RIG-I x TLR3

摘要：登革热病毒（DENV）通过感染的伊蚊传播给人类，引起的疾病从轻微的登革热到致命的登革休克综合征不等。不同DENV血清型或不同黄病毒之间相似保守的结构和序列导致了交叉反应的发生，随后是抗体依赖性增强（ADE）。迄今为止，能够提供针对不同DENV血清型感染的有效保护的疫苗仍然是最大的挑战。因此，深入研究对于开发有效和有效的治疗药物至关重要。此外，黄病毒的交叉反应性导致临床环境中的误诊，可能会导致适当干预管理的延迟。因此，迫切需要具有高特异性和敏感性的准确诊断，以便及时诊断并为DENV感染的个体提供早期治疗。在这篇综述中，将讨论DENV感染治疗平台中中和抗体、抗病毒药物和疫苗候选物的最新发展。此外，还将介绍抗原隐蔽表位的发现、分子模拟原理以及单链或单域抗体在DENV应用方面的进展。 1.引言 登革热病毒感染是热带和亚热带地区最常见的蚊媒传播疾病之一，全球每年约有1亿至4亿感染病例。目前，DENV感染在非洲、东地中海、美洲、东南亚和西太平洋等国家流行。全球登革热流行的分布表明，登革热感染的爆发正在全球范围内发生（图1）。根据最近的WHO报告，2020年感染病例的增加使得DENV成为COVID-19之后最严重的病毒性疾病。在这些国家中，菲律宾、越南、印度、哥伦比亚和巴西报告了最多的DENV感染病例。导致蚊子传播疾病在全球传播的主要因素之一是快速的城市化和不适当的基础设施规划，这可能导致无效的病媒控制管理。此外，商务团队或个人旅行也促进了这些蚊子传播疾病在他们从一个地方到另一个地方旅行时传播到新环境中。2013年，在马来西亚沙捞越发现了一种新发现的DENV血清型。最初，这起DENV病例被认为是DENV4的森林登革热感染，涉及蚊子Aedes nivalis和非人类灵长类动物之间的传播。经过一系列遗传验证过程，它被确定为新的DENV5血清型，主要发生在东南亚的森林中。尽管DENV5的实际传播途径仍不清楚，但可能导致其出现的因素可能是由于森林株到人类株的遗传变化、DENV的高变异频率和大规模的森林砍伐。这种新的DENV5血清型与另外4种现有血清型在系统发育上有明显的不同，表明DENV的新出现正在进行中，预示着可能会有更多的病毒出现，这可能是由于气候和生态系统的变化导致的动物源性传播。到目前为止，针对DENV感染的特定治疗药物或疫苗仍然不可用。原因之一是DENV和其他黄病毒之间通常发生的交叉反应，因为黄病毒在包膜蛋白（E）上呈现的相似保守结构。如前所述，DENV E蛋白与ZIKV E蛋白的同源性高达50%，因此，在第二次感染任何黄病毒科成员时，由于免疫系统产生的交叉反应性抗体的特异性和数量，会发生交叉反应随后是ADE。此外，不同黄病毒如寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）或不同DENV血清型的共感染总是呈现类似的起始症状，因此可能导致临床诊断管理的复杂化。为了解决这个问题，准确且快速的诊断工具对于早期药物治疗至关重要。在这篇综述中，将重点讨论DENV感染问题，如由于不同血清型DENV感染和不同黄病毒感染导致的交叉反应、ADE、免疫逃避和商业诊断试剂盒的限制。此外，将回顾和介绍不同的诊断和治疗方法的最新进展，以建议可能解决交叉反应问题的方法。事实上，潜在的治疗剂和诊断标记的发现永远不会结束，直到产生特定的、敏感的诊断标记和疫苗或治疗剂，它们在治疗DENV感染方面既敏感又有效。 图1. 2020年和2021年全球登革热疫情。受影响的国家包括孟加拉国、菲律宾、越南、印度、马尔代夫、印度尼西亚、新加坡、哥伦比亚、巴拉圭、秘鲁、肯尼亚、斐济、库克群岛、留尼汪岛、斯里兰卡、泰国、苏丹、毛里塔尼亚、东帝汶、也门、尼泊尔、马约特岛、厄瓜多尔和巴西。 1.1.登革热病毒基因组和结构 DENV是来自黄病毒科的黄病毒属。通常，如登革热休克综合征（DSS）和登革热出血热（DHF）等严重症状可能由四种抗原性不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）中的任何一种连续感染引起。DENV是一种小的二十面体包膜病毒，由11 kb的正单链RNA组成，其成熟的包膜结构称为病毒粒子，包含三种结构蛋白，包括衣壳（C）、包膜（E）和膜（M），以及七种非结构（NS）蛋白，如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5（图2）。结构蛋白主要参与病毒组装。例如，C蛋白与RNA相互作用以组装核衣壳。成熟病毒粒子的形成需要M蛋白的帮助，M蛋白在识别不同黄病毒感染的不同类型免疫反应中很重要。它也是DENV的主要组成部分，作为表面蛋白，协助病毒附着和融合在宿主细胞膜上。除此之外，M蛋白可以通过寡聚化形成结构病毒粒子。另一方面，非结构蛋白和细胞蛋白对于病毒基因组的复制、翻译、封装和病毒蛋白的正确折叠至关重要，所有这些都发生在与粗面内质网相关的细胞质中。 图2. DENV基因组和NS1蛋白结构域图。病毒基因组经过翻译产生单一多聚蛋白。多聚蛋白处理后，通过蛋白水解裂解产生病毒蛋白。对于NS1，涉及DENV病理学的三个结构域包括β-卷、翼状结构域和β-梯。 1.2.登革热病毒的生命周期 人类通常通过感染的蚊子如埃及伊蚊或白纹伊蚊感染登革热病毒（DENV）。DENV在感染的第一天就会针对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞。从其他综述中总结，DENV生命周期包括病毒进入和附着、病毒和内体膜融合、核衣壳释放、蛋白合成和处理、RNA复制、核衣壳形成、病毒组装、病毒成熟，最后是成熟DENV粒子的释放。对于宿主细胞附着，DENV E蛋白将与目标细胞的细胞因子如树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素（DC-SIGN）、甘露糖受体、硫酸肝素等相互作用。接下来，DENV通过网格蛋白介导的内吞作用进入目标细胞，内体隔室内的低pH值允许DENV与内体膜融合。在酸性内体环境的帮助下，RNA基因组从解包的核衣壳释放到细胞质中进行蛋白处理和复制。最初，RNA基因组作为mRNA并进行翻译以产生病毒蛋白。RNA基因组的复制发生在病毒诱导的细胞内膜上，称为复制复合体，由病毒RNA、病毒蛋白和宿主细胞因子组成。这个复合体在内质网（ER）膜上形成，也有助于保护复制产物免受宿主先天免疫系统的识别。核衣壳形成后，DENV粒子开始组装，当它进入ER腔时形成未成熟的DENV粒子。在跨高尔基体网络（TGN）的分泌途径中，DENV的成熟需要通过类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的作用将前膜/膜（prM/M）切割成M蛋白，以释放成熟和传染性的DENV。为了避免过早的DENV膜在病毒粒子从感染细胞释放之前与宿主细胞融合，pr将继续与E二聚体结合，包裹疏水融合环。最后，成熟的DENV一旦释放到细胞外空间，pr最终会从病毒粒子表面脱离。 1.3.临床表现 登革热感染包括发热期、危重期和恢复期。发热期通常持续一周，症状包括高热、流感样症状、头痛、呕吐和关节痛。危重期也称为生命威胁期，会出现血浆渗漏和内出血等更严重的症状。在恢复期，随着血管通透性的恢复，症状会减轻。DENV感染可以引起一系列广泛的症状。在第4天至第10天的潜伏期内，疾病可能是无症状的或表现为称为登革热（DF）的轻微急性发热疾病，而危重期通常从第3天至第7天开始。登革出血热（DHF）伴随着异常的血管通透性，可能会导致突发性低血容量休克，称为登革休克综合征（DSS），这是感染严重登革热患者的危重阶段。DENV感染可能导致不同程度的严重性，这取决于血清型、遗传变异和病毒毒力。不同的登革热血清型可能因其结构差异和病毒复制率而对病理产生不同的影响。此外，核苷酸的变化，如氨基酸突变或替换，会影响病毒毒力，因为核苷酸的变化最终会导致不同的病毒-宿主相互作用和传播能力。 2.关于DENV未解决问题的综述  在这一部分，简要回顾了涉及先天和适应性免疫反应的免疫反应。我们还回顾了一些未解决的问题，如DENV的免疫逃避、DENV血清型内的交叉反应、不同黄病毒间的交叉反应、不同的抗体依赖性增强（ADE）机制及其影响。第4.2节将讨论当前诊断试剂盒的限制。 2.1.对DENV感染的免疫反应 树突状细胞（DCs）是病毒颗粒入侵期间先天和适应性免疫反应之间的连接。它负责上调促炎细胞因子和共刺激分子的表达，这有助于激活人体免疫反应。因此，当NS1通过调节相关基因表达干扰其成熟和迁移时，DCs将无法刺激Th1细胞分泌IFN-γ。为了确保灭活流感病毒NS1，抗病毒药物必须能够恢复宿主的抗病毒反应，如与IFN产生相关的先天免疫，并限制病毒复制。DCs将目标抗原扩展到T细胞，如CD8+和CD4+，作为引流淋巴结（LNs）中先天免疫反应的起点。激活的皮肤肥大细胞在激活招募细胞毒性细胞如CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞到感染部位中起着至关重要的作用，以刺激病毒终止，同时控制引流LNs中的感染。CD8+ T细胞可以直接通过靶向登革蛋白（如NS3）的各种变异，借助激活的CD4+ T细胞来终止感染细胞（Mathew等人，1996）。CD8+ T细胞通常关注非结构蛋白，而CD4+ T细胞更多地关注衣壳、包膜和NS1表位。CD4+ T细胞的作用包括帮助B细胞反应，协助从CD8 T细胞中提取记忆反应，并提供细胞毒性效应，以及Mapalagamage团队回顾的专门CD4+ T细胞的许多其他功能。补体系统的激活对于在先天免疫反应的早期阶段阻断病毒感染很重要。然而，DENV的免疫逃避可以通过NS1实现，当它与不同补体激活途径（如经典途径和凝集素途径）中的相应补体组分相互作用时。这将导致补体组分的功能改变，并抑制补体介导的反应。通过这些策略，DENV增加了其生存和病毒复制的机会。此外，NS1和NS4B之间的相互作用将通过与双链RNA共定位来调节RNA复制。 DENV的病毒复制在早期通常由干扰素（IFNs）的产生控制，这是第一道防线。一旦病毒进入人体皮肤，TLRs和C型凝集素受体（CLRs）作为模式识别受体（PRRs），由免疫哨兵产生，会识别DENV的存在。PRRs的激活通过产生IFNs和肿瘤坏死因子（TNF）激活人体的抗病毒先天反应。TLR-3和TLR-7的激活将导致产生IFN-α和IFN-β，这对于抑制DENV感染很重要。IFNs与IFN受体之间的结合反应将触发Janus激酶-信号转导和激活转录因子（JAK-STAT）途径，进一步增强效应蛋白的产生高达100单位。除了IFNs，包括视黄酸诱导基因1（RIG-I）和螺旋酶黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在内的细胞内传感器也是负责病毒RNA识别的第一线防御，它们也有助于产生IFN-β。激活的RIG-I在检测到病毒RNA后会被转移到线粒体，与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用。RIG-I和MAVS之间的相互作用将进一步导致MAVS聚集，充当免疫信号体，启动核因子κB（NF-κB）和转录因子IRF3，诱导转录因子转移到细胞核后产生I型IFN。 2.2.DENV逃避免疫系统 DENV逃避免疫系统通常发生在抑制免疫反应激活途径的情况下。例如，DENV设法通过抑制MAVS途径来绕过人类的第一道防线。一种策略是通过干扰NS3蛋白阻断RIG-I进入线粒体。除了NS3，NS4A也能通过结合MAVS的半胱天冬酶激活和招募域（CARDs）来抑制RIG-I和MAVS之间的结合。病毒逃避宿主病原体识别受体的另一种方式是通过干扰TLR-3抗病毒信号的激活。另一方面，DENV也能够通过几种机制抑制干扰RNA（RNAi）途径，这是产生先天抗病毒反应的重要途径。亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）将从病毒RNA的3′-非翻译区产生，以防止Dicer酶切割双链RNA。通过表达NS4B调节宿主RNAi/microRNAs途径，RNAi途径将受到干扰，从而促进DENV的复制。NS5可以通过阻断转录复合体PAF1C的招募来影响IFN的产生，以阻止IFN刺激基因（ISGs）的产生。此外，DENV还可以通过几种机制影响IFN机制的功能。例如，非结构蛋白NS2B/3能够通过中断IFNα/β诱导途径来下调抗病毒反应，而其他非结构蛋白如NS2A、NS4A和NS4B可以通过部分阻断STAT信号途径来影响细胞间的IFN信号传导。 2.3.不同DENV血清型间的交叉反应和不同黄病毒间的交叉反应 所有DENV血清型的NS1蛋白共享相似的序列高达70%，并且其序列与其他黄病毒也有40-50%的相似性。因此，不同血清型DENV之间以及DENV与其他黄病毒之间总会发生交叉反应。根据在巴西发生的DENV-1和DENV-2的共感染以及在索马里、台湾和中国检测到的DENV-2和DENV-3的共感染，Araújo, F. M.和他的团队表明埃及伊蚊可能被不同病毒的组合感染，或者它们可能有能力同时传播多种病毒。正如Wenming等人（2005）所假设的，如果一个地方存在多种血清型，那么通过感染蚊子传播DENV-2和DENV-3的共感染可能会发生。此外，也有报道DENV和寨卡病毒（ZIKV）以及DENV和基孔肯雅病毒（CHIKV）之间的共感染。 与DENV类似，寨卡病毒（ZIKV）也是一种正单链RNA病毒，源自黄病毒科。寨卡病毒感染通常显示非特异性的临床症状，如结膜炎、轻度发热、头痛和皮疹，这很容易与其他黄病毒感染如登革热和基孔肯雅病混淆。此外，ZIKV感染还可能影响孕妇，导致胎儿畸形和婴儿出生缺陷，如小头畸形。一个最初被检测为登革热病毒感染的旅行相关病例，由于NS1抗原测试的假阳性结果，后来被怀疑为急性寨卡病毒感染。当ZIKV对先前感染过另一种黄病毒感染（如DENV）的患者造成二次感染时，这个人可能体内有DENV背景免疫，并在DENV检测中呈阳性结果，导致IgM测试的交叉反应。然而，如果ZIKV是初次感染，IgM测试中的交叉反应会很低。正如George等人所报告的，先前感染过ZIKV的患者会有更高水平的DENV-2原发病毒血症，随后与严重DENV感染相关的变化。这是因为ZIKV感染触发的高浓度DENV交叉反应性抗体对DENV-2的中和效果很低，导致DENV-2交叉反应性抗体反应的非中和浓度。这些反应还增加了从DENV-1、3或4获得异型血清型感染的机会，这意味着对ZIKV的预先存在的免疫反应可能会诱导所有DENV血清型的ADE。 2.4.ADE的机制和影响 ADE的第一种机制被称为内在ADE，其中DENV免疫复合物的内化将通过抑制细胞内抗病毒反应增加感染细胞的“爆发大小”。DENV可以通过与亚中和抗体形成DENV-抗体复合物并通过抗体介导的吞噬作用进入宿主细胞。当2个巨噬细胞Fcγ受体配对并诱导白介素-10（IL-10）产生时，它将导致偏向T辅助细胞-2（Th2）反应，由于RIG-I/MDA5和JAK-STAT途径的抑制，导致释放的1型干扰素、白介素12、干扰素γ和TNF变得下调。简而言之，内在ADE通过改变先天免疫系统和细胞内机制来增强病毒复制。 另一种ADE机制是外在ADE。两种常见的ADE机制是Fc受体（FcR）依赖性ADE和C1q依赖性ADE（图3）。FcR依赖性ADE是广泛病毒感染（如HIV、流感A、登革热和埃博拉）的最常见机制。具有FcR的细胞，如单核细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，很容易被病毒-抗体复合物附着，因为抗体的Fc区域将与细胞表面的FcR结合，导致病毒附着到细胞表面的增加。一旦DENV-免疫复合物抑制负责产生白介素-12（IL-12）、干扰素γ（IFN-γ）、TNF-α和一氧化氮自由基（NO）的抗病毒免疫反应，IL-6和IL-10的表达将被激活，并刺激病毒颗粒的传播，导致感染细胞和病毒颗粒的增加，随后发生ADE。 图3. 抗体依赖性增强（ADE）的不同机制。病毒进入可以通过不同的途径，在(A) Fc受体或(B) C1q受体的帮助下被吞噬进入细胞膜，并进一步引起ADE。 C1q依赖性ADE机制是补体经典途径的启动，这在埃博拉病毒（EBOV）感染中很常见。在这种机制中，ADE是通过补体蛋白C1q和C1q受体（C1qR）来促进的，它在大多数哺乳动物细胞中被区分出来，尽管FcRs在免疫系统中完全表达，包括B细胞、中性粒细胞和单核细胞或巨噬细胞。 当病毒与非中和抗体或亚中和水平的抗体结合时，这将有助于病毒进入并进一步增强病毒感染，这可能是二次感染。这种情况指的是抗体依赖性增强（ADE）。最初，预先存在的抗体可以通过阻止DENV与细胞表面的天然受体之间的结合来中和同源DENV感染，但它将允许异型登革病毒进入并穿过初次感染途径，导致由于高病毒负荷而发生ADE。 通过多年感染后刺激免疫记忆产生的交叉反应性抗体可以中和多种DENV血清型。这些抗体通常具有较差的中和活性，并倾向于附着在可用性低的免疫显性表位上，导致ADE和交叉反应的更高比率。正如Mongkolsapaya等人所报告的，异型记忆和交叉反应性CD4+T细胞的存在将在二次感染的免疫回忆反应期间加剧感染。 在异型血清型二次感染期间由抗体反应诱导的非中和抗体可能导致内在ADE，这可能导致更严重的登革热感染。这种类型的ADE与外在ADE相比，可以在感染的早期阶段大大增强病毒复制。这是因为它能够逃避先天免疫反应，并通过抗体介导的内化自由迁移，不容易被内源性干扰素途径检测到。 3.针对DENV感染的治疗剂  3.1.中和抗体及其机制  中和抗体在抑制DENV包膜（E）蛋白的功能位点与宿主细胞相互作用中发挥重要作用。高度中和的抗体通常结合在E蛋白上容易接近且暴露在病毒粒子表面的表位上。然而，非中和抗体，包括亚中和水平的中和抗体，当它们结合到DENV粒子时，可能会导致ADE。 以西尼罗河病毒的中和机制为例，该机制被称为“多重打击”模型，与使用抗体“包被”病毒粒子模型的其他病毒的中和也类似。中和效果取决于中和抗体的浓度。对于潜在的中和抗体达到中和的最小化学计量学，大约需要30个抗体占据一个病毒粒子。可能影响中和抗体与病毒表位之间相互作用的因素包括病毒表位的可接近性、抗体浓度和结合亲和力。 被中和抗体包被的病毒粒子的传染性可以通过不同方式被阻断，其中之一是通过抗体的Fab臂交叉链接病毒粒子，以形成大的交叉链接病毒/抗体聚集体，这可以通过降低可以感染细胞的病毒粒子浓度来阻止病毒粒子的传播。除了交叉链接，抑制E蛋白构象变化和受体结合可以避免病毒粒子与内体膜之间的膜融合，从而允许病毒基因组释放到细胞质中。一些中和抗体可能具有双重活性，可以阻断膜融合，同时中断受体结合机制，从而阻断病毒通过内体进入。当预连接测定格式中中和抗体的中和滴度超过后连接中的中和滴度时，总体中和可能会发生，并允许对DENV粒子进行双重保护。 关于中和逃逸的问题，可以通过利用针对不同表位的潜在中和单克隆抗体（mAbs）混合物来解决，以阻断突变逃逸。Wang等人的研究表明，通过LALA突变工程化的重组四价对称抗体在小鼠模型中通过中和从每个亲本抗体单独发展出来的逃逸突变体，非常有效地抑制了ZIKV感染，逃逸突变体的生长被抑制。 3.2.针对DENV感染的潜在中和抗体 DENV的E蛋白始终是开发中和抗体的主要关注点。每个DENV E蛋白的外域由三个独特的域组成，如域I（EDI）、II（EDII）和III（EDIII），它们连接在一起作为二聚体存在。通常，中和表位位于EDI内的铰链区、EDII末端和EDIII侧面。在与E蛋白三种域匹配的中和小鼠单克隆抗体（mAbs）中，大多数强烈中和的mAbs识别EDIII的表位和A链。潜在的中和抗体通过与病毒粒子表面的E二聚体交叉链接，靶向成熟病毒粒子上的暴露四聚体结合位点，从而抑制构象变化，阻止融合膜的形成。 1A1D-2是一种中和抗体，可以通过阻断EDIII位置来防止E蛋白的构象变化和膜融合的形成。Gandham和他的团队开发了硫代适体（DENTA-1），利用中和抗体1A1D-2的中和机制针对EDIII，因为其出色的结合特性。由于过滤结合测定表明硫代适体能够紧密地结合在DENV-2 EDIII上，DENTA-1有很大可能表现出与1A1D-2相同的中和效果。对于静态下的成熟病毒粒子，中和抗体与EDIII的结合区域位于非表面暴露的β−1链，这表明未暴露区域可以很容易地与溶剂接触，并通过靶向结合区域来增强抗体的中和活性。Deng等人的另一项研究也证明，特异性结合EDIII的抗体2B8能够抑制DENV血清型2在BHK细胞上的附着。 Dejnirattisai及其团队报道了发现广泛中和抗体的潜力，这种抗体有可能中和所有DENV血清型。他们发现，针对包膜二聚体表位（EDE）的mAbs能够与针对融合环表位（FLE）的抗体相比，更有效地中和感染人类细胞和昆虫细胞的DENV。原因之一可能是由于抗EDE抗体的能力，它们可以在不同的成熟阶段识别具有不同prM浓度的DENV，与依赖于prM存在进行融合环结合的抗FLE抗体不同。 除此之外，工程化抗体如双特异性抗体的发现也是开发针对DENV的治疗性抗体的一种流行方法。将两个具有特定功能的mAbs结合起来产生双特异性抗体（DVD-1A1D-2A10），已被发现保留并表现出亲本活性。这种双特异性抗体能够在DENV早期感染期间阻断病毒附着和融合过程，因为它由能够与EDIII相互作用以抑制DENV在宿主细胞上的附着的1A1D亲本抗体组成，以及另一个能够与EDII域结合以干扰病毒粒子和内体膜之间融合过程的2A10亲本抗体。具有双重阻断功能的优势，病毒附着和融合的阻断可能同时发生，或者可以抑制其中任一过程，作者预测，这可能更有效地抑制DENV感染。DENV E蛋白在病毒附着和融合过程中分别具有转变为二聚体和三聚体结构的能力，然而双特异性抗体由于其亲本活性的优势，能够同时结合EDII和EDIII域，从而避免E蛋白结构的变化。此外，这种双特异性抗体在1.33 µM的浓度下还显示出完全的中和活性，与其各自的亲本抗体相比，在相同浓度下仅显示出70%的中和效果。双特异性抗体的产生非常有希望被开发成针对DENV的治疗性抗体。 3.3.抗病毒肽 作为抗病毒剂之一，肽类抑制剂旨在通过影响病毒蛋白的功能来中断DENV生命周期。抗病毒肽可以通过几种途径抑制DENV感染，如（i）识别宿主细胞受体以阻止病毒进入，避免宿主细胞与病毒蛋白结合，（ii）靶向结构蛋白，通过阻止宿主细胞与病毒之间的结合来防止病毒进入，（iii）靶向非结构蛋白，主要处理抑制病毒复制。然而，抗病毒肽作为有效治疗药物使用存在一些缺点，如稳定性弱和生物利用度有限。解决这些问题的方法之一是应用化学修饰来改变肽的物理化学性质，另一种方法是通过突变分析改进抗病毒肽的性质。 一些抗病毒肽靶向登革热蛋白酶，如NS2B-NS3，它参与病毒多聚蛋白的切割，以在成熟时释放结构和非结构蛋白。Ltc 1在高温（40°C）下表现出更好的抑制能力，降低了感染细胞中的病毒载量。因此，Ltc 1可能通过抑制NS2B-NS3蛋白酶的活性来干扰DENV的生命周期。还有其他针对NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，有潜力被开发为抗病毒剂。 Hrobowski及其团队建议，可以使用模拟II类融合蛋白高度保守区域的肽来阻断病毒进入和融合。他们鉴定了一种肽抑制剂DN59，模拟DENV E蛋白的茎域，能够以低浓度抑制DENV-2感染。它在20 µM时显示出最高的抑制活性100 ± 0.5%，其IC50记录在大约10 µM。它还对DENV-2感染显示出极好的特异性，以低浓度超过99%的抑制活性抑制斑块形成。除了对DENV-2具有抑制活性外，这种肽抑制剂还对西尼罗河病毒（WNV）显示出抑制效果，由于它们具有相似的保守区域，因此它可能作为黄病毒的广谱肽抑制剂。进一步的研究表明，这种肽抑制剂对所有DENV血清型都有抑制效果，IC50在2到5 µM之间。有趣的是，他们还发现DN59能够破坏病毒膜并释放病毒基因组。基因组在用DN59处理后完全从E蛋白中分离出来，因为它在病毒膜上形成孔洞，由于其与脂质体囊泡的强烈相互作用并破坏脂质双层，导致病毒失去感染性。 此外，MLH40肽的模拟能力使其能够通过模拟M蛋白外域的螺旋疏水茎区和保守的疏水环来中断DENV M-E相互作用，当它结合到DENV时会引起同源二聚体E蛋白结构的改变，从而抑制所有类型的DENV的病毒感染。 DENV C蛋白与脂滴（LDs）之间的相互作用对于登革病毒颗粒的形成很重要。利用分子模拟的原理，肽可以通过模拟C蛋白无序的N端区域，包括NML + R基序（被认为是LD-C蛋白的相互作用位点）来抑制DENV颗粒的形成。还有另一种发现涉及DENV C蛋白的抗病毒机制。一种名为ST148的复合抑制剂显示出抑制DENV复制的潜力，它与两个衣壳二聚体“接吻”相互作用，形成一个抑制剂结合的衣壳四聚体，这可能在病毒感染新细胞之前或期间发生。含有这种复合抑制剂的病毒在感染新细胞时的核衣壳解包过程中会有故障效果。这将进一步导致C蛋白和RNA基因组的降解。因此，这种机制可能是未来抗病毒方法的有用见解。 另一方面，Kaptein和合作研究者鉴定了一种有前途且有效的泛血清型DENV抑制剂，称为JNJ-A07。它是一种靶向NS3和NS4B相互作用的抑制剂。NS3-NS4B复合物的形成是病毒复制的重要部分，因此该抑制剂通过在细胞质环上引起构象变化来阻断复合物的形成。他们的研究表明，抑制NS3和NS4B之间的相互作用显示出有前途的抗病毒机制和很好的抑制效果。这种抑制剂具有良好的药代动力学，并且对不同的21种基因型和血清型组合显示出有前途的抑制活性。 3.4.疫苗开发和针对DENV感染的潜在疫苗候选物 由于其四种抗原性不同的血清型可能引起的复杂感染，疫苗的开发一直是登革热治疗的巨大挑战。一种DENV血清型的初次感染将导致长期同型保护，但对其他血清型的短期异型保护，因此一个人在第二次异型感染期间可能会面临疾病加重。通过在二级淋巴组织中形成生发中心（GC），在滤泡辅助T细胞（Tfh）的帮助下，产生长期抗体分泌浆细胞对于开发有效的登革热疫苗很重要。 到目前为止，全球唯一授权的疫苗是Dengvaxia（CYD-TDV），它是一种活体嵌合、减毒和四价疫苗，由非结构黄热病17D株病毒骨架组成，结合了四种DENV血清型的结构前膜（prM）和包膜（E）基因。然而，Dengvaxia仅适用于9至16岁之间的感染人群。 其他疫苗候选物仍在通过不同阶段的临床试验，从第一阶段到第三阶段。正在进行第三阶段临床试验的疫苗候选物包括TV003/TV005（NCT01506570）和TDV/DENVax/TAK003（NCT02302066）。疫苗候选物TDEN-LAV（NCT01702857）仍在进行第二阶段临床试验，TDEN-PIV（NCT01666652）和D1ME100/TVDV（NCT00290147）目前处于第一阶段临床试验阶段，而V180（DEN-80E）（NCT01477580）已完成第一阶段临床试验。 Graham及其团队最近开发了一种新的活体减毒四价疫苗（DLAV），在接种疫苗后的8到14天内迅速产生DENV特异性多功能T细胞，并至少保留6个月。此外，DLAV还诱导效应记忆T细胞重新表达CD45RA（TEMRA），在接种疫苗后1年内保持其高频率。这表明这种疫苗诱导的免疫保护非常有希望。 在先前的研究中，Pinto团队展示了基于E蛋白的DNA疫苗（pE1D2）和基于NS1的DNA疫苗（pcTPANS1）都能在免疫小鼠模型中诱导免疫保护。在他们最近的研究中，他们更感兴趣的是找出两种DNA疫苗候选物组合所能诱导的保护性免疫。他们的研究表明，用pE1D2+pcTPANS1 DNA疫苗接种的小鼠由于结合的免疫反应而获得了出色的免疫保护。即使在DENV-2的致命挑战之后，pE1D2+pcTPANS1免疫的小鼠也没有发现病态，由于免疫反应的加强，它们也没有表现出感染的临床迹象。 所有上述讨论的潜在治疗剂总结在表1. 4.DENV诊断 在登革热诊断中，提供高特异性定量评估的传感器对于更好的监测和早期检测很重要。用于DENV诊断的常见检测方法之一包括酶联免疫吸附测定（ELISA）。这种测定有一些限制，如昂贵的测试套件和需要几个小时才能检测到目标兴趣。除此之外，在急性阶段使用病毒分离来诊断DENV感染既耗时又需要非常熟练地处理细胞培养或动物模型。对于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，它能够在发热阶段检测早期DENV感染，但也耗时且程序复杂。免疫层析测定法也常用于DENV检测，特别是应用了金纳米颗粒偶联抗体作为捕获蛋白的测定法。金纳米颗粒（AuNPs）是由于其稳定性、无毒性、生物相容性和易于与许多生物分子功能化等优点而在侧流测定中应用的有前途的纳米材料。 由于感染患者血清中NS1抗原水平高，使其成为许多商业免疫测定类型（如侧流快速测定和ELISA试剂盒）中一个有前途的生物标志物，因此NS1的检测已被应用于许多类型的单克隆或多克隆抗体基础免疫测定。与病毒RNA相比，病毒抗原在登革热感染患者的血液中循环时间更长，因此在RT-PCR中病毒RNA不可检测时，检测NS1抗原更受青睐。 图4说明了初次和二次感染期间NS1抗原、IgM和IgG的水平。在初次感染期间，从第0天起就可以检测到NS1抗原，并且在第4天会获得一个小高峰。即使NS1和IgM从感染的第3天到第9天同时存在，抗原检测也不会受到IgM存在的影响。另一方面，IgM的检测只能在发病后3到4天进行，并且从第5天起在血清中会保持持续量。从症状发作后第10到15天起，才能有效检测IgG。通常，IgG检测测定会用于根据IgG水平区分初次和二次感染。这是因为IgG只有在初次感染后几周或几个月才会显著提高。在二次感染期间，由于其快速的记忆反应，从第3天起就可以检测到IgG，这导致早期IgG水平高。 图4. 原发性和继发性登革热感染的NS1、IgM和IgG水平。(A) 在原发性感染期间，从第0天起可以检测到NS1，从第3天起可以检测到IgM，而IgG只能在第10天起检测到。(B) 对于继发性感染，IgG水平用于区分原发性和继发性感染，因为在急性期由于快速的免疫记忆IgG反应，IgG水平非常显著。 4.1.当前商用诊断试剂盒 NS1的检测是早期诊断DENV感染的有效方法，一旦发热开始，由于其在早期阶段出现，即在第0天至第9天内，第6至10天可以检测到最大水平。在Alcon等人的研究中，从症状发作的第一天开始，NS1抗原在血清中循环，长达9天，NS1的浓度从第0天的0.04lb/mL增加到第7天的2.00 lb/mL，而恢复期血清样本从第8天开始的浓度为0.04 lg/mL。对于二次感染，NS1在血淋巴中的浓度约为0.01至2 lb/mL，且在恢复期血清样本中未检测到。因此，大多数商用试剂盒侧重于检测NS1作为DENV诊断的生物标志物，因为它在早期阶段有可检测的显著量。 根据S. D. Blacksell及其团队的评估，商用NS1抗原现场诊断测试的敏感性和特异性分别在48.5%至58.6%和92.5%至99.4%之间。根据Osorio L.团队对不同商用NS1诊断测试的敏感性和特异性进行的比较，SD BIOLINE™ NS1/IgM/IgG检测提供最高的检测敏感性，高达80.7%，其次是SD BIOLINE™ NS1/IgM（78.4%）和第二代Pan E™（71.1%）。还有其他研究对不同类型的商用诊断试剂盒进行了审查。 商用SD Bioline Dengue Duo检测是常见的诊断测定，包括2种评估测试，用于检测患者血清中的DENV NS1和抗-DENV IgG或IgM。它的益处在于对DENV IgM和IgG的额外评估，增加了检测敏感性，这对NS1检测测定是补充的。SD Duo测试的改进敏感性再次通过比较NS1/IgG/IgM的联合检测和每个单独生物标志物的检测得到证明。NS1/IgG/IgM测试显示最高的敏感性（90.65%），其次是IgG测试（90.06%），NS1测试（87.50%）和最后是IgM（60.515）。将两个或更多登革热生物标志物（如NS1与IgM或NS1与IgM和IgG）的组合似乎对诊断试剂盒的整体性能有改善作用，从53.5%提高到88.7%和从60.61%提高到90.65%。 然而，无论是IgG还是IgM检测的单独阳性结果也可以表明过去几个月的感染，这只能被视为推定诊断。此外，当IgM测试作为单一生物标志物使用时，其敏感性被报道为低，从IgM测试获得的阴性结果不能完全排除登革热感染的嫌疑，因此IgM测试更适合用于检测近期感染，而不是作为急性感染诊断的标志。 4.2.当前诊断测试的限制 在Jayathilaka及其团队的研究中，大多数特异性检测NS1的抗体是针对高度保守的NS1区域，这导致与JEV和WNV的交叉反应超过65%。NS1抗体的产生可能是由于其他黄病毒的感染，并在DENV的二次感染期间增加到更高的抗体滴度。此外，RDTs中的假阳性通常是由于先前由任何类型的黄病毒或不同登革热血清型感染的残留抗体引起的，这在流行区经常发生。 Chung提到，商用诊断试剂盒似乎存在高变异性，范围从37%到98.9%，这可能是由于在二次感染期间，特别是在病毒血清型2、血清型4的发热开始后，随着时间的推移，敏感性降低，血清中发现大量DENV反应性IgG时，这一点在Osorio等人（2010）的研究中得到证明，即在二次感染的发热开始4天后和严重感染的情况下，检测敏感性降低。与诊断试剂盒的时间依赖性敏感性相关的是，疾病的持续时间据说会影响诊断试剂盒的敏感性，因为Guzman团队的研究报告称，与后期收集的血清样本相比，试剂盒在测试亚洲患者的急性血清样本时更为敏感，这些样本是在疾病初期的前3至4天内收集的。 此外，诊断试剂盒的敏感性也因不同类型的DENV血清型而异。在Guzman等人（2010）的研究中，Platelia试剂盒对DENV-2的敏感性最低，与其他血清型相比，诊断试剂盒对不同血清型的敏感性差异可能与不同血清型和同一血清型不同来源的特定NS1表位有关。 尽管有各种商用DENV诊断试剂盒的可用性，但仍存在一些现有的限制，如表2所列。 4.3.改善DENV诊断和发现有前景的诊断标记 Nascimento等人的研究发现，抗登革热NS1 IgG和IgG3有潜力被开发为长期DENV感染的生物标志物，而不是通常用于检测急性感染的生物标志物，如IgA和IgM抗体。这可能是因为它们在感染症状出现后的第一周内持续存在，有助于早期检测，并且检测窗口期更长，即在症状出现后4至6个月内。相比之下，NS1抗原检测的检测时间限于发病后的前几天，以最大化检测灵敏度。 生物功能化的锥形光学纤维可作为DENV诊断中的无标签定量诊断工具，因为它具有快速检测时间、简单过程、便携式可用性和易于制造的优点。在二次感染的早期，IgG抗体的存在量会比初次感染时更高，因此为抗体通过抗原生物受体的捕获提供了更高的可能性。Mustapa及其团队专注于通过在锥形多模光纤（TMMF）上固定DENV NS1抗原来检测抗NS1 IgG抗体。他们确定生物功能化的TMMF能在5分钟内检测到100 pg/mL的抗体，其灵敏度可达7 × 10-6a.u/pg/mL。这种生物功能化的TMMF可被用于DENV诊断，以获得更好的灵敏度和快速诊断结果。 Mustapa及其团队最近的研究是改进TOF的生物传感性能，通过整合纳米材料如聚酰胺胺（PAMAM）树状分子。这是一种超支化大分子，当集成到TOF中时，可以作为活性层。这种策略可能会增加TOF传感器的活性位点，以便于目标抗原的附着，主要是由于PAMAM树状分子的极性功能，它能够在其边缘锚定蛋白质并改善蛋白质装载。他们的研究将PAMAM树状分子集成到TOF传感器中作为活性层，以增强抗体吸收，从而在固定过程中为DENV-2 E蛋白的结合提供更多的活性位点。这种改进的PAMAM集成TOF传感器显示出与Kd值为1.02 ×10-10M的传感亲和力，比他们之前的研究更好。这可能是因为使用了PAMAM，它提供了更多的结合位点，并为E蛋白附着提供了更大的表面积。他们的研究证明，将PAMAM树状分子作为活性层在生物功能化的TOF传感器中大大增强了其在识别DENV E蛋白方面的性能。 之前，许多工作已经进行了利用血清型特异性抗体在DENV诊断测定中的应用，但这些方法在区分所有DENV血清型方面效果不佳。与其使用杂交瘤技术产生的抗体，不如使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体，据报道它们可以通过与单一泛反应性捕获抗体结合来进行多重诊断，因为它们具有特定的表位。这些表位与NS1中最易接近的表位之一的翼状结构域表位不同。因此，使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体的应用可能为解决DENV血清型鉴别的挑战提供了思路。 研究人员成功地产生了能够检测所有DENV血清型和ZIKV的杂交瘤抗体，且不会与小鼠免疫接种的重组DENV1、DENV2、DENV3、DENV4和重组ZIKV蛋白发生交叉反应。有效的检测仅适用于在急性期收集的血清样本，因为这是NS1和RNA都可检测的阶段。杂交瘤抗体对血清型特异性测试和泛DENV测试的检测限从1到20 ng/mL不等，而20 ng/mL是ZIKV NS1检测的检测限。 含有高浓度IgG的血清样本可能会导致NS1抗原与IgG形成免疫复合物而无法被检测，这进一步影响了诊断试剂盒的灵敏度。IgG的高水平通常存在于二次登革热感染患者的血清样本中。对于一些血液传播病毒如乙型和丙型肝炎，解离的抗体-抗原免疫复合物在早期诊断中起着重要作用。根据Koraka及其团队的说法，NS1抗原和IgG形成的免疫复合物需要被分解，以检测二次感染患者血清中NS1的存在。 针对病毒的sdAb研究越来越受欢迎，他们发现sdAb可以作为治疗和诊断领域的有前途的工具。纳米抗体是指具有最小分子大小的抗原结合片段，大约为15 kDa。它可以从鲨鱼和骆驼科动物（如羊驼和驼）中获得，这些动物没有轻链。纳米抗体的一个例子是单域抗体（sdAb），它由互补决定区（CDRs）组成，如CDR1、CDR2和CDR3。CDR3是一个不寻常的环，它长且延伸，能够穿透并结合到抗原的裂缝中，使其在目标结合上具有高亲和力。sdAb具有极高的热稳定性，高达95°C，并能在热变性过程中重新折叠，保持其结合亲和力。sdAb的热稳定性可以是解决使用传统mAb进行快速诊断测试时遇到的问题的方案之一。 具有特定结合亲和力的人类单链可变抗体片段（HuScFv）针对NS1的R和E域，被证明在暴露于HuScFv时，通过干扰细胞内NS1的产生和恢复宿主先天免疫活性，有效减少流感病毒感染的宿主细胞中的病毒复制。众所周知，具有Fc区域的抗NS1抗体会以某种方式诱导补体介导的细胞溶解，这可能加剧DENV感染。因此，首个专注于完全针对NS1的HuScFv的抗体开发被报道。这种HuScFv不包含Fc区域，并且比传统的IgG小得多。HuScFv与NS1的结合能力，无论是在天然形式还是分泌形式，表明它可能能够中断NS1的作用。这项研究表明，通过HuScFv和NS1之间的相互作用，可以中断病毒复制过程，因为病毒释放减少了。 与商用试剂盒SD Bioline Dengue Duo、固定mAb试剂盒和固定VHH抗体试剂盒相比，固定VHH抗体试剂盒在3种诊断试剂盒中实现了最高的特异性（99.50%），其对重组NS1的检测限为4.5 ng/mL，远低于固定mAb试剂盒（9 ng/mL）。从固定VHH抗体试剂盒获得的检测限不仅在急性期循环NS1的检测限范围内（10 ng/mL至50 µg/mL），而且远低于该范围，表明该试剂盒对检测低水平的DENV2 NS1具有显著的灵敏度。Fatima及其团队还使用表位绘图来识别VHH抗体和mAb的潜在表位。他们发现，两种类型的所有结合肽都有与NS1抗原的氨基酸序列从位置224到232相对应的同源区域。His和Trp几乎出现在每个克隆中，表明这两种氨基酸对抗体结合至关重要，特别是His残基。这种固定VHH抗体试剂盒是一个非常有前景的诊断工具，与其在效率、灵敏度、特异性和结合亲和力方面相比固定mAb试剂盒的优势。 基因工程改造可以应用于单域抗体（sdAb）以提高免疫分析的检测限。将sdAb作为捕获蛋白在与复杂基质的大总面积发生共价相互作用时存在局限性。它的小分子大小在与广泛的结合界面结合时会遇到困难，这将进一步影响目标蛋白的检测和分析的灵敏度。一种有趣的方法是通过蛋白质工程改造sdAb，获得二聚体形式的SpyTag融合sdAb，通过固定在SpyCatcher涂层微球上形成SpyCatcher/SpyTag对。应用SpyCatcher/SpyTag对有助于显著增加与非定向sdAb相比，所有DENV血清型污染的人血清中NS1的检测信号。检测限提高至5倍的增加是SpyTag融合sdAb在DENV诊断和其他蛋白质捕获应用中的有希望的结果。 上述讨论的主题的启示性部分总结在表3中。 5.结论  DENV的广泛传播早已是一个长期的公共卫生问题，随着COVID-19大流行的爆发，一些亚洲国家将需要面对双重负担，特别是对经济和卫生部门的影响。更令人担忧的是，大多数COVID-19病例从轻到中度疾病，与登革热感染常见的症状（如发热和皮疹）相似，因此存在很高的可能性，COVID-19病例和登革热病例可能会被误诊，或者一个人可能会同时感染两种病毒，就像DENV和其他黄病毒一样。此外，也有报道称在印度尼西亚、泰国和新加坡等国家存在交叉反应的案例。到目前为止，由于不同DENV血清型和不同黄病毒的感染导致的交叉反应问题仍未解决。此外，也存在更高的可能性发生ADE状况，并恶化病情。除了这些问题，DENV逃避免疫反应的习惯也是有效控制DENV感染时需要考虑的因素之一。为了解决交叉反应问题，已经持续进行了许多方法来发现有用和潜在的抗病毒药物、中和抗体和疫苗候选物，它们可以有效地发挥作用。这些方法包括基因工程的应用、纳米抗体的衍生、分子模拟、抗原隐蔽表位的发现、结构研究和抑制机制。此外，开发更敏感和特定的诊断替代品也非常需要，以解决当前商用诊断试剂盒的限制，以便能够快速和早期诊断黄病毒或其他新出现的烈性病毒，以便对感染患者进行立即的临床管理。纳米抗体衍生物和抗体工程等方法在开发敏感和特定的生物标志物检测器方面是一个有趣的想法。有趣的是，NS1可能作为DENV检测的潜在生物标志物，因为许多生物标志物检测器可以如上所述特别针对NS1抗原。总之，治疗和诊断方面的开发为未来的发展提供了有用和有趣的想法。

摘要：基于mRNA的疫苗概念出现在三十年前。过去20年的开创性发现和技术进步解决了最初阻碍这种新型疫苗模式应用的主要障碍。快速开发的含核苷修饰的COVID-19 mRNA疫苗表明，这种免疫平台易于开发，具有可接受的安全性，并可大规模生产。抗原设计的灵活性和简便性使得mRNA疫苗进入了针对多种病毒以及各种细菌和寄生虫的开发。然而，我们知识上的空白限制了下一代mRNA疫苗的开发，这些疫苗具有增强的效力和安全性。对mRNA疫苗作用机制的更深入了解，应用新技术以实现合理的抗原设计，以及创新的疫苗递送策略和接种方案，可能会产生针对广泛病原体的强大新疫苗。 1.引言 疫苗在减少由各种病原体引起的发病率和死亡率方面产生了显著影响。在二十世纪下半叶，许多国家引入了全面的疫苗计划，这标志着与致命病原体斗争的转折点，几乎完全根除了几种严重的儿童疾病，并减轻了许多其他危险的病毒或细菌疾病。然而，一些目前许可的疫苗无法诱导出强大、广泛保护、持久的免疫反应，生产耗时且困难，或安全性配置亚优，凸显了改进的需求。此外，目前缺乏针对多种相关难以靶向的病原体的人类疫苗，例如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）或丙型肝炎病毒，以及许多其他病毒和人类致病细菌、真菌和寄生虫，这些病原体合计每年在全球造成数百万人死亡。 mRNA疫苗是疫苗学领域的新来者。数十年的工作现在已解决了体外转录（IVT）mRNA的基本障碍，包括其高度炎症的特性以及安全高效体内递送和大规模生产的困难。关键进展包括在mRNA中引入修饰核苷，利用可电离脂质纳米颗粒（LNPs）进行mRNA递送，以及优化IVT反应，允许无细胞、快速、可扩展的mRNA疫苗生产。值得注意的是，这种疫苗平台比其他模式有几个关键优势。首先，抗原设计的灵活性（mRNA序列可以快速修改）使mRNA疫苗成为针对快速进化病原体（如流感病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2））的理想选择。其次，mRNA生产的简便性允许快速迭代筛选过程，以识别针对病原体的优化免疫原。第三，可以制作多组分（组合）mRNA疫苗，以针对单一病原体的几种不同抗原。例如，预临床流感病毒疫苗中包括了同一抗原的不同版本，以及双价许可的2019年冠状病毒病（COVID-19）疫苗，以及其他疫苗则用单一疫苗配方针对多种病原体。第四，mRNA疫苗可以在短时间内大规模生产，这对于季节性（例如，流感）疫苗或大流行情况非常理想。第五，mRNA疫苗是设计针对具有多个跨膜域的复杂蛋白的疫苗的理想平台。这些mRNA疫苗的一些关键特性使它们成为对COVID-19大流行有效响应的理想选择。事实上，Moderna和辉瑞-BioNTech迅速开发了含核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，并在短时间内生产了数十亿剂。最重要的是，这两种配方在预防死亡和严重COVID-19方面都非常有效，并在全球SARS-CoV-2大流行期间挽救了数百万人的生命（方框1）。 过去10-15年，在疫苗研究方面取得了巨大进展，产生了新的免疫平台，对多种病原体的生物学有了更深的理解，对人类免疫学有了新的见解，对登革热、呼吸道合胞病毒（RSV）和疟疾（除了COVID-19）等疾病的新疫苗，以及重要的是，开发了新技术，使合理的抗原设计能够诱导出最佳的免疫反应。本综述概述了基于mRNA的疫苗平台，包括mRNA设计和递送技术的原则，评估了对mRNA疫苗作用机制的当前理解，并强调了新的临床前和临床传染病疫苗配方。讨论了mRNA疫苗研究中最重要的挑战、限制和机会，以及将mRNA平台技术与反向疫苗学结合起来，实现针对多种病原体的新型、安全有效的人类疫苗的潜力。 2.mRNA疫苗技术概述 大多数临床前和所有直接注射的临床mRNA疫苗有两个主要组成部分：编码抗原的mRNA和保护它免受RNases快速降解并促进大型、负电荷RNA分子细胞摄取的递送平台。mRNA疫苗的两个组成部分影响引起的免疫反应的质量和大小。 2.1.RNA格式和RNA设计原理 在过去25年中，几种RNA格式已在临床前和临床研究中开发和评估（图1）。非复制性（线性）mRNA，无论是否含有修饰核苷，以及自扩增mRNA（saRNA）是经过最广泛研究和改进的主要平台。其他新兴的RNA平台包括跨扩增mRNA和环状RNA（方框2）。 图1 | RNA疫苗平台。该图展示了目前正在使用或探索的用于疫苗接种的RNA格式。值得注意的是，环状RNA由内部核糖体进入位点（IRES）和编码抗原的区域定义。未翻译区域（UTRs）可以改善环状RNA，因此在图中显示。(A)n，聚(A)尾；m7G，7-甲基鸟嘌呤帽；nsP，非结构蛋白。 非复制性mRNA疫苗。非复制性（线性）IVT mRNA已在疫苗研究中测试了数十年，可以含或不含修饰核苷。未修饰的格式主要由CureVac AG开创，它在临床前研究中被证明是一种有效的传染病mRNA疫苗格式。然而，该平台在COVID-19 mRNA疫苗临床试验中的表现不如其含修饰核苷（N1-甲基假尿嘧啶）的对应物。未修饰的CureVac COVID-19疫苗（CVnCoV）性能不佳的一个潜在原因是，即使在相对较低的剂量（12.5微克）下，其在人体内也具有高度炎症性。这种未修饰mRNA的更高反应原性阻止了测试高剂量CVnCoV mRNA（如辉瑞-BioNTech（BNT162b2）和Moderna（mRNA-1273）配方中使用的30微克和100微克）的可能性，而12.5微克剂量在IIb-III期试验中未能诱导出足够强大的保护性免疫反应。在开创性研究中，2023年诺贝尔奖得主Karikó和Weissman证明，将某些修饰核苷引入mRNA序列可以增加IVT mRNA的蛋白产量，重要的是，减少其先天免疫感应。修饰核苷mRNA的这一特性使得BNT162b2和mRNA-1273能够在足够高的剂量下用于诱导对COVID-19的保护，同时将疫苗诱导的不良事件保持在可接受的水平。 IVT mRNA的关键考虑因素包括其半衰期、稳定性、可翻译性和炎症能力；这些特征影响mRNA疫苗的效力和安全性，可以通过优化mRNA的结构元素（5'帽，5'-非翻译区（UTR），编码区，3'-UTR，聚（A）尾）和/或使用适当的mRNA化学和生产程序进行微调。5'帽和聚（A）尾都有助于mRNA的稳定性，并在翻译启动中起关键作用。目前，cap1（m7GpppNm）是最广泛使用的修饰，可以共转录使用cap1类似物或转录后使用病毒封顶酶添加到IVT mRNA上。使用cap1而不是cap0（m7GpppN）通过克服干扰素诱导的蛋白四聚体重复序列1（IFIT1）引起的翻译抑制，增加了蛋白产量。哺乳动物或病毒序列的UTR也已包含多年，以增加mRNA的稳定性和翻译。最近，高通量报告基因测定和计算机引导的方法使得选择优化的UTR和密码子组成以提高mRNA稳定性和翻译成为可能。增加基因中的鸟嘌呤和胞嘧啶含量通常与更高水平的表达相关，但最近的发现揭示mRNA二级结构也是mRNA稳定性和可翻译性的关键预测因子。有趣的是，最具结构化的mRNA通常（但并非总是）具有最高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，密码子使用和二级结构通过增强IVT mRNA的溶液稳定性来明显调节其翻译能力。将某些修饰核苷，如假尿嘧啶或N1-甲基假尿嘧啶，引入IVT mRNA可以通过抑制替代残基的mRNA水解来增加溶液稳定性。N1-甲基假尿嘧啶替代促进了真核生物翻译启动因子2A（eIF2a）的磷酸化减少，从而增加了来自mRNA的蛋白产量。这些发现至少部分解释了为什么在早期研究中发现含有假尿嘧啶的IVT mRNA与其未修饰的对应物相比，蛋白产量增加。 减轻IVT mRNA的免疫激活能力是开发安全传染病疫苗的关键。这可以通过至少四种方法实现。首先，在mRNA序列中用假尿嘧啶或其衍生物N1-甲基假尿嘧啶替代尿嘧啶，减少了IVT mRNA的尿嘧啶依赖性免疫感应。其次，RNA聚合酶生成的短中止转录本可以在IVT mRNA制剂中形成强烈的免疫刺激性双链RNA（dsRNA），通过被多种传感器（例如，TLR3, OAS, PKR, RIG-I和MDA5）在各种细胞区域识别，诱导炎症和翻译阻断。因此，通过纯化或RNase III处理从IVT mRNA制剂中去除dsRNA污染物，进一步提高其可翻译性并减少炎症能力。开发一种在转录过程中产生较少dsRNA的RNA聚合酶，可能允许在“单罐”反应中生成IVT mRNA，简化疫苗生产。第三，cap0被细胞内RNA传感器RIG-I识别，诱导炎症反应。因此，使用含有甲基基团在第一个帽近端核苷上的5' cap1（在高阶真核生物中的“自我”标志）是减少IVT mRNA诱导的免疫识别的关键。第四，某些密码子优化策略增加了IVT mRNA内的dsRNA形成，因此可能增加了其被细胞dsRNA传感器的识别。尽管许多上述关于最佳IVT mRNA生产的考虑因素已在一系列体外和体内实验中进行了检查，但关于它们对疫苗免疫原性的临床前模型的影响的细节不足。 自扩增mRNA疫苗。使用IVT mRNA的saRNA疫苗已经研究了十多年。这种模式通常使用来自α病毒的序列，其中非结构蛋白（编码RNA依赖性RNA聚合酶的复制酶基因）是完整的，而结构蛋白被感兴趣的抗原所取代。与非复制性mRNA疫苗相比，saRNA疫苗有可能以较低的剂量给人类接种，以诱导保护性免疫反应，减少疫苗诱导的不良事件和成本。与非复制性mRNA类似，saRNA也包含5′帽、5′-UTR、编码区、3′-UTR和聚(A)尾（图1）；因此，这些元素的病毒骨架特异性优化可以产生改进的疫苗设计。在saRNA摄取后，病毒复制酶产生多个编码抗原的RNA副本，导致持续的抗原生产。在RNA自扩增过程中，通常会生成dsRNA中间体，这些中间体通过激活各种细胞RNA传感器（例如TLR3、OAS、PKR、RIG-I和MDA5）来引发强烈的免疫激活，特别是通过激活I型干扰素反应15。这种强烈的炎症反应有利于免疫细胞的激活，但限制了来自saRNA的蛋白生产并降低了耐受性。saRNA疫苗在临床前模型中显示出早期的希望，即使在低疫苗剂量下也能诱导出强大的抗体和T细胞反应。相反，它们在早期COVID-19疫苗试验中在人类中的表现并不好。然而，最近的一项临床研究报告称，与用作加强剂量的BNT162b2核苷修饰mRNA配方相比，ARCT-154（Arcturus）COVID-19 saRNA-LNP疫苗的非劣性，用于以前接种过任何两种批准的COVID-19 mRNA疫苗的个体。ARCT-154和BNT162b2诱导的不良事件是可比的。值得注意的是，与BNT162b2（30微克）相比，ARCT-154的使用剂量要低得多（5微克）。由于这些有希望的发现，ARCT-154在日本获得许可，成为第三种获得批准的基于mRNA的药物。 saRNAs由于兼容性问题，通常使用传统的未修饰核苷酸生产，但最近的一项开创性出版物报告称，将某些未修饰核苷酸完全替换为修饰核苷酸，可以产生具有增加的翻译能力和显著降低的炎症能力的功能性saRNAs。具体来说，含有5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶修饰的saRNAs在体外细胞转染效率方面优于其N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA对应物。最重要的是，当以低剂量（10纳克RNA）使用时，含有5-甲基胞嘧啶的SARS-CoV-2 saRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导出比N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA-LNP疫苗更高的刺突抗原特异性IgG滴度和更高水平的保护。如果这些发现可以转化为人类，这可能为saRNA疫苗领域开辟新的道路。最近对saRNA疫苗的研究工作产生了创新的双组分载体系统，其中感兴趣的抗原和复制酶分别编码在不同的mRNAs上（图1）。分割载体系统是有利的，因为saRNA的长度可以减少，减轻RNA不稳定的问题，简化疫苗生产，并允许对双组分平台的两个组成部分进行单独优化。值得注意的是，与这种模式的成功使用相关的挑战是，两个RNA组分应该在同一细胞中存在，否则载体系统将无法工作。到目前为止，这两个组分的saRNA模式只在小鼠中进行了测试；因此，有必要在更高阶物种中进行研究。 2.2.mRNA疫苗的递送材料 mRNA疫苗递送的主题最近已经回顾了；因此，下面只讨论最关键的考虑因素和最新的发现。由于mRNA是一个大的、带负电荷的分子，它通过细胞膜的被动转移是一个低效的过程。早期的mRNA疫苗研究使用了物理方法（例如，基因枪和电穿孔）、精氨酸或聚合物复合mRNA，或者给药载有RNA的树突细胞来诱导保护性免疫。尽管这些方法在临床前研究中显示出一些希望，但它们在更高级的临床前和人类试验中并未显示出足够的效力和/或被证明是不切实际的。几十年来，永久带正电荷的脂质已被用于体外mRNA递送，但由于与带负电荷的血清蛋白的广泛相互作用，它们主要用于体内用途的次优选择；然而，这主要是在静脉注射纳米颗粒递送的背景下进行的，对于肌肉内给药的传染病mRNA疫苗可能具有有限的相关性。2010年代通过开发含有“可电离”脂质的LNPs解决了递送问题，它们通常由四个组成部分：磷脂质（辅助脂质）、胆固醇、聚乙二醇（PEG）缀合脂质和阳离子可电离氨基脂质（pKa通常为6.0-6.8），与封装的核酸一起，可以形成通常为50-150纳米的稳定颗粒。可电离脂质在生理pH下不带电荷，这使它们比永久带正电荷的替代品更安全。它们促进mRNA的细胞摄取，并通过在内体酸化后变得带正电荷来破坏内体膜，从而将核酸货物从内体释放到细胞质中。此外，它们为mRNA疫苗提供了强大的佐剂活性。mRNA-LNP疫苗的这种固有免疫刺激性活动允许在不添加进一步佐剂的情况下诱导出强大的保护性免疫反应。将可电离LNPs作为有效的核酸载体和强大的免疫佐剂的发现是偶然的和开创性的创新，它允许开发成功的COVID-19 mRNA疫苗mRNA-1273和BNT162b2。核苷修饰的mRNA-LNP疫苗平台的成功在于使用最少的免疫原性mRNA来最大化蛋白（抗原）生产，结合LNPs有效递送货物和促进强烈抗原特异性免疫反应的能力。 可电离LNPs的高度炎症性质可以被认为是一把双刃剑：虽然它对于诱导强烈的免疫反应至关重要，但它也可以限制它们可以如何被管理。通过鼻内疫苗管理来诱导粘膜免疫反应特别具有挑战性。然而，Moderna的一项研究最近证明了通过鼻内给药的SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗在仓鼠中的效力，这表明优化可能会克服鼻内给药LNPs的低耐受性和安全性。尽管可电离LNPs是最先进的配方，但其他材料也用于实验性RNA疫苗中，可能会为给药途径提供更多的灵活性。一种新型纳米载体，称为脂质无机纳米颗粒（LION，一种阳离子油包水乳液），被优化用于saRNA的递送，然后在临床前和临床研究中用于mRNA疫苗开发（NCT04844268，NCT05132907）。 阳离子聚合物与mRNA形成复合物，可以通过目标细胞的内吞作用被摄取。早期研究使用聚乙二烯亚胺-saRNA复合物在小鼠中诱导针对流感病毒的免疫反应。由于聚乙二烯亚胺可能显示出高水平的毒性，它不是广泛使用的RNA递送材料。树状分子（超支化聚合物树状结构）也在针对埃博拉病毒、流感病毒、寨卡病毒（ZIKV）和弓形虫的临床前saRNA疫苗研究中显示出效力，但尚未报告使用该平台在大型动物或人类中的研究。 最近的一项开创性研究表明，阳离子可生物降解聚合物纳米颗粒（聚（胺-共-酯）(PACE)）可用于通过鼻内途径在啮齿动物中进行粘膜（肺部）免疫接种，以接种针对SARS-CoV-2 mRNA疫苗，以引发保护性免疫。优化含胺端基增强了mRNA从内吞颗粒中的内质网逃逸，PEG含量的修改进一步提高了PACE颗粒的mRNA传递。该平台证明了其安全性，因为在将PACE-mRNA传递给小鼠后，未发现肝脏酶水平升高或肺部有任何损害。最重要的是，作者证明了通过气管内传递的PACE-mRNA复合物被小鼠肺部的上皮细胞和抗原呈递细胞吸收，并表明他们的SARS-CoV-2 spike编码疫苗能在仓鼠中诱导保护性免疫。总体而言，新颖的PACE-mRNA平台对于引发粘膜免疫反应非常有价值，这对于限制呼吸道病原体的传播至关重要。大型动物研究和临床试验将很重要，以确认在啮齿动物中PACE-mRNA的令人印象深刻的发现是否能转化为更高阶物种。 3.mRNA疫苗的作用机制 从高层次上看，传染病mRNA疫苗的作用机制相当简单：编码一个或多个外来抗原的mRNA-LNPs（在大多数情况下）通过肌肉注射，被表达编码抗原的各种细胞类型吸收，然后被免疫系统识别并触发免疫反应。然而，许多关键问题仍然没有答案。哪些细胞正在表达抗原？它如何到达淋巴器官？先天免疫受体是如何被触发的？LNPs在mRNA疫苗接种后诱导免疫反应中的作用是什么？这些主题已经在27中广泛讨论；因此，下面将简要总结最关键的发现。 3.1.抗原表达和运输的位置 在肌肉注射mRNA-LNPs后，可以在脾脏、淋巴结和血浆中发现编码抗原的mRNA，如在非人类灵长类动物（NHPs）和人类的临床前模型中所示。mRNA在体内持续数天或更长时间，这取决于剂量和LNP的类型。更重要的是，肌肉注射的mRNA-LNPs的蛋白表达发生在注射部位，但血浆（血液）、肝脏中也检测到一些蛋白，可能还有其他器官，包括二级淋巴器官。在NHPs中进行的研究发现，许多浸润的免疫细胞以及成纤维细胞和脂肪细胞在注射部位翻译蛋白。虽然一些研究报告了mRNA-LNP的摄取和蛋白在肌细胞中的表达，但其他研究显示肌细胞没有参与。早期使用saRNA的研究表明，肌细胞是表达和呈递抗原的主要细胞类型。观察到的差异可能是由于LNP配方、细胞分析协议或mRNA平台（非复制mRNA与saRNA）的差异（图2）。根据这些主要在NHPs中进行的研究，很可能是表达疫苗抗原的巨噬细胞和单核细胞迁移到引流淋巴结（dLN）以向适应性免疫细胞呈递抗原；然而，也有可能是其他情况。使用saRNA疫苗的小鼠研究报告称，来自骨髓的浸润性抗原呈递细胞，包括树突状细胞，可能从转染的肌细胞中获取抗原，然后将其呈递给适应性免疫细胞，包括CD8+ T细胞。同样非常可能的是，LNPs可以通过淋巴系统通过被动运输到达dLNs（图2）。在NHPs中，可以在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞以及组织细胞、网状细胞和内皮细胞中检测到mRNA或抗原，无论是通过肌肉注射还是皮内免疫。在NHPs的dLN中的B细胞和T细胞中也观察到mRNA或抗原的存在，但水平较低。在人类中，mRNA和/或抗原有效地运输到淋巴结并启动长达数月的生发中心反应。 抗原表达的位置高度相关，因为它可能直接影响适应性免疫反应。例如，在SARS-CoV-2血清阳性的个体中，即使这种反应并不强烈，也在肌肉注射COVID-19 mRNA疫苗后观察到上呼吸道诱导粘膜分泌IgA87。人们认为，只有在粘膜表面局部存在抗原时，才能诱导这种反应。可能是少量的mRNA和/或抗原通过血液运输到上呼吸道表面，正如在血浆中存在编码抗原的mRNA的研究支持的那样。 图2 | 肌肉注射后mRNA-LNP疫苗的转运。a. mRNA和由mRNA表达的抗原被渗透的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞和邻近的脂肪细胞以及内皮细胞吸收。肌肉注射mRNA疫苗后肌细胞吸收mRNA或表达抗原的程度尚不完全清楚。b. 抗原（可能通过迁移的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞）和mRNA-脂质纳米颗粒（LNPs）随后被运输到淋巴结，在淋巴结中巨噬细胞、单核细胞、组织细胞、不同的树突状细胞亚群和与皮质窦、髓窦、副皮质窦和 trabeculae 相关的内皮细胞表达抗原。引流淋巴结中的B细胞和T细胞也表达低水平的抗原（未描绘）。尽管大多数疫苗抗原和/或mRNA在免疫后几天内变得不可检测，但在超过1个月的时间内可以在生发中心检测到疫苗mRNA，并且生发中心反应可以在人类中维持数月。暂时地，mRNA也可以在血浆、肝脏、脾脏中找到，并且根据LNP配方可能在其他地方找到。该图基于非人灵长类动物和人类的发现。 3.2.mRNA和LNP的先天感应 疫苗成分的先天免疫信号是启动强大的适应性免疫反应所必需的。然而，非常强大的免疫激活（特别是I型干扰素的产生）可能是有害的，因为它可以关闭mRNA的抗原表达并引起副作用。如上所述，未修饰和未纯化的IVT mRNA可以激活许多免疫传感器，但用N1-甲基假尿嘧啶修饰mRNA并纯化以去除dsRNA显著降低了mRNA感应。 除了编码抗原的mRNA外，LNP载体的组成部分，特别是离子化脂质，也触发先天免疫反应。研究表明，含有重组蛋白的空的、可电离的LNP比与重组蛋白一起使用的商业MF59样佐剂具有更强的佐剂活性，并且这种佐剂活性高度依赖于可电离的脂质。在另一项研究中，用含有可电离脂质SM-102和核苷修饰的mRNA处理的人外周血单核细胞产生了许多炎症细胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF、CCL5、VEGFA和G-CSF62。IL-1β特别值得关注，因为它是宿主防御反应对感染或损伤的关键介质，其释放意味着炎症体的形成。尽管还不完全了解LNP中的脂质如何触发先天免疫激活，但一个新兴的假设是内质网膜的破坏可能起作用。内质网逃逸是mRNA进入细胞质的重要步骤，并由LNP中的脂质促进。然而，最近，这种内质网损伤也被证明可以直接通过galectin识别和结合触发炎症。抑制galectins或使用更可生物降解的可电离脂质结构可能为未来减少免疫激活提供策略。 在小鼠中评估BNT162b2发现它通过激活dLN中的自然杀伤细胞和CD8+ T细胞触发干扰素反应，并且根据敲除小鼠研究，这种反应依赖于MDA5信号。由于RIG-I和MDA5都通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）信号传导，这一发现与报道的mRNA-LNPs的MAVS独立免疫激活形成对比。在人类中进行的一项开创性研究评估了对BNT162b2的先天免疫反应，发现先天免疫被强烈激活，包括强大的抗病毒签名，具体来说，是I型干扰素反应和RIG-I样信号的上调。在人类中诱导干扰素途径与这些疫苗的观察到的反应原性一致，认为这是由干扰素反应触发的。这些研究的部分不同发现可能反映了疫苗制剂（mRNA设计和生产，不同的LNPs）之间的差异以及小鼠模型和人类之间的免疫反应激活差异。 4.临床前和临床mRNA疫苗 由于COVID-19 mRNA疫苗的成功，近年来发表的关于mRNA疫苗的研究数量显著增加。不仅针对多种病毒，还针对某些细菌和寄生虫，包括蜱虫，其中一些已经进展到临床研究（表1）。下面总结了mRNA疫苗的最新临床前和临床工作。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗已经被广泛审查，这里将只突出COVID-19疫苗报告中具有高临床相关性的方面（方框1，下面讨论）。将集中讨论“主动”免疫工作，而mRNA编码单克隆抗体的最新发现总结在方框3和表2中。 4.1.流感病毒 季节性流感病毒疫苗通常显示出次优的保护水平；因此，基于mRNA的流感病毒疫苗受到了显著关注。与广泛使用的鸡蛋生产疫苗相比，mRNA-LNP平台技术有两个重要优势。首先，基于mRNA的季节性流感病毒疫苗可以快速设计和大规模生产。与基于鸡蛋的疫苗不同，在mRNA疫苗生产过程中没有引入不需要的突变的风险。此外，制造的便利性和大规模生产在大流行情景中可能是至关重要的。多价mRNA疫苗（针对多个抗原）可以诱导广泛的免疫。早期流感mRNA疫苗研究，通常使用单一抗原作为疫苗目标，展示了令人信服的临床前发现。在过去的5年中，下一代流感病毒mRNA疫苗已经使用了合理设计的抗原和/或多个抗原来增加保护性免疫反应的广度，并且，重要的是，临床试验的结果已经发表。Moderna在2015年开始了第一阶段的试验，使用单价核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码H10N8和H7N9流感病毒的血凝素。当以50 µg或100 µg剂量肌肉注射时，这些疫苗具有适度的免疫原性和良好的耐受性，但抗体滴度相当快地下降。Moderna和其他公司在过去几年中也开始了临床试验——也使用了多价方法——一些发现最近已经公开。例如，在一项I-II期试验中，肌肉注射单剂量的mRNA-1010，一种四价季节性mRNA-LNP疫苗候选物，编码四种全长血凝素（世卫组织推荐用于2020-2021年流感季节的流感疫苗），在所有测试剂量（20 µg、50 µg和100 µg）下，针对疫苗匹配的流感A型病毒株诱导了更高的血凝素抑制（HAI）滴度，与灭活的季节性流感疫苗相比，针对流感B型病毒株的滴度相当。有趣的是，mRNA-1010的III期试验的中期结果不那么令人鼓舞；mRNA疫苗比季节性流感病毒疫苗诱导了更多的不良事件（分别为70%和48%），并且针对流感A型病毒显示出类似的免疫原性，针对流感B型病毒株的免疫原性较差。这些结果表明，可能需要改进的mRNA平台技术或合理设计的免疫原，以诱导优于当前许可的流感病毒疫苗所诱导的免疫。此外，添加其他抗原，如神经氨酸酶，可能有助于增加所诱导免疫的效力和广度。神经氨酸酶免疫原包含在mRNA-1020和mRNA-1030（Moderna）中，以及正在人类试验中测试的其他几种mRNA疫苗中（表1）。最后，值得一提的是，mRNA-LNP疫苗试验（例如，NCT05375838、NCT05596734、NCT05585632），使用联合配方，不仅针对流感病毒，还针对SARS-CoV-2和RSV，正在进行中，并且在人类中显示出前景（表1）。 4.2.呼吸道合胞病毒 RSV在婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体中引起严重的呼吸道疾病。RSV疫苗开发面临的一个主要障碍是未能诱导针对RSV融合（F）糖蛋白的强大中和抗体（nAbs），该蛋白介导病毒和目标细胞膜的融合。随着对RSV F的原子结构、构象变化和免疫原性的更好理解，可以合理设计针对F的预融合构象的抗原，并诱导强大的nAb反应。基于预融合F蛋白的疫苗针对老年人和孕妇（以保护新生儿）已于2023年获得FDA批准。Moderna在临床开发中有几种RSV mRNA-LNP疫苗候选物，并且一些结果已经发表。在成功地对mRNA-1777（参考文献103）进行临床前评估后，这是一种预融合稳定的RSV F编码的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，它在I期临床研究中进行了评估。疫苗在所有疫苗剂量（18-49岁成人25-200 µg和60-79岁成人25-300 µg）后单次肌肉注射耐受性良好，并以剂量依赖性方式诱导针对RSV A型和B型nAbs。此外，mRNA-1777诱发了可测量的抗原特异性CD4+ T细胞反应。一种改进版本称为mRNA-1345在一项大型III期试验中进行了测试，有35,541名60岁及以上的参与者。总体而言，疫苗在单剂量50 µg mRNA-LNP后耐受性良好，并对至少有两个症状的RSV相关下呼吸道疾病显示出83.7%的效力，对至少有三个症状的疾病显示出82.4%的效力。其对RSV相关急性呼吸道疾病的效力为68.4%。重要的是，mRNA-1345（以mRESVIA的名义）最近获得了FDA的批准，成为Moderna第二个获批的产品。该疫苗目前正在5-24个月大的儿童（NCT05743881）和12-59个月大的RSV血清阳性儿童（NCT04528719）中进行I期试验。 4.3.其他呼吸道病毒 人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒（PIV）都会引起呼吸道疾病，主要影响婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体，目前没有获得许可的疫苗。Moderna开发了一种双价疫苗候选物mRNA-1653，编码hMPV和PIV3的全长膜结合融合蛋白。在I期研究（NCT03392389）中，两次肌肉免疫接种（间隔4周）使用相对较高的疫苗剂量（75 µg、150 µg和300 µg）针对两种疫苗目标诱导了强大的中和抗体（nAb）反应107。有趣的是，在给予更高疫苗剂量后检测到类似的nAb滴度，但不良事件是剂量依赖性的。在大多数初次加强剂量组中，针对hMPV A和B的nAb滴度在首次疫苗剂量给药后13个月仍高于基线，而针对PIV3的这种情况仅在300 µg组中观察到。还进行了另一项试验mRNA-1653（NCT04144348），包括12-59个月大的成人和儿童，但结果尚未发表。 总体而言，mRNA-LNP平台可以成功用于针对呼吸道病毒，因为这样的疫苗可以快速开发和生产，并且基于显著的临床经验（表1）——它们通常耐受性良好，可以诱导强大的nAb反应，并且可以根据需要调整以针对快速变化的病毒。然而，需要克服一些限制，例如人类中缺乏足够的抗体持久性或保护性粘膜免疫。 4.4.人类免疫缺陷病毒1 HIV-1感染影响着数千万人口，每年约有150万新感染者登记。HIV-1是最具有挑战性的疫苗目标之一，因为它的遗传多样性、复杂的免疫逃避机制和包膜（Env）糖蛋白的免疫原性差，这是抗HIV-1 nAbs的唯一靶标。因此，即使在40年的积极研究之后，也没有HIV-1疫苗可供人类使用。最近使用mRNA-LNP编码的合理设计的免疫原在各种动物模型中发表的研究显示出一些希望。这些报告证明了在小鼠中使用镶嵌免疫原诱导针对HIV-1蛋白质组保守区域的多功能T细胞反应，在使用saRNA编码的纳米粒子免疫原的转基因小鼠中诱导体细胞超突变到广泛中和抗体谱系，以及在NHPs中使用各种工程Env mRNA-LNPs产生多功能抗体。此外，在转基因小鼠模型中的研究表明，铁蛋白纳米粒子mRNA-LNP疫苗可以诱导具有中和异质HIV-1分离株能力的抗体，并且针对mRNA-LNP编码免疫原的种系抗体成功地启动了广泛中和抗体前体。一项开创性的NHP研究表明，一种共同表达膜结合Env和猴免疫缺陷病毒gag蛋白、产生类似病毒颗粒的mRNA-LNP疫苗，刺激了针对二级异质猴-人类免疫缺陷病毒的nAbs。 总体而言，使用合理设计的免疫原的有前景的临床前发现为临床发展铺平了道路。事实上，Moderna正在进行的I期临床研究（NCT05001373）评估上述纳米粒子免疫原（mRNA-1644）编码为mRNA-LNP以及第二个纳米粒子构建物mRNA-1644v2-Core。第二项试验（NCT05217641）使用mRNA编码（mRNA-1574）合理设计的Env三聚体在健康个体中（表1），美国国立卫生研究院还开始了一项I期研究（NCT05903339）利用mRNA编码的基于铁蛋白纳米粒子的免疫原。 4.5.黄病毒 黄病毒代表了一个多样的家族，主要是通过节肢动物传播的病原体，具有显著的流行潜力。已经开发了针对某些类型的黄病毒的许可疫苗，如日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病毒和登革热病毒（DENV），使用的是活减毒病毒、化学灭活病毒或病毒载体。人类还需要开发针对其他可能在人类群体中迅速传播的黄病毒成员的疫苗。新疫苗需要解决现有疫苗的一些缺点，如保护性免疫的广度不足（DENV）或可能引起不良事件的潜力，如抗体依赖性增强。能够诱导针对多种黄病毒的保护性免疫的多组分疫苗也将非常理想。疫苗的持久性也很关键，因为nAb水平的下降可能会增强疾病。有趣的是，2017年发表的首次突破性研究（使用核苷修饰的mRNA-LNP疫苗）证明了该平台能够诱导小鼠和NHPs对ZIKV的保护性免疫反应。在随后的几年中，针对黄病毒抗原的mRNA或saRNA平台在针对一系列目标的临床前研究中显示出希望，如ZIKV、DENV、波瓦桑病毒和黄热病毒。Moderna开发了第一代和第二代ZIKV mRNA-LNP疫苗，分别称为mRNA-1325和mRNA-1893。两种疫苗都编码ZIKV的前膜和Env糖蛋白，它们只在编码序列中相差五个氨基酸，并使用不同的前导序列。mRNA-1893在1/20的剂量下诱发了与mRNA-1325相当的nAb滴度，可能由于mRNA-1893能够形成类似病毒颗粒，并且在NHPs中提供了完整的针对ZIKV挑战的保护。两种疫苗都在I期临床试验（NCT03014089和NCT04064905）中以引导增强设置（两次注射之间4周）在黄病毒血清阴性或血清阳性的健康个体中进行了测试。总的来说，这些试验的发现与其他I期安全性和免疫原性mRNA疫苗试验相似；疫苗在广泛的剂量范围（10-250 µg）内耐受性良好，并且在更高剂量和第二次免疫后发现更多的不良事件。虽然mRNA-1325诱导了较差的nAb反应，但mRNA-1893表现良好，所有剂量在黄病毒血清阴性和血清阳性个体中都诱导了长期存活的（>13个月的初次免疫后）nAb反应。 4.6.其他病毒 针对多种其他相关的人类致病病毒开发了mRNA疫苗候选物。几个RNA病毒家族的成员可以引起人类的病毒性出血热，如沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒和黄病毒，大多数这些病原体没有疫苗可用。虽然大多数出血热病毒（HFVs）被认为是被忽视的热带疾病，但所有这些病原体的公共卫生影响是显著的。像2014-2016年西非埃博拉病毒这样的大规模爆发，以及潜在的大流行，是主要关注的问题。由于这些病毒组中的一些潜在疫苗抗原（例如，布尼亚病毒糖蛋白）具有复杂的折叠，并且使用标准方法难以表达，mRNA平台非常适合针对这些病原体的疫苗开发。尽管针对最相关的埃博拉病毒之一，扎伊尔埃博拉病毒，有两种病毒载体疫苗可用，但对载体平台的安全性的担忧证明了使用替代技术开发新的埃博拉病毒疫苗的合理性。针对埃博拉病毒糖蛋白的自复制和非复制mRNA疫苗在啮齿动物中诱导了保护性免疫，这为将来在大型动物中，可能在人类中进行研究提供了理由。同样有希望的结果也在使用mRNA疫苗针对其他HFVs，如拉沙病毒、克里米亚-刚果HFV和严重发热伴血小板减少综合征病毒，在啮齿动物疫苗研究中获得。 针对具有大流行潜力的其他病毒，如尼帕病毒和猴痘病毒（MPXV），已开发了mRNA疫苗候选物。两项针对尼帕病毒的临床前研究——一项针对可溶性亨德拉病毒糖蛋白，另一项针对与尼帕病毒糖蛋白单体共价连接的预融合稳定融合蛋白——分别在叙利亚仓鼠和 mice 中证明了保护性免疫。后者的疫苗候选物（mRNA-1215）正在由Moderna在I期临床试验（NCT05398796）中进行测试。针对2022年病毒爆发，迅速生成并测试了针对MPXV的mRNA疫苗。Moderna开发了一种针对四种高度保守的MPXV表面蛋白（M1, A29, A35 和 B6）的疫苗候选物，这些蛋白参与病毒附着，并在 mice 中证明了对相关牛痘病毒（VACV）的感染保护。该公司已开始对其MPXV mRNA疫苗候选物mRNA-1769进行I期试验（NCT05995275）。采用类似方法——针对病毒融合蛋白——在 mice 中证明了对VACV挑战的保护性免疫。BioNTech还开发了MPXV疫苗候选物，四价BNT166a针对M1, A35, B6 和 H3，以及不含H3组分的三价疫苗BNT166c。这两种疫苗都保护了 mice 免受VACV、MPXV I型和IIb型感染，BNT166a保护了NHPs免受致命的I型MPXV感染。BNT166a已进入临床试验（NCT05988203）。 针对狂犬病病毒的许可疫苗，使用灭活病原体，已经挽救了过去几十年中无数的生命。然而，现有配方的限制包括生产成本相对较高以及在流行区域需要多次剂量。多个针对病毒糖蛋白的mRNA疫苗候选物在小型和大型动物中显示出希望。CureVac在其I期试验（NCT03713086）中测试了其未修饰的mRNA-LNP疫苗候选物CV7202，发现疫苗在人类中诱导了nAbs，但只有低疫苗剂量（1 µg和2 µg）在引导增强计划中被良好耐受。转向这种疫苗的核苷修饰版本可能会允许使用更高的疫苗剂量来增加诱导的免疫反应，而不会诱发更多的不良事件。 人巨细胞病毒（HCMV）会导致常见的先天性感染，在免疫受损个体中尤其危险。已经投入了大量精力开发针对HCMV的安全有效的疫苗。几个临床前mRNA疫苗候选物使用核苷修饰的mRNA-LNP来针对病毒融合糖蛋白B和/或五聚体复合物，这些复合物对于进入是必要的，并在 mice、兔子和NHPs 中诱导了nAbs和细胞免疫反应。Moderna在I期试验中测试了mRNA-1647（一种多价HCMV mRNA-LNP疫苗，针对糖蛋白B和五聚体复合物），在0、2和6个月时肌肉注射180 µg剂量，发现在两种血清阴性和血清阳性试验参与者中，HCMV特异性抗体反应多功能且持久，与对照组相比，糖蛋白B特异性IgG反应较低，但总体nAb和抗体依赖性细胞毒性反应更高，后者是MF59佐剂糖蛋白B蛋白疫苗。 针对生殖器疱疹——一种由单纯疱疹病毒类型1（HSV-1）和HSV-2引起的非常常见的性传播疾病——的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗开发也已有报道。理想的抗HSV疫苗将预防痛苦的生殖器病变，并减少或消除病毒脱落，这会危及传播给伴侣和新生儿。一种针对进入分子糖蛋白gD2和两种免疫逃避分子，糖蛋白gC2和gE2的三价HSV-2 mRNA-LNP疫苗，保护了 mice 和豚鼠免于发展成生殖器病变，并减少了病毒脱落。在后续研究中，该疫苗保护了 mice 免受HSV-1生殖器病变和潜伏感染，并为新生 mice 提供了保护。该配方，名为BNT163，目前正在由BioNTech在I期剂量递增、免疫原性和安全性试验中进行测试（NCT05432583）。Moderna还在进行I期试验（NCT06033261），使用HSV-2 mRNA-LNP候选物mRNA-1608，作为肌肉注射的引导增强疫苗。其他几个针对重要人类病毒病原体的有前景的mRNA疫苗候选物正处于临床前或临床开发中，数据有限或没有公开发表，如针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Epstein–Barr病毒（EBV）、水痘-带状疱疹病毒和诺如病毒的候选物。Moderna正在研究临床EBV疫苗候选物mRNA-1189（针对gp42、gp220、gH和gL糖蛋白，NCT05164094）和mRNA-1195（NCT05831111），以预防传染性单核细胞增多症和EBV感染罕见但有时危及生命的后果或长期后遗症，如多发性硬化症。Moderna还在I期试验（NCT05992935）中研究针对诺如病毒感染的mRNA疫苗mRNA-1403（三价）和mRNA-1405（五价）。最后，Moderna（mRNA-1468，针对糖蛋白E）和BioNTech–Pfizer（BNT167，针对糖蛋白E）都有针对水痘-带状疱疹病毒的临床候选疫苗，处于I期（NCT05701800和NCT05703607）。 4.7.细菌 鉴于许多人类病原细菌中抗微生物耐药性的上升，开发安全有效的细菌疫苗是有必要的。然而，与病毒相比，针对细菌的疫苗开发通常更具挑战性，因为潜在的疫苗目标数量众多（细菌基因组通常比病毒基因组大得多），非蛋白质疫苗目标（糖；mRNA疫苗不能用于针对碳水化合物）和高度抗原变异。此外，与病毒疫苗相比，细菌疫苗所需的疫苗诱导免疫反应通常在质量上有所不同。诱导nAbs通常足以保护免受病毒侵害，但细胞外细菌（例如，肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）通过补体介导的杀伤和抗体介导的吞噬作用等免疫机制有效靶向。此外，虽然大多数病毒目标并非绝对需要，但诱导强大的CD8+ T细胞反应通常对于有效靶向细胞内细菌至关重要。 研究表明，mRNA疫苗可能适合针对细菌。通过鼻内递送的未修饰裸mRNA已用于诱导针对结核分枝杆菌（结核病）的免疫反应，该感染影响全球超过十亿人。目前可用的结核病疫苗，卡介苗，效果低，持久性差，经常引起不良事件；因此，生成更安全、更有效的结核病疫苗是一个未得到满足的临床需求。编码四种结核病抗原（esxV、RpfD、PPE60和Ag85B）融合蛋白的saRNA-脂质无机纳米颗粒平台在 mice 中展示了一定程度的针对M. tuberculosis感染的保护。saRNA平台也被用于开发针对A组和B组链球菌的临床前疫苗。 最近，一种核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码经过工程改造的环状置换F1（cp-caf1）耶尔森氏菌抗原，被证明在小鼠中单剂量接种后能诱导强烈的体液反应和对致命瘟疫感染的保护。一种优雅的基于免疫肽组学的方法被应用于识别理想的疫苗靶点，并为单核细胞增生李斯特菌——一种食源性细胞内细菌开发mRNA疫苗。通过在mRNA-LNPs中编码高度呈现的抗原（从多种细菌蛋白中选择），在小鼠挑战研究中实现了对李斯特菌感染的强大CD8+ T细胞反应和保护性免疫。铜绿假单胞菌，一种具有多重耐药菌株的关键人类病原体，也是通气相关肺炎的重要原因，也已成为研究目标。一种包含融合蛋白膜孔F（OprF）-脂蛋白I（OprI）和V抗原（PcrV；铜绿假单胞菌类型I分泌系统的一部分）的mRNA-LNP疫苗，在系统感染小鼠模型中诱导了保护性免疫反应。此外，一种针对莱姆病（美国最常见的媒介传播疾病）的mRNA-LNP疫苗，使用伯氏疏螺旋体的外表面蛋白（OspA）作为疫苗靶点，证明了在小鼠中诱导强烈的细胞和体液免疫反应，并对细菌挑战提供保护。针对蜱唾液蛋白的mRNA-LNP疫苗，用于预防莱姆病等媒介传播疾病，也在啮齿动物中进行了研究。Moderna和BioNTech正在进行针对莱姆病和结核病的mRNA疫苗的临床试验。Moderna的mRNA-1975（七价配方）和mRNA-1982（单价疫苗），都针对OspA，正处于I-II期开发（NCT05975099）。BioNTech的BNT164a1和BNT164b1是处于I期试验（NCT05547464）的结核病疫苗候选物。 4.8.寄生虫 致病寄生虫是影响数亿人、每年造成超过100万人死亡的多样化的真核生物群体。然而，针对这些病原体的疫苗开发极其困难，主要是因为真核细胞作为疫苗靶点的复杂性，以及它们逃避先天和适应性灭菌免疫反应的能力。越来越多的临床前研究表明，mRNA疫苗能够提供针对寄生虫病的保护。例如，针对弓形虫——弓形虫病的致病因子，以及利什曼原虫——利什曼病的原生动物致病因子，开发了具有保护性的临床前mRNA疫苗。针对疟疾的mRNA疫苗候选物也已经产生并进入临床开发。 疟疾感染是世界主要的健康问题之一，每年造成数亿例临床病例和数十万人死亡。疟疾疫苗可以分为三类：针对孢子体或肝期寄生虫的红前期疫苗，针对滋养体或感染红细胞的血液期疫苗，以及针对配子体和蚊子期寄生虫的阻断传播疫苗。一种针对恶性疟原虫（PfCSP）的环孢子体蛋白（CSP）的佐剂蛋白基础红前期疟疾疫苗已被批准用于人类，尽管它显然提供了公共卫生利益，但仍有改进其有效性的余地。近年来，多项临床前研究为核苷修饰的mRNA疫苗能够引发对由P. falciparum和P. vivax引起的疟疾的保护提供了概念验证。疫苗抗原包括PfCSP、P. falciparum的谷氨酸富含蛋白（PfGARP），以及针对P. falciparum的P. falciparum ookinete表面（Pfs）25和230D1蛋白，分别针对红前期、血液期和传播期的P. falciparum病原体。重要的是，BioNTech在2022年开始了一种编码PfCSP的mRNA疫苗候选物BNT165b1的临床开发（NCT05581641）。 一种编码疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）的saRNA疫苗，该因子调节宿主对疟疾的炎症反应，改善了对肝期和血液期疟原虫感染的控制，并在致命的小鼠模型中提供了对再感染的完全保护。在一项机制研究中，静脉注射α-半乳糖神经酰胺-佐剂脂质复合物基mRNA疫苗，编码核糖体蛋白L6（RPL6）疟疾抗原，诱导了肝驻留记忆T细胞，并在小鼠中提供了保护。 虽然P. falciparum疟疾比P. vivax疟疾造成更多死亡，但后者影响更多人（超过30亿人）在全球范围内，并且目前没有批准的疫苗。P. vivax疟疾也更难控制和消除，因为它的休眠肝期可以潜伏数月至数年，然后重新激活。最近的一项小鼠研究开发了使用Pvs25作为疫苗抗原的阻断传播疫苗，并证明了一种优化的全长Pvs25编码核苷修饰的mRNA-LNP疫苗候选物优于对照佐剂Pvs25蛋白疫苗，并激发了更强大和持久的功能性免疫。 总的来说，mRNA基础的疟疾疫苗领域取得了显著的进展，为这类疫苗在可预见的未来将可用于人类提供了希望。 5.挑战、限制和机遇 尽管核苷修饰的mRNA-LNP平台技术在COVID-19大流行期间被证明非常有效，并且是我们大流行病准备的重要部分，但当前一代mRNA疫苗的局限性需要克服，以进一步提高这种疫苗方式的价值。值得注意的是，这些挑战中的许多并不特定于mRNA疫苗，也适用于其他疫苗平台。 5.1.临床前模型的局限性 免疫原性。包括mRNA-LNP疫苗在内的疫苗开发的一个普遍问题是，临床前模型对人类免疫原性的预测价值次优。一个明显的例子是Moderna开发的H10流感病毒疫苗候选物。基于血凝素的H10疫苗在雪貂中诱导了非常高的HAI滴度，达到约1:3,000，这通常很难用传统疫苗平台诱导。同样的疫苗在人类中诱导了短暂的，大约1:100的HAI滴度，在6个月内消退。同样，基于mRNA-LNP的季节性流感病毒疫苗在不同的动物模型中诱导了非常高的中和抗体滴度，但似乎与常规季节性流感病毒疫苗（具有更好的耐受性）在人类中相当——在某些情况下甚至不如——在人类中。对COVID-19 mRNA-LNP疫苗的类似发现；它们在小鼠中诱导强烈和持久的免疫反应，但在人类中免疫反应和动力学较差。NHP模型似乎更能反映人类中的疫苗诱导免疫反应；然而，它们昂贵，其使用引发伦理关注，并且在某些情况下，由于NHPs对某些感染（包括季节性流感病毒）有抵抗力，无法评估疫苗诱导的保护。 安全性和反应原性。在人类中，mRNA-LNP疫苗触发了系统性炎症反应，这在小鼠和其他动物模型的研究中并未预测到。这一发现至少部分是由于不同物种间IL-1受体信号传导的差异62所造成的。这些不良事件（称为反应原性）有时相对较强，包括发热、不适、头痛、身体疼痛等。反应原性在年轻人中更普遍，并且在第二次接种mRNA疫苗后通常更强，这表明不仅先天免疫反应，适应性免疫也有所贡献。有趣的是，有报道称mRNA-1273比BNT162b2引起更强的反应原性，可能由于剂量、mRNA生产程序和LNP配方的差异。疫苗诱导的不良事件可能严重到导致工作小时数的损失，这不仅可能对个人未来接种疫苗的意愿产生负面影响，还会造成经济负担。一些非常罕见的副作用，包括过敏性反应（也见于其他疫苗）和心肌炎，主要见于12至24岁的男性，更为麻烦。mRNA-1273也观察到延迟的大局部反应，最近在HIV-1 mRNA-LNP疫苗（Moderna）的临床试验中报告了皮疹。为了使mRNA-LNP疫苗在常规、非大流行环境中更易被接受，应提高这种疫苗方式的安全性和反应原性。修改LNP配方和改进mRNA设计及生产可能减少先天免疫对mRNA的识别。然而，必须指出反应原性和免疫原性通常相伴出现，具有改进安全性概况的疫苗可能诱导较弱的免疫反应。 一个关键挑战是缺乏评估疫苗诱导副作用的相关动物模型。不同物种间先天免疫受体的微妙差异使得很难基于动物模型中获得的数据来预测人类的反应原性。此外，人类对许多病原体的预先存在的免疫和各种免疫激活状态可能影响反应原性，而在动物中模拟这些条件是具有挑战性的。识别和调查非常罕见的副作用，如心肌炎或过敏性反应，更是复杂，因为它们的流行率通常非常低（每100,000剂接种疫苗的事件数很少）。因此，即使是III期临床试验，也不太可能足以在这方面获得相关信息。 5.2.诱导期望的免疫反应 粘膜免疫。肌肉注射或皮内注射的疫苗通常在上呼吸道（URT）中诱导粘膜免疫的能力较差。然而，URT中的局部免疫对于抵抗呼吸道病毒感染很重要，因为这是这些病原体的入口以及传播的场所（图3）。在COVID-19疫苗开发的早期就已注意到，注射的mRNA疫苗可能会很好地保护人类免受有症状疾病的侵害，但可能不会有力地保护免受感染本身，这在这些疫苗的临床前开发中已在动物模型中观察到。现在已清楚，这一预测是准确的。尽管COVID-19 mRNA疫苗可以在以前感染过SARS-CoV-2的个体中引起一定程度的粘膜免疫，但与SARS-CoV-2感染相比，它们通常不会在URT中诱导强大的抗体反应。这是有问题的，因为URT中的粘膜免疫与免受SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的感染有关。一个关键挑战是制定mRNA疫苗的配方，通过诱导分泌型IgA和驻留记忆T细胞（图3），安全地在URT中引起强烈的粘膜免疫反应。解决这个问题的一个策略是开发可以通过鼻内或口服给药安全有效地递送到粘膜表面的mRNA配方。大多数当前基于LNP的mRNA配方对这种递送途径来说并不理想，因为吸收差和毒性。其他类型的mRNA递送分子，如聚合物，可能更适合此目的。事实上，通过各种递送方式的改变，已经取得了粘膜mRNA疫苗配方的首次成功尝试，这些有希望的研究将为这一重要的疫苗途径提供前进的道路。第二种策略可能是使用注射的mRNA疫苗，除了编码抗原外，还编码驱动B细胞和T细胞反应到粘膜部位的因素或甚至是归巢分子。然而，这种方法首先需要阐明URT的归巢机制200。在粘膜表面针对细菌感染的免疫方面，共表达驱动Th17 T细胞反应的细胞因子或转录因子也可能有益。 图3 | 粘膜免疫、呼吸道病毒和mRNA疫苗接种。a. 上呼吸道的表面是呼吸道病毒的主要入口点，而下呼吸道的病毒复制通常与严重疾病相关。人们认为，局部产生的分泌型IgA1（sIgA1）是保护上呼吸道的主要抗体类型，而血清IgG1被认为是保护下呼吸道的主要抗体类型。b. 通过肌肉注射接种mRNA-脂质纳米颗粒疫苗可以诱导强烈的系统性IgG反应；这些IgG的一部分也会短暂地出现在上呼吸道。然而，局部sIgA1反应并未被强烈诱导，因此病毒传播未被有效阻断。c. 开发粘膜mRNA疫苗，例如，使用新的传递载体，如聚合物或较少炎症的脂质纳米颗粒，可能允许安全地在上呼吸道诱导局部抗体和细胞免疫反应。d. 共同传递编码在B细胞和T细胞中表达的上呼吸道归巢分子的mRNA，可能即使在肌肉注射mRNA疫苗后也能激发有效的粘膜免疫反应。c和d部分中的免疫反应也可能在突破性感染的情况下阻断进一步传播。 预先存在的免疫和印记。COVID-19 mRNA-LNP疫苗在大多数接种个体中引起了强大的保护性免疫反应。对一个完全未接触过的群体进行疫苗接种是一个罕见的场景，主要涉及新出现的大流行病原体。人类通常对病原体有广泛和复杂的预先存在的免疫，包括流感病毒、RSV，现在还有SARS-CoV-2，这种预先存在的免疫将以积极和消极的方式影响疫苗接种的免疫反应。在对SARS-CoV-2 spike蛋白有广泛预先存在的免疫的个体中，额外的mRNA疫苗加强剂量的增强效果要小得多（预先存在的抗体对疫苗接种的免疫反应的抑制作用也已描述过流感）。此外，预先存在的免疫可能影响免疫反应的质量和特征。由于病毒发生了抗原变化，因此在2022年引入了基于SARS-CoV-2变体的mRNA疫苗。当更新后的疫苗用于以前接触过原始SARS-CoV-2 spike的个体时，大多数反应是与原始SARS-CoV-2 spike蛋白交叉反应的，并且几乎未诱导针对变体的特定新生免疫。这让人想起背boost或原始抗原罪行型现象，描述了流感病毒，其中暴露于新变体病毒引起一个交叉反应反应，针对新毒株和生命早期遇到的毒株，以牺牲对新毒株的新生株特异性反应为代价。虽然这些与预先存在的免疫和缺乏强大的新生反应的问题是一个普遍现象，也是所有疫苗平台的问题，但测试mRNA疫苗在具有预先存在免疫的动物模型中将是有益的，以促进它们的成功部署。此外，由于mRNA配方也可以设计为共表达细胞因子和趋化因子，该平台可能特别适合开发专门针对原始B细胞而非记忆B细胞的疫苗，以驱动更好的新生变体特异性反应。这不仅对SARS-CoV-2很重要，对流感病毒疫苗也很重要。 疫苗诱导的免疫反应的持久性。mRNA-LNP疫苗诱导的免疫反应的持久性一直是讨论的重要问题。针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗在SARS-CoV-2未接触过的个体中引起了强烈的浆细胞反应，导致针对SARS-CoV-2的抗体滴度显著增加。浆细胞是短期存活的B细胞，它们在外围循环并产生抗体，但只活跃约2周。然后抗体水平开始下降，IgG的半衰期约为30天。由于mRNA疫苗最初诱导的针对SARS-CoV-2的高抗体水平，这种下降看起来很戏剧性，通常在免疫后6个月内抗体滴度减少10-20倍。与此相比，腺病毒载体疫苗平台观察到的抗体衰减速度较慢；然而，这些疫苗并没有诱导最初的高抗体峰值。实际上，尽管由COVID-19 mRNA疫苗诱导的针对SARS-CoV-2的特异性抗体滴度最初开始下降，但最终会变得稳定。这些稳定的长期滴度由骨髓中不同的B细胞亚群产生，称为长期存活的浆细胞，它们通常可以持续一生。还观察到mRNA-LNP疫苗在接种疫苗的人类的淋巴结中引发惊人的长期（数月）生发中心反应。这些可能有助于增加长期存活的浆细胞的频率，但这些持久的生发中心反应的重要性仍然不清楚。总体而言，尽管mRNA疫苗诱导的抗体反应有显著的初始下降，但这可能更多是最初诱导的高抗体峰值的效果，而不是mRNA疫苗实际上无法诱导持久免疫。然而，保持mRNA疫苗接种后的高抗体水平以保证长期保护是可取的。通过优化疫苗配方，将更多的B细胞从生发中心反应引导到骨髓，这可能是可行的。例如，下一代合理设计的LNP可能允许精确靶向关键的免疫细胞类型，并最终诱导所需的免疫反应。其他可能性包括在LNP中加入具有额外佐剂活性的分子，以进一步增强其效力，或共表达转录激活因子、细胞因子或归巢分子，引导B细胞成为长期存活的骨髓浆细胞。 CD8+ T细胞反应。虽然中和和结合抗体作为许多病毒疫苗的保护相关因素，细胞毒性T细胞反应也可能与保护相关（例如，对于流感病毒）。人们认为，当抗体反应未能中和病毒时，CD8+ T细胞反应可以保护免受SARS-CoV-2引起的严重COVID-19进展（通常在抗原漂移变体中看到）。因此，核苷修饰的mRNA疫苗的另一个重要目标是在人类中诱导强大的CD8+ T细胞反应。流感病毒核苷修饰的mRNA疫苗在小鼠中诱导了强大的CD4+ T细胞（和抗体）反应，但CD8+ T细胞反应中等。这些观察在一定程度上适用于人类中的基于mRNA的COVID-19疫苗，其中通常比强大的CD4+ T细胞诱导引起较弱的针对Spike蛋白的CD8+ T细胞反应（尽管CD8+ T细胞似乎足够初始化，可以通过突破性感染被强烈激活）。这与未修饰的非复制mRNA和saRNA疫苗形成对比，这些疫苗已知可以驱动强大的CD8+ T细胞反应，可能由于它们能诱导更高水平的I型干扰素，这有助于诱导更强大的细胞免疫反应。目前尚需探索如何通过核苷修饰的mRNA疫苗更好地激活CD8+ T细胞，以及共表达特定细胞因子或改变mRNA设计和生产或LNP化学是否是解决这一限制的关键。 针对递送载体的抗体产生。mRNA-1273和BNT162b2不仅针对编码的疫苗抗原，而且有些令人惊讶地也针对LNP载体引起了适应性免疫反应。LNP表面的PEG成分被确定为主要的非目标抗体反应的原因。与BNT162b2配方相比，mRNA-1273配方诱导了更高水平的抗PEG抗体，可能由于疫苗配方的不同组成。尽管尚不清楚这些反应是否总是有害的，但重要的是进一步监测这一现象并探索潜在后果。对LNP的抗体可能会影响LNP的摄取，通过移除它们或将它们导向不同的Fc受体承载细胞类型；这可能导致使用相同基于LNP的平台进行重复剂量的效率问题。此外，抗PEG抗体水平的增加可能会导致某些患者群体中使用的其他聚乙二醇化药物的更快清除（因此效果较低）。总的来说，LNP不是免疫学上无活性的分子，并且可以成为适应性免疫反应的目标。然而，存在可能具有较低免疫原性的PEG替代品。 5.3.疫苗配方和选择 多组分疫苗配方。多价mRNA-LNP疫苗的一个有趣但尚未充分研究的方面是mRNA编码的抗原异源多聚体化（hetero-multimerization）的潜在问题。例如，当两种（或更多）不同的SARS-CoV-2变异株刺突蛋白在同一细胞中由mRNA疫苗表达时，可能形成由不同变体单体组成的三聚体。类似的问题可能也出现在含有四种不同类型的血凝素（H1、H3和两种B型血凝素）的基于mRNA-LNP的流感病毒疫苗中。异源三聚体的形成可能导致结果蛋白的错误折叠，从而可能不准确地反映糖蛋白表面的中和或保护性表位。这种理论上的担忧尚未通过实验验证，但可能是原始株-BA.5二价COVID-19 mRNA疫苗相比XBB.1.5单价疫苗表现较差的原因之一，也可能在临床测试的基于mRNA的流感疫苗中流感B病毒组分的较低免疫原性中发挥作用。此外，多价或多组分疫苗的一个组分可能对其他组分产生免疫优势。这在其他疫苗类型中已有描述，并且可能通过调整疫苗中各种mRNA的比例来克服，例如，减少编码优势组分的mRNA量和/或增加亚优势组分的量。 剂量选择。mRNA疫苗临床开发的一个重要方面是剂量选择。最初的SARS-CoV-2 mRNA疫苗临床试验包括100微克或更高剂量的mRNA。mRNA-1273的第一个版本剂量为100微克mRNA，但后来用于加强剂量的版本将剂量减少到50微克，可能是为了减少不良反应。50微克mRNA剂量似乎是当前人类预防性疫苗的耐受性上限（改变mRNA和LNP化学可能有助于改善这一点），这限制了多价mRNA-LNP疫苗中包含的抗原组分的最大数量。例如，目前正在开发的八价mRNA-LNP流感病毒疫苗候选物，包括四种血凝素和四种神经氨酸酶构建物，假设不同组分以相同量使用，为了不超过50微克总疫苗剂量，每个构建物只能使用6.25微克mRNA。目前尚不清楚这些低剂量是否能在人类中诱导足够强大和持久的免疫反应。在未经免疫的人群中，10微克SARS-CoV-2 mRNA剂量比30微克剂量诱导的免疫反应明显较低，这表明mRNA疫苗在临床使用中至少对当前配方存在价数限制。克服这些障碍对于包含流感病毒、RSV、SARS-CoV-2、hMPV和不同副流感病毒以及季节性冠状病毒抗原的泛呼吸道病毒疫苗的开发至关重要。更简单的多价配方，例如包含流感病毒和SARS-CoV-2（甚至RSV）抗原的mRNA-LNP疫苗，已经在开发中（表1）。 对抗原变化的响应。mRNA疫苗的一个关键优势是它们的灵活性，特别是对于那些需要频繁更新的疫苗，如流感病毒疫苗和SARS-CoV-2疫苗。基于灭活病毒的流感疫苗每年更新一次，以反映流通的毒株。为即将到来的北半球季节选择疫苗配方的组分，这一过程每年二月进行，基于监测和预测（南半球疫苗的生产也有类似的过程）。更新疫苗的生产大约需要6个月的时间，在这段时间里，有时变得清楚的是，选择的疫苗株不是最优的，可能与流通的毒株不匹配，对疫苗的有效性产生重大负面影响。SARS-CoV-2 mRNA疫苗在大约2个月内进行了更新和生产。因此，使用mRNA平台进行季节性流感病毒疫苗的潜在可能允许更晚的毒株选择，并且能够开发出比使用传统平台生产的疫苗更匹配流通毒株的疫苗。 反向疫苗学3.0。当新疫苗进入临床开发时，通常只测试一种疫苗抗原，因为Good Manufacturing Practice生产过程的高成本和复杂性通常需要为所选抗原专门设计（框4）。这种抗原可能在不同剂量下进行测试，或与不同的佐剂结合使用，但包含额外版本的抗原通常成本过高。mRNA疫苗克服了这一限制，因为即使抗原序列不同，也可以使用相同的流程进行制造（框4）。mRNA疫苗技术还允许针对大型多亚基抗原或病毒表面抗原，这些抗原由于存在多个跨膜域而难以作为重组蛋白生产（例如，布尼亚病毒GnGc蛋白）。与临床测试几种候选疫苗同时进行的预临床试验中测试许多不同版本的抗原或许多不同的病原体抗原也是现实的。然后可以根据人类试验中获得的数据选择最佳疫苗候选物。这一过程在辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗的选择过程中被利用，其中BNT162b2在临床测试几种不同版本后被选为领先候选物。未来，mRNA疫苗的这一重大优势可能导致对表达许多不同蛋白质且最佳疫苗靶标未知的病原体的疫苗开发取得突破，包括结核病、不同的单细胞和多细胞寄生虫，包括疟原虫和锥虫种类，甚至DNA病毒具有大基因组和未知保护性抗原，如非洲猪瘟病毒。这一“反向疫苗学3.0”过程（图4）可以类似于用于开发B型脑膜炎奈瑟菌疫苗的“反向疫苗学”过程，但将显著更快，并且具有更高的吞吐量（“反向疫苗学2.0”被定义为基于免疫系统与抗原之间相互作用的结构分析的合理疫苗设计）。重要的是，最终的疫苗配方可能在确定正确的保护性靶标抗原后基于另一种疫苗平台（例如，重组蛋白疫苗）。 图4 | mRNA疫苗生产的简单和速度：反向疫苗学3.0。a. 对于大多数传统疫苗平台，需要为每个单独的抗原分别开发包括上游处理、下游处理以及放行标准和测试的流程，并且不同流程之间通常存在显著差异。mRNA生产主要是序列独立的；相同的生产程序可以用来生产任何编码蛋白质抗原的mRNA。这使得Good Manufacturing Practice生产非常灵活，成本效益更高。b. 生产编码许多不同抗原的mRNA疫苗的简便性和灵活性使得“反向疫苗学3.0”成为可能。例如，一个复杂病原体的所有开放阅读框（ORFs），其保护性抗原未知，可以作为mRNA疫苗生产并在动物挑战模型中进行测试，然后可以快速鉴定出具有保护性的抗原，这些抗原随后可以作为疫苗候选物进行更详细的临床前研究，甚至可能进行临床研究。 5.4.疫苗公平和全球获取 mRNA疫苗的一个重要挑战是全球疫苗公平。在COVID-19大流行期间，低收入和中等收入国家（LMICs）获得mRNA疫苗的机会不佳且被延迟。低收入国家通常获得病毒载体和基于灭活病毒的SARS-CoV-2疫苗（或根本没有疫苗）；这是由于定价、获取、超冷存储分销网络的可用性、疫苗民族主义和疫苗外交。mRNA疫苗需要冷冻长期储存的要求即使在高收入国家也可能对疫苗推广造成问题。目前正在开发在4°C甚至室温下稳定的mRNA疫苗，这些热稳定的mRNA疫苗可能会进一步增加mRNA疫苗技术的全球影响。为了让mRNA疫苗技术在全球范围内可用，建立全球各区域的开发和生产能力也很重要。许多传统疫苗生产商和LMICs的初创公司已经开始开发自己的mRNA疫苗配方和设施，这是有希望的。已经开始了一些加强这一努力的倡议，但一些mRNA疫苗制造商已经在缩减他们向LMICs转移技术的努力。同样还有待观察的是，mRNA和LNP技术的潜在知识产权问题是否可以解决，以促进LMIC疫苗生产商的获取。全球分布的mRNA疫苗开发商和生产商将无疑增加大流行病的准备，并允许LMICs依赖自己的疫苗，而不是依赖高收入国家及其疫苗外交。 6.结论和展望 尽管基于RNA的疫苗，特别是核苷修饰的mRNA-LNP配方，多年来显示出巨大的希望，但正是COVID-19大流行使它们成为焦点，并导致了首批获得许可的mRNA疫苗。然而，我们远未实现基于RNA的疫苗的全部潜力，需要进一步的优化来解决当前的限制。在这方面，有机会开发具有增强免疫原性和降低反应原性、更大的稳定性以及能够诱导粘膜免疫反应的新型RNA疫苗配方。除了病毒，还需要针对人类致病细菌、真菌和寄生虫的mRNA疫苗，以及能够同时保护免受几种不同病原体侵害的疫苗。mRNA疫苗设计和制造的灵活性和简便性可能会彻底改变抗原选择和疫苗开发，并可能使得为以前难以捉摸的病原体设计疫苗成为可能。对mRNA疫苗作用机制的更深入理解将指导下一代mRNA疫苗的设计。mRNA疫苗技术为疫苗开发、免疫接种和大流行病准备的未来持有巨大希望，并已经为疫苗学的新的黄金时代做出了贡献。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要:佐剂性和递送性是mRNA疫苗设计的两个关键方面。在现代mRNA疫苗中，佐剂功能被整合到mRNA疫苗纳米颗粒中，允许抗原mRNA和佐剂以统一的、一体化的形式共递送。在这种配方中，许多mRNA疫苗利用mRNA的免疫刺激性特性以及疫苗载体组分（包括脂质和聚合物）作为佐剂。然而，需要谨慎设计，因为过度的佐剂性和不当的先天免疫信号激活反而会阻碍疫苗效果并引发不良反应。mRNA疫苗还需要递送系统来实现在淋巴器官内的抗原呈递细胞（APCs）中的抗原表达。一些疫苗直接针对淋巴器官中的APCs，而另一些则依赖于APCs在摄取mRNA疫苗后迁移到引流淋巴结。本综述探讨了这些过程的当前机制理解以及基于这种理解正在进行的提高疫苗安全性和有效性的尝试。 1.引言 mRNA为疫苗提供了一个强大的工具。在传染病的情况下，一旦建立了mRNA递送平台，只需改变mRNA序列，疫苗就可以针对各种病原体。这一特性使得两种mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273在由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）爆发后的一年内迅速获得紧急批准。这些疫苗在各种疫苗形式中展示了高效果，对控制大流行起到了关键作用。mRNA疫苗有效诱导中和抗体，有助于其在预防SARS-CoV-2感染方面的高效性。此外，mRNA疫苗还激发细胞免疫反应，这些反应比体液免疫反应更持久，更能抵抗病毒突变。细胞免疫可能在预防COVID-19的严重疾病和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的诱导，也使其成为癌症疫苗的一个有吸引力的候选者。mRNA癌症疫苗通过针对共享的肿瘤相关抗原和来自每个患者基因突变的新抗原，在临床试验中显示出有希望的结果。新抗原疫苗的准备需要在识别癌症基因突变并预测合适的表位后迅速适应。在这方面，mRNA疫苗允许通过改变mRNA序列，简单地对应于每个患者中的突变蛋白，快速且方便地准备。从安全角度来看，mRNA在注射后一周内迅速降解，在体内持续存在的风险最小。最近的一项研究在人体样本中解决了这个问题，显示mRNA在接种后一个月内通过定量PCR（qPCR）检测不到。每年数十亿剂的可扩展性是另一个关键属性，特别是在大流行中。 早在1990年代中期就有关于针对传染病和癌症的mRNA疫苗的记录。然而，它们需要多年的研究和技术突破才能达到目前的临床成功，特别是在mRNA合成和递送系统领域。在前者中，mRNA的假尿苷修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，并提高了蛋白质翻译效率。其他关键技术包括添加5'帽和聚A尾，编码和非翻译区域的序列优化，以及去除体外转录mRNA的杂质。这些mRNA合成技术通过避免不良的炎症反应来提高mRNA疫苗的安全性，并通过增加抗原产生效率来增强疫苗效果。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APCs和淋巴组织，并促进mRNA在细胞内的运输到细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究表明递送纳米颗粒作为免疫刺激性佐剂的作用。值得注意的是，在2010年代中期之前，大多数mRNA疫苗临床试验采用了体外mRNA递送后的APC移植。然而，体外策略需要在移植前进行临床级别的细胞培养的繁琐程序，限制了mRNA在癌症免疫疗法中的应用。最近的技术进步使得有效的体内mRNA递送成为可能，扩大了mRNA在传染病疫苗中的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的体外程序。在上述描述的mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述关注两个问题：疫苗佐剂性和针对APCs和淋巴器官的递送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者重定向到其他综述中，以获得mRNA递送系统的一般描述，特定于COVID-19疫苗的主题，以及mRNA疫苗的临床概况。 2.佐剂性 2.1.佐剂性概述 免疫刺激性佐剂通过引发先天免疫反应，将抗原表达与适应性免疫诱导联系起来，从而提高疫苗效果的效率和持久性。在由重组蛋白或编码蛋白的核酸衍生的现代疫苗中，佐剂的作用变得越来越重要。值得注意的是，这些疫苗缺乏传统活减毒和灭活疫苗中存在的许多病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式充当佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂功能被整合到离子化脂质基脂质纳米颗粒（iLNPs）配方中，作为内置佐剂，而不是作为额外的佐剂补充。事实上，小鼠和人类对mRNA iLNPs的强烈先天免疫反应在疫苗功能中发挥着关键作用。iLNPs的脂质组分和mRNA分子都有助于mRNA疫苗中的佐剂性。内置佐剂方法允许mRNA疫苗的简单一体化配方，有助于平稳的临床转化。此外，一体化配方使得抗原mRNA和佐剂能够共递送到相同的APCs中，有效激活表达从递送的mRNA中得到的抗原蛋白的APCs。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究表明共递送抗原和佐剂的好处。在一项开创性研究中，共包埋CpG DNA和卵清蛋白（OVA）的聚（D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）微球在诱导小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性方面优于分别包埋这两种组分的微球混合物。尽管佐剂在疫苗接种中起着关键作用，但佐剂性应该精确控制，以在最佳强度下激活适当的信号通路，因为过度和意外的佐剂性会带来安全问题，并对疫苗效果产生负面影响。本节提供了关于mRNA疫苗中佐剂性的机制理解和开发的观点。 2.2.当前mRNA疫苗的先天免疫反应 mRNA通过几种先天免疫受体触发先天免疫反应，包括内体内的Toll样受体（TLRs）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1(a)）。每个受体的首选配体分别是TLR3的>45碱基对（bp）双链RNA（dsRNA），TLR7,8的>20核苷酸（nt）单链RNA（ssRNA），MDA-5的几千bp dsRNA，以及RIG-I的>20 nt dsRNA，其在5'端有一个三磷酸基团。这些受体的主要适配分子分别是TLR3的Toll/白介素-1（IL-1）受体结构域包含的适配分子诱导干扰素-β（IFN-β）（TRIF），TLR7,8的髓样分化初级反应88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。这些分子最终触发I型IFN和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽结构对于区分自身和非自身mRNA至关重要。5'帽结构基于第一和第二核糖体的2'O-甲基化状态进行分类。在Cap0中，第一和第二核糖体中都没有2'O-甲基化，在Cap1中，只有第一核糖体有2'O-甲基化，而在Cap2中，第一和第二核糖体都有2'O-甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，留下Cap0 mRNA主要被RIG-I识别为非自身。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力。 图1. mRNA疫苗诱导的先天免疫。(a) 外源性RNA的受体及其信号通路。ppp-dsRNA：在5'端具有三磷酸基团的双链RNA。(b) 对iLNPs脂质成分的先天免疫反应的潜在机制。 体外转录mRNA中的杂质，包括未加帽和长dsRNA，引发强烈的先天免疫反应。体外转录制备的未加帽RNA在5'末端有一个三磷酸基团，刺激RIG-I。尽管包括CleanCap在内的最新技术已经提高了加帽效率，但在CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然显著激活先天免疫反应。事实上，CleanCap mRNA溶液的南极磷酸酶处理，去除未加帽mRNA杂质的5'三磷酸基团，显著降低了培养巨噬细胞中的细胞因子反应。这一结果突出了CleanCap mRNA中未加帽mRNA污染物的显著免疫刺激。长dsRNA是先天免疫的强烈诱导剂，是从体外转录过程中的RNA模板转录RNA制备的。在这个过程中，从DNA模板制备的预期mRNA链作为模板合成互补的非预期RNA链，导致长dsRNA的形成。如后文讨论的，这些杂质对先天免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗接种的结果，需要仔细讨论在免疫刺激杂质的背景下的疫苗接种效果。 尽管mRNA疫苗需要先天免疫反应作为佐剂，但过度的反应会带来安全问题，并负面影响疫苗效果，如后文所述。此外，对体外转录mRNA的细胞反应通过诱导全局mRNA降解和损害翻译启动，对mRNA的蛋白表达效率产生负面影响（图1(a)）。2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的mRNA识别和随后的RNase L激活导致大量细胞内ssRNA降解。此外，外源RNA通过激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译启动因子2-α（eIF-2α）损害蛋白翻译的启动过程。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感知。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1-甲基-假尿苷（1 mΨ）的核苷修饰，这减轻了对mRNA的先天免疫反应。此外，使用高效液相色谱（HPLC）消除长dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA的5'三磷酸也减少了mRNA杂质的免疫刺激。mRNA纯化的更近期技术包括具有光敏疏水标签的帽类似物，用于从未加帽mRNA中纯化加帽mRNA，以及为最小化dsRNA产生的工程化RNA聚合酶。这些方法可以通过增加抗原蛋白翻译和减轻促炎反应来提高mRNA疫苗的安全性和有效性。 在当前mRNA疫苗广泛使用的iLNP配方中，其脂质组分是先天免疫反应的主要诱导剂。事实上，不含mRNA封装的空iLNPs在小鼠局部注射后诱导了强烈的促炎反应。值得注意的是，在去除离子化脂质组分后，促炎反应几乎消失，表明离子化脂质在免疫刺激中的关键作用。离子化脂质在细胞外pH下呈中性电荷，在内/溶酶体pH下变为阳离子。因此，离子化脂质被认为比无pH响应的传统阳离子脂质的炎症性小，因为使用离子化脂质而不是阳离子脂质可能减少LNP与细胞膜的相互作用及其随后的膜损伤。相反，将iLNP中的离子化脂质替换为阳离子脂质减少了对纳米颗粒的先天免疫反应。几份报告提供了iLNP先天免疫激活的机制见解（图1(b)）。如后文所述，几种离子化脂质特别激活先天免疫受体，包括TLRs和细胞内干扰素基因刺激剂（STING）。此外，mRNA iLNPs和其他纳米颗粒的研究表明，溶酶体破裂，mRNA递送的一个重要细胞内过程，通过炎症体激活引发先天免疫反应。在注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后刺激先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究表明，在肌肉注射（i.m.）批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后，包括双链DNA、高迁移率族蛋白盒（HMGB）1和尿酸在内的DAMPs血清水平急剧增加。在人类中，批准的COVID-19 mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应，可能造成DAMPs的释放。 2.3.桥接佐剂性到疫苗效果 本节讨论先天免疫反应如何影响疫苗效果，重点关注iLNPs。最近的一项全面研究通过为各种受体准备基因敲除小鼠，调查了各种先天免疫受体在接种批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后诱导体液和细胞免疫的参与情况。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症体中的NLR家族PYD结构域含有蛋白（NLRP）3和凋亡相关斑点蛋白含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC），以及TLR2、TLR4、TLR5、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和STING，其中一些是离子化脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5基因敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞的频率。更准确地说，MDA-5基因敲除减少了IFN-α的分泌，这是MDA-5信号传导的下游分子，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFN-α/β受体（IFNAR）1基因敲除也损害了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞反应中的关键作用。MDA-5可能识别mRNA疫苗配方中的dsRNA或作为DAMPs释放的受损细胞中的dsRNA。 然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。上述任何先天免疫受体的基因敲除都没有降低刺突特异性抗体的效率。此外，只有在IFNAR1基因敲除后检测到刺突特异性抗体的最小减少。这一结果与人类研究的结果一致。该人类研究评估了COVID-19 mRNA疫苗在由于TLR7、IFNAR1或干扰素调节转录因子（IRF）7的固有缺陷或对I型IFNs的自身抗体而患有先天性和获得性I型干扰素信号传导缺陷的患者中的有效性。mRNA疫苗在这些患者中有效地诱导了中和抗体和记忆B细胞，水平与健康对照组相当。同时，几项动物研究提供了对体液免疫诱导至关重要的途径的见解。MyD88基因敲除，该基因编码许多TLRs的适配蛋白，显著抑制了使用mRNA iLNP疫苗接种后抗原特异性滤泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导。此外，编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的白介素（IL）-6基因敲除也消除了疫苗效果。相比之下，RIG-I和MDA-5的适配蛋白MAVS基因敲除后，疫苗效果得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用，表明IL-6基因敲除损害了抗体反应和Tfh细胞及GC B细胞的诱导。与此同时，IL-6基因敲除后，saRNA疫苗对致命性流感病毒挑战的保护效果得以保留。这些研究表明，在诱导体液免疫反应的先天免疫信号传导途径中存在冗余，而TLRs和IL-6发挥主要作用。 在人类疫苗接种中，第二剂COVID-19 mRNA疫苗大幅增强了体液和细胞免疫，并同时引起了比第一剂更严重的全身反应原性。这一观察结果意味着，第二剂后负责反应原性的促炎分子可能也有助于增强适应性免疫。先前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆中67种细胞因子的概况。其中，IFN-γ显示出一个独特的概况，特别是在第二剂后急剧增加。小鼠模型也在第二次接种BNT162b2后复制了IFN-γ水平的急剧增加，伴随着巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活。进一步分析揭示了CD4+和CD8+ T细胞在第二次接种后产生IFN-γ的显著贡献。有趣的是，IFN-γ受体中和抗体的给药减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活，证明了IFN-γ在第二剂后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+及CD8+ T细胞诱导的效率影响很小。因此，需要进一步的研究来解读COVID-19 mRNA疫苗的佐剂性机制。 2.4.脂质和mRNA的佐剂性 iLNP佐剂性的另一个关键问题是，脂质和mRNA组分中哪一个主要促进免疫刺激，以及每个组分激活的信号通路是什么。一项全面的机制研究通过比较空iLNP与封装修饰mRNA的iLNP来解决这个问题。有趣的是，两种配方在小鼠皮内（i.d.）注射后4和24小时引流淋巴结中产生的细胞因子和趋化因子水平相似，表明脂质组分在对iLNP的先天免疫反应中占主导地位。因此，两种iLNP都作为佐剂，并提高了重组蛋白疫苗的效率，使其比AddaVax（模仿临床上批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂）更有效地产生抗原特异性抗体。有趣的是，空iLNP的佐剂效应在MyD88和MAVS基因敲除后大多得以维持，但在IL-6基因敲除后减少。因此，空iLNP可能通过IL-6分泌发挥其佐剂性。然而，同一研究的详细分析揭示了mRNA对mRNA iLNPs的先天免疫反应的贡献，即使mRNA在化学上被修饰以最小化免疫刺激。当比较空iLNP和装载mRNA的iLNP对其作为佐剂以提高重组蛋白疫苗的效率时，MyD88基因敲除减少了装载mRNA的iLNP的体液免疫诱导，而不是空iLNP。这一结果表明，mRNA而不是脂质组分激活了MyD88。在另一项研究中，非人类灵长类动物（NHPs）肌肉注射和皮内注射后，只有装载修饰mRNA的iLNP，而不是空iLNP，在引流淋巴结中的树突细胞中诱导了I型IFN表达和树突细胞的成熟，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的关键作用。 随着未修饰mRNA的使用和较少免疫刺激性的mRNA递送载体，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，用于癌症疫苗临床试验的阴离子脂质体比iLNPs的免疫刺激性小。有趣的是，当装载未修饰的mRNA时，阴离子脂质体提供了强大的CTL活性，但相反，当装载1 mΨ mRNA时，诱导了抗原特异性免疫耐受。这些研究强调了未修饰mRNA的佐剂性，将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗。在装载未修饰mRNA的阴离子脂质体中，TLR7和IFNAR1基因敲除，而不是TLR3、4和9，减少了疫苗接种后树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的激活。这一结果表明，mRNA通过TLR7识别和随后激活I型IFN在未修饰mRNA的佐剂性中的贡献。 2.5.设计递送系统以改善佐剂性 迄今为止回顾的机制理解意味着改善mRNA疫苗的佐剂性的好处，促进了这一领域的积极研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性，而不是抗原表达效率，可能决定疫苗接种的效果，其中提供增强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗比提供效率较低的免疫刺激和增强抗原表达的疫苗表现更好。在设计mRNA疫苗佐剂时，首选包含抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗配方，允许抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究已经显示了共递送抗原和佐剂对强大疫苗接种的好处。此外，这种简单的疫苗配方在临床转化中是有利的。 一种策略是将佐剂和mRNA共封装到相同的纳米颗粒中。基于脂质的系统有两个选择：将水溶性佐剂封装在水相中，或将疏水性佐剂封装在脂质相中（图2(a)）。前者的方法是iLNP封装锰，这是STING途径的激活剂，在针对SARS-CoV-2的疫苗接种中显示出有希望的结果。在后一种方法中，R848，一个小分子TLR7/8激动剂，被结合到棕榈酸中以并入阳离子mRNA脂质复合物。该脂质复合物显示出强大的CTL诱导和抗癌效果。另一个例子是Pam2Cys，一个由半胱氨酸、硫甘油和两个棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂，被并入iLNP，从而增强了细胞和体液免疫反应。其他系统使用了α-半乳糖神经酰胺，它在APCs上呈现后激活不变自然杀伤T（NKT）细胞，证明了它们在针对癌症和疟疾的疫苗中的效用。针对疟疾的疫苗靶向感染的肝细胞。 除了使用额外的佐剂外，将佐剂性纳入可离子化或阳离子脂质是脂质基疫苗的一个选项（图2(a)）。无需额外的佐剂，这种方法通过最小化成分来简化疫苗配方，可能有利于临床转化。佐剂脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，具有环胺头基的可离子化脂质比具有线性胺头基的脂质更有效地诱导先天免疫反应和针对癌症的抗原特异性CTL活性。有趣的是，STING基因敲除消除了由环胺iLNP诱导的先天和适应性免疫反应，表明可离子化脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了可生物降解的酯类连接物，以促进佐剂环胺的清除，提高安全性。另一项研究开发了一种类似阳离子脂质的材料，激活TLR4。由此产生的基于脂质的疫苗在野生型小鼠中提高了细胞免疫，但在TLR4基因敲除小鼠中没有提高，证明了TLR4信号在疫苗中的参与。将现有的佐剂或其组分结合到可离子化脂质上是更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂结合的佐剂可离子化脂质体，提高了细胞和体液免疫的诱导效率。另一项研究将维生素E（临床上批准的AS03佐剂的组分）引入可离子化脂质的疏水尾部。含有维生素E的可离子化脂质展现出增强的佐剂性，比含有肉豆蔻酸或油酸尾部的对照可离子化脂质更有效地诱导CTL反应。 在脂质基配方中使用无机系统是另一个具有递送和佐剂功能的双功能系统的例子。先前的一项研究设计了由mRNA负载的钙磷酸核心和脂质层涂层组成的纳米颗粒（图2(b)）。钙磷酸核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+。由此产生的细胞内Ca2+浓度增加触发树突细胞成熟的信号。此外，钙磷酸核心可以与抗原mRNA共同封装PD-L1 siRNA，用于免疫检查点阻断，进一步增强癌症疫苗的效果。 聚合物基系统，作为一大类mRNA递送系统，与脂质基系统相比，在mRNA疫苗配方中的关注度较小。先前的一项研究比较了聚聚体和iLNP中saRNA的疫苗效果。有趣的是，装载saRNA的iLNP在肌肉注射后远远优于装载saRNA的聚聚体，在细胞和体液免疫诱导方面，尽管聚聚体比iLNP提供了更有效的抗原表达。一致地，iLNP在诱导IL-6（mRNA疫苗佐剂性的关键分子）的表达方面比聚聚体更强。因此，作者将其低疫苗效率归因于其低佐剂性，尽管其他因素，包括递送到淋巴组织的效率，也可能影响疫苗效果。 与此同时，一些聚聚体系统在疫苗接种中提供了有希望的结果（图2(c)）。在几项临床试验中使用的精蛋白/mRNA聚聚体利用未修饰mRNA的佐剂性刺激TLR7（图2(d)）。在这个系统中，与精蛋白的mRNA复合增加了先天免疫反应，但与裸mRNA相比，在小鼠皮内注射后降低了抗原表达效率。因此，控制mRNA和精蛋白的混合比例，以在注射溶液中包含游离mRNA和精蛋白/mRNA聚聚体，以同时获得抗原表达和佐剂性。在一项机制研究中，TLR7基因敲除几乎完全抑制了聚聚体给药后的IL-12分泌。此外，聚聚体通过TLR7基因敲除减少了其CTL诱导潜力，而不是TLR9基因敲除，突出了TLR7佐剂性在这种疫苗配方中的作用。在另一个例子中，硅纳米颗粒被聚(乙二醇)（PEI）涂层，随后PEI交联，mRNA装载和甘露糖涂层。然后，移除硅核心，提供中空核心糖胶囊（图2(e)）。甘露糖的功能是靶向树突细胞并激活树突细胞作为佐剂。结果，这个系统为癌症疫苗提供了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还展示了mRNA疫苗中佐剂性多阳离子的潜力（图2(c)）。例如，用于mRNA复合的200-kDa阳离子壳聚糖也作为佐剂，通过激活STING和炎症体，增强抗原特异性细胞和体液免疫。在另一项研究中，具有C18侧链的多阳离子由于其佐剂性激活树突细胞和有效的淋巴结迁移，展现了有效的癌症疫苗效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了多阳离子佐剂性。在这项研究中，PEI通过释放宿主细胞的DNA作为DAMPs，激活IFN调节因子-3信号，发挥其佐剂性。这些研究表明了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这尚未被充分探索。如前所述，iLNP也产生DAMPs，这可能作为佐剂。同时，过量的DAMPs可能引发自身免疫性疾病。例如，通过自身DNA过度激活cGAS-STING途径可能会引起艾卡迪-古特雷斯综合症和共济失调毛细血管扩张症。疫苗开发需要考虑这些风险。 图2. 提高mRNA疫苗佐剂效应的策略。(a) iLNPs或其他脂质系统。(b) 含有磷酸钙核心的脂质载体。(c) 聚复合物。(d) 普罗胺/mRNA聚复合物。(e) 用甘露糖涂层的空心糖胶囊。(f) 设计用于提高佐剂效应的mRNA。用于增强佐剂效应的策略和组分用粗体标出。 2.6.设计mRNA以提高佐剂性 调节mRNA佐剂性提供了另一种改善疫苗效果的选项。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激性蛋白的mRNA，并利用RNA分子的内在免疫刺激性特性（图2(f)）。这些策略允许使用单一纳米颗粒配方共递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内经历酶促降解，避免长时间的免疫刺激。关于编码免疫刺激性蛋白的mRNA，一项开创性的研究将抗原mRNA与三种类型的免疫刺激性mRNA混合，编码CD40配体、TLR4的组成性活性形式和CD70。这种设计显著提高了与单独注射裸mRNA相比的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞诱导和抗癌效果，在淋巴结内注射后。最近的研究证明了免疫刺激性mRNA在iLNP配方中的好处。例如，先前的一项研究通过筛选编码参与先天免疫信号传导的各种蛋白的mRNA物种，确定组成性活性STING mRNA是最有效的mRNA，能在小鼠中诱导CTL活性。另一项研究使用了编码C3d的mRNA，C3d是哺乳动物补体成分，能激活滤泡树突细胞和B细胞。C3d mRNA封装到iLNP中提高了抗原特异性细胞和体液免疫。 RNA分子，特别是dsRNA的内在免疫刺激性特性可以作为佐剂使用。在这方面，dsRNA的免疫刺激性特性可能对saRNA疫苗的疫苗效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我放大，提供抗原蛋白的持续表达。此外，细胞内增殖过程中的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，以诱导先天免疫反应。这些特性使得使用低剂量的saRNA在动物和人类中进行有效的疫苗接种。然而，dsRNA中间体的持久性可能导致长时间的免疫刺激和PKR激活，可能在某些情况下对疫苗效果产生负面影响。事实上，IFNAR1或MAVS基因敲除提高了saRNA疫苗接种后体液或细胞免疫诱导的效率。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a提高了其疫苗效率，该蛋白通过结合dsRNA抑制MDA-5和RIG-I的激活[86]，或天花病毒免疫逃逸蛋白阻断PKR和IFN-β的活性。 相反，使用dsRNA对先天免疫反应进行短暂刺激有助于改善mRNA疫苗以提高CTL活性。在这个策略中，dsRNA结构是通过将互补RNA与mRNA杂交到非复制mRNA中准备的（图3）。以前的研究评估了互补RNA与mRNA杂交在蛋白翻译效率和先天免疫反应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区域时，在与17 nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3(a)），但在与23 nt或更长的RNA杂交后下降（图3(b)）。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特别被从mRNA上脱落，可能是通过翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性。这个过程可能允许从与17 nt互补RNA链杂交的mRNA中有效表达蛋白。关于佐剂性，23 nt或更长的互补RNA杂交，而不是17 nt互补RNA，增加了mRNA的免疫刺激性特性。同时，当靶向mRNA的非编码区域时，RNA杂交的影响是不同的。在先前的研究中，通过体外转录准备的120 nt poly U RNA与mRNA的120 nt poly A杂交。有趣的是，poly U杂交极大地增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，对翻译效率的影响最小（图3(c)），提供了具有佐剂性的mRNA的优秀配方。机制分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120 nt poly U RNA在体外转录时没有5'帽类似物，在5'端有一个三磷酸基团，是RIG-I的配体。在小鼠疫苗接种中，这种配方在淋巴结内裸mRNA的形式下增强了模型抗原mRNA的疫苗效果。然而，这个系统中的免疫刺激强度是不可控的。因此，后来的研究重新设计了这个系统，以实现对免疫刺激强度的微调。为此，通过17 nt互补RNA与mRNA杂交，准备了梳状结构的mRNA，精确设计了dsRNA牙齿以诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激性牙齿的数量，这个策略使佐剂性的微调成为可能，以最大限度地提高疫苗效率，同时最小化不良反应。最终，这个系统提高了三种不同mRNA配方的CTL活性：阴离子脂质体、iLNP和聚乙二醇化聚聚体。 图3. mRNA与dsRNA佐剂杂交。展示了RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激性。(a-c) 互补RNA与mRNA的编码区(a, b)和聚A区(c)杂交。(d) 梳状结构的mRNA与设计用于靶向mRNA编码区RIG-I的dsRNA杂交。 2.7.杰基尔和海德的佐剂特性 上述描述集中在mRNA疫苗中先天免疫反应的积极方面。然而，许多研究揭示了佐剂特性更为复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗接种中提供了复杂的结果。像Ψ和1 mΨ这样的mRNA修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，即佐剂效应。未修饰的mRNA的佐剂效应对CTL诱导和抗体产生产生相反的效果。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应方面优于修饰的mRNA。根据最近的一项研究，不含核苷修饰的抗原mRNA包裹在iLNP中，比包裹1 mΨ修饰的抗原mRNA更有效地诱导抗原特异性CD8+ T细胞，包括那些对颗粒酶B呈阳性的细胞，并更有效地激活肿瘤浸润性树突状细胞。结果，未修饰的mRNA在小鼠模型的癌症疫苗中优于修饰的mRNA，显示出有效的肿瘤体积抑制和延长小鼠存活时间（图4（a））。引人注目的是，在一项使用编码荧光蛋白的mRNA的报告试验中，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中提供的报告蛋白表达效率远低于1 mΨ修饰的mRNA（图4（b））。这些结果证明了未修饰的mRNA在诱导CTL反应方面的潜力，即使以牺牲抗原表达效率为代价。在机制分析中，未修饰的mRNA比修饰的mRNA更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体的给药减少了未修饰的mRNA在疫苗接种中的好处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂效应。 图4. 1 mΨ修饰对癌症疫苗接种的影响。(a) 装载卵清蛋白（OVA）mRNA的iLNP被肌肉内注射到皮下携带表达OVA的B16F0肿瘤的小鼠中。评估了肿瘤大小。(b) 使用iLNPs肌肉内注射0、40、70和100% 1 mΨ修饰的mCherry mRNA。量化了淋巴结和脾脏中常规类型1和2树突状细胞（cDC1和cDC2）中mCherry表达的效率。版权所有© 2022 sittplangkoon, Alameh, Weissman, Lin, Tam, Prompetchara和Palaga。 相反，与iLNP一起传递的1 mΨ mRNA在产生抗原特异性抗体方面比未修饰的mRNA更有效，这表明未修饰的mRNA中佐剂效应的负面影响。一项全面研究调查了1 mΨ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗在小鼠中结果的影响。在i.d.疫苗接种后，1 mΨ mRNA在诱导抗原特异性CD4+ T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），伴随着脾脏中Tfh和GC B细胞的增强产生。这些结果可能反映了未修饰的mRNA佐剂效应的负面影响。同时，1 mΨ mRNA比未修饰的mRNA产生了更有效和持久的报告蛋白表达（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白表达效率的好处在器官和细胞类型之间有所不同，在脾脏免疫细胞中尤为明显，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提供增强的抗原表达的能力也可能有助于其高疫苗潜力。最近的一项研究通过调查使用三种不同的iLNPs在小鼠和NHPs中1 mΨ修饰的效果，提供了关于先天免疫反应和抗体产生效率之间关系的机制见解。在研究中，1 mΨ修饰增加了抗体产生效率，并伴随着系统性趋化因子和细胞因子分泌的减少。更具体地说，在三种iLNPs中，两种在没有1 mΨ修饰的情况下诱导了大量I型IFN分泌的iLNPs，在1 mΨ修饰后获得了比其他iLNPs更大的疫苗效率好处，后者在没有修饰的情况下显示出最小的I型IFN反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。 图5. 1 mΨ修饰对传染病疫苗的影响。(a) 小鼠通过皮内注射使用iLNPs装载的未修饰或1 mΨ修饰的表达流感病毒血凝素（HA）的mRNA进行疫苗接种。评估了HA抑制滴度。(b) 在使用装载未修饰和1 mΨ修饰mRNA的iLNP皮内注射后评估荧光素酶表达效率。版权所有© 2018 Pardi等人。 mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近的一项iLNP mRNA疫苗研究中，C57BL6小鼠比BALB/c小鼠表现出更弱的体液免疫诱导。在这两种小鼠之间比较，C57BL6小鼠的树突状细胞产生的I型IFN比BALB/c小鼠多10倍以上。在使用HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中的IFN产生被抑制，C57BL6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠观察到的水平相当。这些数据也表明了I型IFN对体液免疫诱导的抑制效应。在人类中，如上所述，I型IFN信号通路的缺陷并没有损害SARS-CoV-2 mRNA疫苗中的抗体产生。因此，人类的抗体产生可能不需要强烈的佐剂效应和I型IFN激活。从安全角度来看，1 mΨ修饰减轻了使用iLNP在NHPs中mRNA疫苗接种后系统性细胞因子和趋化因子的释放。因此，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗配方可能在专注于体液免疫的疫苗中更实用。同时，也应注意到化学修饰的必要性仍然是有争议的。事实上，装载未修饰的mRNA的iLNP在NHPs中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的COVID-19疫苗装载1 mΨ mRNA的水平相当。 除了核苷修饰，I型IFN信号在CTL诱导中的作用提供了另一个复杂机制的例子，这些机制是佐剂效应的基础。值得注意的是，I型IFN信号根据疫苗接种途径对CTL诱导产生相反的效果。IFNAR1基因敲除或IFNAR1阻断抗体改善了局部给药后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，包括皮内(i.d.)、皮下(s.c.)和淋巴结内给药，显示出I型IFN信号对疫苗接种的负面影响。重要的是，即使没有从mRNA中大幅度提高蛋白表达效率，IFNAR1阻断也改善了疫苗接种效果。因此，除了抗原表达效率之外的机制，大概是I型IFN信号的过度佐剂效应，可能会损害疫苗接种效果。相反，IFNAR1基因敲除降低了系统性注射后CTL诱导的效率，显示出I型IFN佐剂效应的积极影响。根据对疫苗接种中I型IFN信号的后期机制研究，局部给药后的负面影响和系统性给药后的积极影响在条件性IFNAR1基因敲除的CD4+ T细胞中被消除，但在树突状细胞中没有。因此，I型IFN对CD4+ T细胞的作用可能解释了其在疫苗接种中相互矛盾的效果。 对于CD4+ T细胞的激活，I型IFN信号和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着关键作用。在抗原呈递给T细胞受体之前，I型IFN信号对T细胞具有抗增殖和促凋亡作用。另一方面，同时或延迟的I型IFN信号对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学上的差异可能解释了系统性给药和局部给药之间I型IFN的相互矛盾效果。系统性注射可能将mRNA直接送入脾脏树突状细胞，允许与I型IFN暴露相对快速和同时的抗原呈递，从而激活T细胞。另一方面，局部注射需要时间让组织残留的APCs迁移到淋巴器官。这可能会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。 最近的一项研究揭示了iLNP对先天和适应性免疫反应的长期影响，持续数周。有趣的是，预先注射装载非抗原mRNA的iLNP或空iLNP减少了2周后注射的后续iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6(a,b)）。当预注射到疫苗接种的时间间隔从2周增加到8周时，抑制效果仍然存在，但程度较小。预注射降低了后续疫苗接种中mRNA iLNP的抗原表达效率，这可能有助于抑制效果。进一步的机制实验通过评估iLNP预注射对预防传染病的保护效果，调查了先天免疫在这种抑制效果中的作用。在这个实验中，接受装载非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白色念珠菌挑战，其中先天免疫决定了对感染的易感性（图6(c)）。有趣的是，预注射对流感病毒（图6(d)）提供了保护效果，但加剧了白色念珠菌的感染（图6(e)）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可能解释了白色念珠菌的结果，而涉及流感病毒挑战实验的机制尚不清楚。重要的是，两个结果都表明iLNP注射对先天免疫反应的长期影响对抗随后的传染病。通过显示iLNP对后续疫苗接种的抑制效果，这项研究可能具有临床意义。通过延长初次和加强剂量之间的时间间隔，提高了COVID-19疫苗在人类中的效力。初次剂量对加强剂量的抑制效果可能解释了这一临床结果。 图6. iLNP预注射对后续先天和适应性免疫反应的影响。(A-B) 装载非抗原mRNA (eGFP)、空iLNP (eLNP) 或PBS被皮内注射。两周后，注射装载血凝素（HA）的iLNP，随后在疫苗接种后两周评估疫苗效果。(a) 实验方案。(b) HA特异性抗体产生。(c-e) 注射装载非抗原mRNA的iLNP两周后，小鼠被流感病毒或白色念珠菌挑战。(c) 实验方案。(d, e) 流感病毒挑战后的病毒载量(d)和白色念珠菌挑战后的病毒载量(e)。版权所有© 2021 Qin等人。 总的来说，这一节提供了过度佐剂效应阻碍疫苗效果的例子，而佐剂效应是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所描述的。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂效应的杰基尔和海德特性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂效应的结果。 3.传递 3.1.传递概述 有效的疫苗接种需要在淋巴器官中表达抗原的APCs（抗原呈递细胞），包括淋巴结和脾脏，与T细胞和B细胞合作以诱导适应性免疫。mRNA疫苗在淋巴器官中的APCs实现抗原表达主要有两条途径（图7）。在一条途径中，mRNA疫苗在非淋巴组织给药后，残留的APCs在注射部位摄取抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要数小时到数天。在APCs较少的组织中，这一途径需要mRNA疫苗引发的先天免疫反应触发免疫细胞向注射部位的浸润。将mRNA疫苗传递到富含APCs的组织，如皮肤组织，是利用这一途径的另一种策略。在另一条途径中，疫苗纳米颗粒通过淋巴管传递，直接将mRNA传递到淋巴组织中的APCs，这一过程需要数分钟到数小时。值得注意的是，淋巴管有对流以促进这一过程。这一途径需要具有适合淋巴运输的尺寸和表面特性的纳米颗粒。此外，靶向配体可以帮助疫苗在淋巴组织中的积聚和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全角度来看，疫苗在淋巴器官中的保留对于避免疫苗分布到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活至关重要。以下各节将从传递的角度讨论mRNA疫苗接种，重点关注传递途径和纳米颗粒设计（表2）。每个部分首先一般性地描述每种疫苗传递途径，然后专注于mRNA疫苗接种。 图7. iLNP mRNA疫苗肌肉内注射后的可能机制。在一条途径中，iLNPs迁移到淋巴结以在淋巴结中的APCs中提供抗原蛋白表达。在另一条途径中，免疫细胞浸润到注射部位并在摄取抗原后迁移到淋巴结。 3.2.非淋巴组织的传递 大多数临床可用的疫苗都是注射到肌肉或皮下组织，尽管这些组织中APCs很少。因此，需要浸润注射部位的APCs摄取疫苗并迁移到近端引流淋巴结，以促进适应性免疫反应的协调激活。或者，疫苗可能直接通过淋巴管传递到这些淋巴结。与皮下途径相比，肌肉内注射通常在注射部位的不良事件风险较低，并诱导更强的免疫反应。肌肉组织通常血管和淋巴循环更丰富，允许疫苗有效运输到淋巴结。这可能解释了肌肉内注射途径相对于皮下途径在疫苗接种中的优势。相比之下，皮下给药的疫苗倾向于在注射部位停留较长时间，大概是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下途径在疫苗接种中依赖于APC迁移到淋巴结，而不是疫苗迁移。 在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究已经讨论了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定它们在细胞间质给药后的命运。特别是，它们的尺寸和表面特性，如电荷和亲水性，是它们淋巴结转移的决定因素。尺寸在10到100纳米之间，更具体地说是20-50纳米的纳米颗粒，适合穿越细胞间质并进入和通过淋巴管。然而，尺寸在100-200纳米的纳米颗粒表现出较差的淋巴结迁移能力，因为大约100纳米大小的水通道限制了它们通过细胞间质的扩散和对流。尺寸超过200纳米的纳米颗粒停留在注射部位，并完全依赖于APCs的摄取和APC迁移到淋巴结以提供疫苗效果。相反，小于10纳米的纳米颗粒更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为尺寸允许穿透血毛细血管壁。此外，血毛细血管中的流动大约是淋巴流动的100-500倍，有助于清除纳米颗粒。 关于纳米颗粒的表面特性，带正电荷的纳米颗粒被注射部位的负电荷细胞膜和细胞外基质所困。相比之下，带负电荷或未带电荷的纳米颗粒缺乏这种局部相互作用，可以穿过淋巴管传递到淋巴结，显示出在疫苗接种中的适宜特性。用包括聚乙二醇（PEG）在内的亲水性隐形材料涂层纳米颗粒表面，可以进一步提高纳米颗粒向淋巴结的迁移效率，因为这种表面与细胞间质的相互作用最小。有趣的是，纳米颗粒的PEG化使超过100纳米尺寸的纳米颗粒转移成为可能，如120纳米尺寸的阴离子脂质体和250纳米尺寸的阳离子脂质体，大概是因为PEG化可能改善了纳米颗粒的胶体稳定性，并减少了它们在注射部位细胞间环境中的非特异性吸附。同时，纳米颗粒表面的PEG密度需要优化。例如，含有1摩尔% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的保留时间延长，并且比含有5摩尔% DSPE-PEG2000的APCs摄取增强，而两种脂质体都有效地迁移到淋巴结。另一项研究也揭示了PEG密度优化对最大化疫苗效力的重要性。针对APCs的配体，如甘露糖衍生物和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体，也可以提高传递效率到APCs。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性。考虑到APCs的高吞噬活性以及它们在淋巴结中的丰富性，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的APCs，调整纳米颗粒的物理化学特性可能就足够了。 这些关于纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的一项mRNA研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结中可以产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他传递途径中，包括皮内、皮下和近淋巴结注射，未能诱导出可检测的疫苗效果。淋巴结内裸mRNA注射在针对新抗原的癌症疫苗的临床试验中也显示出有希望的结果。这些研究强调了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，淋巴结内注射需要在超声成像的指导下进行繁琐的操作，阻碍了广泛的临床应用。相比之下，在普通医疗护理中进行的局部注射，如皮下和肌肉内注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应该具有在传递到非淋巴组织后在淋巴组织中的APCs诱导抗原表达的功能。促进mRNA疫苗和APCs向淋巴结迁移是实现这一目的的两条主要途径（图7），而这两个途径通常无法区分。 有趣的是，mRNA iLNP在肌肉内注射后在引流淋巴结中有效地产生表达抗原的APCs，这可能有助于批准的COVID-19 mRNA疫苗的高效性。之前的一项研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层摄影术跟踪了NHPs中放射性标记的iLNP。肌肉内注射后4小时内，iLNP在距离注射部位远达9.2厘米的淋巴结中提供了强烈的信号。其他研究通过观察小和大动物肌肉内注射iLNP后mRNA分布和报告蛋白表达，进一步深入了解了局部传递后mRNA iLNP在细胞水平上的过程。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中提供报告蛋白表达。报告蛋白表达在注射后8小时在引流淋巴结中有效观察到，但在非引流淋巴结中未观察到。表达水平逐渐下降，但在注射后7天仍高于检测限。在淋巴结中的各种细胞类型中，位于被膜下和髓质窦的巨噬细胞表现出强大的报告表达，而树突状细胞和单核细胞的表达效率较低，T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为APCs通过与T细胞和B细胞的相互作用来触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人类引流淋巴结在肌肉内疫苗接种后也显示出疫苗mRNA和抗原蛋白表达的有效积累。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结中获得抗原表达的两条途径，即iLNP和APCs的迁移（图7），但iLNP在远处淋巴结的快速积累意味着iLNP迁移的贡献。此外，iLNP在全身器官中诱导了强大的蛋白表达，包括肝脏和脾脏，大概是通过iLNP迁移而不是APC迁移，突出了iLNP在注射部位以外传播的潜力。 几项研究试图进一步区分这两条途径的贡献。为了这个目的，最近的一项研究准备了一个在注射部位具有高效抗原蛋白表达效率而在引流淋巴结中效率低的系统。mRNA和空iLNP的混合物在肌肉内注射后在注射部位提供了可比较的蛋白表达水平，但与装载mRNA的iLNP相比，在引流淋巴结中的水平要低得多。值得注意的是，与装载mRNA的iLNP相比，mRNA和空iLNP的混合物在诱导体液和细胞免疫方面的效率要低得多。这些结果表明，淋巴结中抗原表达在疫苗接种中的重要贡献。尽管这项研究无法精确区分iLNPs和APCs的迁移，但可以合理假设装载mRNA的iLNP可能比mRNA和空iLNP的混合物更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，结果表明iLNP迁移到引流淋巴结在疫苗接种中的重要角色。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA iLNPs的大小也可能影响其疫苗结果。在这种情况下，之前的一项研究使用小鼠中的135批iLNP进行回顾性研究，显示了抗体产生效率和iLNP大小之间的明确相关性。这一结果支持iLNP迁移到淋巴结在疫苗接种中的参与。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，这可能反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖学的差异。 另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，揭示了每种配方的目标细胞类型影响体液和细胞免疫的诱导效率（图8(a)）。肌肉内注射后，与其他配方相比，iLNP产生了更高水平的抗体产生，但细胞免疫水平较低（图8(b)）。在报告试验中，阳离子脂质体在小鼠的引流淋巴结中诱导蛋白表达的效率比其他配方更高。在培养细胞实验中，iLNP在蛋白表达方面对肌细胞的偏好超过了树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中显示出高效的蛋白表达。基于这些结果，作者假设阳离子脂质体在淋巴结中的有效积累和有效的mRNA传递到树突状细胞有助于细胞免疫的强烈诱导。相比之下，iLNP可能主要在肌细胞中提供蛋白表达，然后APCs摄取肌细胞释放的抗原。这一过程可能更倾向于诱导体液免疫。重要的是，非APCs中的抗原蛋白表达以几种模式对疫苗结果做出贡献。当mRNA编码分泌性抗原时，APCs可以摄取非APCs分泌的抗原。在质粒DNA（pDNA）疫苗的研究中，编码分泌性OVA的pDNA在肌肉内和皮内裸注射后产生的抗OVA抗体水平比编码膜结合或细胞质OVA的更高，显示了抗原分泌的好处。同时，在mRNA iLNP疫苗中，编码细胞相关和分泌性血凝素（HA）的mRNA显示出可比的抗HA抗体产生，表明在这种情况下抗原分泌的作用边缘化。在另一种模式中，非APCs的细胞碎片也可以在疫苗接种后表达抗原的非APCs受损时向APCs提供抗原。 图8. 不同mRNA疫苗配方的接种效果。(a) mRNA疫苗配方。(b) 针对SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域（RBD）的每种疫苗配方诱导的体液和细胞免疫。版权所有© 2022 Shi等人。 一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织就能有效地进行疫苗接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了皮内注射，该saRNA优选在皮肤温度范围（30-35°C）内复制，但在体温或超过37°C时变得失活。裸RNA分布在注射部位以外的其他器官是不可能的，因为在迁移到其他器官的过程中裸mRNA可能会被降解。此外，其他组织中非最佳温度限制了saRNA仅在皮肤中复制。即使仅在皮肤中表达抗原，这种疫苗配方也能诱导强大的细胞免疫。另一项研究表明，即使阳离子纳米乳基saRNA疫苗的分布最小化到淋巴结或其他器官，也能通过强烈的体液免疫诱导。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒的表面，与脂质层内装载mRNA的iLNP相反。该研究比较了阳离子纳米乳和iLNP之间的生物分布和疫苗效果。在小鼠肌肉内注射后，纳米乳主要将蛋白表达限制在注射的肌肉中，而iLNP在引流淋巴结和肝脏中提供了强烈的蛋白表达。然而，纳米乳比iLNP诱导了更强烈的体液免疫反应，表明迁移到淋巴结在疫苗接种中并非不可或缺。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布有助于避免全身炎症反应，而iLNP诱导了全身细胞因子释放和体重减轻。 值得注意的是，最近的一项研究揭示了NHPs中mRNA iLNP的大量系统分布，在肌肉内注射后在脾脏、肝脏和血浆中检测到注射的mRNA。这种系统分布可能在人类中引起安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎病例。自身免疫性肝炎的人类研究揭示了针对肝脏中尖峰蛋白的CD8+ T细胞的存在。这一结果表明，T细胞可能在mRNA疫苗接种后攻击表达尖峰蛋白的肝细胞。关于心肌炎，对mRNA疫苗接种后死亡的患者进行的mRNA分布调查揭示了在几位患者的心肌中存在疫苗衍生的mRNA。有趣的是，这些患者的心脏部分可视化显示心脏损伤的证据，有巨噬细胞浸润，而这种变化在心脏中未检测到疫苗mRNA的患者中要少得多。这些结果暗示了心肌炎和iLNP分布到心脏之间的因果关系。 尽管这些研究强调了mRNA疫苗系统分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗更倾向于超越注射部位到淋巴器官。因此，研究人员试图开发能够迁移到引流淋巴结而不发生系统泄漏的mRNA疫苗配方。例如，之前的一项研究筛选了基于引流淋巴结中蛋白表达水平的iLNP配方，使用了一组可电离脂质和具有不同混合比例的四种脂质成分的iLNP。与BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中提供了增强的蛋白表达，并最小化了肝脏或其他系统器官中的表达。另一项研究通过使用大约100 nm（小）、180 nm（中）和330 nm（大）大小的iLNP来调查iLNP大小的影响，从而提供了机制上的见解。肌肉内注射后，小型和中型iLNP从注射部位泄漏出来，在肝脏中积累并提供了强烈的蛋白表达，而大型iLNP显示出从注射部位的最小泄漏。 使用iLNP以外的传递系统也可能减少mRNA疫苗的系统泄漏，因为iLNP在肝脏积累中具有积极机制。血液中的载脂蛋白E（ApoE）与iLNP结合，通过肝脏中的低密度脂蛋白受体促进其被肝细胞吸收。没有这种积极机制，一些脂多聚复合物和多聚复合物避免了在肝脏中的积累，但允许有效地传递到淋巴器官，实现安全有效的疫苗接种。脂多聚复合物的研究比较了其分布与肌肉内注射后iLNP的分布（图9(a)）。脂多聚复合物在淋巴器官中，包括淋巴结和脾脏中，提供了有效的荧光素酶表达，而在肝脏中的表达最小，而肝脏是iLNP注射后表达荧光素酶的主要器官（图9(b)）。在脂多聚复合物注射后的定量PCR评估中，83%的mRNA停留在注射的肌肉中，其余的mRNA主要分布在血液中，只有0.06%分布在肝脏中（图9(c)）。这些结果表明了脂多聚复合物有利的分布概况。这种脂多聚复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强大疫苗接种，显示出对感染的保护效果。疫苗显示出可接受的安全性概况，全身细胞因子释放和白细胞的短暂增加。 图9. 脂多聚复合物的生物分布。(a) 脂多聚复合物的制备。(b) 脂多聚复合物和装载荧光素酶mRNA的iLNP肌肉注射后的荧光素酶表达分布。(c) 通过qPCR评估脂多聚复合物注射后的mRNA分布。饼图显示了每个器官中累积的mRNA拷贝数。版权所有© 2021 Yang等人。 3.3.皮内传递 与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一个高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供了一个有吸引力的场所。表皮中的免疫相关细胞包括角质形成细胞、APCs（如朗格汉斯细胞）、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用于触发先天和适应性免疫。角质形成细胞占表皮细胞的80%，它们表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF）以及促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子（IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α），为发展免疫原性环境做出贡献。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。真皮环境富含血管和淋巴管，吸引免疫细胞并促进它们在对促炎刺激的反应中进入淋巴流动，允许疫苗有效地传递到淋巴结。 真皮组织作为免疫器官的这些有利特征促使多年来开发皮内mRNA疫苗。早期的动物研究已经证明了皮内普罗胺/mRNA疫苗针对传染病和癌症的潜力。皮内普罗胺/mRNA疫苗还在癌症疫苗的人类临床试验中提供了可检测的抗原特异性T细胞反应。此外，针对狂犬病病毒糖蛋白的皮内喷射普罗胺/mRNA疫苗在人类中诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，没有严重的安全问题。皮内给药途径即使在裸mRNA疫苗中也显示出其临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂的裸mRNA疫苗针对几种肿瘤相关抗原，通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了一些患者的肾癌进展。最近，BNT162b2和mRNA-1273，这两种基于iLNP的COVID-19疫苗在临床上被批准用于肌肉内给药，它们在临床试验中被测试了皮内注射的潜力。皮内注射10μg或20μg的mRNA-1273产生了几乎与肌肉内注射100μg mRNA相当的尖峰特异性抗体，表明皮内给药在剂量节省方面的潜力。BNT162b2的临床研究评估了作为灭活疫苗接种者的增强剂量的疫苗接种结果。在这些研究中，皮内注射五分之一剂量和肌肉内注射全剂量诱导了几乎相当的针对尖峰蛋白的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，与全剂量注射BNT162b2相比，五分之一剂量的皮内疫苗接种减轻了系统性反应原性。 一项机制研究使用NHPs对皮内和肌肉内mRNA疫苗接种进行了详细比较。在针对流感病毒的基于iLNP的mRNA疫苗中，皮内途径在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于肌肉内途径。皮内和肌肉内iLNP给药都导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，皮内给药刺激了CD209+残留真皮APCs的增殖。有趣的是，在皮内传递荧光标记的装载报告蛋白mRNA的iLNP后，CD1a+和CD209+真皮APCs有效地摄取了iLNP，提供了长达9天的报告蛋白表达，激活表达CD80，并迁移到引流淋巴结。这些真皮APCs可能增强了皮内传递后的疫苗效果。最近的一项研究评估了使用敲除这些细胞类型的小鼠在接种装载saRNA的iLNP后朗格汉斯细胞和常规类型1树突状细胞（cDC1）的贡献。缺乏这两种细胞类型的小鼠表现出血清中疫苗特异性抗体诱导和引流淋巴结中Tfh和GC B细胞反应受损（图10(a)）。有趣的是，那些只缺乏一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果受损，表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗接种中的冗余作用。同一研究还通过评估有无中性粒细胞耗竭的疫苗效果，探索了中性粒细胞在疫苗接种中的作用。中性粒细胞耗竭并没有显著减少Tfh和GC B细胞反应和抗体产生（图10(b)），表明在皮内mRNA疫苗接种中浸润中性粒细胞的较小贡献。如图7所示，mRNA疫苗有两种机制来获得APCs在淋巴结中的抗原表达：组织残留APCs迁移到淋巴结和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节中的皮内疫苗接种研究表明，通过展示真皮组织残留APCs的关键作用，前一种机制做出了巨大贡献。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于皮内给药途径。例如，以前的saRNA疫苗报告显示，皮内途径提供了与肌肉内途径相当或效率较低的疫苗效果。其他因素，包括抗原蛋白表达的效率、saRNA生物分布和佐剂效应，可能是这些设置中疫苗接种结果的决定因素。 图10. 朗格汉斯细胞（LCs）和常规树突状细胞1（cDC1）在皮内mRNA疫苗接种中的作用。使用iLNPs皮内注射表达HA的mRNA。(A) 在野生型（WT）小鼠或缺乏一个或两个LCs和cDC1的敲除小鼠中的抑制滴度。(B) 在疫苗接种前用中性粒细胞耗竭抗体（1A8）注射的WT小鼠中的抗体水平。版权所有© 2022 Ndeupen等人。 皮内疫苗接种途径在临床设置中面临技术困难和注射不准确的问题。这一问题促使了新的注射方法和设备的开发。其中，喷射注射器在狂犬病毒的临床试验中被使用。有趣的是，普罗胺/mRNA多聚体的喷射注射，而不是多聚体的针头注射，在人类中诱导了可检测的抗体产生。这一结果揭示了喷射注射改善疫苗效果的额外好处，大概是通过提高多聚体的传递效率。 微针提供了另一个有希望的皮内疫苗接种选择。例如，裸mRNA和脂质mRNA载体在用空心微针注射后在猪皮中提供了有效的报告蛋白表达，这种微针允许从每个针尖的孔中注入液体。最近的一项研究开发了由可溶解聚合物基质组成的微针，其中包含mRNA iLNP。微针在插入皮肤后30分钟内溶解以释放iLNP。这一系统在水平上显示出与相同iLNP的肌肉内注射相当的强大疫苗效果对抗SARS-CoV-2。此外，该系统可以在室温下耐受6个月的储存，储存后蛋白表达效率没有显著下降。 3.4.系统性传递 通过静脉注射进行的系统性给药提供了一条有效的途径，可以达到全身的器官或组织。与其它注射途径相比，其低侵入性、技术简单性和普遍适用性也具有吸引力。值得注意的是，通过系统性给药的重组蛋白癌症疫苗在治疗黑素瘤和结直肠癌方面显示出高疗效。在目标器官中，脾脏和淋巴结作为富含免疫细胞（包括T细胞、B细胞和树突状细胞）的二级淋巴器官，在疫苗接种中发挥关键作用。特别是，疫苗的主要靶器官是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。 多年来，除了mRNA疫苗领域外的研究已经解决了控制系统给药纳米颗粒生物分布的一个艰巨挑战。纳米颗粒的物理化学属性决定了它们在系统给药后的生物分布。例如，纳米颗粒应具有直径大于6纳米或分子量大于50 kDa，以避免通过肾脏肾小球滤过快速清除。尺寸在10到200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中积累，肝脏是一个主要的清除器官。这一尺寸范围与肝脏窦状内皮细胞中的孔径（50-200纳米）和Kupfer细胞的大小依赖性吞噬活性一致。此外，肝脏窦状内的慢血流促进了纳米颗粒对窦状壁的捕获，肝脏的重量也是一个导致纳米颗粒在肝脏中积累的原因。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向。用生物相容性亲水性聚合物，如PEG或两性离子聚合物，涂层纳米颗粒表面，可以有效地减少纳米颗粒的肝脏摄取。PEG化肝脏窦状内皮壁，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏中的积累。脾脏通过脾脏窦隙的内皮缝隙物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，这些缝隙过滤血液成分，而微米级聚集体则受到肺微血管的捕获。此外，将纳米颗粒的表面电荷从正变为负或用亲水性聚合物修饰它们可以显著改善它们对脾脏的选择性。总的来说，略大于200纳米的大小、阴离子表面和亲水性隐形涂层可能是适合脾脏靶向的属性，而脾脏APCs的靶向配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏中的积累。 在mRNA疫苗领域，一项开创性研究已经证明了系统性mRNA疫苗在动物实验和人类临床试验中对抗癌症的效用。在该研究中，具有不同表面电荷的脂质体，通过改变mRNA和阳离子脂质体的混合比例制备，基于它们在系统注射到小鼠后在脾脏中的mRNA传递效率进行筛选。在报告试验中，用mRNA对阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，提供蛋白表达。这一系统在几种小鼠癌症模型中展示了有效的治疗效果，并在人类中诱导了可检测的抗原特异性T细胞。随后的临床试验通过靶向肿瘤相关抗原和新抗原展示了这一系统的强大的抗肿瘤效果。人类中的荧光-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，在这一阴离子脂质体传递后，脾脏中葡萄糖摄取选择性增加（图11），表明这一系统在人类中也成功地靶向脾脏。 图11. 通过系统给药使用脂质体靶向人类脾脏。在使用阴离子脂质体进行静脉疫苗接种后的人体中进行18F-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描。脾脏被圈出。版权所有© 2018 Pektor等人。 这一临床成功正在促进针对脾脏的mRNA传递系统的开发。例如，向mRNA iLNP中添加阴离子脂质将iLNP从肝脏重新定向到脾脏，而iLNP具有肝脏的内在亲和性。随后的机制研究表明，添加阴离子脂质改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白质冠的组成，这可能决定了iLNPs的组织亲和性。同样，来自报告mRNA和聚阳离子的聚复合物在小鼠静脉注射后选择性地在脾脏和淋巴结中提供报告蛋白表达（图12(a)）。聚阳离子具有两性离子结构，向阳离子侧链添加了带负电荷的磷酸基团。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效地表达了报告蛋白（图12(b)）。尽管阴离子纳米颗粒经常用于mRNA疫苗中靶向脾脏，但一种称为两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也展示了选择性mRNA传递到脾脏。 图12. 使用聚复合物在小鼠中靶向淋巴组织。系统性注射编码荧光素酶（a）和tdTomato（b）的报告mRNA。（a）荧光素酶表达的分布。（b）淋巴结中表达tdTomato的细胞类型。版权所有© 2021美国化学会。 碳点是通过将疏水烷基链结合到基于多胺的纳米颗粒上制备的。通过体外筛选选出的两种碳点配方在系统注射后评估了其体内功能。其中一种实现了对脾脏的选择性mRNA传递，在癌症疫苗中诱导了有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学属性进行脾脏靶向。然而，在大多数系统中，靶向的确切机制仍然不清楚，阐明这些机制将有助于未来合理设计脾脏靶向系统。 除了依赖于物理化学属性的策略外，配体基础系统也被追求作为一种实现细胞水平精确靶向的策略。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚复合物上，这增加了mRNA传递到脾脏树突状细胞的效率4倍。在应用于靶向肿瘤相关抗原的癌症疫苗时，脂多聚复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂多聚复合物在脾脏以外的器官中诱导了蛋白表达，包括肝脏。为了提高对脾脏树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖而不是单甘露糖作为配体。结果，三甘露糖脂多聚复合物将mRNA专门传递到脾脏，并在其他器官中最小化了传递mRNA的蛋白表达。此外，在小鼠中耗尽CD11c+ APCs后脾脏中的蛋白表达显著减少，显示出该系统在脾脏APCs中的高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应独立于I型IFN，因此即使带有1 mΨ修饰也保留了CTL活性。因此，装载1 mΨ修饰的mRNA的脂多聚复合物提供了有效的癌症疫苗，并最小化了系统性细胞因子释放的诱导。另一组使用唾液酸作为配体，靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1) 作为iLNP的配体。有趣的是，将唾液酸引入iLNP显著增加了内体逃逸效率。结果，iLNP在系统给药后允许有效的mRNA传递到脾脏树突状细胞，从而增强了抗癌症疫苗。 3.5.粘膜传递 粘膜疫苗接种可以避免侵入性注射程序，并在粘膜相关淋巴组织（MALT）中触发强大的局部和系统免疫反应。特别是，包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道的粘膜，是针对传染病的疫苗的一个有吸引力的场所。针对COVID-19的鼻内（i.n.）给药或吸入活减毒和腺病毒载体粘膜疫苗在临床试验中显示出有希望的结果。在粘膜免疫中，分泌到粘液中的IgA在中和和消除最初进入点的外来病原体中发挥重要作用，有效预防感染。此外，鼻内疫苗接种有效地诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫。这一特性对于预防具有高突变率的病毒（如RNA病毒）的感染是吸引人的。有效地诱导IgA分泌需要将抗原传递到位于粘液覆盖的上皮屏障下的淋巴组织中的APCs。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面到固有层的采样。因此，以前的鼻内疫苗接种研究已经尝试促进疫苗穿透粘液以被M细胞吸收，证明了这一策略的可行性。在这种给药途径中，靶向APCs也是至关重要的，其中被APCs激活的B细胞在激活的CD4+ T细胞的协助下大量分泌IgA。值得注意的是，不同部位的粘膜具有交叉对话。因此，在粘膜部位的疫苗接种可以在远处的粘膜部位诱导抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的加强。除了粘膜IgA分泌外，激活的B细胞还为全身免疫提供系统性IgG分泌。此外，粘膜疫苗接种可以诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，激励其应用于癌症疫苗。 尽管粘膜疫苗接种具有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报告涉及这一主题。在一项针对流感病毒和SARS-CoV-2的疫苗研究中，saRNA iLNP的鼻内（i.n.）给药产生的抗体滴度比其肌肉内（i.m.）注射低10倍以上，并且细胞免疫效率较低。机制分析显示肌肉内注射后的血清细胞因子水平高于鼻内给药。因此，作者通过鼻内途径的低佐剂效应来解释i.n.路线的疫苗效率降低。随后的一项研究在i.n.、i.m.和皮内（i.d.）saRNA疫苗接种中进行了更全面的比较，使用了4种不同的疫苗配方：固体LNP、聚合物纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP。在每种配方中，i.n.疫苗接种一致地产生了比其他疫苗途径效率低的体液和细胞免疫，即使i.n.疫苗接种使用的mRNA剂量比其他两条途径高10倍。荧光素酶mRNA报告试验显示，荧光素酶表达在i.n.给药后仅持续几天，而肌肉内和皮内注射提供了超过10天的表达。因此，通过i.n.给药引入的saRNA细胞的快速清除可能解释了i.n. saRNA疫苗接种的低免疫原性。 与此同时，几份报告在利用基于脂质和聚合物系统的i.n. mRNA疫苗接种中展示了有希望的结果。在脂质系统方面，一项开创性的研究使用了一种商业脂质试剂进行i.n. mRNA疫苗接种，在小鼠模型中预防性和治疗性给药后诱导了抗癌症活性。在另一项研究中，mRNA被装载到使用普罗胺缩合的聚乙二醇化阳离子脂质体中。这一系统在培养细胞中展示了有效的抗原表达和免疫刺激，以及在小鼠中伴随CD4+和CD8+ T细胞有效诱导的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，通过用阳离子脂质替代两性离子辅助脂质来增强mRNA传递效率到粘膜组织，iLNP被用于i.n.疫苗接种。结果iLNP实现了有效的mRNA传递到粘膜APCs。最终，iLNP展示了与相同系统在装载编码SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域和补体C3蛋白的融合蛋白的mRNA后肌肉内疫苗接种观察到的水平相当的强系统IgG诱导。 在聚合物系统的领域，一系列研究试图克服阻碍mRNA疫苗到达APCs的鼻上皮屏障。虽然多聚阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地破坏屏障，但它们可能引起组织损伤。因此，这些研究通过将聚乙烯亚胺与环糊精结合来减轻细胞毒性，从而减少电荷密度。在i.n.疫苗接种后，得到的聚复合物成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，以及IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞。根据随后的机制研究，聚复合物在浅表颈、深颈和腋窝淋巴结中有效地提供了蛋白表达，并激活了淋巴结中的树突状细胞，从而增强了疫苗效率。在安全分析中，聚复合物没有引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中没有观察到异常。在最近的一项研究中，通过聚乙二醇化mRNA聚复合物传递到肺部尝试了粘膜疫苗接种。对于聚复合物的肺部传递，需要优化表面PEG密度。PEG减轻了由阳离子聚复合物引起的组织损伤，并促进了它们对粘膜的穿透，尽管它们表面密集的PEG层阻碍了进入目标细胞。疫苗研究首先通过基于传递效率到肺部的筛选优化了PEG密度和多阳离子结构。最优聚复合物在肺部APCs和上皮细胞中有效地提供了蛋白表达。在SARS-CoV-2疫苗方面，聚复合物在引流淋巴结中诱导了抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和强粘膜IgG分泌，证明了成功诱导粘膜免疫。最终，该系统有效地保护了小鼠免受病毒挑战。然而，该系统未能诱导可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。 4.未来展望 mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNase攻击、以最小化非靶向分布为目标APCs和淋巴组织，以及时空控制先天免疫激活。虽然先天免疫的刺激对于有效的疫苗接种至关重要，但过度的佐剂效应可能导致不良反应并阻碍疫苗结果。在mRNA传递系统方面，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布到非靶向组织，如肝脏和心脏，可能导致罕见但严重的不良反应。在mRNA疫苗中微调这些各种因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最优的mRNA疫苗设计。例如，SM-102是一种用于批准的COVID-19疫苗mRNA-1273的可电离脂质，它是基于小鼠和NHPs中抗原产生能力从30种LNPs配方中筛选出来的。值得注意的是，可电离脂质结构的微小变化可能导致体液免疫诱导的显著差异，而pKa在6.6和6.9之间的可电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种领先的LNPs在小鼠中展示了可比的抗体产生效率，但它们在NHPs中导致了抗体诱导的大差异，强调了疫苗效力的物种特异性变化。更详细地解密结构-功能关系可能有利于未来疫苗开发，为此，正如本评论所讨论的，正在进行有力的机制分析。 前述的物种差异是纳米医学领域的一个重要问题。例如，临床前动物模型和人类之间在纳米药物生物分布上存在显著差异。吸附到纳米药物上的蛋白质冠在不同物种中的特异性变化可以通过影响克服多种生物学屏障的过程（如有限的组织扩散和不良的清除机制）来影响它们在各个物种中的分布。此外，对mRNA疫苗构成额外障碍的炎症反应在不同物种之间也有所不同。例如，小鼠对阴离子mRNA脂质体的耐受性比人类高，系统给药时炎症反应最小。小鼠在对炎症刺激的反应中更有效地产生抗炎IL-1ra，与人类相比，减轻了mRNA疫苗的系统反应原性。解决物种差异对未来疫苗开发至关重要。 尽管mRNA疫苗在对抗COVID-19方面取得了成功，但当前的mRNA疫苗仍需改进，特别是在减少反应原性方面。虽然在大流行期间，反应原性可能被认为是可以接受的，但人们需要反应原性更温和的mRNA疫苗配方，以用于反复增强针对COVID-19的免疫力，以及更广泛地应用于其他传染病。此外，强烈的反应原性也是疫苗犹豫的原因之一。关于反应原性和免疫原性（疫苗效果）是否可以分离的辩论仍在继续。在人类中，疫苗的系统反应原性在第二次剂量后比第一次剂量更常见，这表明适应性免疫在反应原性中的参与。此外，增强的反应原性与第二次剂量后系统IFN-γ分泌水平的升高相吻合，这在人类和小鼠中都有观察到。在小鼠研究中，CD4+和CD8+ T细胞是第二次剂量中IFN-γ的主要产生者，给予IFN-γ受体中和抗体减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活。这些发现表明反应原性和免疫原性之间存在密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响很小。此外，系统反应原性的强度与人类体液和细胞免疫诱导的效果之间的相关性有限。这些结果表明反应原性和免疫原性有潜力被分离。关于佐剂效应，阐明负责反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路可能有助于开发具有降低反应原性的高效疫苗。在淋巴结中有效积累且系统泄漏最小的mRNA传递系统可能在减轻系统不良反应的同时保持效果。 虽然这篇综述主要关注佐剂效应和mRNA传递系统，但与其他策略的结合对未来mRNA疫苗的设计至关重要。旨在延长抗原表达持续时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。saRNA疫苗ARCT-154在3期临床试验中作为加强疫苗接种，比BNT162b2或mRNA-1273的两剂接种后显示出更强的免疫原性。编码SARS-CoV-2尖峰蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫反应，尽管环状RNA和线性mRNA之间的疫苗效果几乎相当。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学对疫苗接种结果有很大影响，持续暴露导致增强的抗体产生。因此，在mRNA疫苗中调节动力学可以提高其效力。为了实现这一点，一些报告尝试通过水凝胶控制mRNA纳米颗粒的释放。例如，与基于脂质的商业试剂复合的mRNA被装载到基于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)的多孔支架上。在皮下注射后，这种支架保留mRNA超过3天，并提高了与mRNA注射相比的蛋白表达效率。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性聚乙烯亚胺(LPEI)组成的水凝胶，装载抗原mRNA和TLR7激动剂。这种水凝胶在小鼠注射后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，超过一个月，同时在此期间保护mRNA免受降解。结果，水凝胶注射比纳米颗粒的注射提高了抗肿瘤效果。由mRNA编码的蛋白质的工程也大大影响疫苗接种效果。有趣的是，在mRNA疫苗中将SARS-CoV-2的尖峰蛋白工程化形成类病毒颗粒，提高了中和滴度10倍以上。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的结合是关键。优化佐剂效应和传递系统，结合上述其他策略，将大幅扩展mRNA疫苗在未来的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。