐剂，因为mRNA分子本身会刺激免疫系统。例如，针对COVID-19的mRNA疫苗使用脂质纳米颗粒传递系统来保护mRNA并促进其进入细胞，但这种传递系统在传统意义上不被视为佐剂。然而，一些研究正在进行中，以探索在mRNA疫苗中使用佐剂以增强其有效性，特别是对于可能对疫苗有较弱免疫反应的某些人群，如老年人。 4.7.基于蛋白质亚单位的疫苗 基于蛋白质亚单位的疫苗只包含来自病原体的特定蛋白质或蛋白质，而不是整个病原体。佐剂通常与基于蛋白质亚单位的疫苗一起使用，以通过增加对蛋白质抗原的免疫反应来增强其有效性。铝盐（如氢氧化铝）是用于基于蛋白质亚单位疫苗的最常用佐剂，因为它们已被证明可以增强对抗原的抗体反应。其他佐剂，如MF59（油包水乳液）、AS03（角鲨烷油包水乳液）和AS04（氢氧化铝和MPL），也已在基于蛋白质亚单位疫苗中使用，以提高其免疫原性。此外，正在研究使用Toll样受体激动剂等新型佐剂与基于蛋白质亚单位疫苗一起使用，以进一步增强其免疫反应。 5.疫苗佐剂的临床试验和许可 开发一种含有佐剂的疫苗是一项艰巨的任务，可能需要数年时间，因为必须确保疫苗的每个组成部分单独和组合时都是兼容的。美国食品和药物管理局下属的生物制品评估和研究中心（CBER）发布了一份指南，以促进新疫苗配方的开发，以应对开发针对传染病疫苗的迫切需求（见图6）。该指南建议从使用适当的动物模型进行临床前测试开始，以评估配方的安全性和免疫原性，包括佐剂对免疫反应的作用。必须包括仅含佐剂和抗原的对照组，以提供佐剂效应的证据。免疫原性评估可能包括体液和细胞反应，如果疾病有动物模型，则可以获得初步的保护效果信息。在临床前测试和疫苗配方的良好生产规范（GMP）生产之后，开始进行人体临床试验。 图6. 疫苗发展的演变阶段 第一阶段研究评估健康个体的安全性和剂量，并获得初步的免疫原性信息。第二阶段a试验涉及数百名志愿者，以评估免疫原性、耐受性和安全性。当测试进入第二阶段b/第三阶段时，重点是确定疫苗目标人群中的免疫原性和效力，随着涉及的志愿者人数增加，研究持续时间也会增加。 在确认疫苗的安全性和效力后，可以对其进行许可和市场推广。然而，配方在第四阶段进行上市后安全性监测，以评估其他罕见的不良反应。这些活动旨在确保根据安全监测结果采取适当的行动。监管机构严格应用药物警戒流程，以评估许可后出现的潜在安全信号。然而，尽管许可后有大量安全信息，但试图建立与疫苗接种的因果关系的评估研究可能是复杂的且结论不一。 曾有疫苗在许可后因证明疫苗与不良事件之间存在因果关系或效力不足而撤回，这改变了风险-效益比。尽管也有例子表明疫苗接种与不良事件之间的所谓因果关系被证明是没有根据的。疫苗制造商和监管机构在安全信号监测或报告新的重要不良事件时采取迅速行动。他们迅速将证据传达给医疗专业人员和公众，以便就当前的风险-效益概况做出明智的决策。 6.疫苗佐剂的临床试验示例 6.1.乳液 MF59是开发疫苗以引发针对HIV的特异性体液和细胞免疫反应的一个例子，这对于预防HIV感染是可取的。在第一阶段临床试验中，研究了使用DNA进行初步免疫，然后用MF59佐剂的重组包膜糖蛋白进行增强的组合疫苗方案，以研究该组合HIV疫苗方案在未感染HIV的成年人中的安全性和免疫反应。此外，灭活流感A/H9N2疫苗有无MF59佐剂在门诊成人中的第二阶段临床试验正在进行，以评估4种不同剂量的纯化单价表面抗原（SA）流感A/H9N2病毒疫苗有无MF59佐剂的安全性，并肌肉注射给门诊成人。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种已在临床研究中调查的水包油乳液佐剂。它们具有不同的油对水比例。Montanide ISA 51已在疟疾疫苗的第一阶段和流感疫苗的第二阶段研究中进行了评估，并已在古巴的肺疗疫苗中获得许可。Montanide ISA 720已在疟疾疫苗的第二阶段临床试验中进行了测试。这两种佐剂都已被证明可以促进有效的免疫反应，特别是增强特定的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，观察到短暂的副作用，如发烧、头痛或类似流感的症状，尽管两者似乎都能很好地耐受。AS03佐剂在赛诺菲H1N1流感疫苗中的使用，在健康成人和老年人群的不同剂量水平下进行，以查看身体对不同强度的H1N1流感疫苗的反应，当它在有无“佐剂”的情况下给予时。这项研究还将比较年龄如何影响身体对H1N1流感疫苗的反应。 6.2.基于铝的佐剂 在第一阶段临床试验中，评估了默克0657nI金黄色葡萄球菌疫苗单剂量的安全性、耐受性和免疫原性，有无默克铝佐剂。此外，还评估了MN重组可溶性gp120/HIV-1（MN rsgp120/HIV-1）与QS21有无铝的安全性和免疫原性的扩展评估，在第一阶段试验中进行了评估。 6.3.基于脂质的佐剂 基于脂质的材料已被用作疫苗佐剂，因为其独特的囊泡结构被发现非常适合包裹各种生物活性物质，如DNA和脂肪酸。在早期，科学家们专注于脂质A，LPS的疏水锚，它被认为是一种有效的佐剂，可以显著增加体液和细胞免疫反应。然而，基于脂质A的佐剂由于其高毒性，被认为不适合人类疫苗。相反，GLA-SE和GLA-AF，都是脂质A类似物，已被发现在增强对H5N1的保护方面特别有效，毒性低，副作用有限。GLA-AF也已作为乳液在许多疫苗中作为替代品进行了测试，最值得注意的是在大流行流感中。 6.4.基于Toll样受体（TLR）激动剂的佐剂 TLR3激动剂Poly-ICLC已在黑色素瘤患者的疫苗佐剂安全性研究中进行了研究。这是一项TLR3激动剂Poly-ICLC作为NY-ESO-1蛋白疫苗佐剂治疗高风险黑色素瘤患者的第一阶段开放标签剂量递增研究。疫苗佐剂治疗的目标是训练内源性免疫系统识别和针对最小残留疾病。 6.5.皂苷 基于皂苷的OPT-821已在三价神经节苷脂中用于临床第三阶段试验中的三阴性肉瘤患者。如果三价疫苗能刺激患者的免疫系统产生抗体，识别并针对GM2、GD2和GM3糖，则患者的抗体可能会攻击并杀死任何剩余的肉瘤细胞，可能防止肉瘤复发。MatrixMTM也在大流行流感和RSV疫苗的第一阶段和第二阶段临床试验中进行了测试，并显示出安全和良好耐受性，增强了体液和细胞免疫反应。其他基于皂苷的佐剂，如QS-21，已在癌症疫苗和传染病疫苗的临床试验中进行了评估，并显示出诱导强烈的免疫反应和提高疫苗效力。然而，它们的复杂结构和可变组成可能会影响它们的一致性和可重复性，它们潜在的毒性和溶血活性需要在dLNs的临床前和临床研究中仔细评估。由MPL和QS-21组成的AS02正在进行疟疾疫苗的第二阶段试验。 6.6.核苷酸 CpG ODN、dsRNA和IL-12 DNA等佐剂成分是激活模式识别受体（PRRs）以刺激免疫反应的核苷酸基佐剂的例子。例如，dsRNA可以分泌IFN-a和IFN-c等细胞因子，通过TLR3、MDA-5和NLRP3炎症体信号传导，目前正在流感和狂犬病疫苗的临床试验中进行。用IL-12 DNA佐剂的DNA疫苗被引入以提供针对广泛HIV变体的高效保护，最近的试验表明它们耐受性良好，可以增强免疫反应。Pika佐剂是另一种核苷酸基佐剂，是dsRNA的合成类似物，用卡那霉素和钙稳定，促进干扰素、IL-2和IL-12的产生。这种佐剂可以将主要产生体液免疫的预防性疫苗转变为具有强大细胞免疫的治疗性疫苗。 6.7.细胞因子 在最近的研究中，分子佐剂已被证明能有效刺激免疫反应，特别是在亚单位疫苗中。例如，IL-2和GM-CSF细胞因子已在针对口蹄疫的疫苗中进行了研究，GM-CSF目前正在乙型肝炎和HIV疫苗中进行评估。其佐剂效应归因于其促进巨噬细胞分化和增殖的能力，以及激活抗原呈递细胞。同样，IL-12和IL-15已被作为HIV疫苗的佐剂在第一阶段临床试验中使用。这些细胞因子已证明能够刺激NK细胞和T细胞增殖。 6.8.病毒体 病毒体是包膜的病毒样颗粒，已在欧洲获得许可，用于针对甲型肝炎和流感的疫苗，并已在恶性疟和慢性丙型肝炎疫苗的临床试验中使用。 6.9.肽 肽，MUC1-poly-ICLC疫苗正在第二阶段试验中进行测试，旨在评估MUC1疫苗在增加患结直肠癌风险的受试者中的抗体和T细胞反应，这些受试者有晚期腺瘤的病史。MUC1-poly-ICLC疫苗正在开发中，以防止息肉发展成结肠癌，并防止息肉复发，这有助于体内免疫系统识别MUC1的变化，这些变化伴随着癌症的进展，并消除产生异常的细胞1。 6.10.其他 其他形式的佐剂也在临床试验中进行调查。一项针对研究性PIKA（基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐剂）狂犬病疫苗的第一阶段临床研究，包括灭活和纯化的狂犬病病毒和PIKA佐剂，是为了评估疫苗组合在健康成年志愿者中的临床安全性，并根据加速疫苗方案评估疫苗的效力。Mayo Clinic与Agri-King Corporation合作开发了一种名为AKSB（Agri-King Synbiotic）的新型合生元。AKSB在65岁以上正常人类志愿者中进行的第一阶段安慰剂对照试验，旨在研究当患者同时接受流感疫苗时这种益生菌的安全性。磷酸钙，以羟基磷灰石的形式，已在法国获得许可，用于白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗。磷酸钙被认为是人体内的天然化合物，并且耐受性良好，使其成为可能替代铝佐剂的潜在替代品，后者可能有不良副作用。作为TLR5配体的细菌鞭毛蛋白也显示出佐剂效应，导致混合的Th1和Th2反应。在临床试验中，一种双价P. aeruginosa鞭毛蛋白佐剂疫苗帮助囊性纤维化患者降低了感染P. aeruginosa的风险。多糖是另一种可能的佐剂，可以增强疫苗的免疫反应，并促进细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。还有一些新型佐剂结合了上述几种佐剂，有效成分协同作用以产生最佳免疫反应。 7.针对COVID-19的疫苗佐剂 COVID-19大流行凸显了需要一种安全有效的疫苗来控制SARS-CoV-2病毒的传播。开发理想的疫苗需要广泛的研究和资源，以确保它满足当前情况的需求。疫苗旨在诱导保护性免疫反应，可以预防或减轻病毒感染的严重程度。 7.1.COVID-19疫苗中佐剂的好处 在COVID-19疫苗中使用佐剂有几个原因/动机：1)一个有效的COVID-19疫苗的主要要求之一是其能够刺激强大的免疫反应，能够产生高水平的中和抗体。为了实现这一点，疫苗可能需要多剂或佐剂。佐剂可以帮助减少疫苗中所需的抗原量，从而降低其成本。2)在SARS-CoV-2疫苗中加入合适的佐剂可以通过减少产生保护性免疫反应所需的抗原量来满足这些要求。疫苗的生产和分配应该是成本效益和可扩展的，以满足压倒性的需求。由于大流行影响了世界上大多数国家，因此迫切需要一种可以快速高效生产和分发的疫苗。3)此外，佐剂还可以通过提供持久的免疫反应和扩大其对不同病毒株的保护范围来增强疫苗的效力。因此，针对COVID-19的佐剂疫苗的研究和开发对于开发一种安全、有效和具有成本效益的疫苗以控制大流行至关重要。 7.2.针对Covid-19的许可佐剂和候选物。 NVX-CoV2373是由Novavax开发的有希望的疫苗候选物，用于预防COVID-19。它是一种基于蛋白质的疫苗，是使用导致COVID-19的SARS-CoV-2病毒的第一株的基因序列创建的。S蛋白是COVID-19疫苗的关键靶点，因为它是病毒附着和感染人类细胞的主要手段。为了增强免疫反应并刺激高水平的中和抗体，NVX-CoV2373与Novavax的专利皂苷基Matrix-M™佐剂配方。这种佐剂经过广泛测试，并已证明通过刺激抗原呈递细胞进入注射部位并在局部淋巴结中增强抗原呈递，从而增强免疫反应，具有强大且耐受良好的效果。这种基于蛋白质的疫苗候选物旨在教会免疫系统如何识别和对抗SARS-CoV-2病毒，提供针对COVID-19的保护。临床试验表明，NVX-CoV2373在预防COVID-19方面非常有效，总体有效率高达90%以上。获批后，NVX-CoV2373在抗击COVID-19中可能发挥关键作用，特别是在其他疫苗可能不太容易获得或有效的地区。世界上已经授权了几种COVID-19疫苗用于紧急使用，其中一些使用了佐剂。例如，AstraZeneca COVID-19疫苗使用MF59佐剂，这是一种角鲨烷油的水包油乳液，以增强疫苗的免疫反应。Sinovac COVID-19疫苗使用铝佐剂，这是一种帮助增强免疫反应的铝盐。 8.新型疫苗佐剂的发展 8.1.新型佐剂的设计原则 为了开发有效的佐剂疫苗，了解佐剂的工作原理并遵循一些设计原则非常重要。问题导向原则涉及考虑四个主要问题：(1)预防特定病原体引起的疾病所需的免疫反应类型，(2)能够诱导所需免疫反应的相关固有免疫细胞，(3)这些固有细胞亚群在体内的定位，以及(4)这些细胞上模式识别受体（PRRs）的表达。基于这些问题，在设计疫苗佐剂时需要考虑四个步骤。首先，应该确定疫苗效力在宿主中所需的免疫效应元素类型。这应该考虑到抗原类型、目标细胞亚群和表型、免疫途径，以指导选择传递系统和免疫刺激剂。由于PRRs是产生有效疫苗生成的关键靶点，因此在设计疫苗佐剂时，评估相关固有免疫细胞在体内的定位和目标细胞上的PRR表达非常重要。不同的PRR信号通路可能被用来开发针对不同侵略的定制响应。其次，合适的疫苗抗原的确定应该基于对免疫识别和保护的分子机制的理解。合适的抗原还应该能够在目标人群中实现疫苗诱导的响应。此外，疫苗必须向适当的细胞群体呈现足够数量的正确构象的抗原，以诱导免疫反应保护，同时考虑诱导的炎症反应的耐受性和安全性。第三，佐剂需要一个传递系统，无论是合成的还是天然的。这需要设计感兴趣的抗原的适当传递方式，结合相关的免疫刺激剂。第四，疫苗和佐剂的制备过程应该简单。例如，如果不需要特殊的乳化剂，生产过程就更加简单。如果佐剂与抗原的比例较低，可能会增加疫苗改进的范围。 8.2.新型疫苗的佐剂配方 已经为已获许可产品中包含的佐剂建立了几种配方方法。这些包括用作吸附剂的不溶性铝盐、易于注射的低油含量、油包水乳液和脂质体传递系统。虽然成分不同，但这些系统有一些显著的相似之处，因为它们都是作为纳米颗粒制造的。此外，这些系统可以作为抗原和免疫增强剂（包括TLR激动剂）的有效“传递系统”。适当选择佐剂的免疫刺激剂和配方组分对于诱导适当的免疫反应以控制目标病原体至关重要。同一免疫调节分子的不同配方可能会诱导大不相同的免疫反应，正如在疟疾疫苗计划中所证明的。例如，用AS02配方的RTS,S疫苗候选物保护了七个疫苗接种者中的六个免受感染，而相同的抗原与AS03或AS04分别只保护了七个中的两个或八个中的一个。为了构建改进的佐剂，确保每个组分都是必要的，并增加明确的价值，同时不引入重大的不合理责任至关重要。AS01目前在获许可产品中包含的最成功的佐剂，对带状疱疹的有效性>97%。AS01佐剂的开发基于两个关键组分，MPL和QS-21，当一起使用时会产生固有激活的协同作用。这种协同作用不能单独使用任一分子实现，并且开发了一种脂质体传递系统，将两种免疫增强剂共同传递给相同的免疫细胞群体。此外，脂质体配方在减少QS-21诱导显著局部和全身反应原性的潜力方面也是有效的。然而，新型系统疫苗学方法可以用来识别新的佐剂途径和配方，这些可以用来设计下一代佐剂。 8.3.推进系统疫苗学 Bali等人提出了一种基于系统疫苗学的跨学科方法，以加速临床中佐剂的发现和开发，该方法涉及早期使用人类研究来生成“组学”数据，这些数据可以用来制定关于候选佐剂如何刺激强大和持久的抗原特异性T和B细胞反应的新假设。然后可以在动物模型中重新测试这些假设，随之而来的机制见解可以用来设计新的佐剂概念。所提出的佐剂开发框架更加强调在它们的发展管道早期进行许多潜在佐剂概念的小型临床试验（0/I期），这可以快速测试新的佐剂并使用系统疫苗学方法获得机制见解。此外，系统疫苗学方法可以用来定义佐剂的作用机制，以及配方的作用基础机制，疫苗接种后不久发生的不良反应的潜在机制，以及疫苗传递的最佳配方的合理设计。总的来说，这种基于系统疫苗学的跨学科方法有潜力转变佐剂科学，并为疫苗中使用的新佐剂的开发注入活力。 8.4.非侵入性疫苗传递 非侵入性疫苗传递研究是一个关键焦点，可能对全球大规模疫苗接种活动产生重大影响。开发安全、有效、低成本的疫苗配方和佐剂，以产生期望的免疫反应和长期免疫，是一个优先事项。广泛的研究已经导致了几种新的佐剂的开发，这些佐剂目前正在临床试验中或已获许可。一个研究领域集中在开发安全并提高非侵入性传递疫苗效力的含脂佐剂。然而，需要更多关于佐剂分子刺激后细胞表面受体之间相互作用的信息，以及这些佐剂与现有或新型配方的兼容性。随着我们对免疫保护所涉及的分子机制的理解提高和合成化学中的新方法的发展，预计疫苗开发将取得突破。新的技术，如新的糖苷共轭方法、反向疫苗学和下一代测序技术，应该能够为带状疱疹病毒、百日咳毒素、莱姆螺旋体病和HPV等疾病带来新的疫苗策略，无论是否使用佐剂。研究界旨在通过引入新的免疫刺激剂和结合效力、持久记忆免疫反应和安全性的新型传递系统，确保高水平的广泛保护。这种新方法将不再仅仅依赖于结构疫苗学，因为目标表位的变异性和新病原体和肿瘤抗原的不断出现。 9.结论和展望 佐剂在疫苗开发中发挥了近一个世纪的关键作用，增强了免疫原性。最初，佐剂的选择主要是经验性的，但最近的进展导致了更有针对性和合理的方法。对免疫系统的更深入理解使更有效的疫苗配方的开发成为可能。本综述概述了疫苗中使用的佐剂，从传统到COVID-19疫苗，重点关注它们的类型、对免疫反应的作用机制，以及它们在疫苗配方中的作用。这些见解为选择适合传统和冠状病毒疫苗的佐剂奠定了基础。 了解各种佐剂对免疫反应的影响、它们与不同类型的抗原和疫苗平台的协同作用，以及对这些佐剂的全面分析，将有助于选择提供必要免疫保护的佐剂。像基于铝的盐、TLR激动剂、乳液和其他新型选择的佐剂具有独特的理化性质，显著影响免疫反应的强度、持续时间和类型。这些新型佐剂已经增强了流感疫苗和乙型肝炎和HPV疫苗。 随着COVID-19等新兴疾病的持续挑战以及寻找更明确的治疗方法，开发安全有效的疫苗至关重要。更有信息的佐剂和抗原选择不仅可以增强对传统疫苗反应不佳的人群的保护，还可以开辟预防应用之外的新途径。这种方法在应对当前和未来的全球健康挑战中可能至关重要。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

关注并星标CPHI制药在线 呼吸道病毒是以呼吸道为侵入门户，在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的一类病毒，主要包括正黏病毒科（流感病毒）、副黏病毒科（副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、人偏肺病毒）、冠状病毒科（SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV冠状病毒）、披膜病毒科（风疹病毒）、小RNA病毒科（鼻病毒）等不同病毒科的多种病毒。呼吸道病毒感染是全球范围内人类发病和死亡的主要原因之一，多数急性呼吸道感染是由病毒引起的。天然药物主要通过直接和间接途径发挥抗呼吸道病毒感染类疾病，直接作用是指抑制病毒的吸附和阻止病毒释放，从而保护机体细胞不受损害，间接作用则是通过免疫调节作用起到抗病毒效果。 1、抑制病毒的吸附和阻止病毒释放 血管紧张素转化酶2 (angio‐tensin-converting enzyme 2，ACE2) 是存在于宿主细胞上的一种受体，新型冠状病毒表面的刺突蛋白可以协助病毒找到宿主细胞上的 ACE2 受体并诱导病毒与受体细胞相结合，吸附宿主细胞，在酶的反应下病毒的包膜与宿主细胞融合进而入侵宿主细胞。研究发现青蒿素及其衍生物可以缠绕新冠病毒刺突蛋白的Lys353和Lys31 结合位点，从而影响其与人体ACE2受体蛋白的融合，从而阻止病毒吸附宿主细胞。高分辨质谱和ACE2生物色谱法筛选确定连花清瘟中的大黄酸、连翘苷A、连翘苷I、新绿原酸及其异构体对ACE2具有高度抑制作用。姜黄素、醉茄素A、胡椒碱、芒果苷、蒂 巴 因、小檗碱、穿心莲内酯和印楝素对SARS-CoV-2 的刺突蛋白和ACE2 受体均具有显著的结合亲和力，可以阻断刺突蛋白与ACE2 受体的结合从而抑制病毒吸附宿主细胞。中药丹参水溶性单体成分丹酚酸可通过阻止刺突蛋白六螺旋束结构形成，有效抑制新型冠状病毒的吸附。 血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒包膜上的2种糖蛋白，在流感病毒入侵宿主细胞及传播的过程中扮演着重要的角色。HA可识别并结合宿主细胞表面的唾液酸受体，使病毒粘附于宿主细胞表面、介导病毒包膜与胞内体膜融合；NA能够水解宿主细胞表面的唾液酸释放新病毒。研究发现，槲皮素可通过与流感病毒血凝素蛋白结合，竞争性抑制流感病毒血凝素与宿主细胞的唾液酸结合，抑制病毒包膜与宿主细胞膜融合，抑制病毒以胞吞形式入侵宿主细胞。发酵人参提取物可通过抑制HA、NA活性对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9病毒起到治疗作用。穿心莲内酯磺化物可通过抑制HA活性实现抗H1N1、H3N2、乙型流感病毒（IBV）的作用。大蒜素可以用作H1N1的NA、HA、M2蛋白通道的有效多靶点抑制剂，黄芩苷可通过抑制病毒的血凝素HA2亚基活性而抑制H5N1禽流感病毒的进入。安石榴苷能抑制流感病毒的神经氨酸酶，阻止唾液酸的分解，阻断病毒释放。诃子酸和诃子林鞣酸可以抑制病毒NA蛋白的活性，破坏病毒与宿主细胞上唾液酸的结合，在感染的细胞中阻止病毒释放。 人呼吸道合胞病毒 (human respiratory syncytial virus，HRSV) 含有三种膜结合蛋白：附着蛋白(G)、融合蛋白(F)、病毒孔蛋白 (SH)。蛋白G可与宿主细胞结合，蛋白F可以融合病毒和细胞膜，使病毒核糖核蛋白能够到达细胞质。三种糖蛋白相互作用使病毒入侵宿主细胞。甘草可通过抑制病毒附着、内化减少HRSV感染，18β-甘草次酸是影响甘草抗HRSV 活性的活性成分之一。穿心莲内酯衍生物可有效抑制HRSV包膜表面糖基蛋白荧光肽的裂解，阻止病毒入侵细胞。车前草醇提液可通过与HRSV竞争结合Hep-2细胞表面的特异性受体抑制HRSV的吸附过程，同时可直接杀死病毒，发挥抗RSV作用。  2、抑制病毒的增殖 病毒感染特定的活细胞后，可以在病毒核酸的控制下，利用宿主细胞的能量系统、核糖体等合成病毒核酸和蛋白质，最后组装成结构完整、具有感染力的成熟病毒颗粒。冠状病毒3C 样蛋白酶(3C-like protease，3CLpro) 与木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease，PLpro) 在病毒增殖过程能够将多肽链切割分解成病毒复制需要的片段。通过研究发现，木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花黄素、紫檀素、蒙花苷、金丝桃苷等通过与3CLpro特异性结合，阻止3CLpro发挥作用。萝卜硫素 (SFN) 是一种缓慢结合的抑制剂，SFN与3CLpro能够发生共价反应， 形成了SFN-3CLpro复合物，从而阻断3CLpro的作用。杨梅素可以与3CLpro共价结合，阻止3CLpro发挥作用，从而抑制病毒的增殖。冬凌草甲素不仅能够抑制3CLpro 的活性，而且在高浓度下可以阻止PLpro主导的反应活动，从而阻止病毒的增殖。新橙皮苷、蛇床子素等与PLpro结合，阻止PLpro发挥作用，从而抑制病毒增殖。西北甘草异黄酮和甘草异黄酮 A可以与RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRp) 结合形成复合物，阻止RdRp发挥作用，从而抑制病毒的增殖。 核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB) 信号通路可以调节流感病毒RNA合成，在病毒的复制过程中发挥重要作用。葡萄红素B能够抑制H1N1病毒在MDCK和A549细胞中的复制，并通过IκB激酶 (IκB kinase，IKK) 去磷 酸化抑制NF-κB 转入细胞核，从而降低了病毒诱导的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的生成。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21可以直接与病毒聚合酶酸性蛋白结合，并通过破坏核糖核蛋白复合物的形成来限制IAV聚合酶活性，从而阻止病毒增殖。 免疫调节        病毒感染机体时，巨噬细胞是防御系统的第一道屏障，产生各种抗病毒因子如白细胞介素IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子TNF⁃α等，介导机体发挥抗病毒免疫应答，进而抑制和清除体内病毒细胞。人参多糖治疗H9N2感染的鸡发现，其胚胎成纤维细胞CEF中MHC Ⅱ基因表达及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10水平升高，表明人参多糖可通过增强体液免疫应答促进机体抗病毒活性。儿茶提取物可增强流感病毒感染小鼠的细胞免疫，还能促进特异性中和抗体产生。干扰素是细胞相互交流以预防和根除病毒感染的一种手段，分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。先天性免疫细胞分泌的以IFN⁃α 与IFN⁃β 为主的Ⅰ型干扰素（IFN）介导的天然免疫机制是宿主细胞抵抗冠状病毒最重要的方式之一。研究报道，黄檗水提物通过诱导Ⅰ型干扰素（IFN⁃β）或促炎性细胞因子（IL-6、TNF⁃α）和随后刺激在宿主细胞中的抗病毒状态， 从而抑制病毒复制， 提高小鼠对甲型流感病毒H1N1、H5N2、H7N3、H9N2的感染存活率。IFN⁃γ 属于Ⅲ型干扰素，主要由Ⅰ型辅助性T细胞（Th1细胞）及自然杀伤细胞产生。研究表明，红参水提物可通过抑制HRSV诱导的小鼠树突状和巨噬细胞样细胞中炎性因子TNF⁃α、IL-6、IL-8表达和人肺上皮细培养液中活性氧的形成，降低肺病毒载量，增强干扰素IFN⁃γ分泌以及增加小鼠 HRSV感染后CD8+T细胞和CD11c+树突状细胞的数量等多种机制发挥抗HRSV作用。此外，红参水提取物可诱导甲型流感病毒H5N1感染的小鼠肺组织IFN⁃α、IFN⁃γ 产生，增强免疫从而减轻H5N1流感病毒的感染。 视黄酸诱导基因1样受体（RLRs）信号通路在抗病毒免疫的过程中发挥着重要作用。当16HBE细胞被H1N1 病毒感染后，炎症因子IL-4、IFN⁃γ、RLRs通路相关因子RIG-Ⅰ、IFN⁃β 启动子刺激物⁃1（IPS-1）、IRF-7、IRF-3、NF⁃κB水平均升高，穿心莲内酯干预后上述因子水平均降低，提示穿心莲内酯可通过降低其信号因子来影响RLRs信号通路。研究发现，连翘酯苷A可通过降低小鼠肺部免疫细胞的RLRs信号通路相关蛋白RIG-Ⅰ、MAVS、NF?κBp65表达，降低Th 1/Th 2和Th 17/Treg比例，从而减轻甲型流感病毒FM1株在小鼠肺部引起的炎症反应。 Toll样受体（TLRs）信号通路也是和呼吸道病毒相关的天然免疫主要信号通路之一， TLRs可以激活 NF⁃κB等转录因子，促进多种与免疫有关的细胞因子及趋化因子的分泌从而引起炎症反应。玉叶金花水提物能抑制感染流感病毒A/FM1/47（H1N1）小鼠血清TNF⁃α、IL⁃6、 IL-1β过表达及肺组织中TLR7、MyD88、NF⁃Κb mRNA及蛋白表达，提示玉叶金花可通过降低TLR7介导的MyD88依赖的信号转导通路活化抑制 NF⁃κB活性，从而减轻炎症风暴， 发挥抗流感病毒作用。研究发现，栀子苷通过影响TLR3/TRIF信号通路，降低炎性细胞因子IL-6、TNF⁃α 表达，促进抗病毒因子IFN⁃β 合成，保护A/FM/1/4（H1N1）建立的流感病毒性肺炎小鼠引起的病毒性肺损伤。黄芩苷可通过抑制TLR4/NF⁃κB信号转导途径，降低下游细胞因子IL-6 水平来发挥抑制 HRSV 感染的作用。 参考文献：       [1]王剑,张萍萍,于健,等.天然药物抗呼吸道病毒活性成分及其作用机制研究进展[J].药学学报,2024,59(04):853-865. [2]杜正彩,郝二伟,韦棪婷,等.中国-东盟传统药用植物抗呼吸道常见病毒研究进展[J].中成药,2022,44(11):3579-3587. 作者简介： 小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。 END 【智药研习社直播预告】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

摘要：mRNA疫苗已被证明是传统疫苗的强大替代品，因为它们具有高效力、安全性和有效性，以及快速的临床开发能力和快速、低成本生产的潜力。这些疫苗已经从一种纯粹的好奇心发展为COVID-19大流行疫苗的领跑者。在纳米技术领域为mRNA疫苗开发输送载体的进步非常重要。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的每一个方面。文章描述了mRNA的结构、其诱导免疫的药理功能、脂质纳米颗粒（LNPs）、以及mRNA疫苗制造的上游、下游和配方过程。此外，还描述了正在进行临床试验的mRNA疫苗。对未来mRNA疫苗的展望，如其冻干、输送系统，以及LNPs靶向抗原呈递细胞和树突细胞，也进行了总结。 1.引言  疫苗接种是预防传染病传播的最有效手段。疫苗对卫生保健系统经济可行性的影响极大，因为它降低了传染病的治疗成本。此外，疫苗还有助于减少疫情爆发的影响和风险。疫苗在公共卫生与安全方面的更广泛作用及其对经济的延伸效应，在COVID-19大流行期间得到了重申和见证。成功的疫苗接种运动已经根除了天花和脊髓灰质炎等致命传染病，并试图应对COVID-19。世界卫生组织估计，疫苗每年可预防因百日咳、破伤风、流感和麻疹引起的200万至300万人死亡。疫苗已经从利用灭活和减毒病原体发展到包含病原体组分的亚单位，以触发免疫反应。疫苗研究的重要里程碑包括重组病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、结合多糖或基于蛋白质的疫苗以及类毒素疫苗的开发。然而，最重要的也是关键的里程碑是mRNA疫苗的开发，因为其在COVID-19大流行中迅速开发和批准，以及其mRNA技术在细胞内产生所需的疫苗抗原。 我们目前正处于mRNA疫苗接种的时代，因为基础研究早在三十年前就已奠定。尽管1990年代早期在动物模型中产生有效的体外转录（IVT）mRNA疫苗的表位呈递是有效的，但mRNA疫苗和治疗并未得到发展，因为直到19世纪末它们才得到验证。在过去的十年中，通过以下方式改善整体mRNA质量的关键技术创新和广泛研究：（i）通过引入加帽、加尾、点突变和有效的纯化技术提高其稳定性，（ii）通过引入脂质纳米颗粒改进mRNA递送，以及（iii）通过引入修饰核苷酸减少其免疫原性，已导致其作为疫苗的广泛使用。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有几个重要优势，包括活病原体、亚单位和基于DNA的疫苗。这些包括（i）安全性，因为mRNA不与宿主DNA整合且无传染性；（ii）有效性，因为mRNA结构的修改可以使疫苗更稳定、有效，并减少免疫原性；（iii）制造和规模化效率，因为mRNA疫苗在无细胞环境中生产，因此允许快速、可扩展且成本效益高的生产。例如，一个5升的生物反应器可以在单一反应中生产出一百万个mRNA疫苗剂量。此外，mRNA疫苗还有编码多个抗原的能力，从而加强针对一些顽固病原体的免疫反应。 当mRNA疫苗由Pfizer–BioNTech为COVID-19大流行开发并获得批准时，这种疫苗技术的有效性得以实现。这些疫苗在世界被SARS-CoV-2病毒感染、导致住院和死亡后不到一年的时间里开发出来，以创纪录的时间开发了Spikevax®（Moderna）和Comirnaty®（Pfizer–BioNTech），并广泛接种给数百万人，帮助控制了COVID-19疫情。 这些疫苗制造商展示的开发、批准和制造能力已经验证了mRNA平台作为一种安全有效的疫苗工具。此外，这也激发了科学界对探索mRNA作为预防性疫苗工具的极大兴趣。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的基础知识，包括其mRNA结构及其药理作用，mRNA结构修改，并解释了mRNA疫苗如何在宿主中引起所需的免疫反应。综述还解释了脂质系统的重要性，如脂质纳米颗粒对mRNA疫苗递送的作用。文章深入探讨了脂质纳米颗粒的结构组成部分及其功能。第二代mRNA疫苗的最新发展以及当前的临床试验也在详细描述。 2.mRNA疫苗的药理学  2.1.mRNA结构  mRNA分子通过细胞质中的核糖体将DNA遗传序列有效地翻译成所需的蛋白质。非复制型mRNA和自扩增RNA是作为潜在疫苗候选抗原正在研究的两种主要类型的mRNA。传统的非复制型mRNA疫苗编码所需的抗原，用于免疫反应，包含50和30非翻译区（UTRs）和开放阅读框（ORF），也称为编码区和聚（A）尾。自扩增mRNA包含所有这些组件，在其ORF中有一个额外的编码区域，该区域编码病毒复制机制，使细胞内RNA连续扩增，随后是扩增的抗原表达。体外转录（IVT）是一种反应，其中包含感兴趣基因的线性化DNA质粒被转录成mRNA序列。 2.2. 5'端帽 mRNA的5'端含有一个7-甲基鸟苷(m7G)基团，紧随其后的是第一个核苷酸的三磷酸基团(m7GpppN)。m7GpppN被称为5'端帽，它是一种保护结构，可以保护RNA不被外切酶切割，调节前mRNA剪接，并启动mRNA的翻译和从细胞核到细胞质的输出。5'端帽对于识别非自身mRNA或外源mRNA与自身mRNA或内源mRNA也至关重要。通过引入许多转录后修饰，可以改善mRNA的效力和稳定性。这些包括在第一个核苷酸(Cap 1, m7GpppN1m)和第二个核苷酸e(Cap 2, m7GpppN1mN2m)的20位的20-O-甲基化。这些5'端帽结构的修饰不仅增加了mRNA的翻译效率，还阻止了内体和细胞质受体的激活，包括RIG-I和MDA5，这些受体是针对病毒mRNA的防御机制。因此，5'端帽结构的20-O-甲基化是提高mRNA转录后蛋白产量并阻止宿主免疫系统对外源性IVT mRNA产生不良免疫反应的非常理想的属性。这种5'端帽可以通过向IVT mRNA反应中添加S-腺苷甲硫氨酸和Cap 0结构来实现，这会产生带有Cap 1结构的IVT mRNA和S-腺苷-L-高半胱氨酸。Cap 1指的是m7GpppNm，其中Nm代表任何具有20 O甲基化的核苷酸。三核苷酸帽类似物也可以用来在共转录反应中制造Cap 1类似物。Ishikawa等人使用m7GpppAG类似物对IVT mRNA进行加帽。这些类似物在IVT反应中允许mRNA在5'端具有m7G基团，而没有反向加帽的5'端mRNA产品。使用A、Am、m6A或m6Am等核苷酸的进一步修饰导致了IVT mRNA特异性的进一步提高。特别是，m7Gpppm6AmG帽在体外转染实验中实现了最大的荧光素酶表达。Sikorski等人比较了改变第一个转录核苷酸如A、m6A、G、C和U以及有无20-O-甲基化在mRNA IVT反应中的效果。他们观察到，携带A、Am或m6Am作为第一个核苷酸的脂质体传递mRNA在荧光素酶表达上更高，而携带G或Gm的IVT mRNA则较低。重要的是，在树突状细胞(DC)系JAWSII中mRNA翻译导致了m6A和m6Am 5'端帽之间8倍的差异。这些发现证明了5'加帽结构对于有效靶向DCs和产生所需的免疫反应的重要性。 2.3. 5'和3'非翻译区(UTRs) 尽管UTRs不会翻译成所需的抗原或蛋白质，但它们参与调节mRNA表达。这些区域位于ORF和mRNA的5'和3'端之间，在mRNA的上游和下游。这些UTR包含与mRNA稳定性以及mRNA的有效和正确翻译相关的调控序列。它们还帮助核糖体识别mRNA，并帮助mRNA的转录后修饰。通过在UTRs中包含顺式调控序列可以改善mRNA的翻译及其半衰期。此外，包括天然发生的序列，如来自α-和β-珠蛋白的序列，已被广泛用于设计疫苗的mRNA构建。Zeng等人基于鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量及其(GC)长度为mRNA疫苗的开发设计了新的5'UTR序列。 2.4. 聚(A)尾 IVT mRNA在其3'端有一个聚腺苷酸部分，称为聚(A)尾。这个聚腺苷酸尾对于决定mRNA的寿命至关重要。哺乳动物细胞中自然发生的mRNA分子的聚(A)尾长度大约为250个核苷酸(nt)，这在mRNA在细胞质中的寿命期间逐渐缩短。由于尾巴大小影响mRNA的降解，因此在生产具有更长半衰期的mRNA疫苗和治疗剂时，加入聚(A)尾是可取的。向聚(A)尾添加大约100个nt可以生产出具有所需延长降解的mRNA。 2.5. 修饰核苷酸 天然mRNA和其他RNA分子包含ATP、CTP、GTP和UTP作为四种基本核苷酸。在mRNA分子的转录后修饰后，一些核苷酸会得到修饰，如伪尿苷和5-甲基胞苷。这些修饰核苷酸可以用于mRNA的体外转录。尽管未修饰的mRNA有其自身的优势，但修饰核苷酸的好处在于它们可以避免IVT mRNA被先天免疫系统识别，从而避免任何不良的免疫反应，并提高mRNA到所需抗原的翻译效率。Andries等人证明，含有N(1)-甲基伪尿苷(m1Ψ)修饰的mRNA在转染到细胞系或小鼠时，与伪尿苷(Ψ)修饰的mRNA平台相比，分别提供了大约44倍和13倍更高的报告基因表达。作者还证明，(m5C/) m1Ψ修饰的mRNA在体外转染后导致细胞内先天免疫原性的降低。这种修饰导致Toll样受体3（TLR3）的控制激活，并启动下游先天免疫信号传导，这是mRNA疫苗的一个理想特性。图1描述了mRNA分子的结构组成部分。 图1. mRNA 分子结构组成 2.6. mRNA疫苗通过先天和适应性免疫刺激 由病原体特异性免疫原（编码病毒蛋白）和佐剂组成的疫苗可以帮助刺激适应性免疫反应。虽然佐剂旨在刺激先天免疫反应并提供T细胞激活的信号，但理想的佐剂应该在不引起全身炎症的情况下刺激先天免疫反应，这可以引起严重的副作用。对于mRNA疫苗，mRNA分子既作为免疫原又作为佐剂，由于mRNA的内在免疫刺激性。一旦肌肉内注射mRNA疫苗，就会通过以下途径潜在地激活适应性免疫系统：（i）转染肌肉细胞和表皮细胞，（ii）转染注射部位的组织驻留免疫细胞，如树突状细胞（DC）、巨噬细胞和郎格汉斯细胞，从而启动T和B细胞的启动，以及（iii）运输到二级淋巴组织，如淋巴结（LNs）和脾脏。图2描述了肌肉内注射的mRNA-LNP疫苗的作用方式。宿主细胞通过各种内体和细胞质先天受体识别单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA），这些受体是人类对外源病毒先天免疫反应的关键部分。Toll样受体（TLR3和TLR7）与内体内的外源ssRNA结合，炎症信号受体包括RIG-I、MDA5、NOD2和PKR与细胞质中的ssRNA和dsRNA结合。这导致细胞激活，并产生I型干扰素和其他多种炎症介质。I型干扰素对细胞翻译有抑制作用，可以抑制mRNA疫苗产生的抗原量。目前可用的mRNA疫苗含有纯化的IVT mRNA，其本质上是单链的，并含有修饰核苷酸。这有助于减少与TLR3和TLR7的结合，以及免疫传感器，因此限制了I型干扰素的过度产生及其对mRNA细胞翻译的抑制作用。mRNA疫苗转染组织驻留的免疫细胞，包括APCs，如DCs和巨噬细胞。 图 2. mRNA 脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）的肌肉内注射部位及其作用方式。mRNA-LNP 疫苗可以转染肌细胞，并转染注射部位附近的组织驻留抗原呈递细胞（APCs）。此外，mRNA-LNP 疫苗可以流入淋巴结（LNs）并转染淋巴结内驻留的细胞，导致 T 细胞和 B 细胞的激活。 mRNA疫苗通过转染非免疫细胞发挥作用，导致所需抗原的产生。这种抗原随后在细胞质中的蛋白酶体中被分解，暴露出抗原表位，与主要组织相容性复合体（MHC）I类形成复合体，呈现给表达CD8+的细胞毒性T细胞。这有助于建立对mRNA表达的抗原的细胞免疫。mRNA疫苗通过转染肌细胞可以激活骨髓来源的树突状细胞（DCs），这有助于CD8+ T细胞的启动。mRNA疫苗还通过转染包括DCs和巨噬细胞在内的组织驻留免疫细胞发挥作用。这在注射部位触发局部免疫反应。免疫细胞的mRNA转染可以导致通过MHC I类途径的抗原呈递，这会导致CD8+ T细胞的成熟。此外，APCs的激活也可以导致MHC II类途径的呈递，从而激活表达CD4的T辅助细胞。在转染局部免疫和非免疫细胞后，一些施用的mRNA疫苗通过淋巴系统排入淋巴结。淋巴结包含单核细胞和原始T和B细胞。淋巴结APCs的转染可以启动T细胞和B细胞的激活。图3描述了mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。 图 3. mRNA-LNP 疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。(1) 体外转录的 mRNA 被包裹进脂质纳米颗粒（LNP）中。(2) 使用 LNP 表面的专用脂质，将 mRNA-LNP 疫苗分子转染到宿主细胞中。(3) mRNA-LNP 的内吞作用。(4) 内吞介导的内化后，mRNA 从内体逃逸到细胞质中。(5) 宿主细胞的核糖体将 mRNA 翻译成细胞内所需的抗原蛋白。(6) 抗原蛋白在细胞外释放，或者被蛋白酶体降解，暴露抗原位点。(7) 主要组织相容性复合体 I（MHC I）将 MHC I 上的表位呈现到细胞膜上进行抗原呈递（APC）。MHC I 将表位呈递给 CD8+ T 细胞。(9) 早期释放的外源蛋白可以通过 MHC II 表位降解并呈递。细胞外抗原可以被 B 细胞识别，导致 B 细胞成熟。 3.mRNA疫苗的药物递送技术  本节可能通过小标题进行划分。它应该提供对实验结果、它们的解释以及可以得出的实验结论的简洁而精确的描述。mRNA疫苗分子体积较大（104-106 Da），带负电荷。它们无法通过细胞膜的磷脂双层。裸露的mRNA会被血液中的核酸酶破坏和降解。此外，裸露的mRNA也会被组织和血清中的免疫细胞附着和吞噬。将mRNA分子递送到细胞内的方法包括基因枪、电穿孔和体外转染等技术。体内递送mRNA的方法涉及使用脂质或转染剂转染免疫或非免疫细胞。 3.1.脂质纳米颗粒（LNPs） 尽管裸露的mRNA、脂质体和多聚体在人类中已显示出临床效果，但LNPs是唯一证明临床效果并获得批准用于人类使用的mRNA疫苗的药物递送系统。针对SARS-CoV-2的COVID-19 mRNA疫苗，由Moderna和Pfizer/BioNTech开发，采用LNPs将mRNA有效载荷递送到体内。LNPs目前是非病毒载体中用于基因治疗的最前沿。当LNP-siRNA治疗药物Onpattro®（patisiran）获得美国FDA批准用于遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性时，首次证明了LNPs的临床效果。LNP配方是最成功、有效和安全的方法，用于递送mRNA疫苗进行人类免疫。LNPs为mRNA递送到作用部位提供了许多优势，包括易于配方和规模化生产、高效的转染能力、低毒性概况、模块化、与不同类型和大小的核酸的兼容性、保护mRNA免受内部降解，并增加mRNA疫苗的半衰期。LNPs通常由四种成分组成：一种可电离的阳离子脂质、一种辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。这些脂质包裹mRNA疫苗的有效载荷，保护核酸核心免受降解。 3.2. 阳离子和可电离脂质 阳离子脂质是最早开发的脂质之一，用于mRNA疫苗递送。这些脂质含有一个季铵氮原子，赋予它们永久的正电荷。这些脂质的正电荷使它们能够与带负电荷的mRNA疫苗形成离子相互作用，形成一种称为脂质复合物的脂质体。DOTMA及其合成类似物DOTAP是1989年首次用于递送mRNA疫苗的阳离子脂质。自那时以来，包括商业上成功并广泛使用的Lipofectin在内的阳离子脂质如DOTMA、DOPE和DOGS已广泛用于mRNA递送。Lipofectin是DOPE和DOTMA的混合物，是最早成功实现mRNA体内翻译的LNP配方之一。 早期的阳离子脂质在体外基因递送方面显示出了希望，但它们在体内效果不佳。氮头基团的正电荷和早期阳离子脂质的非生物可降解性是它们在体外递送和效果不佳的原因。可电离脂质，也称为pH依赖性离子脂质，是第二代阳离子脂质，包含一个在生理pH或低于生理pH时赋予它们正电荷的伯胺。这些脂质在生理pH的血液中具有中性电荷的特性有助于提高它们的安全性，与第一代阳离子脂质相比。它们还延长了LNPs的循环时间，与由阳离子脂质衍生的LNPs相比。这些脂质的开发是为了克服第一代阳离子脂质的缺陷和安全性问题，例如免疫激活和与血清蛋白的相互作用。DLin-MC3-DMA是第一个获得美国FDA批准的离子脂质，用于第一个siRNA药物Onpattro®。DLin-MC3-DMA离子脂质是在对第一代离子脂质DODMA进行一系列修改后合成的。DLinDMA是通过替换DODMA的油酸尾部形成的。与DODMA相比，DLinDMA在体内抵抗呼吸道合胞病毒(RSV)的保护免疫方面表现出更优越的能力。DLinDMA进一步优化为DLinKC2-DMA，再进一步为DLin-MC3-DMA，这取决于一系列基于结构-活性关系的研究。DLin-MC3-DMA被认为是第一代可电离脂质。 DLin-MC3-DMA或MC3具有72小时的长血浆半衰期，增加了siRNA的作用持续时间。后来证明MC3离子脂质在递送mRNA以及siRNA方面也是有效的。MC3唯一的缺点是它的长半衰期(72小时)。这限制了使用MC3的疫苗的长期给药。因此，下一代可电离脂质采用了可生物降解的官能团，可以促进快速清除。引入酯基有助于增加MC3的生物可降解性，并增加了其系统清除率。酯基易于安装在脂质中，可生物降解，化学稳定，可被细胞内酯酶轻易裂解。MC3作为开发可生物降解酯基可电离脂质的重要前体和起点。这些包括Moderna的专有脂质、Acuitas的专有脂质等，还包括YSK12-C4、CL4H6和L319脂质，被认为是第二代可电离脂质。基于酯的可生物降解可电离脂质在基因递送方面比MC3可电离脂质表现出更高的效力。Moderna的脂质5被发现效力是MC3的三倍，Acuitas的脂质，ACL-0315（用于Pfizer/BioNTech COVID-19疫苗的脂质），在向动物递送荧光素酶mRNA方面效力是MC3脂质的六倍US10166298B2。 第三代可电离脂质以优化的方式合成，化学合成步骤有限，这增加了可电离脂质的高通量生产。98N12-5是第三代可电离脂质的第一个例子。对98N12-5脂质的修改和改进导致了包括C12-200和C14-113在内的优越类似物的发明。C14-113脂质可以特异性靶向心肌，从而可以为优化和靶向基因疗法以增强心脏功能开辟新的视野。Li等人报道TT3是一种有效的脂质，用于递送编码CRISPR/Cas9、因子IX和SARS-CoV-2的各种mRNA分子。除了寻找提高效力外，还在进行提高基因递送特异性到特定目标细胞或器官的兴趣。针对免疫细胞以及初级和次级淋巴器官的疫苗和免疫疗法的靶向递送正在迅速进行。一些靶向剂的例子包括含有多环尾部的脂质，包括11-A-M，以及含有环状咪唑头基的脂质，如93-O17S，专门设计用于靶向T细胞。此外，脂质A18-Iso5-2DC18中的环状胺头基已被证明可以结合干扰素基因刺激因子(STING)蛋白。这导致树突状细胞成熟，并通过免疫刺激具有抗肿瘤效果。这对于使用基因疗法的癌症免疫疗法可能是一个有用且理想的特征。利用第三代可电离脂质的基因疗法也显示出对抗多药耐药细菌感染的希望。将抗菌肽和组织蛋白酶B mRNA递送到巨噬细胞的环状维生素C衍生的可电离脂质表明，该疗法可以消除多药耐药细菌，并保护小鼠免受细菌诱导的败血症。LNPs是mRNA最先进的且经临床批准的递送载体。 3.3. PEG-脂质 在成分中，聚乙二醇(PEG)是一种亲水材料，以其在化妆品、食品和制药工业中的广泛应用而闻名。LNPs中的聚乙二醇化脂质组分通常连接到锚定脂质上。发现PEG是LNPs配方中的基本化学物质，可以减少纳米颗粒被过滤器官的摄取，也提高了LNPs在生物流体中的胶体稳定性。因此，LNPs的循环半衰期和体内分布得到了增强。通常，PEG-脂质在LNPs的脂质成分中占最小摩尔百分比（大约1.5%）。然而，它们在影响诸如粒径、多分散性指数、聚集减少、颗粒稳定性改善和封装效率等关键参数方面发挥着非常关键的作用。PEG的分子量和锚定脂质的碳链长度可以被利用来微调循环时间，并通过免疫细胞的摄取，改变效率。此外，LNPs上的PEG-脂质涂层作为防止存储期间自组装和聚集的立体亲水屏障。因此，PEG的存在有助于稳定LNPs并通过限制脂质融合来调节大小。PEG的数量与LNPs的大小成反比；PEG含量越高，LNPs的尺寸越小。通常，PEG的分子量范围在350到3000 Da之间，锚定脂质的碳链在13到18个碳之间。多个文献报告表明，PEG的分子量越高，脂质链越长，纳米颗粒的循环时间就越长，免疫细胞的摄取也越少。随着PEG-脂质从LNP表面解离，它减少了LNP的循环时间，并提供了更多的机会，通过称为“PEG-困境”的效应将mRNA货物传递到目标细胞。在某些情况下，当PEG-脂质的摩尔%保持在1.5%时，体内转染水平被发现与脂质的碳链长度无关。PEG-脂质的一个额外优点在于它们能够将特定配体结合到LNPs上，从而有助于靶向药物递送。 3.4. 辅助脂质 辅助脂质在LNPs配方中的主要功能在于支持其在储存和体内循环过程中的稳定性。从化学角度来看，这些是甘油酯类，并且是非阳离子性质的。在各种辅助脂质中，甾醇和磷脂是最广泛使用的。胆固醇是细胞膜中存在的天然成分。它是一种可交换的基团，可以很容易地在LNP中积累。从一系列的不同研究表明，胆固醇可能存在于表面、脂质双层内部，甚至与其核心中的离子化脂质共轭。它通常被纳入LNP配方中，通过填补脂质间的空隙来维持稳定性。需要胆固醇的存在来调节LNP内部脂质双层基质的密度、摄取和流动性。因此，它通过“凝聚效应”控制膜的刚度和完整性，防止任何泄漏。胆固醇的疏水尾部、甾体环的柔韧性以及羟基的极性被报道影响LNP递送的效力。胆固醇还有助于通过减少表面结合蛋白来提高LNPs的循环半衰期。此外，它通过与LNPs的细胞摄取期间的内体膜融合发挥作用。它在降低从层状相向六角相转变所需的温度中起着至关重要的作用；因此，LNP中的mRNA货物将被递送到细胞质中。磷脂在LNP配方中的包含可以帮助提高封装效率（与胆固醇一起）并增加细胞递送。通常，LNP中的磷脂数量大大减少，同时增加胆固醇含量以延长循环时间。此外，磷脂的包含促进了LNP的包封效率和转染效力。有报道称，增加磷脂的摩尔百分比有助于通过LNPs加速递送效力。这些以Zwitter离子形式存在的磷脂被报道在通过稳定阳离子脂质、mRNA货物和周围水分子之间的静电相互作用中发挥关键作用。然而，磷脂在通过LNPs递送mRNA中的实际作用仍然不明确。因此，进一步探索磷脂在增强颗粒稳定性和体内递送中的实际作用仍然很有趣。图4描述了LNPs的成分，包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 图 4. 脂质纳米颗粒的成分，包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质 3.5. 影响mRNA-LNPs的物理化学性质 LNPs具有许多独特的特性，其中大多数是有益的；讽刺的是，一些特性赋予了一些不希望的毒性。因此，非常关键的是要理解影响装载mRNA的LNP的物理化学性质。 大小和表面积：大小和表面积决定了LNP与生物系统的相互作用过程，以及分布、消除、内吞、降解和响应。减小大小对应于表面积的增加，从而使其对周围生物环境更具反应性。包括内吞作用和细胞摄取在内的基本生物活动大多依赖于颗粒大小。任何大小依赖的毒性都是基于LNPs进入生物系统并修饰大分子的能力，从而改变基本的生物功能。在疫苗的情况下，报告了高效率的递送，同时保持了大约50纳米的粒径，不考虑其化学成分。 电荷：电荷在决定LNPs的生物分布和疗效命运中起着主要作用。载体的电荷对于将mRNA疫苗穿过生物膜非常重要。因此，带负电荷的mRNA可以与带正电荷的阳离子脂质发生静电相互作用，从而实现高效封装。最终，阳离子脂质体与带负电荷的细胞表面和内体膜相互作用，释放mRNA货物。阳离子脂质的pKa（获得正电荷的能力）对递送mRNA货物有显著影响；显然，了解其作用非常重要。尽管，围绕基因递送所需的实际pKa值仍存在一些不确定性。一些报告指出，通过IV途径递送LNPs的理想pKa范围在6.2到6.6之间。电荷调节已经被有效地研究用于减轻毒性表现，同时改善从LNPs中递送mRNA。 形状和结构：形状和内部结构是直接影响细胞摄取和与生物环境相互作用的重要参数。一些报告提到，与其他形状相比，球形纳米颗粒的内吞作用相对容易。或者，非球形纳米颗粒更倾向于通过毛细血管流动。关于形状和结构的作用机制及其在体内的作用至今仍不清楚。由于涉及许多技术挑战，由形状和结构引起的实际作用机制仍然未被广泛探索。因此，需要加快研究步伐，以了解它们在变形膜和治疗效率方面的活动。 表面组成：LNPs的有效递送和生物分布可能受到递送载体表面组成的影响。众所周知的例子包括通过聚乙二醇化（PEGylation）在LNPs表面引入PEG-脂质进行表面修饰。这种聚乙二醇化过程已知能够改变纳米载体的运输，并延长循环半衰期。然而，除了改善生物分布和循环外，聚乙二醇化还可能通过空间位阻减少LNPs的摄取，并限制与血浆膜的相互作用。因此，PEG-脂质会从血清中脱离并缓解空间位阻，以利于内体摄取。 4.mRNA疫苗制造  mRNA疫苗相比传统疫苗展示了多项优势，包括易于开发、易于扩大规模和快速制造。与其它疫苗类似，mRNA疫苗药物产品在制造过程中经历三个典型步骤，即上游生产、下游纯化，以及最终的mRNA药物物质的配方。本节将讨论这些步骤以及每个过程中的较新发展，以简化mRNA疫苗生产。 4.1.上游生产 mRNA疫苗的上游生产包括从含有感兴趣基因的质粒中生成mRNA转录本。这个反应被称为体外转录反应（IVT）。IVT酶促反应依赖于RNA聚合酶，如T7、SP6或T3。RNA聚合酶催化合成目标mRNA，该mRNA来源于含有感兴趣基因的线性化DNA模板。线性化DNA模板是通过限制性内切酶酶切含有感兴趣基因的质粒产生的，或者通过PCR扩增感兴趣基因也可以用来产生mRNA分子。IVT反应的基本酶包括：(i) RNA聚合酶 - 将DNA转换为RNA，(ii)无机焦磷酸酶（IPP） - 提高IVT反应产量，(iii)鸟苷酸转移酶 - 向mRNA的5'端添加GMP核苷酸，(iv)Cap 20-O-甲基转移酶（SAM）- 该酶在mRNA的5'帽的20位置添加甲基，(v) DNase I - 用于去除RNA样品中污染的基因组DNA和IVT反应中DNA模板的降解的内切酶，以及(vi)聚(A)尾聚合酶和(vii)修饰和未修饰的核苷酸三磷酸(NTPs)。这些酶促进了含有感兴趣基因的质粒的mRNA转录本的上游开发。加帽酶包括SAM和鸟苷酸转移酶，它们在mRNA的5'端酶促形成5'帽，而聚(A)尾聚合酶尾部酶形成聚(A)尾。另一种5'加帽方法是使用共转录方法，其中5'帽事先准备好，然后以非酶促方式添加到mRNA上。这种共转录反应可以使用CleanCap®试剂AG进行。 4.2. 下游纯化 mRNA通过上游生产阶段的IVT反应产生；然后在下游处理中通过多个纯化步骤进行分离和纯化。IVT反应混合物包含几种杂质，包括残留的NTPs、酶、错误形成的mRNA和DNA质粒模板。基于实验室规模的IVT mRNA纯化涉及通过DNase酶消化去除DNA的方法，然后是氯化锂(LiCl)沉淀。基于实验室的方法不允许完全去除异常mRNA物种，包括dsRNA和截断的RNA片段。去除这些杂质是获得纯mRNA产品的关键，该产品展示了其预期的效力和安全概况。低效的纯化技术可能导致mRNA疫苗产品具有降低的翻译效率和不必要的免疫刺激性。例如，当通过反向相HPLC纯化修饰的mRNA然后将其传递给树突状细胞之前，观察到mRNA转染和相关蛋白质产量增加了10-1000倍。色谱法是生物制药行业中普遍且广泛接受的用于疫苗和生物药物产品纯化的纯化过程。2004年首次发表的用于大规模核酸纯化的RNA寡核苷酸的程序使用了尺寸排除色谱法(SEC)。SEC有几个优点，包括选择性、可扩展性、多功能性、成本效益以及实现核酸产品的高纯度和产量。然而，SEC不能去除具有相同大小的杂质，如dsDNA。与SEC相比，离子对反向相色谱法(IEC)已被证明是mRNA疫苗的极好纯化技术。IEC可以轻松地将目标mRNA与IVT反应中的杂质分离。这种分离方法依赖于目标mRNA和杂质之间的电荷差异。IEC有几个优点，包括从目标mRNA中分离出更长的RNA转录本、更高的结合能力、成本效益和可扩展性。由于IEC在变性条件下进行，该过程变得复杂且对温度敏感。基于亲和的色谱分离是另一种mRNA纯化方法。脱氧胸腺嘧啶(T)-寡脱氧胸腺嘧啶(dT)是一种捕获mRNA聚(A)尾的序列。含有Oligo dT的色谱珠可以用于mRNA疫苗的下游纯化。切向流过滤(TFF)或核心珠过滤可用于去除小尺寸杂质。作为mRNA疫苗的最终抛光步骤，与连接的交互介质单体(CIM)柱连接的疏水相互作用色谱(HIC)含有OH或SO3配体可以极其有益。 4.3. 配方 作为带负电荷的mRNA分子，应该在基于脂质的药物递送系统中进行配方设计，以避免mRNA降解并提高其转染效率和半衰期。LNPs是最受信赖、最可靠且经美国FDA批准的基于脂质的非病毒载体系统，用于递送mRNA疫苗药物物质。通过将溶解在有机相中的脂质沉淀并与水相中的mRNA混合来形成mRNA LNPs。有机相中最常用的脂质是可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。同时，mRNA溶解在pH 4的柠檬酸或醋酸缓冲液中。将水相和非水相混合使可电离脂质质子化，引起可电离质子化脂质与阴离子mRNA之间的静电吸引。这种相互作用同时与其他脂质的疏水相互作用耦合，并推动mRNA-LNPs自发自组装，将mRNA包裹在纳米颗粒的核心内。这个过程也称为微沉淀。LNP形成后，进行透析以去除非水溶剂（通常是乙醇），并将溶液pH提升至生理pH。微流体混合器能够使LNP形成小尺寸、低多分散指数和高mRNA包封效率。微流体混合是实验室规模和GMP水平mRNA LNP配方最常用的方法。Precision NanoSystems的NanoAssemblr®平台已广泛用于LNP配方开发和在受控环境下的GMP生产。该系统使用错位鲱骨型微混合器（SHM）墨盒结构。SHMs的结构使得两种水相和非水溶剂在微秒内混合。这个时间尺度比脂质聚集所需的时间要小得多；因此，SHMs产生均匀尺寸的小纳米颗粒。NanoAssemblr®的设置可以简单调整流速和水相与非水相的体积，以获得所需尺寸和尺寸分布的LNPs。总流速12-14 mL/min和流速体积比3:1，非水相：水相，通常用于产生小的单分散LNPs。尽管SHMs在高效生产LNPs方面具有多个优点，但由于溶剂不兼容性，它们在GMP生产中的实用性受到限制。SHM及其内部部件长期暴露于含聚二甲基硅氧烷的乙醇中可能导致其变形。在连续的GMP生产运行中更换墨盒变得困难。因此，T型混合器被用于LNP的放大和生产。它们可以产生与SHM相似的LNPs，可以处理更高的流速和体积（60-80 mL/min），并且与乙醇等有机溶剂兼容。图5解释了mRNA疫苗制造的过程。 图 5. mRNA 疫苗制造过程的步骤和阶段。mRNA 疫苗生产可以分为三个阶段：上游 mRNA 制造、下游 mRNA 纯化和 mRNA 脂质纳米颗粒的配方。mRNA 生产可以通过一步共转录反应进行，其中使用加帽试剂，或者通过两步反应进行，其中进行酶促加帽。小规模实验室规模的 mRNA 纯化过程包括 DNase I 消化酶，然后是 mRNA 的 LiCl 沉淀。大规模的 mRNA 纯化涉及利用已建立的色谱方法结合切向流过滤（TFF）。最后，mRNA 疫苗的配方包括将 mRNA 水溶液与非水相的脂质溶液混合。这导致脂质纳米颗粒（LNPs）的自组装，并将带负电的 mRNA 包裹在 LNPs 的核心内。mRNA 和脂质分子在错落有致的鲱鱼骨微型混合器（SHM）中的混合发生在多个周期中，这导致了最终 mRNA-LNP 疫苗的形成。 5.mRNA疫苗在临床试验中  任何疫苗候选物在成功的临床前研究之后和市场推出之前的关键步骤是临床开发。任何mRNA疫苗的临床开发包括一系列临床试验，以评估其在人类中的安全性、免疫原性和有效性。根据患者的群体和试验的目标，它们被归类为1期、2期、3期和4期。1期研究在一小群人类（理想情况下是一个中心）中进行，主要确定疫苗的安全性和药代动力学。2期研究是概念验证研究，主要旨在确认1期研究中获得的结果，并在稍微更多的人类中评估效力。3期研究是确认性研究，在多个中心和广泛的人类群体中进行，以确认疫苗候选物的有效性和安全性。这些研究通常使用活性对照或安慰剂进行。4期研究在疫苗候选物获得市场批准后进行，主要旨在确认疫苗的安全性。每种疫苗候选物在商业推出之前都必须在所有临床研究中经过关键的临床评估。疫苗的开发需要几年时间才能完成。然而，由于COVID-19大流行，Comirnaty（辉瑞）和Spikevax（Moderna）在不到一年的时间内获得了紧急使用授权（EUA）。目前，有各种各样的mRNA疫苗正在进行临床试验，目标是传染病（COVID-19、流感、寨卡病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等）、遗传性疾病和癌症，因为mRNA疫苗能够平衡适应性和先天免疫反应。这些疫苗大多数都是基于脂质体的，并且处于1期和2期临床试验中。此外，约60-70%的正在进行的临床研究是使用基于mRNA的COVID-19疫苗进行的。因此，我们在下面的表1中总结了所有正在进行的非COVID-19 mRNA疫苗的临床试验。如前所述，大多数mRNA疫苗处于临床试验的早期阶段（1期或2期），只有少数基于mRNA的疫苗处于3期开发阶段。下面的部分提供了当前处于3期阶段的疫苗的详细信息。 5.1.mRNA-1345 mRNA-1345是Moderna针对呼吸道合胞病毒（RSV）感染开发的疫苗候选物，它编码一种称为融合前F糖蛋白的RSV蛋白，从而引发有效的中和抗体反应。这种蛋白负责病毒的进入和细胞间的传播，对于RSV感染的传播至关重要。这种疫苗是一种基于脂质纳米颗粒的疫苗，包含优化的蛋白质和密码子序列。美国FDA最近为60岁以上的成年人授予了mRNA-1345的快速通道审查指定。以前为RSV感染开发的几种疫苗在临床试验中失败，原因是免疫反应低。最近，Moderna报告了正在进行的1期研究的中期结果，评估了mRNA-1345在儿童、年轻人、老年人和育龄妇女中的耐受性、反应原性和免疫原性。结果显示，截至数据截止日期，疫苗在试验中的所有剂量水平都得到了良好的耐受。该研究预计将在2023年完成。正在进行的mRNA-1345疫苗2/3期研究（NCT05127434）在60岁及以上的成年人中进行，以评估mRNA-1345疫苗的安全性和耐受性，并证明与安慰剂相比，mRNA-1345疫苗单剂量在预防首次RSV相关下呼吸道感染（RSV-LRTD）方面的效力，从注射后14天开始至12个月。该研究计划在两个安慰剂对照阶段进行，即2期在400至2000名参与者中进行，3期在超过30000名参与者中进行。研究的主要目标是评估疫苗的安全性和效力。安全性终点包括监测参与者发生不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括mRNA-1345疫苗效力（VE）在注射后14天至12个月内预防首次RSV-LRTD发作。这项研究于2021年11月开始，预计将于2024年11月完成NCT05127434。 表 1. 正在进行的 mRNA 疫苗临床试验（不包括 COVID-19 疫苗） 5.2 mRNA-1010 mRNA-1010是由Moderna开发的一种四价流感疫苗候选物，它编码了世界卫生组织建议的四种季节性流感病毒的表面蛋白——血凝素（HA）蛋白，包括季节性流感A/H1N1、A/H3N2以及流感B/Yamagata和B/Victoria谱系。HA被认为是疫苗开发的重要靶点，因为它能产生广泛的抗流感保护，并且是目前可用流感疫苗的主要靶点。mRNA-1010的有效性已在1期和2期研究中进行了评估。2021年12月，Moderna公布了正在进行的1期研究的中期结果，该研究评估了mRNA-1010在年轻人和老年人中的三个剂量（50微克、100微克和200微克）。结果显示，在所有参与者中，所有剂量在接种疫苗后29天成功提高了针对所有菌株的血凝抑制试验几何平均滴度，并且没有显著的安全发现。该公司还确认，正在进行的mRNA-1010的2期研究已达到完全招募，计划在2022年进行中期分析。正在进行的3期对照研究（NCT05415462）旨在评估成人≥18岁的mRNA-1010季节性流感疫苗的免疫原性和安全性。活性对照是任何许可的四价灭活季节性流感疫苗。本研究的主要目标是评估mRNA-1010相对于活性对照针对疫苗匹配的流感A和B株在第29天的体液免疫原性，并评估mRNA-1010的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括第29天的抗血凝素（HA）抗体几何平均滴度（GMT）和达到血清转换的参与者百分比。本研究于2022年6月开始，预计将于2023年8月完成NCT05415462。 5.3 mRNA-1647 mRNA-1647是由Moderna开发的一种针对生育年龄妇女的巨细胞病毒（CMV）感染的疫苗候选物。它由六个mRNA组成，编码CMV表面的两个抗原。五个mRNA编码形成膜结合五聚体复合体的亚单位，而第六个编码全长膜结合糖蛋白B（gB）。mRNA-1647疫苗指导人类细胞制造抗原，产生功能性抗原，模仿CMV在自然感染期间呈现给免疫系统的抗原。迄今为止，mRNA-1647疫苗已在1期和2期研究中进行了评估。这两项研究的中期分析结果积极，并启动了3期研究以确认mRNA-1647的有效性和安全性。这项3期研究（NCT05085366）是一项随机、观察者盲法、安慰剂对照研究，旨在评估16至40岁健康参与者的mRNA-1647疫苗的有效性、安全性和免疫原性。本研究的主要目标是评估CMV血清阴性女性参与者中mRNA 1647疫苗的有效性，并评估所有参与者中mRNA-1647疫苗的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括血清免疫球蛋白G（IgG）对mRNA-1647未编码抗原的阴性至阳性结果的血清转换（时间框架：第三次注射后第197天（第三次注射后28天）至第887天（第三次注射后24个月））。本研究于2021年10月开始，预计将于2025年7月完成NCT05085366。 5.4 mRNA疫苗的临床安全性 任何疫苗候选物在临床开发计划中的早期临床试验的主要目的是评估其在人类群体中的安全性。通过主要监测不良事件、死亡、实验室发现等来评估疫苗的安全性。只有在安全性概况可接受的情况下，才可能获得任何疫苗的市场授权/批准。如果在研究期间和临床开发计划中出现任何不良事件，监管机构/机构伦理委员会（IEC）可以停止临床试验。预计与疫苗候选物相关的不良事件应该能够迅速解决/恢复。即使在疫苗获得市场批准后，申办方也有责任监测其安全性概况。由于核苷的存在，毒性是需要为基于mRNA的疫苗考虑的重要因素之一。据文献报道，一些基于核苷的抗癌药物和抗病毒药物的毒性是由于非天然核苷。特别是针对mRNA疫苗，肝脏毒性是在Crigler-Najjar综合征疫苗开发期间观察到的最常见毒性。这可以归因于用于递送的脂质纳米颗粒配方中的任何有毒辅料的存在。在另一项关于狂犬病的mRNA疫苗研究中，由于mRNA的炎症特性，在临床试验中报告了系统性不良事件。与mRNA疫苗相关的大多数毒性主要是由于配方中使用的辅料或其他在配方开发期间使用的溶剂。通过在安全限制内使用辅料并遵循减少疫苗中残留有毒成分的过程，可以避免这些毒性。未来，预期的mRNA疫苗的毒性包括局部和全身炎症、表达免疫原的生物分布和持久性、刺激自身反应性抗体以及任何非天然核苷酸和递送系统组分的潜在毒性效应。除上述外，这些疫苗还可能引起强烈的I型干扰素反应、水肿（由于细胞外裸露的RNA）、血液凝固和病理性血栓形成。另一方面，已有几种mRNA疫苗获得了全球卫生当局批准用于人类。所有批准的疫苗在临床试验评估期间都显示出可接受的安全性概况。例如，来自Pfizer–BioNTech（Comirnaty）和Moderna（Spikevax）的两种COVID-19 mRNA疫苗已经展示了出色的安全性和有效性概况。总体而言，临床开发中几种基于mRNA的疫苗的安全性概况一直是可接受的（耐受性良好），至今很少有或没有被撤出临床试验的。临床研究期间报告的大多数不良事件包括注射部位反应。所有申办方在疫苗开发期间都应将安全性视为一个重要因素，通过在非临床开发期间进行彻底的毒性测试。非临床研究的观察结果应在临床试验中考虑，并应仔细监测。 6.第二代mRNA疫苗  第二代疫苗是在改进了第一代mRNA疫苗的一些低效问题并增强了安全性、有效性、储存和处理之后开发的。这些改变包括使疫苗在室温下稳定，减少对冷链储存和运输的需求，同时保持相同的有效性和安全性。其他改变包括寻找更强大和靶向配体的纳米载体，这些载体可以有更好的安全性和mRNA递送效率概况。此外，正在进行大量研究，探索各种RNA基分子作为疫苗的使用，包括自扩增RNA。本节重点介绍预计将在未来开发的第二代mRNA疫苗。 6.1. 冻干mRNA脂质纳米颗粒 通常，mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗必须在零下温度下储存以保持稳定性和有效性。疫苗的冷链运输限制了低收入和新兴经济体国家获得疫苗的机会。长期稳定性是LNPs开发的主要问题之一，因为在水溶液中储存LNPs时观察到物理和化学不稳定性。化学降解涉及mRNA分子中键的改变。物理降解包括变性/聚集（二级和三级结构的丧失）、融合和封装mRNA的泄漏。mRNA的化学降解主要通过水解和氧化发生。LNPs中脂质的降解也导致水解和氧化。水解主要发生在mRNA分子的主链——磷酸二酯键上。另一方面，氧化影响mRNA的核苷酸碱基和糖基团。氧化导致mRNA链断裂、碱基断裂和二级结构改变，这可以阻止体内抗原的翻译。此外，LNPs储存过程中的脂质结晶和脂质多态转变导致药物泄漏或排斥。储存条件是强烈影响mRNA-LNP疫苗稳定性的一个关键参数。mRNA-LNPs的长期储存尚未完全探索。在长时间储存期间，mRNA-LNPs可能会经历结构变化。因此，了解在储存期间对它施加了哪些变化以获得稳定的mRNA-LNP至关重要。由于mRNA-LNPs中的降解反应是由水的存在引发的，冻干是一种广泛使用的干燥技术，用于包括mRNA-LNPs在内的纳米颗粒的长期储存。在冻干的蛋糕或粉末形式下，mRNA-LNP疫苗可以方便地在全球运输，而不需要冷冻储存。 冻干过程分为三个阶段：冷冻、一次干燥和二次干燥。在冷冻过程中，水被冻结成冰晶，而溶质材料被排除在冷冻浓缩相中。一次和二次干燥过程都是在真空下进行的。一次干燥步骤在低温下进行，此阶段通过升华过程去除冻结的水。在二次干燥步骤中，温度升高以通过解吸机制去除未冻结的水。冻干过程的详细信息在其他研究中讨论。 由于mRNA-LPN疫苗是由特定类型的脂质在一定浓度下制备的，因此在冻干及随后的储存过程中保留物理化学参数（如粒径、多分散性和封装效率）非常重要。因此，仔细选择冻干过程参数、缓冲液和冷冻保护剂和冻干保护剂至关重要，以确保稳定效果。在一项研究中，Shirane等人在形成LNPs后冻干了含有siRNA-LNP的乙醇分散液。结果表明，新鲜制备（传统）和重新配制的冻干配方之间的体内基因敲低效率没有差异，证明了mRNA-LNPs冻干的可行性。在冻干过程中的冷冻和干燥步骤中，封装在LNP中的mRNA可能会暴露于不同的压力下，这最终会影响mRNA-LNP的稳定性。因此，在配方中使用冷冻保护剂非常重要，并且稳定LNPs的最佳冷冻保护剂取决于材料和配方类型。 Zhao等人确定了类似脂质纳米颗粒（LLNs）的mRNA的最佳储存条件。LLNs是使用可电离脂质、N1、N3、N5-三(3-(二十二烷氨基)丙基)苯-1,3,5-三羧酰胺衍生物、TT3制备的。筛选并评估了冷冻保护剂（海藻糖、葡萄糖和甘露醇）的类型和物理状态条件（如液态、冷冻或冻干）对纳米颗粒大小和体外及体内mRNA表达等属性的影响。在水性条件下，LLNmRNA没有保持长期储存稳定性。在最佳浓度下添加冷冻保护剂有助于保持冻干LLNs中mRNA的体外表达效率。然而，在冻干和重组过程中，LLN-mRNA的纳米结构发生了变化，这影响了mRNA-LLNs与血清蛋白的体内相互作用，导致不同的体内效率。在液氮中冷冻mRNA的LLNs，加入5%的蔗糖或海藻糖被认为是长期储存的最佳选择。 Hong等人使用阳离子脂质基递送系统开发了一种可冻干的SARS-CoV-2疫苗。重组疫苗在小鼠中诱导了针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应，证明了冻干后SARS-CoV-2的免疫原性和中和抗体活性。 在冷冻过程中的各种压力可能会影响LPNs的稳定性，包括晶体形成、界面效应、冻浓、缓冲液pH变化和相分离。冷冻过程中的晶体形成会施加一个冰-液界面，这可能导致胶体结构的吸附和损伤，包括mRNA的蛋白质分子。冷冻增加了剩余液相中溶质材料的浓度，促进了粒子-粒子相互作用，并导致粒子聚集。冻浓增加了对脂质双层的渗透压，给膜带来物理压力并导致膜破裂。此外，渗透稳定性取决于脂质膜组成，因为溶质的选择性渗透性。关于冷冻和干燥引起的压力的详细信息在其他研究中进行了讨论。 在一项研究中，Jones等人检查了冻干对mRNA完整性的影响。将25 µg/mL的纯化RNA在水或10%海藻糖中冻干，储存在-70°C、-20°C、4°C、37°C或室温下，在氮气下储存长达10个月，并分析RNA的完整性。在水中冻干的RNA恢复率在66%到零之间变化，而冻干在10%海藻糖中的RNA在所有时间点都显示出高一致性的恢复，允许在4°C下储存RNA长达10个月。这允许即使在发展中国家也可以开发RNA疫苗。 Muramatsu等人证明，修饰核苷的mRNA-LNPs可以冻干，并且mRNA LNPs的物理化学属性（粒径、封装效率）在环境温度下12周和至少在4°C下储存24周后没有显著变化。然而，在4°C和25°C储存时，冻干的修饰核苷mRNA-LNPs的RNA完整性分别观察到10-15%和30%的下降。此外，在小鼠中进行的体内生物发光成像研究表明，冻干的萤火虫荧光素编码mRNA-LNPs保持其高表达，没有失去其高翻译性。在比较小鼠免疫研究中，作者证明冻干的修饰核苷mRNA LNP流感病毒疫苗在室温储存12周后或在4°C储存至少24周后仍保持其效力。 水分替代假说和小分子玻璃化是冷冻保护剂（糖）在冻干过程中稳定生物系统的两种机制。作为冻干保护剂的海藻糖被报道在冻干过程和随后在-80°C、5°C、25°C和40°C储存期间都能稳定mRNA-鱼精蛋白复合物配方。在储存期间分析的质量属性，包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压，都满足了稳定和安全RNA药物所需的稳定性规格（WO2016165831A1）。 蔗糖似乎也是稳定LNPs成分之一的可裂解质子激活脂质材料（ssPalm）的合适冷冻保护剂。通常，在冷冻过程中，相互混溶性较差的分子会导致相分离，颗粒将通过相互碰撞发生聚集/聚合。蔗糖与含有接枝聚乙二醇（PEG）聚合物的LNP表面具有高混溶性。蔗糖与LNP表面PEG层之间的优先相互作用通过展示冷冻保护属性来稳定颗粒。 糖与磷脂头基之间的相互作用降低了干燥状态下脂质膜的熔化温度。糖减少了磷脂的酰链之间的范德华相互作用，并保持了头基间距。因此，糖减少了水与磷脂之间的相互作用，然后取代了水。 在无水条件下，糖是水的良好替代品。糖与脂质双层表面的脂质形成多个氢键，而不改变脂质双层结构。糖可以同时与不同的脂质相互作用，与磷脂极性基团（P=O和/或C=O）以及脂质胆碱部分的甲基基团相互作用。在玻璃化过程中，糖溶液在冷冻过程中变得冻浓，在去除水分后形成稳定的玻璃基质，导致冻干蛋糕被困在糖的玻璃基质中。具有低流动性和高粘度的玻璃基质保护脂质双层免受冰晶引起的损伤。此外，糖玻璃基质抑制了脂质相变介导的构象变化。渗透和体积效应是玻璃化期间两个关键属性，通过防止脂质膜聚集时相邻双层的紧密接触，从而减少机械应力。冻干技术的进展，包括使用SMART冻干进行量热温度测量和用于监测关键过程参数的过程分析技术，有助于满足mRNA-LNP疫苗更好的储存要求。 6.2.聚合物纳米载体 通常，与基于脂质的载体类似，用于mRNA递送的聚合物载体利用电静吸引力（聚合物的正电荷和mRNA的负电荷之间）进行mRNA多聚体的自组装。与基于脂质的系统相比，mRNA多聚体形成更坚硬的超分子结构，具有高分子量和较慢的聚合物链流动性，提供了卓越的稳定性。 Palamà等人通过乳液-扩散-蒸发方法开发了聚(ε-己内酯)纳米颗粒，用于细胞内递送GFP（绿色荧光蛋白）-mRNA。在颗粒组装之前形成鱼精蛋白-mRNA复合物，以获得更好的稳定性、控制释放和更高的mRNA装载量。具有核壳结构的纳米颗粒有一个被聚(ε-己内酯)层覆盖的mRNA内核，提供了更大的稳定性和隐身属性。作者指出，聚(ε-己内酯)纳米颗粒有潜力解决mRNA不稳定问题。mRNA递送的聚合物载体一直在与细胞毒性斗争，部分原因是聚合物的阳离子电荷。用聚乙二醇链修饰阳离子电荷聚合物可以改善体外和体内的货物递送并减轻细胞毒性。此外，聚合物载体的固有异质性和它们相对较低的基因转移效率限制了聚合物mRNA疫苗的临床转化和大规模生产。由于患者依从性和较少侵入性的疫苗接种，利用支架的mRNA疫苗递送已经被开发。Yan等人报告了一种可注射的壳聚糖海藻酸盐凝胶支架用于mRNA疫苗递送。通过单链mRNA与脂质体载体纳米颗粒的复合形成脂质复合体复合体。然后将mRNA脂质复合体装载到冻干的壳聚糖-海藻酸盐支架上，随后进行再水化步骤。此外，还确定了凝胶中mRNA的释放动力学和凝胶-mRNA的免疫效率。结果表明，基于支架的mRNA疫苗递送可能是传统免疫方法的潜在替代品。 聚乙烯亚胺已广泛用于mRNA疫苗递送。聚乙烯亚胺结构的优化提供了高基因转染效率。聚乙烯亚胺的属性，如在广泛的pH范围内的缓冲容量和在低pH下氨基酸基团的更高质子化比例，有助于核酸复合物的形成。尽管效果出色，但聚乙烯亚胺的应用受到其毒性和与带负电荷的血清蛋白的相互作用行为的限制，这导致蛋白质聚集。将PEG纳入配方、使用低分子量聚合物形式（大约2kDa的聚乙烯亚胺）、与环糊精共轭和二硫键连接是一些可以减轻聚乙烯亚胺毒性的策略。 低分子量聚乙烯亚胺（2k）已被用于递送HIV-gag mRNA至树突状细胞和BALB/c小鼠。在体内皮下注射后，形成的mRNA-低分子量聚乙烯亚胺复合物有潜力诱导抗原特异性免疫反应。基于2kDa聚乙烯亚胺的mRNA疫苗的鼻内给药成功递送了编码HIV gp120抗原的mRNA并诱导了系统性免疫反应。通过与几种环糊精复合来修改聚乙烯亚胺的化学结构，已被研究以确定聚乙烯亚胺的化学结构对mRNA递送到目标部位（淋巴结）及随后的免疫反应的影响。Tan等人合成了β-环糊精（β-CD）和支链聚乙烯亚胺（2kDa）共轭物，用于mRNA疫苗的递送。形成的复合物有效地封装了mRNA，并通过穿过质膜和从内体逃逸提供了高转染效率。 除了聚乙烯亚胺，其他聚合物载体，如聚(-氨基酯)、壳聚糖、聚酰胺胺和聚(2-丙基丙烯酸)，也已被研究用于mRNA递送。聚(-氨基酯)是一种生物可降解的聚合物，由于其外围高度的胺基密度，通过形成高度分支的树状球形树状大分子，有效地形成mRNA复合物。基于壳聚糖(CS)的核酸(mRNA)递送纳米颗粒之前已有研究。然而，它们有限的逃离内体的能力阻碍了mRNA的递送。壳聚糖是一种从几丁质衍生的生物相容性阳离子生物聚合物，与核酸通过静电力相互作用，并且可以接受化学修饰。电荷密度或脱乙酰度、分子量和胺基-磷酸盐比率(N:P)是壳聚糖参数，这些可以影响基于SiRNA-CS系统的转染效率。通过硫酸透明质酸包覆和添加海藻糖，CS-mRNA纳米颗粒的生物活性提高了4-10倍。尽管壳聚糖纳米颗粒的体外和体内递送是有效的，但与用于递送mRNA的脂质纳米颗粒相比，它们的胶体稳定性和内体逃逸潜力较差。聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子是高度分支的(甲基丙烯酸和乙二胺，并以胺基和羧酸末端基团结束)阳离子聚合物，具有生物相容性，允许与核酸包埋。Chahal等人为RNA疫苗递送开发了体外转录的传统未修饰mRNA和修饰PAMAM树状大分子纳米颗粒(MDNP)。修饰的树状大分子纳米颗粒可以通过在小鼠中提供多种抗原，对包括H1N1流感病毒和埃博拉病毒在内的广泛致命病原体提供保护性免疫。 聚(ε-己内酯)是一种吸引人的聚合物，用于mRNA应用，已获得食品药品监督管理局(FDA)的批准。由聚(ε-己内酯)组成的纳米颗粒具有低体外和体内毒性、在生物流体中高胶体稳定性、封装货物的控制释放行为，以及通过内吞作用实现的卓越细胞摄取。已采用生物可降解聚合物如聚葡萄糖(一种葡萄糖聚合物)和精胺(一种存在于所有生物体中的多胺)用于递送mRNA疫苗。在电荷比为5:1的情况下，聚葡萄糖:精胺共轭物与编码SARS-CoV-2 RBD抗原的mRNA自组装，保护了封装的mRNA不被核酸酶降解，允许在4°C下以冻干形式储存而不失核酸活性，这对于疫苗储存和运输是一个重要考虑因素。 E. Jeandupeux等人研究了将聚(2-丙基丙烯酸)PPAA纳入壳聚糖mRNA纳米颗粒，以提高生物活性并促进内体逃逸。PPAA是一种在酸性pH下具有膜溶解性质的阴离子聚合物。三元(CS/mRNA/PPAA)纳米颗粒对粒径、多分散指数、z-电位和体外转染效率进行了评估。与生物活性仅为75%的脂质对照(LipofectamineTM MessengerMaxTM (LP-MM) mRNA脂质纳米颗粒)相比，三元纳米颗粒在pH 6.5时显示出86%的表达水平，且未显示出任何代谢毒性。假设PPAA通过增加内体释放或降低CS/mRNA复合物稳定性来增强生物活性。尽管越来越多的研究表明使用各种聚合物载体进行mRNA递送，但值得注意的是，目前还没有全面比较研究可以指导使用聚合物载体有效递送mRNA疫苗的理想配方。 6.3.佐剂纳入脂质纳米颗粒 为了通过激活细胞特异性受体来增强免疫反应，从而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它们与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 肽也作为佐剂纳入脂质纳米颗粒。Xiang等人合成了靶向淋巴结的蜂毒肽-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离蜂毒肽相比，α-蜂毒肽-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面显示出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-蜂毒肽的良好稳定性和无副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导全身抗肿瘤反应。在一些研究中，来自细菌的单磷酸脂质作为佐剂被纳入。Ravindran等人通过将可溶性利什曼抗原(SLA)与佐剂单磷酸脂质-海藻糖二硬脂酸肌醇酸盐结合，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与未加佐剂的对照组相比，加佐剂的脂质体制剂在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对利什曼原虫的保护水平显著更高。即使在接种疫苗四个月后，包括诱导IFN-γ和Ig2a抗体在内的细胞免疫反应也很明显，这为所开发配方能够提供长期免疫提供了潜在证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中并增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被称为病原体相关分子模式(PAMPs)的分子组，能够被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特异性识别。佐剂通过TLR-9信号通路发挥作用，从初步数据中可以看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮的诱导和内体成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将一种名为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。可电离脂质已成为mRNA递送的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易地将mRNAs纳入，以生产具有高封装效率特征的脂质纳米颗粒。制定的纳米颗粒显示出成功表达肿瘤抗原，最终导致免疫反应的刺激。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为通过mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了通过在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白质亚单位疫苗，可以增强其效力，这归因于诱导T滤泡辅助细胞和激活体液反应。发现纳入可电离脂质组分在引发免疫反应中至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，被发现比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用使核酸结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒的纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤功效的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号通路。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内功效的估计显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗接种后免疫反应的增强。在脂质纳米颗粒中配制修饰核苷的mRNA已被证明是针对传染病的有效免疫方式。已经确定，在针对艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清HIV-1结合抗体的高滴度。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单一或多组分疫苗方面具有有希望的潜力。 6.4.靶向抗原呈递细胞 脂质纳米颗粒因其多功能特性，如生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性，正在成为疫苗递送的极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和Pfizer–BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为一种临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取有限。为了增强免疫反应，通过激活细胞特异性受体进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 肽也被作为佐剂纳入脂质纳米颗粒。Xiang等人合成了靶向淋巴结的蜂毒肽-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离蜂毒肽相比，α-蜂毒肽-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面显示出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-蜂毒肽的良好稳定性和无副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导全身抗肿瘤反应。在一些研究中，来自细菌的单磷酸脂质被作为佐剂纳入。Ravindran等人通过将可溶性利什曼抗原(SLA)与佐剂单磷酸脂质-海藻糖二硬脂酸肌醇酸盐结合，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。加佐剂的脂质体制剂在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对利什曼原虫的保护水平显著更高。即使在接种疫苗四个月后，包括诱导IFN-γ和Ig2a抗体在内的细胞免疫反应也很明显，这为所开发配方能够提供长期免疫提供了潜在证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被称为病原体相关分子模式(PAMPs)的分子组，能够被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特异性识别。佐剂通过TLR-9信号通路发挥作用，从初步数据中可以看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮的诱导和内体成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将一种名为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。可电离脂质已成为mRNA递送的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易地将mRNAs纳入，以生产具有高封装效率特征的脂质纳米颗粒。制定的纳米颗粒显示出成功表达肿瘤抗原，最终导致免疫反应的刺激。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为通过mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了通过在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白质亚单位疫苗，可以增强其效力，这归因于诱导T滤泡辅助细胞和激活体液反应。发现纳入可电离脂质组分在引发免疫反应中至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 6.5.自扩增mRNA疫苗 脂质纳米颗粒由于其多功能特性，如生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性，正在成为疫苗递送的极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和Pfizer-BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为一种临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取有限。为了增强免疫反应，通过激活细胞特异性受体进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制有关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强效细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的Toll样受体(TLRs)是佐剂开发的主要靶点，因为它们能够在激活后增强细胞因子的产生。这反过来触发免疫系统，从而增强疫苗的效力。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，被发现比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用使核酸结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒的纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤功效的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号通路。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内功效的估计显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗接种后免疫反应的增强。在脂质纳米颗粒中配制修饰核苷的mRNA已被证明是针对传染病的有效免疫方式。已经确定，在针对艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清HIV-1结合抗体的高滴度。对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单一或多组分疫苗方面具有有希望的潜力。 7.mRNA疫苗的缺点  7.1.抗体反应的持续时间  mRNA疫苗接种后产生的抗原被抗原呈递细胞(APCs)摄取并运输到淋巴结。在这里，B细胞、APCs和滤泡辅助T细胞(TFH细胞)之间的相互作用促进了生发中心的形成。然后B细胞在生发中心增殖并分化和突变，产生针对病原体的高亲和力中和抗体。这一串生化免疫反应对于持久抗体至关重要，这对应于对传染病的长期作用。几种有前景的mRNA疫苗正在开发中，它们具有积极针对APCs的有前景的策略。针对LNPs与APC细胞特异性配体、单克隆抗体(mAbs)和肽的靶向是一些正在探索的策略，以增加mRNA疫苗产生的免疫反应。此外，通过延长抗原性mRNA的翻译来改变mRNA疫苗的药代动力学特性，现在已成为增强抗体反应的有前途的工具。mRNA疫苗在针对HIV-1、SARS-CoV-2、寨卡病毒和流感病毒的临床前研究中，已引发强大的生发中心免疫原反应和TFH细胞诱导。尽管这些结果是有希望的，但抗体反应的持续时间是一个复杂的现象，这将在抗原与抗原之间大不相同。此外，评估mRNA疫苗的免疫反应持续时间需要更长期的数据才能全面了解。 7.2.安全性 总体而言，目前的mRNA疫苗在临床试验和批准后的实际人口数据中展示了有希望的安全性概况。这些疫苗只有轻度或中度不良事件，如临床试验中所见。然而，也有一些零星的安全事件需要进一步优化mRNA疫苗及其所有组分。例如，CureVac基于精氨酸的狂犬病疫苗CV7201，在78%的参与者中引起不良反应。这导致CureVac采用LNPs作为他们下一个狂犬病候选物CV7202的主要和首选递送载体。像大多数药物一样，mRNA疫苗的不良反应通常随着剂量的增加而增加和升级。例如，在Moderna的流感H10N8疫苗的I期试验中，从400 µg开始观察到不良事件。因此，他们继续使用高达100 µg的较低剂量。在CV7202的I期试验中，5 µg剂量具有高度的反应原性；因此，1 µg是给受试者施用的最高剂量。 在每百万COVID-19疫苗接种中，轻度过敏反应的发生率分别为4.7例，Moderna疫苗为2.5例，Pfizer–BioNTech疫苗为2.2例。这比传统疫苗通常所见的要高得多。科学家提出，这种过敏反应可以归因于患者对LNPs中使用的聚乙二醇化脂质的预先存在的抗体。这些抗体可以在体内形成，以响应许多消费品中存在的聚乙二醇，如牙膏和洗发水。尽管聚乙二醇是安全的，但据传它以T细胞独立的方式在一部分人群中激活体液免疫。它通过直接交联B细胞受体并引入IgM的产生来实现这一点。据报道，40%的人群中存在抗聚乙二醇抗体，这可能会加速并增加过敏反应的风险，并妨碍疫苗效力。疾病控制和预防中心建议，mRNA疫苗不应给予对Pfizer–BioNTech或Moderna疫苗有过敏反应历史的人接种。由于mRNA疫苗配方的一些组分可能会在一部分人口中引起过敏反应，因此应该重新设计配方组分，以提高安全性。 7.3.孕产妇/新生儿疫苗接种 怀孕期间和婴儿新生儿阶段的免疫系统是高度动态和不断发展的，这可能会增加一个人对传染病的易感性。寨卡病毒可以感染发育中的胎儿的皮层神经元和神经胶质细胞，导致细胞死亡、神经炎症和严重的先天性胎儿畸形。巨细胞病毒感染可能导致大约1%的妊娠并发症，导致婴儿的先天性残疾，以及神经功能损害。也有报道称SARS-CoV-2病毒极为罕见地在子宫内传播。其对孕产妇和新生儿健康的影响正在调查中。为了解决这些缺点，孕产妇疫苗接种已成为提高孕产妇健康和减少新生儿发病率负担的工具。孕产妇IgG抗体可以很容易地通过与新生儿结晶片段(Fc)受体结合并进入胎儿循环来穿过胎盘屏障。这保护了胎儿免受病原体和其他传染病的侵害。几项临床前研究表明，孕产妇用mRNA-LNPs疫苗接种可以防止寨卡病毒传播到怀孕小鼠的胎儿，在A组和B组链球菌，并保护小鼠新生儿免受疱疹病毒的侵害。 7.4. 老年人疫苗接种 预计到2050年，世界60岁以上人口比例将从12%翻倍至22%。这一人群迫切需要疫苗，因为许多传染病对老年人的影响格外严重。例如，70-90%的流感相关死亡发生在65岁以上的人群中，COVID-19在65岁以上患者中的致死率比年轻患者显著高出65倍。老年人群体通过疫苗接种获得免疫更加困难，因为年龄对先天和适应性免疫系统产生不利影响。感染后产生的适应性免疫反应通常因细胞因子信号传导受损以及生理和细胞变化而不足。这些变化可能包括较少的初始B细胞和T细胞、T细胞凋亡的易感性增加、T细胞受体多样性减少，以及关键受体如细胞毒性CD8+ T细胞上的CD28表达降低。 mRNA疫苗可能是提升老年人免疫力的解决方案。这些疫苗可能为所有年龄组，特别是老年人提供强大的效力，正如Pfizer–BioNTech疫苗候选物BNT162b2的III期试验所见。该疫苗在所有按年龄明确定义的治疗组中激发了超过93%的效力。同样，Moderna疫苗mRNA-1273也非常有效，在65岁以上的志愿者中显示了86.4%的效力，与18-65岁年龄组的95.6%效力相比。设计有效的药物递送系统对于提高老年人的疫苗效力至关重要。mRNA递送载体作为佐剂，通过增强APC对注射部位的招募来放大疫苗反应。例如，诺华的油包水乳液MF59已被用作mRNA递送载体，并可用作佐剂。MF59增强了流感疫苗的免疫反应，并已获准用于老年人。在老年人群体中，用MF59佐剂的流感疫苗增强了血清转换率和血清保护率，与未加佐剂的疫苗相比。 7.5.疫苗接受度 只有当疫苗被接种，并且公众对疫苗的有效性有满意的接受度和信念时，疫苗才会有效。然而，由错误信息引发的公众怀疑威胁到群体免疫的实现和维持，使最脆弱的群体，如老年人和儿童，面临风险。疫苗覆盖率和接种率的下降可能导致本已根除的危及生命的疾病的重新出现。例如，麻疹在2000年已在美国完全根除，但由于较差的疫苗接受度，在2019年感染了超过1200人。对于COVID-19，由于信息的广泛可用性和大规模的意识，全球疫苗接受率在55%到90%之间。目前美国接受率在56-75%之间，这可能不足以维持对SARS-CoV-2的群体免疫阈值。此外，在美国，mRNA疫苗试验的高效力率提高了公众对mRNA疫苗的信心。 7.6.疫苗获取 负担得起且易于获得疫苗是实现对传染病普遍保护的最大挑战，特别是在低收入国家。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷藏要求，这种获取进一步受到限制。在2014-2016年西非致命的埃博拉病毒爆发期间，需要-80°C储存的疫苗通过便携式和可重复使用的Arktek冰箱供应到刚果民主共和国，允许向40万人接种疫苗。这样的冷藏技术能够在流行病期间迅速部署数百万剂疫苗。然而，在像COVID-19这样不断发展的大流行中，为数十亿人接种疫苗需要热稳定的疫苗。两种SARS-CoV-2疫苗候选物在临床前研究报告称在室温下具有热稳定性。 如果这些热稳定的mRNA疫苗候选物在临床试验中显示出有希望的结果，它们将极大地简化全球未来对mRNA疫苗的获取。设计负担得起、稳定且有效的热稳定mRNA疫苗是当务之急。 8.结论 几十年来在mRNA设计及其递送技术方面的发展和研究，使mRNA疫苗成为抗击大流行病和现有传染病的惊人工具。首批两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗以意想不到的速度开发出来。这些疫苗超出了预期，并为mRNA疫苗的未来奠定了坚实的基础和必要的基础工作。从众多针对mRNA疫苗的临床试验中可以看出，这些疫苗可以与常规疫苗平台并驾齐驱，甚至在未来取代它。mRNA技术有潜力开发出更有效的疫苗，以对抗持久和具有挑战性的病原体，并在未来治疗各种癌症。然而，需要在mRNA递送技术上取得进步，以实现更有效、更安全且无需冷链的mRNA疫苗，这些疫苗有能力跨越边界为数十亿人群接种。需要进一步研究mRNA疫苗如何影响先天免疫反应。已批准的mRNA疫苗的大量积极安全性和效力数据，加上明确的监管批准路径，为科学界带来了希望，即mRNA治疗确实有巨大的潜力，可以改变现代生物治疗方法，用于疫苗接种、蛋白质替代疗法和癌症免疫疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。