LT

摘要：化学免疫疗法和细胞疗法是复发/难治性（R/R）淋巴瘤治疗的主要手段。这些治疗中出现的耐药性和常见毒性限制了它们在实现期望的响应率和持久缓解方面的作用。抗体-药物偶联物（ADC）是一种新型靶向疗法，已证明在治疗包括淋巴瘤在内的各种癌症中具有显著的疗效。迄今为止，已有三种ADC药物被批准用于不同类型的淋巴瘤，这标志着该领域取得了重大进展。在本文中，我们旨在回顾ADC的概念及其在淋巴瘤治疗中的应用，分析目前批准的药物，并讨论ADC开发正在进行的进展。 1.引言 淋巴瘤是一组来自不同类型淋巴细胞（B细胞、T细胞或自然杀伤（NK）细胞）在不同成熟阶段的克隆性增殖的恶性肿瘤。过去几十年来，不同类型淋巴瘤的发病率一直在增加。化学免疫疗法和细胞疗法仍然是不同亚型淋巴瘤常用的治疗手段。大多数化疗方案的治疗效果指数较窄，导致广泛的毒性。此外，耐药性的出现是最常见的原因之一，阻碍了它在复发和难治性（R/R）情况下的使用。针对表面抗原的单克隆抗体，如利妥昔单抗和奥比妥珠单抗，已经彻底改变了淋巴瘤的治疗。抗体-药物偶联物（ADCs）是一种高度靶向的药物，将针对特定表面抗原的单克隆抗体（mAb）与细胞毒素分子连接起来。毒素只传递给表达表面抗原的细胞，具有高度的肿瘤特异性和有限的系统暴露。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了三种用于治疗淋巴瘤的ADC药物，分别是本妥昔单抗、波拉图单抗和洛卡图单抗。 在本文中，我们将回顾ADC的概念，重点关注它们的结构、工程和在淋巴瘤治疗中的作用。此外，我们将提供目前批准的ADC在这一设置中的综合分析，以及正在进行的进展的概述。这包括突出来自临床前和临床试验的有希望的结果，以及讨论下一代ADC开发的未来方向。 2.ADC的基本结构  ADC由抗体、药物（有效载荷或细胞毒素）和连接子组成。抗体结合恶性细胞表面表达的特定抗原。一旦结合，ADC被内化，细胞毒素有效载荷释放到细胞内，导致细胞周期终止和凋亡。在周围目标阴性细胞中也可以看到细胞毒性效应，当药物扩散到它们中并引起“旁观者杀伤”时，这是一种当有效载荷从被内化和降解的ADC释放或当药物释放到细胞外空间后从目标细胞释放时发生的细胞死亡。值得注意的是，为了获得更好的结果和更少的副作用，抗原和抗体之间的结合需要尽可能特异性。有效载荷的内化率、连接子的稳定性和相应抗体的选择是影响ADC在临床实践中使用的一些变量。 2.1. 单克隆抗体 选择合适的抗体是ADC工程中的关键步骤；它通常被设计为特异性结合癌细胞表面表达的目标抗原。理想的单克隆抗体应具有低免疫原性、低交叉反应性、长的血浆半衰期，以及对肿瘤细胞表面抗原的高结合亲和力。最常用的类别是免疫球蛋白G（IgG），更具体地说是IgG1亚型，因其血清稳定性。在ADC开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体。然而，这些抗体报告有很高的失败率，可能归因于它们缺乏临床效益，同时引起严重的免疫原性相关的不良效应。这些ADC也被人类抗小鼠抗体迅速清除，限制了它们的疗效。此外，这些早期ADC中使用的连接子在人体循环中不稳定，导致有效载荷过早释放，大大降低了效果并增加了毒性。自从出现显著降低免疫原性的人源化小鼠单克隆抗体以来，已经取代了小鼠抗体，导致更优化的设计，如2000年FDA批准的针对CD33阳性急性髓系白血病患者的首个ADC药物吉妥单抗奥佐米星。迄今为止，已有十四种ADC获得FDA市场批准，其中三种如前所述已获批准用于治疗淋巴瘤。其中，只有本妥昔单抗使用嵌合抗体。嵌合抗体是通过融合不同物种的域（例如，整个小鼠或兔的可变区与人类来源的恒定域）设计的。相比之下，人源化抗体含有嵌入人类来源的Fab区和恒定区的外来氨基酸段。因此，它们较少免疫原性，是更安全的选择。在全人抗体中，没有一部分是小鼠来源的，与人类化抗体相比，它们在免疫反应中的发生率更低；例如FDA批准的enfortumab vedotin。 2.2. 有效载荷 ADC的理想有效载荷应具有低免疫原性、长半衰期、小分子量、在抗体的水性环境中良好的溶解度、在循环和溶酶体中的高稳定性、体外亚纳摩尔半最大抑制浓度（IC-50）以及有助于与抗体结合的官能团，同时保持ADC的内化特性。每个抗体平均结合两到四个强效的细胞毒素分子。目前，ADC设计中最受欢迎的两类有效载荷是微管破坏剂和DNA靶向剂（图1）。 图1. 设计ADC时常用的十种不同有效载荷的分子结构 微管抑制剂可以根据它们的作用机制分为两大类。第一组包括微管稳定剂。这些药物通过抑制微管解聚和促进聚合来增强丝状体的稳定性，使丝状体功能降低。第二组由破坏微管的物质组成，阻止微管蛋白组装和成熟微管的发展。在ADC开发中使用和研究的主要微管抑制剂包括长春碱类、紫杉醇类、auristatins、美登素类、隐孔菌素、海葵素和圆盘菌素。auristatins如单甲基auristatin E (MMAE)通过阻止α-和β-微管蛋白单体聚合并触发凋亡来破坏微管并阻止细胞分裂。结合区域位于两个纵向排列的微管二聚体的β1-微管蛋白和α2-微管蛋白亚基之间。根据体外研究结果，auristatin-微管蛋白键合形成环状或螺旋形聚集体，改变微管的功能。长春碱类如长春新碱或长春碱，以及隐孔菌素和多拉斯他汀，诱导微管形成类似的弯曲结构构象。 在细胞周期的任何阶段，DNA损伤剂通过双链断裂、烷基化、插入和交联四种主要机制可以杀死癌细胞。最常用的DNA损伤有效载荷是卡利烯胺、二酮霉素、吡咯并苯并二氮杂环（PBD）、多柔比星和喜树碱类似物。针对BCL-2抑制剂、剪接体抑制剂和针对RNA聚合酶II的转录抑制剂等靶向药物是具有不同作用机制的额外有效载荷。 值得注意的是，根据FDA对15种含有PBD有效载荷的ADCs的肿瘤学分析，PBD有效载荷的毒性概况更高，这表明常见的不良事件包括可能的血管渗漏综合征、转氨酶升高、骨髓抑制、胃肠事件、代谢效应、肌肉骨骼事件、神经病变、呼吸困难和肾损伤，所有这些都源于PBD的非靶向输送；该分析表明，2013年至2017年间47%的PBD偶联ADCs的新药申请被中止。这些高效ADCs发生危及生命的毒性的更高发生率是一个限制。 目前减轻PBD毒性的机制包括药物-连接子组分的聚乙二醇化，这显著提高了ADC的耐受性。另一种机制是使用对氨基苄氧羰基（PABC）自毁间隔基，在连接臂-药物中；该间隔基具有稳定的二硫键，允许在细胞内快速释放自由有效载荷，从而实现更好的血浆稳定性和与可裂解连接臂相比提高的毒性。后一项研究认为，肽连接的和二硫键连接的PBD ADC在两种不同的淋巴瘤模型中提供了相似的疗效，并且二硫键连接的PBD ADC具有更好的安全性。第三种机制是通过减少PBD结构中的一个亚胺官能团进行化学修饰，从而将DNA交联的PBD二聚体转变为DNA烷基化代谢物，称为吲哚喹喔啉二聚体（IGN），这在小鼠肿瘤模型中实现了更有效的载荷释放，其中小鼠能够耐受更高剂量的IGN偶联ADC。 近期在有效载荷方面也取得了进展。主要的进展是免疫调节ADC，如干扰素基因刺激剂（STING）激动剂、Toll样受体（TLR）激动剂和使用蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）策略的目标蛋白降解剂（TPD）。STING激动剂激活干扰素和其他细胞因子的产生，从而增强免疫和抗肿瘤反应。将STING激动剂作为有效载荷纳入ADC可以实现其向肿瘤目标的传递，具有更高的疗效和由于免疫激活导致的过度炎症反应而减少的毒性。STING激动剂的例子包括DMXAA、c-di-AMP、c-di-GMP、cGAMP、ADU-S100、MK-1454、SB11285、BMS-986301、E7766、MSA-1和MSA-2；它们主要在乳腺癌中被探索。TLR激动剂通过增强肿瘤微环境中抗原呈递细胞的抗原呈递，改善先天和适应性抗肿瘤免疫，从而促进更多细胞毒性T细胞的促进和活性。它们在局部癌症中发挥作用，例如，BCG（TLR2/4激动剂）用于膀胱非浸润性癌，AS04（TLR4激动剂）用于宫颈癌，以及咪喹莫特（TLR7激动剂）用于表皮基底细胞癌。目前，许多TLR激动剂正在作为ADC中的有效载荷在癌症免疫疗法中进行研究。一个例子是BDC-1001（TLR7/TLR8激动剂与抗HER2抗体偶联的ADC），在临床前模型中显示出有希望的结果。目前正在进行一项I/II期临床试验，该试验正在招募表达HER2的晚期实体瘤患者（NCT04278144）。PROTAC是一种催化作用于小剂量的催化剂，它通过泛素化介导的蛋白水解作用靶向特定的蛋白质。当PROTAC有效载荷与抗体偶联时，它会产生PROTAC催化行为和抗体的组织特异性的新型组合，具有更好的疗效和更少的限制。在表达HER2的细胞中存在成功的例子。这些在ADC设计中的微妙改进具有巨大的潜力，通过不断的研究可以为肿瘤学带来更好的结果，并为包括淋巴瘤在内的其他癌症类型的发展打开大门。 2.3. 化学连接臂 连接臂是成功开发ADC的最重要和最复杂的部分，因为它们形成了治疗和抗体之间的联系。它们的结合机制、稳定性和化学性质对于防止意外释放药物进入血流以及在癌细胞内吞后促进容易裂解至关重要，允许有效载荷仅在预期的地点释放。它们在确定ADC的药代动力学、药效学和治疗窗口方面至关重要。目前FDA批准的ADC使用两类连接臂，它们在有效载荷释放机制上有所不同：可裂解和不可裂解连接臂。最常用的四种可裂解连接臂是β-葡萄糖醛酸酶敏感连接臂、谷胱甘肽（GSH）敏感二硫键连接臂、卡他蛋白B敏感连接臂和腙连接臂。前面描述的旁观者效应，它影响肿瘤微环境中的正常细胞和没有或低目标表达的肿瘤细胞，更有可能发生在使用可裂解连接臂的ADC中。 不可裂解连接臂与可裂解连接臂相比，具有更好的血浆稳定性、较低的非目标毒性和抗蛋白水解降解的能力，因为它们与抗体的氨基酸残基具有不可还原的键。通常，不可裂解连接臂由硫醚或马来酰亚胺己酰基团形成。附着在由降解的抗体衍生的氨基酸残基上的不可裂解连接臂必须在ADC内化后，由细胞质和溶酶体蛋白酶完全分解抗体部分才能释放有效载荷。图2展示了一般的基本结构。 图2. ADC的一般基本结构。ADC由一个嵌合或人源化（免疫原性较低）的抗体组成，该抗体对淋巴瘤癌细胞表面表达的抗原具有强烈的结合活性。抗体应在循环中具有较高的半衰期，以便被输送到目标细胞表面。抗体与不同结构的有效载荷（主要是微管抑制剂或DNA相互作用）相连，这些是具有理想药物/抗体比例的高效药物。抗体与有效载荷之间的连接是通过可裂解或不可裂解的连接臂实现的，这些连接臂应具有精确的结合、在循环中的稳定性，并确保在目标处有效分配有效载荷。 3.FDA批准用于淋巴瘤的ADC  截至2023年，已有三种ADC获得了FDA对各种类型淋巴瘤的批准，分别是Brentuximab Vedotin（BV）、Polatuzumab Vedotin（PV）和Loncastuximab Tesirine（LT），如表1所示。 Brentuximab Vedotin（BV）由针对CD30的IgG1嵌合单克隆抗体“cAC10”和细胞毒素MMAE组成，它们通过一个稳定的连接臂（Cathepsin可裂解连接臂和对氨基苄基-羰基间隔基）结合在一起。嵌合单克隆抗体cAC10与CD30结合，随后通过内吞作用和随后与溶酶体的囊泡融合，在溶酶体中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶裂解连接臂，释放MMAE直接进入癌细胞内，从而导致癌细胞毒性。抗体和MMAE之间的连接系统设计为在循环中稳定，由马来酰亚胺己酰基间隔基、蛋白酶敏感的二肽Val-Cit、自毁PABC基团以及二肽和药物之间的附加间隔基组成。后者具有自裂解的能力，并有助于卡他蛋白B进入其裂解序列。马来酰亚胺部分与抗体重链和轻链中的半胱氨酸残基的末端硫醇形成硫醚键，将连接臂连接到抗体。由蛋白酶裂解Cit-PABC酰胺键产生的不稳定PABC取代的MMAE中间体，通过自发的1,6-消除反应，产生自由的MMAE分子、CO2和对氨基苄基醇。值得注意的是，CD30在恶性淋巴瘤细胞上表达非常强，在正常组织上表达较少。与单独的抗体相比，BV可以使CD30+细胞系的生长停滞高达340倍。BV的结构和作用机制如图3所示。cHL的恶性Reed-Sternberg细胞以表达CD30为特征，CD30是肿瘤坏死因子超家族的成员，鉴于其对一小部分活化的B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞的表达限制，它代表了单克隆抗体治疗的理想靶点。BV在未经治疗的cHL患者和R/R疾病中表现出显著的活性，导致在这些情况下获得FDA批准。 图3. BV的结构和作用机制。它由一个针对淋巴瘤细胞上CD30抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被细胞内运输到溶酶体，在那里释放MMAE（有效载荷），干扰细胞核中的微管结构，导致细胞周期停滞和凋亡。 ECHELON-1 III期试验将1334名未经治疗的III期或IV期cHL患者随机分配接受BV-AVD（Brentuximab Vedotin、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）或ABVD（Adriamycin、Bleomycin、Vinblastine、Dacarbazine）。试验显示BV-AVD组的2年修正无进展生存期（PFS）为82%，而ABVD组为77%，风险比（HR）为0.77，6年总生存期（OS）分别为93.9%和89.4%，HR为0.59。基于ECHELON-1的结果，FDA批准BV与化疗联合用于成人未经治疗的III期或IV期cHL的治疗。最近，SWOG S1826试验被开发出来，比较BV-AVD与N-AVD（Nivolumab、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）对儿童和成人新诊断的晚期cHL（III期或IV期）患者的疗效。S1826研究表明，Nivo-AVD的1年PFS（94%）优于BV-AVD（86%），HR为0.48，并且两组的不良事件（AE）概况相当，因此它目前是未经治疗的cHL的一线治疗的首选方案。 尽管年轻患者更容易耐受多药化疗方案，但由于多种因素，包括合并症、身体状况差、无法耐受全剂量化疗以及治疗相关AEs增加，老年cHL人群的治疗结果较差。一项多中心II期研究评估了60岁及以上患者的序贯BV方案，随后进行AVD化疗，并在随后进行BV维持治疗。研究报告了84%的2年PFS率和93%的2年OS率。这种序贯方法提高了这一脆弱人群中cHL的治愈率，是新诊断cHL老年人的首选方案。 在R/R cHL环境中，BV最初在自体造血干细胞移植（ASCT）失败的患者中进行了研究。BV单药治疗显示总响应率（ORR）为75%，完全缓解（CR）为34%，中位无进展生存期（mPFS）为5.6个月。值得注意的是，CR患者的中位持续响应时间（mDOR）为20.5个月。这些结果导致BV首次获得FDA批准，用于治疗ASCT失败或至少两个先前的多药化疗方案失败的cHL患者。随后，AETHERA III期试验包括了接受过ASCT并具有以下不利风险之一的cHL复发难治性疾病患者，例如原发性难治性HL、初次缓解<12个月的复发HL，或一线治疗后复发时的结外受累。AETHERA研究表明，ASCT后早期巩固使用BV将mPFS提高到42.9个月，而对照组为24.1个月，HR为0.57。基于AETHERA试验，FDA随后扩大了BV的批准范围，用于治疗ASCT巩固后有高复发或进展风险的cHL患者。 除了前述的FDA批准外，BV还根据CheckMate 744 II期研究的结果，被国家综合癌症网络（NCCN）指南推荐与Nivolumab联合用于复发或难治性cHL患者的二线或后续治疗。该研究评估了涉及Nivolumab加BV，随后对次优反应患者使用BV加Bendamustine的风险分层响应适应方法。CheckMate 744研究表明，59%接受BV和Nivolumab治疗的患者，以及94%随后接受BV和Bendamustine治疗的患者，实现了完全分子反应（CMR）。这些结果明显优于历史上60至70%的CMR率，为R/R环境中的更高治愈率奠定了基础。 正在进行的BV在cHL的试验如图2所示。 BV在CD30阳性T细胞淋巴瘤中的作用 系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）中CD30的普遍表达，以及在外周T细胞淋巴瘤-未另行指明（PTCL-NOS）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）和成人T细胞白血病或淋巴瘤（ATLL）等亚型中的高表达，为在T细胞淋巴瘤中靶向CD30提供了强有力的理由。 一项针对至少一种联合化疗方案失败后的R/R ALCL患者的II期研究显示，86%的患者实现了客观反应，其中57%为CR，mDOR为12.6个月。这项研究的结果导致FDA批准BV用于R/R PTCL。ECHELON-2试验旨在比较BV与环磷酰胺、多柔比星和泼尼松（A+CHP）联合使用与标准CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）治疗未经治疗的CD30阳性PTCL患者的疗效和安全性。A+CHP显示出48.2个月的mPFS，与CHOP的20.8个月相比，具有可比的安全性概况。5年PFS分别为A+CHP的51.4%和CHOP的43%（HR 0.7），5年OS分别为A+CHP的70.1%和CHOP的61%（HR 0.72），两组之间的安全性概况相当。随后的亚组分析显示，S-ALCL主要从A+CHP中受益，而AITL和PTCL-NOS亚组的益处尚不明确。 除了PTCL，BV在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中的作用也得到了探索。ALCANZA III期试验包括了接受过一线系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈样真菌病（MF）的患者。在平均45.9个月的随访中，试验偏爱BV组，ORR为54.7%对12.5%，mPFS为16.7对3.5个月。同样，与医生选择相比，BV组的下一次治疗的中位时间显著更长（14.2对5.6个月；HR 0.27）。基于ALCANZA试验的结果，FDA批准BV用于治疗接受过先前系统治疗的pcALCL或表达CD30的MF患者。目前，BV正在许多早期阶段的试验中进行评估，这些试验包括在表2中。 波拉图珠单抗（PV）由一种抗CD79B的人源化IgG1单克隆抗体组成，通过一个可被蛋白酶裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC肽段连接臂与MMAE结合。一旦波拉图珠单抗与CD79b结合，它就会被内吞并通过内质网运输到溶酶体，在那里发生连接臂裂解，导致有效载荷释放到细胞内诱导凋亡。PV的结构和作用机制如图4所示。 图4. PV的结构和作用机制。PV由一个针对淋巴瘤细胞上的CD79b抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被内吞到内质体，并与溶酶体融合。然后连接臂被裂解以释放MMAE（有效载荷），这反过来导致细胞核中的有丝分裂停止和细胞死亡。 5.1. PV在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的形式。虽然利妥昔单抗的加入显著提高了CHOP化疗的治愈率，但大约40-50%的患者最初反应后会出现难治性疾病或复发。 POLARIX是一项具有里程碑意义的III期研究，评估了PV加入R-CHP（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松）在DLBCL一线治疗中的疗效，并与R-CHOP进行了比较。POLARIX证明了pola-R-CHP组2年PFS为76.7%对70.2%，（分层HR 0.73）。两组的整体安全性概况相似。值得注意的是，pola-R-CHP的益处在60岁以上的患者、国际预后指数（IPI）在3到5之间的患者以及具有活化B细胞样亚型的DLBCL患者中观察到。相反，在60岁或以下的患者、有大量疾病、较低IPI评分或滤泡中心B细胞样亚型的DLBCL患者中没有明显益处。基于POLARIX试验，pola-R-CHP是第一个在DLBCL一线治疗中证明比R-CHOP具有更好PFS的方案，并获得了FDA对先前未经治疗的DLBCL、未另行指明（NOS）、高级别B细胞淋巴瘤（HGBL）或IPI评分为2或更高的患者的批准。 POLAR BEAR III期试验比较了mini-R-CHOP与pola-mini-R-CHP作为老年DLBCL患者的一线治疗。初步安全性数据显示，两种方案在老年人（69%在80至90岁之间）和脆弱人群中（16%脆弱，12%的ECOG表现状态为3）都是可耐受的，用波拉图珠单抗替代长春新碱并没有导致3到4级血液学毒性或神经病变的发生率更高。值得注意的是，pola-mini-R-CHP组的胃肠道不良事件频率更高（31%对16%）。基于POLARIX试验的结果，人们倾向于假设pola-mini-R-CHP可能显示出比mini-R-CHOP更好的PFS。因此，这项研究的结果备受期待。 在R/R DLBCL环境中，评估PV安全性和有效性的第一项试验是Ib/II期试验，该试验比较了PV与利妥昔单抗（R）和苯达莫司汀（B）联合使用与单独BR对不适合移植的R/R DLBCL的疗效。pola-BR组显示更高的CR（40%对17.5%），更长的mPFS（9.5对3.7个月，HR 0.36），以及更高的mOS（12.4对4.7个月，HR 0.42）。然而，它导致了更高比例的3到4级中性粒细胞减少症（46.2%对33.3%）、贫血（28.2%对17.9%）和血小板减少症（41%对23.1%），尽管3到4级感染的发生率相似（23.1%对20.5%）。与PV相关的周围神经病变在43.6%的患者中观察到，但大多数是1到2级并解决了。这项试验导致了2019年6月pola-BR的初步批准及其在这种情况下的广泛使用。 波拉图珠单抗的另一个有希望的组合在Ib/II期试验中得到证明，该试验结合了Mosunetuzumab，一种针对CD20和CD3的人源化IgG1双特异性抗体，在R/R DLBCL、HGBCL、转化的FL或3b级FL中。在平均23.9个月的随访中，59.2%的患者对波拉图珠单抗加Mosunetuzumab有反应，45.9%的患者达到了CR。mPFS为11.4个月，mOS为23.3个月。这种方案被良好耐受，最常见的AE是25%患者的中性粒细胞减少症。总的来说，这些结果表明波拉图珠单抗和Mosunetuzumab的组合可以在不适合移植的R/R LBCL中带来具有临床意义的反应和有利的安全性概况。 5.2. PV在其他B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中的应用 除了DLBCL，包括PV的联合疗法也在惰性B-NHL中进行了探索。在Ib/II期试验中，评估了波拉图珠单抗、奥比妥珠单抗（G）和来普尼（Len）联合治疗R/R FL的安全性和有效性。在平均27个月的随访后，结果显示ORR为76%，CR率高达63%，尽管没有达到预先设定的活性阈值。在平均43.3个月的随访后，mPFS和mOS尚未达到，而4年的里程碑PFS为53%。这些结果与R/R FL的现有标准化疗选择相当，并支持在FL中进一步研究Pola-G-Len方案。 PV的疗效也在套细胞淋巴瘤（MCL）中进行了研究。在一项针对R/R MCL的II期研究中，PV与Mosunetuzumab联合用于先前接受过两线或以上治疗的患者，包括布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi），并显示出75%的高ORR和70%的CR。然而，需要更多的结果数据来评估其在MCL中的作用，对于对化疗免疫疗法和BTKi耐药的患者迫切需要新的方案。 6.隆卡图珠单抗  CD19是一种在B细胞分化的最早阶段直到浆细胞发育过程中表达的表面糖蛋白。除了正常的B细胞，CD19也在大多数B细胞淋巴瘤中表达。与CD20相比，CD19表现出更均匀的表达，并在抗CD20靶向治疗后的小部分CD20阴性肿瘤中保留，使其成为免疫疗法和联合疗法的选择性靶点。隆卡图珠单抗（LT，ADCT-402）是一种ADC，由一种人源化抗CD19单克隆抗体组成，通过一个可被卡他蛋白裂解的连接臂与高度细胞毒性的DNA小沟交叉链接吲哚喹喔啉二聚体毒素（PBD二聚体）结合。由于其快速的内吞动力学、运输到溶酶体和在循环中的稳定性，LT是针对CD19最有效的ADC。LT的结构和作用机制如图5所示。 图5. LT的结构和作用机制。LT由单克隆抗体Loncastuximab通过可裂解连接臂(统称为Tesirine)与PBD二聚体(有效载荷)相连。该抗体与淋巴瘤细胞上的CD19抗原结合，之后整个复合物被内吞并合并到溶酶体中。接着，PBD被释放到细胞质中，它移动到细胞核，在那里发生DNA交叉链接，导致细胞死亡。 6.1. LT在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 LT在人体I期研究中显示出对R/R NHL具有临床意义的活性，这导致了LOTIS-2研究，该研究评估了其在R/R DLBCL中的疗效。LT显示出48.3%的ORR，其中50%的应答者达到了CR。虽然mPFS为4.9个月，但达到CR者的mDOR为13.4个月。它展示了通常被良好耐受的安全概况，中性粒细胞减少症是最常见的3级AE（26%），其次是血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶升高（17%）。显著的抗肿瘤活性、持久的反应和可接受的安全概况导致了2021年FDA批准用于治疗经过两线或以上系统治疗后的R/R大B细胞淋巴瘤。批准包括那些有DLBCL NOS、由低级别淋巴瘤引起的DLBCL和HGBL。 在具有里程碑意义的LOTIS-2研究之后，LT与其他靶向疗法的组合，如LOTIS-3中的ibrutinib和LOTIS-5中的单克隆抗CD20抗体rituximab对R-GemOX（利妥昔单抗、吉西他滨和奥沙利铂）进行了评估，但目前尚不清楚这些组合是否会进入临床应用（表2）。 6.2. LT在滤泡性淋巴瘤中的应用 LT在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤(R/R NHL)的I期研究中进行了评估，其中在滤泡性淋巴瘤(FL)中显示了78.6%的客观反应率(ORR)。在2023年美国血液学会(ASH)会议上，最近展示了将LT与利妥昔单抗联合应用于R/R FL的II期试验的非常鼓舞人心的结果。该试验显示了95.2%的客观反应率，其中包括66.7%的完全缓解(CR)和28.6%的部分缓解(PR)的比率。 7.其他正在研究、开发和评估用于治疗淋巴瘤的抗体药物偶联物  7.1 针对CD19的抗体药物偶联物  7.1.1 科尔图珠单抗拉伐坦辛  科尔图珠单抗拉伐坦辛（SAR3419）是一种IgG1抗体（huB4），通过二硫键交联剂SPDB与细胞毒素药物DM4相连，靶向CD19。CD19是一种在血液形成分化过程中的B淋巴细胞系高度表达的蛋白，从早期B细胞到成熟B细胞，并在大多数B细胞恶性肿瘤中保持表达。两项II期试验已经研究了科尔图珠单抗拉伐坦辛作为单药或联合用药的使用。一项正在进行的试验正在检查其在R/R DLBCL患者中单药治疗的使用，初步数据显示ORR为44%；然而，mPFS、mOS和DOR尚未得出。它具有可接受的安全性概况，药物在41名患者中有4名因不良事件而中断。另一项试验检查了科尔图珠单抗拉伐坦辛与利妥昔单抗联合用于DLBCL患者，显示出ORR为31.1%，在复发疾病患者中疗效最高（ORR 58.3%），与难治疾病（ORR 43%）或一线治疗（ORR 15.4%）形成对比。总体而言，它显示出mPFS为3.9个月，mOS为9个月，DOR为8.6个月。 7.1.2 德尼珠单抗马佛多汀 德尼珠单抗马佛多汀（SGN-19A或SGN-CD19A）是另一种针对CD19的ADC。它是一种抗体（hBU12-491），通过不可裂解的马来酰亚胺己酰基连接臂与MMAF偶联。一项主要纳入了B-ALL患者（n = 59）的I期试验，以及侵袭性B细胞淋巴瘤（n = 6）和伯基特白血病/淋巴瘤（n = 6），显示DOR为27个月。每3周给药一次，在B-ALL中显示CRc（CR+CRi+CRp）为35%。在六名伯基特白血病/淋巴瘤患者和六名B-LBL患者中，每组只有一名达到CR。最常见的AEs是发热（54%）和恶心（52%）。另一项主要纳入了R/R DLBCL（n = 53），以及MCL（n = 5）和FL（n = 3）的I期试验，与前一次试验相比，在DLBCL中显示出略高的活性，ORR为33%，CR为22%，复发病例的DOR为39周，难治病例为41周。最常见的AEs与眼睛相关：视力模糊（65%）和干眼（52%）。德尼珠单抗马佛多汀在两项II期试验中进一步与化疗联合研究，一项将其与RICE化疗联合用于R/R DLBCL或3B级FL，与单独RICE进行比较，而另一项研究了其与R-CHOP或R-CHP联合对照R-CHOP单独作为DLBCL或3B级FL的一线治疗；然而，这两项试验都被赞助商终止。 7.2 针对CD22的抗体药物偶联物 7.2.1 伊诺珠单抗奥佐加霉素 CD22是一种135 kDa的I型跨膜糖蛋白，是一种在未成熟和成熟B细胞上表达的B细胞系特异性蛋白。它在B细胞恶性肿瘤包括大多数淋巴瘤和白血病中上调表达。目前有两种针对CD22的ADC正在淋巴瘤中进行研究。第一种是伊诺珠单抗奥佐加霉素（CMC-544），一种IgG4 kappa单克隆抗体，带有N-乙酰-γ-卡利奇霉素二甲基肼，一种卡利奇霉素的半合成衍生物，通过4'-乙酰苯氧基丁酸连接，于2017年8月获得FDA批准用于R/R B细胞ALL。一项I期试验研究了其在R/R B细胞NHL患者中的应用，显示79名入组患者的ORR为39%，在FL中为68%，在DLBCL中为15%。然而，DOR很短，DLBCL的mPFS为10.4个月，FL为49天。患者中有90%出现最常见的AE，即血小板减少。一项针对顽固性B细胞NHL（n = 81）的II期试验显示了类似的结果，ORR为67%，CR为31%，mPFS为12.7个月。 7.2.2 匹那珠单抗韦德汀 匹那珠单抗韦德汀（Pina，DCDT2980S，RG-7593）是一种抗CD22的单克隆IgG1抗体，通过可裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC连接臂与MMAF偶联。一项I期试验显示，与利妥昔单抗联合使用相比，作为单药治疗使用时显示出更高的疗效，DLBCL组的ORR分别为25%和17%。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中未见客观反应。在II期试验ROMULUS中进一步检查了其与利妥昔单抗的联合使用，与R-pola相比，在DLBCL患者中显示出更优越的反应，但在FL患者中没有；DLBCL队列在R-Pina（n = 42）上显示ORR为60%，CR为26%，而R-Pola（n = 39）上为ORR 54%，CR 21%。在这项试验中，两者的AEs相当，R-pina组DLBCL队列的3-5级AEs为79%，R-Pola为77%。在FL队列中，AEs略低，R-Pina和R-Pola的3-4级AEs分别为62%和50%。 7.3 针对CD25的抗体药物偶联物 卡米达卢单抗特西林 CD25是一种I型跨膜蛋白，是白细胞介素-2受体α链，是一种在活化的B细胞、活化和调节性T细胞以及髓系前体上表达的蛋白，在包括淋巴瘤和白血病在内的各种肿瘤中过度表达。卡米达卢单抗特西林（ADCT-301，HuMax-TAC）是一种IgG1单克隆抗体，通过可被卡他蛋白裂解的缬氨酸-丙氨酸二肽连接臂与PBD二聚体弹头（SG3199）偶联。一项I期试验检查了其在R/R cHL（n = 133）和R/R NHL（n = 56）中的疗效，其中在cHL患者中显示出71%的优越ORR和42%的CR，与R/R NHL相比（ORR 38%和CR 9%）。3级及以上AEs包括GGT水平升高（15%）、皮疹（12%）和贫血（11%）。更重要的是，3.8%的患者出现了严重的神经系统事件，包括吉兰-巴雷综合征（GBS）/多神经根病变，27.4%的患者因不良反应而中断治疗。尽管研究报告的CR令人鼓舞，但FDA建议不要提交用于治疗R/R HL的批准文件，因此其未来仍不明朗。 7.4 针对CD37的抗体药物偶联物 纳拉图珠单抗艾美曲辛 CD37是一种参与细胞膜组织和共刺激信号的跨膜蛋白，主要在成熟B细胞上表达，在T细胞、巨噬细胞/单核细胞和粒细胞上表达较少。它在成熟的B细胞恶性肿瘤中高度表达，如CLL，在DLBCL中表达不一，CD37阳性范围从40%到90%的病例，而在急性淋巴细胞性白血病（ALL）和HL中低表达或缺失。纳拉图珠单抗艾美曲辛（IMGN529）是一种IgG1单克隆抗体，通过硫醚连接臂N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)与美登木素DM1偶联，靶向CD37。 纳拉图珠单抗艾美曲辛最初在R/R B细胞淋巴瘤的I期试验中研究，结果显示最小的效果，总有效率（ORR）为13%。然而，纳拉图珠单抗艾美曲辛与利妥昔单抗联合的II期试验结果显示，在DLBCL中ORR更高，达到44.7%，完全缓解（CR）为31.6%，在FL中的响应率略高，ORR为57%，CR为36%。在中位随访15个月和21.8个月时，DLBCL和FL亚组的中位持续缓解时间（mDOR）尚未达到。治疗总体上被良好耐受，如在FACT-Lym QoL的淋巴瘤子量表上平均提高了三点的生命质量（QoL）测量所示。总体而言，目前尚不清楚它是否会进入III期研究。 7.5 针对CD70的抗体药物偶联物 Vorsetuzumab Mafodotin CD70是一种共刺激分子，也是肿瘤坏死因子超家族的成员，它在抗原激活的B细胞、T细胞、NK细胞和成熟的树突状细胞上短暂表达。它在实体瘤和血液学恶性肿瘤中异常表达。Vorsetuzumab Mafodotin (SGN-75)是一种ADC，靶向CD70分子和微管毒素分子，连接到单甲基奥瑞斯他汀F（MMAF）。在R/R CD70+ NHL的I期试验中显示出不可接受的毒性，主要是血小板减少症。此外，SGN-CD70A是一种通过稳定、可被蛋白酶裂解的肽基连接臂与PBD二聚体偶联的工程半胱氨酸单克隆抗体（EC-mAb），靶向CD70。同样，它也与不可接受的毒性相关，并且只有适度的活性。 7.6 针对ROR1的抗体药物偶联物 7.6.1. Zilovertamab Vedotin ROR1是一种酪氨酸激酶跨膜受体，表达在未成熟的B淋巴细胞、内分泌腺和小肠上。它在血液学恶性肿瘤中高度表达，尤其是B细胞淋巴瘤。Zilovertamab Vedotin (MK 2140或VLS-101)是一种针对ROR1的人源化IgG1单克隆抗体，通过可被蛋白酶裂解的连接臂与MMAE偶联。在一项具有里程碑意义的I期试验中，Zilovertamab Vedotin在R/R MCL患者中显示出47%的ORR，CR为20%，在R/R DLBCL患者中ORR为60%。II期waveLINE-004研究，将Zilovertamab Vedotin作为R/R DLBCL的单药治疗，显示出略低的疗效，ORR为30%，有10%的患者实现了CR。最常见的3-4级AEs是中性粒细胞减少症（18%），其次是贫血（15%）。目前有额外的研究正在进行招募；一项是将Zilovertamab Vedotin与R-CHP联合用于DLBCL的前线治疗的II期试验，另一项是评估其与R-GemOX联合对照R-GemOX单独用于R/R DLBCL的II/III期研究。 7.6.2. Cirmtuzumab-ADC-7 另一种针对ROR1的ADC是Cirmtuzumab，一种针对ROR1的单克隆抗体，通过UC-961连接臂与MMAE偶联。在I/II期，Cirmtuzumab与ibrutinib联合用于R/R MCL或治疗未经验（TN）或R/R CLL的管理。在MCL队列中，Cirmtuzumab显示出80%的ORR，35%的患者实现了CR。值得注意的是，在中位随访14.9个月时，mPFS尚未达到。在CLL队列中，结果随着成熟仍然令人鼓舞，TN和R/R CLL患者的mPFS在中位随访14个月和7个月时也未达到。总体而言，该研究正在进行中，结果看起来很有希望。 7.7 临床前开发中的ADCs 7.7.1. 新型CD30靶向ADC：SGN-35C SGN-35C在组成上与BV相似，都是抗CD30抗体，但在连接臂上有所不同，它连接的是一种新型的喜树碱衍生的拓扑异构酶1抑制剂有效载荷。在CD30阳性ALCL和HL细胞系上进行的体外和体内研究，包括那些对BV有抗性的细胞系，显示出治疗诱导的细胞毒性。值得注意的是，这种效果扩展到了CD30阴性细胞，表明了旁观者效应。非人灵长类动物模型也证实了其安全性。下一步是人类临床试验，目前正在计划中。 7.7.2. CD19靶向ADC：IKS03 IKS03由一种针对CD19的人源化抗体组成，设计用于位点特异性结合PBD前药有效载荷。它通过生物结合激活，产生一种药物与抗体比率为2的偶联物。体外和体内研究已经证明了其在多种CD19阳性淋巴瘤细胞系中的有效细胞毒性，最值得注意的是在含有经常在R/R NHL中观察到的遗传异常的MCL和DLBCL异种移植模型中，如CCND1 t(11;14)易位和三重打击淋巴瘤，涉及BCL-2、BCL-6和c-MYC的基因重排。此外，与其他使用PBD前药的ADC相比，它展示了更低的非特异性有效载荷从偶联物中的释放率，包括LT。目前正在进行I期临床试验NCT05365659，以评估其在晚期B细胞NHL患者中的安全性。 7.7.3. CXCR5靶向ADC：VIP924 VIP924是一种首创的ADC，靶向CXCR5，由一种可被legumain裂解的连接臂和一种微管蛋白抑制剂（KSPi）有效载荷组成。CXCR5是一种趋化因子受体，在B细胞和T细胞来源的淋巴瘤上高度表达，并参与调节肿瘤细胞侵袭、生长和迁移的途径。一项体内研究比较了VIP924与PV和LT在MCL的人性化小鼠模型中的效果。结果表明VIP924在抑制肿瘤生长、提高存活率和耐受性方面的优势。值得注意的是，与LT不同，VIP924组的动物没有经历细胞减少症。这些有希望的结果支持在人类临床试验中进行进一步研究的需求。 8.ADCs的未来发展方向 最近在设计位点特异性ADCs、利用双特异性抗体以及修改可裂解连接臂方面取得了进展，以期使ADCs更有效、更高效，同时最小化毒性。一种新颖的偶联化学方法涉及位点特异性附着，其中一些技术利用抗体中的天然链间二硫键，而其他技术则需要生物工程将酶促偶联标签整合到抗体序列中。尽管在淋巴瘤中尚未探索，但位点特异性偶联已在实体恶性肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌）中得到评估。其中一种应用是ThioMab技术，它涉及使用工程化半胱氨酸进行位点特异性偶联。使用这种技术生产的ADC包括抗MUC16 ADC，它由在曲妥珠单抗的轻链和重链的特定位置插入半胱氨酸残基组成，然后与MMAE上的硫醇基团结合。此外，pClick技术提供位点特异性偶联；然而，它使用天然抗体和近距离激活的交联剂，不涉及任何生物工程。ThioBridge技术包括一种可裂解的连接臂，也使用天然抗体，并由三碳桥接附着提供增强的稳定性。此外，最近创新的AJICAP第二代技术通过利用硫酯化学的选择性裂解反应，实现了无聚集挑战的位点特异性ADC的生产，并有望成为无需抗体工程的位点特异性ADC。最后，通过不同的方法（如糖基重塑、转谷氨酰胺酶或脂酸连接酶方法）对天然抗体进行无标签酶促修饰，作为推进ADC发展的潜在工具具有潜力。 一类有前景的ADCs由双价双特异性抗体组成，如在HER-2靶向ADC中所示。双特异性抗体靶向两个不重叠的表位，随后诱导受体聚集和内化。这类ADCs已在乳腺癌中显示出疗效，并且在临床前研究中检查了MET过表达肿瘤，提供了有效的细胞毒性。 关于连接臂的最新进展，工作集中在制造稳定以避免非目标有效载荷释放的连接臂，但也容易在目标部位裂解以有效传递。这导致制造具有pH和微环境依赖性裂解的连接臂，允许ADCs在细胞内释放有效载荷。 这些进展正处于开发或临床前阶段研究中，有望提高下一代ADCs在包括淋巴瘤在内的各种癌症中的治疗效果。 9.结论  ADCs是革新了霍奇金和非霍奇金淋巴瘤治疗的新方法。抗体、连接臂和有效载荷的进步将导致ADCs的进一步发展，对淋巴瘤具有更高的特异性和细胞毒性。虽然获得抗性将是一个限制因素，但与其他新型药物的联合疗法，如单克隆抗体、分子靶向疗法和双特异性抗体，将为新的突破性治疗铺平道路。我们迫切需要创新的I期研究，以更好地理解ADCs在不同疾病环境中的作用，因为我们的目标是提高淋巴恶性肿瘤的治愈率。

摘要：疫苗是控制传染病最有效的工具，这些疾病会导致显著的发病率和死亡率。大多数疫苗通过非肠道途径给药，能够引发强烈的系统性体液免疫反应，但它们诱导的T细胞介导的免疫较弱，且在诱导粘膜保护方面效果不佳。考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，一种能在宿主与病原体首次接触点引发保护的疫苗是很有前景的。然而，尽管粘膜疫苗作为在粘膜表面提供保护的良好选择具有优势，目前只有少数粘膜疫苗获得批准。在本篇综述中，我们讨论了疫苗在不同粘膜表面的给药影响；适当的佐剂如何增强保护性粘膜免疫的诱导以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 1.引言 疫苗是控制传染病、导致发病率和死亡率的重要原因的最有效工具。根据世界卫生组织的数据，疫苗每年在全球范围内预防超过250万人死亡。因此，疫苗成功地根除了天花，并减少了其他几种疾病如脊髓灰质炎和麻疹的发病率。 疫苗通过在体内模拟病原体感染来发挥作用，这导致免疫系统激活以对抗病原体。疫苗给药后，疫苗中的病原体相关分子模式（PAMPs）与注射部位的先天免疫细胞中的模式识别受体（PRRs）相互作用，并触发免疫级联反应，涉及趋化因子和细胞因子的产生增加，导致注射部位的抗原呈递细胞（APCs）数量增加。APCs主要负责抗原的摄取和随后呈递给激活B细胞的T细胞，导致抗体产生。因此，为了对病原体产生强大和有效的免疫反应，强烈激活B细胞和T细胞是必要的。 消除病原体后，适应性免疫系统会对其发展免疫记忆。这种免疫记忆是长期个体保护的基础，其特点是抗体的持续存在和记忆细胞的产生，这些细胞在再次暴露于同一病原体时会迅速重新激活。因此，疫苗接种的目标是诱导记忆细胞。 大多数疫苗通过非肠道途径给药，通常包括：皮下（SC）、皮内（ID）和肌肉内（IM）。ID免疫接种比IM注射诱导更强的免疫反应，而SC和IM在临床研究中诱导相似的反应。一个可能的解释是，真皮含有更多的树突状细胞（DCs），这有助于抗原的捕获，局部炎症诱导DCs的成熟和它们迁移到引流淋巴结，导致疫苗剂量节省。尽管ID疫苗注射比其他非肠道途径更有效地诱导免疫反应，但它在给药部位引起更严重的不良反应，其次是SC和IM途径。有研究表明，在15个月至5岁儿童中，接种B型流感嗜血杆菌多糖疫苗时，SC/ID注射可能比IM注射更疼痛。尽管有其优势，但使用非肠道途径需要针头，这使得这种途径更具侵入性且成本更高，除了由于使用不当而存在感染风险外，还需要训练有素的人员进行给药。此外，非肠道疫苗可以引发强烈的系统性体液反应，但提供较弱的T细胞介导的免疫和粘膜保护。 与非肠道疫苗相关的另一个问题是，这种途径只保护疾病而不是感染。一些研究发现，接种了针对B型脑膜炎奈瑟菌的疫苗的个体对侵袭性疾病有保护作用，但在随后的12个月内，并没有迹象表明N. meningitidis的携带密度有所减少。 考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，因为这些表面直接与空气、水、食物和环境接触，针对宿主与病原体首次接触点的疫苗具有吸引力，因为它们有潜力从首次接触点保护宿主免受病原体侵害。 通过粘膜表面和ID途径给药的疫苗显示出抗原的快速和广泛生物分布，以及诱导保护性粘膜和系统性细胞和体液反应的能力。特别是，粘膜疫苗更安全，因为它们不需要针头。这一方面也导致依从性增加。因此，它们便于在流行病/大流行环境中进行大规模疫苗接种，因为它们易于给药。尽管有所有这些优势，但由于粘膜疫苗需要安全有效的粘膜佐剂来实现预期的免疫反应，此外，抗原必须根据粘膜给药途径免受降解，目前只有少数粘膜疫苗可供商业使用，如表1所示。 鉴于上述情况，在本篇综述中，我们讨论了疫苗在粘膜表面的给药影响，适当的佐剂或载体配方如何促进保护性粘膜免疫的诱导，以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 2.粘膜表面的免疫防御 粘膜表面覆盖了身体的400平方米，包括胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道。为了防御感染，粘膜表面配备了由粘膜上皮细胞提供的物理、化学和免疫机制（图1）。物理屏障由细胞间的紧密连接和浓密的粘液层组成，防止外来物质的进入和/或粘附。生化屏障由pH差异和微生物群产生的抗菌肽提供。最后，免疫防御包括先天和适应性免疫反应。 图1 粘膜表面和防御机制。上皮细胞之间的紧密连接是抵御病原体的物理屏障。微生物群和抗菌肽分别是病原体的生物和生化屏障。为了引发特异性免疫反应，微褶(M)细胞负责在腔内摄取抗原并将其呈递给树突状细胞，树突状细胞通过MHC-II将其呈递给T淋巴细胞。T细胞分泌细胞因子，调节细胞反应的模式（Th1、Th2、Th17、Treg），并促进B细胞分化为浆细胞，这些浆细胞产生分泌型IgA（SIgA），能够在粘膜中和病原体。 粘膜组织拥有一个被称为粘膜相关淋巴组织（MALT）的有组织的淋巴组织团块。MALT包括被滤泡相关上皮覆盖的淋巴滤泡，其中含有微褶（M）细胞，它们负责在腔内摄取抗原并呈递给树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在那里它们被处理并呈递给淋巴细胞。DCs将抗原呈递给初始T细胞，以克隆扩增并分化为T辅助（Th）细胞亚群（Th1、Th2、Th17或调节性T细胞）。每个亚群将决定细胞因子分泌的轮廓，之后，T细胞与B细胞相互作用，促进它们在多个粘膜部位的分化和抗体产生。这些B细胞将产生抗原特异性的分泌型免疫球蛋白A（SIgA），它防止病原体在粘膜表面的侵袭，以及IgG抗体。Th细胞在粘膜免疫中扮演重要角色。一些报告表明，主要由Th17细胞分泌的白介素（IL）-17是疫苗诱导的对肺炎链球菌、结核分枝杆菌和流感的保护所必需的。此外，IL-17可以通过上调粘膜上皮中的多聚Ig受体水平来增加SIgA水平，并促进B细胞不依赖T细胞分化成SIgA。 在肠道中，免疫系统级联反应发生在有组织的肠道相关淋巴组织（GALT）中，主要在Peyer氏斑中，这是IgA类别转换的主要部位。在上呼吸道中，它发生在小鼠的鼻相关淋巴组织中，由位于鼻咽管入口的硬腭上的一对有组织的淋巴聚集体组成。这种鼻组织在功能上似乎与人类的Waldeyer环扁桃体和腺样体相当。在下呼吸道中，发现了支气管相关淋巴组织。它是肺淋巴系统的一部分，通常在健康成人中不存在，但在抗原刺激下出现，包括炎症、吸烟习惯、胶原血管疾病、感染和艾滋病。 2.1.分泌型IgA：粘膜武器 如前所述，SIgA通过控制与宿主的首次接触以来的病原体定植，从而预防传染病，这是粘膜免疫的一个主要特征。IgA抗体，以其α重链为特征，存在于血清和粘膜中，有两种亚型：通常在血清中发现的IgA1，以及在粘膜中经常出现的IgA2。虽然IgA1主要由蛋白质抗原诱导，但IgA2在抗脂多糖（LPS）反应中占主导地位。 SIgA和血清IgA在位置、结构和功能上有所不同。SIgA通常呈现二聚体结构，并具有分泌成分，这为分子提供了稳定性，保护免疫球蛋白不被降解（鉴于粘膜环境的侵略性），从而帮助抗体与病原体蛋白结合。此外，SIgA是局部产生的，分泌量高，能够中和病原体。有证据表明粘膜中B细胞的快速周转以及长寿浆细胞的存在。最有可能的情况是，浆细胞会根据微生物群组成的变化而持续存在，微生物群的组成受到饮食、感染和抗生素治疗的影响，因此建立了一个动态平衡。 相反，血清IgA通常呈现单体结构，并且分泌滴度较低。有证据表明它有助于控制炎症，但关于其激活补体系统和促进病原体吞噬的能力存在矛盾的研究。SARS-CoV-2感染的粘膜性质导致了几项针对血清IgA的研究。早在2020年，就已验证人类单克隆IgA抗体能够有效地与SARS-CoV-2结合，并阻断血管紧张素转换酶2（ACE2）和受体结合域（RBD）的相互作用，表现出中和活性。因此，当转化为SIgA和IgG结构时，只有前者能够中和SARS-CoV-2。血清IgA也能够中和SARS-CoV-2，如Sterlin等人的研究，而Mazzini等人发现ELISA-IgA与微量中和试验有很好的相关性，因此，从血清样本中去除IgA显著降低了中和活性。比较表明，二聚体IgA比单体IgA表现出更强的中和能力，以及单体IgA和IgG。最近，Fox等人验证了COVID-19患者的牛奶样本在假病毒试验中具有中和作用。此外，粘膜免疫可以改善血清IgA的诱导，可能是因为B细胞在粘膜激活后归巢到脾脏边缘区。 目前的SARS-CoV-2疫苗也可以诱导IgA的产生，这一点已经对Moderna（mRNA1273）和辉瑞/BioNTech（BNT162b2）的mRNA疫苗以及牛津/阿斯利康（ChAdOx1）的病毒载体疫苗进行了验证。未来的粘膜疫苗可能会从异源初免-加强方法中受益。虽然粘膜免疫会诱导SIgA抗体，但非肠道剂量会改善系统性反应。啮齿动物的数据显示鼻内免疫增强了血清中的IgA以及血清和呼吸道粘膜中的IgA。然而，来自人类研究的证据很少。以前感染过COVID-19的疫苗接种志愿者，可能已经诱导了IgA反应，表现出比没有COVID-19病史的受试者更高的IgA滴度和更持久的IgA反应。我们可以推测，如果自然感染被视为鼻内初免，随后的非肠道疫苗将提供更好的免疫反应。另一项研究验证了mRNA疫苗在人乳中增加了IgA和IgG，尽管IgA比IgG更早减少。 有建议认为非肠道部位的淋巴引流可以作为系统性和粘膜免疫之间的交叉路径。这种观察可能让我们对通常分开的粘膜和系统免疫的观点产生疑问，并假设疫苗策略将从初免-加强方法中受益。尽管证据有限，但SIgA的贡献和血清IgA的前景作用应在疫苗研究中进行评估。 3.给药途径 粘膜疫苗能够在系统和粘膜部位诱导抗原特异性的体液和细胞介导的免疫反应。因此，粘膜免疫反应的诱导取决于疫苗的给药部位。口服免疫通常刺激胃肠道、唾液腺和乳腺的免疫反应和抗原特异性SIgA，而鼻内免疫诱导上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜的抗体产生，舌下疫苗接种诱导胃肠道以及上下呼吸道的抗原特异性免疫反应，如图2所示。上述所有途径以及其他途径，例如阴道内和直肠途径，已在实验动物模型中应用，但只有口服和鼻内途径已在许可的人类疫苗中使用。 图2 粘膜部位的免疫接种不仅引发局部和系统性免疫反应，还在不同部位诱导粘膜反应。(a) 口服免疫刺激胃肠道、唾液腺和乳腺，考虑到母体-胎儿抗体转移，这一点尤其重要。(b) 鼻内途径在上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜中诱导免疫。(c) 舌下疫苗接种在胃肠道以及上下呼吸道中引发反应。 尽管粘膜疫苗具有已知的潜力，但每种途径都有其含义。口服疫苗的开发代表了最大的挑战，这不仅是由肠道环境的侵略性所构成的——它降解了在其中传递的大多数抗原表位，影响疫苗的生物利用度——而且还由粘膜耐受性所构成，粘膜耐受性保护了对消化抗原的不希望的免疫反应。鼻内途径是一个有吸引力的部位，因为它所需的抗原和佐剂剂量比口服途径少，但它也面临着疫苗开发的挑战。鼻内疫苗配方需要到达呼吸道腔并穿过粘液层，其吸收就在那里发生；为此，疫苗配方需要考虑鼻腔的解剖和生理特征，如前庭区域的通透性差，以及毛发和粘液的快速周转，这些都干扰了成分的吸收。此外，鼻腔酶和局部pH可能影响疫苗的稳定性。 理想的粘膜疫苗在物理和化学屏障（pH和酶）方面是稳定的，将抗原传递到特定的免疫诱导部位，适应粘液周转，能够穿过上皮屏障，并且最终被APCs捕获，并且不诱导粘膜耐受性。使用佐剂是一种改善疫苗稳定性和吸收的策略，由于粘膜的生理和化学屏障，提供了更好的抗原传递。 4.粘膜佐剂 “佐剂”一词源于拉丁语adjuvare，意为帮助或援助。佐剂被定义为添加到疫苗配方中的功能性辅料，以增加其抗原的免疫原性。它们允许使用较低剂量的抗原和较少剂量的疫苗免疫方案。因此，佐剂通过增强其在粘膜部位的生物利用度来帮助增加配方的稳定性，其中自然防御机制，如pH、粘液层和运动可能会限制与APCs的相互作用，甚至降解抗原。这一方面影响了免疫反应的强度和持续时间。佐剂构成了一个异质化合物群，可以分为传递系统或免疫刺激分子。 4.1.免疫刺激佐剂 免疫刺激佐剂通过三种机制启动免疫激活：(1) 与非Toll样受体（非TLR）结合后的毒素介导的免疫刺激，例如宿主细胞表面存在的糖鞘脂。这一类别的最好代表是霍乱毒素（CT）和大肠杆菌产生的热敏毒素（LT）；(2) 是PRR配体的物质，例如TLR激动剂；(3) 天然免疫调节剂，如细胞因子、补体片段和信使分子。 研究最深入和最有效的粘膜佐剂是CT、LT和白喉毒素。这些毒素具有佐剂效应，被认为是粘膜佐剂的黄金标准；然而，由于它们的有害毒性效应，它们并未用于临床应用。为了避免这些毒性效应，已经创造了较少毒性的突变体，并连接到其他部分或肽以破坏毒素的活性位点，例如，重组霍乱毒素亚单位B已在Dukoral®疫苗中使用。 另一种使用的佐剂是PRRs配体。这些佐剂基于PAMPs激活，并通过TLR刺激作用。一个有前景的粘膜佐剂是单磷酸脂质A（MPL），源自大肠杆菌的LPS，其中MPL通过与TLR4相互作用刺激免疫反应。单独使用MPL不会引起系统性抗体或T细胞反应。因此，MPL已在包括脂质体和乳液的复合配方中使用，以及与Quillaja saponaria树皮的活性部分（QS-21）结合，形成AS01，它被包括在最近的疟疾疫苗RTS,S（Mosquirix）和目前正在开发的其他疫苗中，以诱导抗原特异性CD4+ T细胞反应，或与氢氧化铝结合形成AS04，由Glaxo-SmithKline在Cervarix™（人类乳头瘤病毒疫苗）和Fendrix™（乙型肝炎疫苗）中使用。 含有未甲基化CpG的合成寡脱氧核苷酸（ODNs）是另一种TLR激动剂。其基序触发表达TLR9的细胞，引发以Th1和促炎细胞因子产生为特征的先天免疫反应。CpG ODN诱导强烈的Th1反应，支持其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和干扰素（INF）-γ分泌的能力。它促进抗原的免疫调节效应，激活APCs，并加快免疫反应。CpG促进浆细胞样DCs上MHC、CD40和CD80的表达，并增强抗原处理和呈递。此外，存在于人类肠道粘膜的B淋巴细胞表达TLR9并响应CpG刺激，导致IgA水平增加。2017年FDA批准的乙型肝炎疫苗HEPLISAV-B是第一个使用CpG ODN作为佐剂的疫苗。 人类TLR5的天然激动剂鞭毛蛋白是细菌鞭毛的关键组成部分，也是另一种粘膜佐剂。鞭毛蛋白与TLR5结合，动员核因子（NF）-κB并通过MyD88依赖途径刺激肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生。鞭毛蛋白也可以被NOD样受体（NLR）家族的另外两个受体NLRC4和NAIP5识别；然后，它激活炎症体途径。鞭毛蛋白是先天和适应性免疫系统的有效激活剂。已经证明，促进最大抗原特异性抗体反应所需的鞭毛蛋白剂量低于刺激最大先天免疫反应所需的剂量，因为鞭毛蛋白能够诱导包括DCs、自然杀伤细胞、上皮细胞和淋巴结基质细胞在内的许多先天和非免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。 细胞因子和趋化因子已被证明在粘膜部位作为佐剂发挥作用。包括干扰素（INF）-γ、INF-α、IL-12、IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和Flt-3配体在内的重组细胞因子类似物已被报道具有佐剂活性。IL-1家族细胞因子能够诱导IgA和IgG抗体，而IL-6、IL-12和IL-15诱导CTL反应和疫苗特异性IgA抗体。然而，剂量相关的毒性和稳定性问题等限制阻碍了它们在疫苗中的应用，尽管通过将其包裹在脂质体或微/纳米颗粒中已用来克服这些问题。 4.2.传递系统 传递佐剂包括微球、纳米或微粒、聚合物、乳液、脂质体和免疫刺激复合物（ISCOM），它们被用来包裹抗原并将其传递给特定细胞。传递系统旨在改善抗原在粘膜表面的运输，同时保护它不受降解和/或在局部粘膜环境中的清除，以改善疫苗分布。 脂质体是具有两亲性质的球形脂质双层结构。由于一些优势，它们已被用作疫苗抗原的传递载体，例如防止抗原降解、组织储存效应或抗原的缓慢释放以及促进APCs对抗原的摄取，除了它们的生物相容性、生物可降解性、低毒性和两亲性质。此外，可以在脂质体表面添加：配体，用于特定细胞靶向，粘膜粘附剂和甘露糖衍生物，除了纳入TLR配体或其他PRR配体和免疫球蛋白以有效传递包裹或结合的抗原。阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更具免疫原性；此外，带正电荷的脂质体更好地与带负电荷的抗原结合，并影响它们在给药部位的保留，从而产生储存效应。二甲基二十八烷基铵（DDA）是一种广泛使用的阳离子脂质体，它主要由于抗原负载脂质体和单独给药的抗原之间的大小特征，在注射部位促进储存形成。阳离子佐剂配方01（CAF01）由DDA和海藻糖二油酸酯组成，这是一种合成变体，位于结核分枝杆菌细胞壁的绳索因子。这种配方已在动物模型中与不同病原体一起使用，如结核分枝杆菌、沙眼衣原体、链球菌等，以及基于重组蛋白亚单位（CTH522）的沙眼疫苗的1期临床试验，该疫苗用CAF01佐剂。CAF01被观察到是一种良好的粘膜佐剂；小鼠研究表明，它诱导Th1/Th17谱并增加IgA抗体反应。 粘膜粘附和粘液穿透成分的结合补偿了疫苗配方在粘膜液体中的稀释以及它们在粘膜更替中的损失，通过它们与粘膜上皮表面粘液层和粘液分子的相互作用，增加了剂量配方在吸收部位的抵抗时间。聚乙二醇是一种亲水成分，可以与粘液形成氢键，导致粘膜粘附，并帮助颗粒穿透粘膜，防止聚集，从而促进其穿过粘膜屏障。 另一种广泛研究的粘膜粘附剂是壳聚糖，它是一种低毒性的亲水、生物相容性和生物可降解的聚合物。壳聚糖具有一些对粘膜疫苗接种相关的属性，例如其带正电荷的分子与带负电荷的粘液相互作用以改善粘附；它增强了由于其能够短暂打开上皮紧密连接而增强的穿透性，从而改善了抗原取样及其促进INF-γ、IgG和SIgA分泌的佐剂属性。一项研究评估了一种基于壳聚糖功能化的铁氧化物纳米酶的鼻内流感疫苗，该研究发现壳聚糖增加了抗原对鼻粘膜的粘附，促进了DC的招募和跨上皮树突的形成以进行病毒摄取，并增加了小鼠的IgA-粘膜适应性免疫，提供了针对病毒的保护。 ISCOM是一种直径为30-40纳米的带负电荷颗粒，用作抗原的传递系统。ISCOM是在将抗原与胆固醇、磷脂（通常是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱）以及从Quillaja saponaria Molina树树皮提取的皂苷Quil A混合后形成的。ISCOM的物理特性有助于抗原稳定性，减少与皂苷相关的溶血作用，并改善与DCs的相互作用，从而增强了所结合抗原的交叉呈递，产生抗体和CD4+和CD8+ T细胞反应。ISCOM上调Th1和Th2反应，并刺激强烈的体液反应（IgG1、IgG2a和IgG2b）以及细胞毒性T细胞诱导。已证明ISCOM佐剂是一种良好的粘膜佐剂，因为它诱导强烈的粘膜免疫反应，包括在鼻内接种ISCOM复合多种抗原后在鼻洗液和肺部产生大量IgA。使用与CT和金黄色葡萄球菌蛋白A（CTA1-DD）融合的ISCOM通过口服或鼻内给药诱导强烈的细胞介导和体液免疫反应，包括粘膜IgA。 5.母体-胎儿抗体转移 母体IgG抗体在怀孕期间通过胎盘被动转移到胎儿体内，这对出生后第一年系统免疫至关重要，因为此时免疫系统正在适应和成熟。推荐孕妇接种一些疫苗加强剂，例如针对流感、破伤风、百日咳和白喉的疫苗，以确保母亲和婴儿都受到保护。 然而，SIgA也通过母乳喂养传递给新生儿，并保护胃肠道——考虑到儿童经常遭受腹泻性感染，这是一个重要的问题。如本综述（给药途径部分/图2）所述，粘膜免疫可以增强乳腺中的SIgA，这将有利于通过母乳喂养传递SIgA。研究发现，从初乳样本中分离的SIgA在体外抑制了肠致病性大肠杆菌对Hep-2细胞的聚集，而从IgA中耗尽的初乳则无法做到这一点。因此，母亲的初乳和她婴儿的粪便在免疫印迹分析中识别了相同的大肠杆菌抗原，表明这些抗体在整个胃肠道中的持久性。母乳喂养的新生儿自出生后第一周起粪便中就含有SIgA，而配方奶喂养的新生儿直到第三周才含有。鉴于胃肠道感染对儿童的负担，应考虑在怀孕期间进行粘膜免疫。下一节将讨论微生物群对免疫反应调节的重要性。值得注意的是，母乳喂养可能通过传递微生物和作为益生元来塑造微生物群，这表明这些主题是多么复杂。 6.影响粘膜免疫反应的其他因素 6.1.维生素 维生素A（VA）是一种脂溶性维生素，包括视黄醇、视醛和视黄酯。VA通过食物途径从植物和水果中的前维生素A类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）中获取。VA通过一系列酶，包括醇脱氢酶和视醛脱氢酶，代谢成其生物活性形式视黄酸（RA）。RA对激活的淋巴细胞上肠归巢分子α4β7和CCR9的诱导至关重要，并且对依赖于RA和TGF-β结合的FoxP3 Treg细胞的诱导至关重要。因此，RA被报道指导B细胞中免疫球蛋白类别转换，增加IgA的产生，这有助于宿主抵御肠道中的微生物。 维生素A缺乏症（VAD）与疾病易感性增加、疫苗反应差和死亡率增加有关。VAD导致大鼠和小鼠的肠粘膜以及雏鸡的气管上皮中IgA的产生减少。此外，VAD损害疫苗接种后的免疫反应：研究表明，在VAD小鼠中FluMist疫苗接种损害了免疫反应，而接种疫苗时口服RA或视黄棕榈酸酯增加了VAD小鼠中IgA的产生。在接种肺炎球菌疫苗（Prevnar-13）时，通过腹膜内途径给VAD小鼠口服VA补充剂（VAS），结果显示肺炎球菌（T4）特异性抗体（IgM和IgG1）得到改善。另一项研究表明，VAS和重组沙眼衣原体抗原的非肠道疫苗在小鼠中增加肠道IgA。因此，所有这些研究表明VAD损害了对疫苗的粘膜免疫反应，但VAS可以逆转这种效应，即使在非肠道免疫中也能增加IgA的产生。 补充全反式视黄酸（ATRA），VA的活性代谢物，导致恒河猴、黑猩猩和人类血液样本中DCs的α4β7整合素表达增加，这对肠道归巢运输很重要。这种治疗还改善了人类B细胞在体外培养中向浆细胞的分化和成熟。 研究表明，维生素A和D补充剂改善了儿童对流感疫苗的体液反应，这些儿童在基线时这些营养素的水平不足。在儿童和成人的混合队列中，评估了VA、抗流感抗体和炎症相关细胞因子。VA水平较高与IgA抗体和更高滴度的中和抗体相关。有趣的是，VA水平低的个体的鼻腔冲洗样本表达了更多的细胞因子和生长因子，使作者建议VA可能在控制粘膜组织中的炎症中发挥作用。 在婴儿中，一些研究表明VAS可以改善对某些疫苗（如破伤风、白喉类毒素、麻疹和乙型肝炎）的抗体反应。 尽管实验模型的证据非常充分，但关于VAS和疫苗反应的人类研究仍然很少，这使其成为一个有前景的研究领域。 6.2.微生物群 微生物群在许多身体功能中发挥关键作用，如食物消化、合成必需维生素和抵御病原体入侵。微生物群落稳态的改变导致肠道微生物失衡和肠道屏障异常。 已经表明微生物群影响疫苗的免疫反应，微生物的改变影响对注射和口服疫苗的免疫反应。无菌（GF）小鼠缺乏微生物群，显示Peyer氏斑的数量和大小减少，更少的固有层CD4+ T细胞，除了降低类别转换抗体IgA和IgG的水平；它们还缺乏发达的GALT。此外，小鼠早期生活中的抗生素驱动的失衡导致对全球通常给婴儿接种的五种不同疫苗的抗体反应受损——B群脑膜炎球菌疫苗（Bexsero）、C群脑膜炎球菌疫苗（NeisVac-C）、13价肺炎球菌结合疫苗（Prevenar）、六联疫苗（对抗乙型肝炎、白喉、破伤风、百日咳、B型流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒，INFANRIX Hexa），以及结核BCG疫苗。另一项研究还表明，抗生素治疗导致微生物组失衡，并影响健康成人对H1N1疫苗的免疫反应。 在中国婴儿中，梭菌科的富集与口服脊髓灰质炎疫苗最后一剂后抗脊髓灰质炎粘膜IgA的阴性检测有关，而放线菌的丰富与抗脊髓灰质炎粘膜IgA呈正相关，多样的肠道微生物群与口服脊髓灰质炎疫苗的粘膜免疫反应呈负相关。 加纳的一项研究报告称，口服轮状病毒疫苗（ORVV）的应答者在接种疫苗前6周大的婴儿中，Bacilli类成员（特别是Streptococcus bovis）的丰度较高，而非ORVV应答者在Bacteroidetes门中，特别是Bacteroides和Provotella种的丰度较高。 另一项研究分析了微生物群对成人接种口服伤寒沙门氏菌疫苗前1周的免疫反应的影响。研究发现，具有更多样化、复杂细菌群落的参与者具有多相细胞介导的免疫反应，这与对疫苗的更好反应相关；然而，该研究没有显示体液应答者和非应答者之间的群落多样性差异。 益生菌对先天和适应性免疫反应有影响。它们通过与肠道免疫细胞和上皮细胞的相互作用或间接通过肠道微生物组调节来介导免疫效应。一项研究表明，每天服用动物双歧杆菌（BB-12®）和副干酪乳杆菌（L. casei 431®）的志愿者，连续6周，并在接种三价灭活流感疫苗后，流感特异性IgG、IgG1、IgG3水平增加，特异性IgA水平更高。 另一项研究中，志愿者连续5周服用L. acidophilus和L. rhamnosus，结果显示接种疫苗后，脊髓灰质炎病毒中和抗体水平和脊髓灰质炎病毒特异性IgA和IgM水平增加。此外，一项比较7种不同益生菌菌株（B. lactis、L. acidophilus、L. plantarum和L. paracasei）连续3周的研究表明，在口服霍乱疫苗接种后，霍乱特异性IgG水平提高，接种B. lactis和L. acidophilus的个体诱导了高滴度的霍乱特异性IgA和IgM。 6.3.在发展中国家口服疫苗的问题 当分析现实世界证据时，口服疫苗在高收入国家的效能高于中低收入国家。值得注意的是，这些国家胃肠道感染的负担更为突出。 虽然在美国和芬兰等国家，活体口服轮状病毒疫苗的效能超过70%，但在非洲国家的效能为61%——值得一提的是，个体评估在南非为76.9%，而在马拉维为49.4%。在美国与印度相比，口服脊髓灰质炎疫苗后的血清转换率更高。在接种口服霍乱疫苗后，来自瑞典斯德哥尔摩的儿童比来自尼加拉瓜莱昂的儿童表现出更高的IgA和弧菌杀菌滴度。这样的方面引发了一个问题：是什么损害了这些疫苗的免疫原性？ 正如本综述前面所讨论的，VAD和微生物群的损害影响免疫反应。食物不安全导致微量营养素营养不良；缺乏清洁水源、适当的卫生设施和卫生教育可能会破坏微生物群的构成，增加肠道病原体的定植。这些问题在发展中国家更为常见，妨碍了口服疫苗的效能。另一个相关问题是新生儿肠道中存在高滴度的抗体，可能通过母乳喂养从不断接触肠道病原体的母亲那里转移。因此，应该研究疫苗接种时间表。有报告称，最近的脊髓灰质炎疫苗接种限制了轮状病毒疫苗的效果，可能是因为口服脊髓灰质炎疫苗可能与口服轮状病毒疫苗竞争，妨碍了强大的体液反应。 总之，一系列因素妨碍了贫困国家口服疫苗的效能。建议使用加强剂量作为克服这些障碍的方法。然而，造成这个问题的社会经济差异应该是讨论的话题，需要政府、科学家和私营部门的参与来解决——就像公共卫生的任何话题一样。 6.4.我们应该针对SARS-CoV-2开发粘膜疫苗吗？ SARS-CoV-2是一种呼吸道病原体——累积证据表明也涉及胃肠道。有效的粘膜免疫被认为是轻度和重度患者之间的差异性方面，提供对上呼吸道病原体的控制。到目前为止，证据已经指出，尽管肌肉内疫苗激发了有效的系统性免疫，但它们未能激活粘膜免疫，这将解释为什么SARS-CoV-2的传播仍然是一个问题。鼻微生物组也被认为是COVID-19临床表现的决定性方面。如前所述，粘膜疫苗易于给药并诱导局部免疫，这两个方面在考虑SARS-CoV-2的粘膜性质和在大流行情况下迫切需要大规模免疫的情况下都是有趣的。 确实，目前有多种粘膜COVID-19疫苗正在进行临床试验，主要是鼻内给药。然而，非肠道疫苗与粘膜疫苗的数量差异——分别是118种和16种，更不用说目前有20多种非肠道疫苗在使用中——留下了一个未解的问题：粘膜免疫是一种被低估的技术，还是前面讨论的障碍阻碍了这种有前途的工具的开发，以控制COVID-19？ 7.结论 粘膜疫苗可以在粘膜表面保护宿主免受病原体的初次接触，并且由于其给药方便和患者接受度高，其应用成为流行期间的一个良好选择。然而，尽管有所有这些优势，但并没有很多粘膜疫苗被批准用于人类使用，因为许多疫苗配方需要根据粘膜给药途径保护抗原免受降解。因此，在疫苗配方中应用佐剂是克服问题的一个好策略。然而，选择一个好的佐剂并不足以改善粘膜疫苗，因为微生物群和维生素可以影响粘膜免疫反应。 一些疾病对微生物群落和维生素吸收有显著影响，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等，这可能妨碍粘膜疫苗的效能。此外，在疫苗接种时间表中应用VA补充剂和益生菌似乎是一个调节粘膜免疫和增加某些个体对疫苗免疫反应的好策略。 因此，开发理想的粘膜疫苗不能仅仅归结为选择完美的佐剂；有必要考虑患者特定的因素，并且，这样分析可能影响疫苗粘膜免疫反应的所有方面。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：在当前形势下，免疫接种至关重要，因为它使我们免受传染病原的侵害，保护我们的安全。尽管疫苗学领域取得了巨大成功，但我们仍需开发安全、理想的疫苗来对抗致命感染，同时提高现有疫苗的质量，解决部分或不一致的保护问题。一般来说，亚单位疫苗在本质上是安全的，但大多数情况下它们未能产生最佳的免疫反应。因此，通过新型佐剂的配方，有很大的可能性提高疫苗的潜力，有效传递卓越的免疫力。与新型佐剂配方的疫苗也可能有助于对抗高度抗原多样性的病原体。然而，由于安全性和毒性的限制，很少有适合人类的佐剂获得批准。在这篇综述中，我们主要关注新型和改进疫苗的需求；佐剂的定义和需求；适合人类的佐剂的特征和机制；疫苗佐剂、粘膜疫苗佐剂和临床开发中的佐剂的现状；以及未来的发展方向。 引言：疫苗的发明被认为是医学研究的一项重大成就。免疫接种不仅阻止了儿童期间感染的传播，而且为某些疾病提供了一生的保护。然而，科学界在开发针对许多传染病的理想疫苗方面仍然面临挑战，例如瘟疫、结核病、疟疾、人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），这是由于免疫学障碍，如对疫苗的不充分免疫反应和较弱的免疫记忆。除了这些障碍外，疫苗安全问题，如在患有罕见遗传性疾病的人群中的不良影响、由白喉毒素和破伤风毒素以及全细胞百日咳（DTwP）引起的系统和局部反应原性，以及白喉毒素和破伤风毒素与无细胞百日咳（DTaP）一起显示出的逐渐减弱的免疫力，被认为是不可接受的，这进一步增加了解决新兴或再次出现的疾病威胁的疫苗问题的挑战。这些挑战需要新的战略，可以帮助理解免疫接种的免疫反应，并引入新的方法来在不牺牲质量和安全的情况下诱导强大的免疫力。最近，全世界科学界见证了重大的疾病爆发，即2003年的SARS、2009年的H1N1流感大流行、2014年的埃博拉病毒、2017年马达加斯加的瘟疫、2018年印度的尼帕疫情，以及迄今为止最引人注目的COVID-19大流行。2014年，埃博拉疫情在发达国家造成了巨大的恐慌，因为在西非国家的死亡率相当高。这些事件迫使科学界不仅要保持警惕，还要开辟新的途径，追求新的战略，以阐明开发针对这些新兴病原体的有效疫苗的机制方法。目前，正在进行的COVID-19大流行严重影响了全球人类的生活，破坏了全球经济；因此，广大科学界正忙于开发针对SARS-CoV-2的有效和安全的疫苗。目前，灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗是人类可获得的四种疫苗类型。减毒活疫苗包含可以复制的整个病原体，能在宿主体内诱导强烈的免疫反应。减毒活疫苗已被观察为对抗脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）、水痘、流感、轮状病毒和黄热病最有效。灭活全病原体疫苗通过热或化学方法灭活[灭活脊髓灰质炎（Salk）和甲型肝炎]，是非传染性的，大多是安全的。灭活（杀死）疫苗已被观察为诱导弱和短期的免疫力，因此需要加强剂以达到完全保护。研究发现，来自印度的DTwP，这是一种获得许可的灭活疫苗，绕过了逐渐减弱的免疫力，显示出长期的保护效果。与灭活全病原体疫苗类似，纯化或重组亚单位疫苗不包含病原体的活体组分，但只包含病原体的抗原部分，这使它们与前者不同。亚单位疫苗抗原的免疫原性较差，因此需要添加组分以增强其保护性免疫力。亚单位疫苗有时使用表位，这些表位已被证明可以识别并与T细胞或免疫球蛋白相互作用。亚单位疫苗在毒性和反应原性方面通常被记录为安全，因为亚单位疫苗包含纯化或重组抗原，而不是整个细胞。有几个非常成功的亚单位疫苗例子，如乙型肝炎病毒（HBV）、流感病毒（注射）和百日咳疫苗。开发的亚单位疫苗被发现免疫原性较差，因此，需要多次加强剂和适当的佐剂化来增强其保护潜力。最近，在COVID-19大流行期间，mRNA疫苗（核酸疫苗）发挥了重要作用。这些基于mRNA的疫苗通过指导抗体的产生提供良好的免疫反应，从而预防严重的并发症。 对佐剂的需求 佐剂最初是在1920年由法国科学家加斯顿·拉蒙（Gaston Ramon）发现的，他在研究中观察到疫苗中加入铝盐可以增强其潜力。"佐剂"一词源自拉丁语单词adjuvare，意为“帮助”。佐剂通常不具有免疫原性，但它们与疫苗配方一起调节免疫反应，从而不仅减少了疫苗所需的剂量，还延长了免疫记忆。通常情况下，疫苗与适当的佐剂配方，以增强对接种疫苗抗原的免疫反应，评估阻止传染的潜力。佐剂另一个重要作用是指导体液和细胞介导的免疫反应，产生针对病原体的特异性免疫。目前，佐剂被利用（a）增强对给定疫苗的免疫反应，增强抗体反应以及接种疫苗的接受者数量；（b）提高因年龄、疾病或治疗干预（例如，使用佐剂MF59与流感疫苗结合，以改善/增加老年人的反应）而反应减弱的个体的血清转化率；以及（c）减少疫苗抗原的剂量和加强剂的数量，因为佐剂的能力，允许用相当低的疫苗抗原量实现相当的反应，在疫苗生产设施有限且公众普遍急需免疫的地区可能至关重要。对需要多次加强剂的疫苗的需求在全球范围内提出了值得注意的挑战。佐剂可以减少提供完全保护所需的加强剂数量（图1）。将疫苗与佐剂配方的另一个原因是实现免疫反应的质量调节。佐剂在未开发的疫苗中使用更为广泛，以调节疫苗抗原未加佐剂时不能有效刺激的免疫反应类型。佐剂用于临床前和临床研究（i）提供功能适当的免疫反应（例如，体液或细胞的，Th1、Th2和Th17）；此外，已观察到平衡的Th1/Th2/Th17反应增加了T细胞反应的持续时间并延长了小鼠的存活时间；（ii）增强长期记忆细胞（例如，T细胞记忆）；（iii）提供在大流行中可能至关重要的初始快速反应；以及（iv）修改反应的广度、特异性或亲和力（图1）。在这篇综述中，我们的主要目标是关注使用各种佐剂调节免疫反应。 图1 疫苗佐剂及其益处的示意图 铝盐（明矾）的特性和作用机制 铝盐已被临床批准，是人体疫苗中最广泛使用的佐剂。这些佐剂由磷酸铝和氢氧化铝的沉淀物组成，用于吸附疫苗抗原。Brenntag Biosector、Chemtrade和SPI Pharma™是一些准备这些配方的制造商。 铝盐（Alum） Alhydrogel®、Rehydragel™和AdjuPhos®是市场上可获得的铝盐的商品名。作为疫苗佐剂的铝盐已在疫苗研究中使用了80多年，并且通常刺激Th2型的免疫反应。铝盐已被批准作为许可的人类疫苗的成分，例如b型流感嗜血杆菌（Hib）、甲型和乙型肝炎病毒、破伤风、脑膜炎病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、白喉，以及最近的SARS-CoV-2。铝盐作为佐剂的作用机制几乎已知，现在清楚的是，沉积物形成不是铝盐作为佐剂活性的必要步骤。作为佐剂的铝盐主要激发先天免疫。铝盐刺激B细胞分化以增加抗体产生。也有充分文件记录表明，铝盐在小鼠中刺激Th2型的免疫反应，但在人类中，几乎所有与铝盐佐剂配方的疫苗抗原都诱导混合型反应，即Th1和Th2。铝盐触发NLRP3炎症体在体外用脂多糖（LPS）对巨噬细胞和树突细胞（DCs）进行初次刺激后表达白介素（IL）1b。然而，在体内，铝盐的佐剂性并不支持数据。已观察到铝盐刺激Th2型的免疫反应，并产生IL-4、IL-5、IgG1和IgE。铝盐执行的另一种功能活动是通过使用DCs启动信号级联，以执行肌动蛋白介导的吞噬作用，导致激活两个激酶蛋白（Src和Syk），进而动员Ca2+并最终激活转录因子NFAT（钙调磷酸酶-活化T细胞核因子），从而产生IL-2。此外，铝盐通过激活补体蛋白的级联来介导其佐剂性。作为佐剂的铝盐由于其安全性、疫苗抗原稳定化以及调节高产量和持久抗体效价的高度优势。与铝盐佐剂配方的疫苗不能被过滤灭菌、冻干或冷冻。 乳液形式的佐剂（油包水） MF59和AS03佐剂 MF59是一种非常安全有效的油包水乳液，由角鲨烯油制成。与Freund佐剂不同，角鲨烯更容易代谢，并且为疫苗开发而高度纯化。最近，MF59已作为老年人流感疫苗的重要组成部分，由Fluad™（Seqirus，墨尔本，澳大利亚）授权，并且后来也在婴儿和儿童中成功使用。除此之外，它还被授权作为针对H1N1大流行疫苗在儿童、婴儿和孕妇中使用。从研究结果中可以看出，含MF59佐剂的三价灭活流感疫苗（TIV）在婴儿中引发了比不含MF59佐剂的流感疫苗更强的体液和细胞免疫反应。MF59的配方显著调节了婴儿流感疫苗的弱效。随后，与MF59佐剂配方的乙型肝炎疫苗观察到比铝盐诱导的免疫反应强100倍。与其他佐剂类似，MF59的作用机制尚未完全阐明。MF59佐剂的有效性不依赖于疫苗接种部位的沉积物形成，因为MF59的半衰期很短。然而，MF59佐剂已显示出潜力，能够引发强烈的IgG和细胞介导的免疫反应。此外，MF59可以诱导单核细胞、巨噬细胞和DCs表达和分泌趋化因子，即CCL4、CCL2、CCL5和CXCL8，这些趋化因子招募更多的白细胞重新摄取更多的疫苗抗原。最后，这种分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞（APCs）。此外，这些APCs迁移到淋巴结，在那里它们诱导适应性免疫反应，如图2所示。AS03也是一种油包水乳液佐剂，包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80。将α-生育酚纳入AS03配方使其与其他油包水乳液佐剂不同。AS03首次用于与疟疾疫苗的配方。最近，这种佐剂已用于人类流感疫苗。最近的临床试验表明，含AS03佐剂的流感疫苗引发了强烈的免疫反应。此外，含AS03佐剂的疫苗也被发现在婴儿中诱导了强大的免疫反应。此外，AS03通过刺激核因子κB（NF-kB），一种促炎细胞因子，以及趋化因子，引发免疫反应。随后，它招募免疫细胞，如单核细胞和巨噬细胞。应用这种佐剂与大流行疫苗配方的优势在于其能够以更低剂量的疫苗抗原产生强烈的体液免疫反应，即每株3.75或7.5毫克，与常规三价灭活流感疫苗中每株15微克相比。自2009年以来，已有约470万剂AS03佐剂的A(H1N1)疫苗被用于儿童接种。 美国军方的脂质体配方 这种配方是由美国军方开发的，由含有饱和磷脂和单磷脂脂A（MPLA）的胆固醇和脂质体组成。美国军方脂质体配方（ALF）有改进版本，即吸附在氢氧化铝上的ALF（ALFA）、含有QS21皂苷的ALF（ALFQ）以及吸附在氢氧化铝上的ALFQ（ALFQA）。研究发现，用ALFA佐剂的恶性疟原虫环孢子蛋白疫苗候选物提供了足够的体液和细胞免疫反应。沃尔特·里德陆军研究所（WRAIR）疟疾疫苗部门开发并测试了FMP013（恶性疟原蛋白-013）和FMP014（一种自组装蛋白纳米颗粒）SAPN（两种新的合成疟疾抗原）与ALFQ佐剂的保护效果。用ALFA佐剂的重组gp120诱导了针对不同亚型的HIV-1的交叉反应抗体。关于ALF和ALFQ与重组HIV1包膜gp140蛋白的配方，ALF诱导了主要的Th2型免疫反应，而ALFQ诱导了更平衡的Th1和Th2型免疫。此外，ALFQ佐剂激活先天免疫反应，上调APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样家族），一种抗HIV蛋白，并维持一种促炎环境，结果，允许HIV-1感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs）变得能够限制HIV-1感染。 病毒体（脂质和糖蛋白） 病毒体具有佐剂系统的特征，并且以其可生物降解和无毒的特性而闻名。通常，病毒体不产生抗病毒体抗体。病毒体是嵌入有病毒包膜蛋白（如流感病毒的神经氨酸酶和血凝素）的小型球形单层脂质膜囊泡（150纳米）。这些蛋白被整合到磷脂酰胆碱双层脂质体中。这些制备的病毒体不包含核衣壳，包括源病毒的遗传物质。这些蛋白促进病毒体膜与细胞受体结合，介导与免疫细胞的pH依赖性融合。因此，病毒体将其内容物，即疫苗抗原（s），直接运送到目标细胞，引发针对弱免疫原性抗原的抗原特异性免疫反应。病毒体是类似病毒颗粒，允许疫苗抗原的呈现对主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类，以引发B细胞和T细胞免疫反应。病毒体佐剂系统引发的免疫反应类型取决于抗原表位是位于病毒体内还是外部。有一些已建立的例子，如PeviPRO™，它诱导体液免疫反应。抗原在细胞的内体中被降解，因此主要产生MHC II抗原呈递。PeviTER™配方的抗原不仅引发CD4+和CD8+ T细胞免疫反应，还产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。病毒体佐剂系统通过MHC I途径封装呈现疫苗抗原，因为抗原自然地进入抗原呈递细胞（APC）的细胞质。批准的疫苗，如Epaxal®（用于甲型肝炎）和Inflexal®V（用于流感）已经成功证明了病毒体的卓越性。迄今为止，这些甲型肝炎（Epaxal®）和流感（Inflexal®V）疫苗已在45多个国家使用，至今已有超过1000万人接种。这种新一代疫苗提供了额外的好处，因为即使在免疫抑制患者和婴儿中也有效。此外，它们具有高安全性，因为嵌入的病毒不会复制。据我们所知，病毒体不再被许可用于人类。 AS04（吸附在明矾上的TLR-4激动剂） 为了开发新型佐剂系统，已经使用了铝盐，主要由吸附在明矾上的不同的Toll样受体（TLR）激动剂组成。佐剂系统04（AS04）已经被批准用于与HPV（Cervarix）和HBV（Fendrix）疫苗的配方。这种佐剂系统包括与LPS主要构成的3-O-去酰基-4'-单磷脂酰胆碱（MPLA）的明矾配方，来自萨氏菌明尼苏达菌株。有文件记录MPLA保留通过与TLR-4相互作用来刺激先天免疫的能力。它进一步导致诱导NF-kB信号并产生促炎细胞因子和趋化因子，这些因子招募免疫细胞到疫苗接种部位和引流淋巴结。在疫苗接种后的几个小时内观察到单核细胞和DCs数量的增加，它们相互作用以刺激抗原特异性T和B细胞，产生强大的细胞和体液免疫反应。明矾与MPLA没有显示出协同效应；然而，MPLA和AS04的比较研究表明，明矾延长了MPLA在疫苗接种部位引起的细胞反应。因此，研究发现AS04佐剂通过刺激TLR-4来诱导先天免疫反应。AS04佐剂的HBV疫苗在人类中引起先天免疫反应。与铝盐佐剂的HBV免疫血清相比，在AS04佐剂的HBV免疫血清中观察到IL-6和C反应蛋白的水平升高。然而，报告的HBsAg特异性T细胞和抗体比铝盐配方的HBV疫苗诱导的更高。与铝盐佐剂配方的相同疫苗相比，AS04配方的HBV和HPV疫苗引起更强的体液免疫反应，这表明TLR4激动剂MPLA佐剂对人类使用的重要性。 RC-529佐剂  LPS的顺序酸和碱水解产生MPLA，已知MPLA保留LPS的各种免疫刺激性功能。体外研究表明MPLA激活并刺激树突状细胞（DCs）成熟，并上调人类白细胞抗原-DR、CD80、CD86、CD40和CD83。MPLA也已知可诱导Th1和Th2细胞因子的表达，并增强抗原特异性Tc细胞反应。MPLA是一种获批的佐剂，并已用于乙肝疫苗配方中。此后，合成模拟物如氨基烷基葡萄糖胺4磷酸盐（AGPs）被鉴定，观察到它们激活先天细胞如巨噬细胞、DCs、B细胞和APCs。其中一种AGP化合物RC-529，观察到通过TLR-4激活信号并上调细胞表面的共刺激分子，包括细胞因子和趋化因子。RC-529在临床试验中被发现是一种有效的佐剂，其中健康志愿者接受了针对乙肝的疫苗配方，与铝盐相比，RC-529在接种疫苗配方的受试者中诱导了显著更高的抗体产生。MPLA的合成模拟物RC-529在临床试验中被观察到是安全有效的。 图2 MF59佐剂及其作用机制。在注射部位，MF59佐剂激活的巨噬细胞分泌趋化因子，刺激并招募免疫细胞。分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞，激活B细胞和T细胞，以传递强烈的体液和细胞免疫反应。 粘膜疫苗佐剂  这些佐剂唤起宿主的先天免疫系统，并有助于提供针对病原体的保护。使用活体减毒或灭活的全细胞疫苗通常包含内源性佐剂，如细菌细胞壁产物及其基因组DNA/RNA。这些佐剂作为病原体相关分子模式（PAMPs），足以刺激适应性免疫。然而，亚单位疫苗通常缺失或无法诱导先天免疫反应，因此，包含佐剂对于提供成功的疫苗至关重要。大多数病原体通过鼻或口途径进入宿主。因此，有效的粘膜疫苗对于预防这类粘膜传播疾病至关重要。与肌肉注射/亚单位疫苗相比，粘膜疫苗提供了显著的好处，如低成本、非侵入性和最重要的是，传播血液传播感染的风险非常低，特别是对儿童。然而，由于缺乏理想的粘膜佐剂，只有少数粘膜疫苗被批准用于人类。通常，粘膜佐剂有两个作用：首先，它们作为递送载体；其次，它们作为免疫刺激分子。然而，一些粘膜佐剂展示了免疫刺激剂和递送系统的双重特征，如壳聚糖及其衍生物。有文件记录表明，粘膜佐剂可以刺激保护性局部和系统免疫，这对于成功的粘膜免疫至关重要，以对抗各种传染病。此外，粘膜佐剂在提供针对远端和局部感染部位的保护方面发挥许多重要作用。例如，胞嘧啶磷酰硫酸鸟苷（CpG）寡脱氧核苷酸作为通过鼻途径接种疫苗的有效粘膜佐剂，针对通过输血和性活动传播的病原体。此外，粘膜佐剂是针对肿瘤的免疫的强效刺激剂。在许多粘膜佐剂中，TLR激动剂和突变型肠毒素是两种最吸引人的类型，因为它们不仅有效，而且相对安全。到目前为止，由细菌衍生的腺苷二磷酸（ADP）-核糖基化肠毒素是最典型的粘膜佐剂。这类药物包括大肠杆菌热敏肠毒素（LT）、霍乱毒素（CT）以及LT和CT的突变体/亚单位。这些毒素刺激抗原特异性的细胞和体液免疫反应，包括CTLs、Th1、Th2和Th17。最重要的是，这些佐剂在通过粘膜途径给药时，刺激针对疫苗抗原的抗原特异性IgA抗体和长期记忆细胞。 热敏毒素、双突变热敏毒素粘膜佐剂如何工作？ 粘膜佐剂LT是一种84千道尔顿的聚合物蛋白。这种佐剂以活性形式AB5存在，包含一个A亚基和一个五聚体B亚基。dmLT是其母分子LT的突变形式。佐剂dmLT在通过粘膜或全身途径接种疫苗后，对疫苗抗原的系统性和粘膜免疫反应具有免疫调节作用。它可以简单地与疫苗抗原（s）以水缓冲液的形式配方。由于佐剂的双重方法，即免疫刺激特性和普遍的细胞结合，疫苗抗原（s）的细胞摄取量成倍增加，这就是粘膜免疫被增强的方式。这是传递疫苗配方，特别是亚单位疫苗到难以到达的部位的最适宜方法，特别是用于舌下（s.l.）、口服（p.o.）和经皮（t.c.i.）递送。这些策略不仅无针头，还显示出提高管理便利性和依从性的潜力。此外，它降低了使用危险注射进行疫苗接种时疾病传播的风险。dmLT佐剂引发了针对疫苗抗原的强烈Th17反应，并诱导IL-17的产生，它主要在粘膜部位提供保护。IL-17的表达有助于通过诱导B细胞分化为IgA分泌细胞，增加分泌型sIgA抗体进入粘膜组织腔。dmLT佐剂还在全身接种后刺激粘膜免疫反应。然而，这些研究仅在动物模型中进行了测试，这种佐剂在人类中的使用尚未确定。LT、CT及其相关突变体在过去的最近时期得到了很好的表征。LT或CT佐剂的活性形式AB5的亚基具有独特的功能。亚基B与受体结合并导致细胞内进入。在粘膜疫苗接种期间，B亚基有助于将疫苗抗原在整个粘膜部位运输。亚基A负责与ADP-核糖化因子（ARFs）结合，并且ADP核糖化Gsa，导致环磷酸腺苷（cAMP）积累。然后，LT刺激树突状细胞（DCs）的激活、细胞因子的表达和Th17反应的刺激。也有文件记录表明，单独使用LT的亚基A会引发混合的Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，但影响比LT的活性AB5形式要弱。使用亚基B会引发Th2/T调节细胞（Treg）偏向的反应。然而，毒性一直是这些佐剂的一个关注点。dmLT佐剂如何诱导免疫系统？ 图3描述了免疫级联反应。（I）在接种部位，疫苗抗原被摄取后，先天免疫系统被激活。上皮细胞分泌细胞因子和趋化因子，如IL-8和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。（II）树突状细胞（DCs）被招募到接种部位并激活，用于抗原处理和呈现给主要组织相容性复合体（Ag-MHC）。CD80和CD86的上调以及极化细胞因子的分泌，例如IL-1、IL-23、IL-6和G-CSF，会发生。（III）携带疫苗抗原的活化DCs随后迁移到二级淋巴器官，并促进抗原特异性T辅助细胞和B细胞分化为分泌IgA和IgG抗体的浆细胞。最后，传递了混合的Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，特别是强烈刺激Th17细胞和粘膜归巢标记。有文件记录表明，Th17细胞是免疫的重要组成部分，促进次级淋巴器官中的生发中心形成，并增强IgA抗体分泌。 被LT/dmLT佐剂激活的树突状细胞引起了非常高的Th17类型的免疫反应，这是由于caspase 1炎症体的激活，以及随后的趋化因子和细胞因子如IL-1和IL-23的表达。一项科学研究报告称，用LT激活的小鼠树突状细胞诱导了IL-1β的表达，这对Th17细胞的产生至关重要。用dmLT配方的疫苗抗原重新刺激免疫个体的人类外周血单核细胞（PBMC）增强了IL-17A和IL-13的表达。总之，在用dmLT配方的疫苗抗原免疫后，发生了一系列定义好的事件，这是APCs和疫苗免疫的有效刺激物。 TLR激动剂作为粘膜疫苗佐剂 与TLR配体基佐剂配方的疫苗触发并激活先天免疫反应，有助于增强疫苗候选物所赋予的保护潜力。基于TLR的佐剂需要一个额外的适配蛋白MyD88，它刺激APCs和B细胞进行抗体产生。此外，MyD88信号也诱导生发中心的形成，这对于产生抗体分泌细胞至关重要。基于TLR配体的佐剂包括依赖于TLR9的佐剂CpG DNA（CpG）和依赖于TLR2的佐剂Porin B（PorB），它们都需要MyD88来适当刺激APCs。CpG是一种未甲基化的细菌DNA基序，而PorB是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白。已证明TLRs在APCs上表达，包括巨噬细胞、DCs和B细胞。因此，使用TLR激动剂作为疫苗制备中的佐剂的主要目的是刺激这些细胞以赋予强大的免疫反应，连接先天免疫和适应性免疫。各种TLR4配体不仅已在临床前研究中使用，而且还被食品药品监督管理局批准用于临床试验，如卡介苗（BCG）和MPLA。LPS，一个众所周知的TLR4配体，被用作体内诱导急性炎症的诱导剂，用于小鼠模型中的肿瘤回归。有报道称，TLR4激动剂，如第二代脂质佐剂SLA-SE，促进了通过肌肉内免疫接种含有肠毒性大肠杆菌（ETEC）疫苗抗原的粘膜抗体的增加。为了测试L-pampo的功效，一种结合了TLR1/2和TLR3激动剂的组合。 图3 dmLT佐剂的作用机制。（I）在接种部位，dmLT佐剂刺激先天免疫反应，激活的上皮细胞分泌IL-8和G-CSF。（II）树突状细胞（DCs）在注射部位被激活并招募，在那里它们处理并呈现抗原。它还上调共刺激分子，即CD80和CD86，并刺激IL-1、IL-6、IL-23和G-CSF的表达。（III）活化的DCs迁移到二级淋巴器官，在那里它们刺激抗体分泌浆细胞B细胞的分化和抗原特异性Th细胞的产生。总的来说，传递了强烈的Th17免疫反应。Th17细胞被识别为免疫的重要组成部分，并在二级淋巴器官中刺激生发中心的形成，以及增强IgA分泌。 用于SARS-CoV-2雪貂模型的利用，引发了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。最近，一种口服SARS-CoV-2疫苗（VXA-CoV21），目前正在进行III期临床试验，使用了双链RNA佐剂，主要针对TLR3，并有助于通过该受体激活树突状细胞群。这项研究中使用的佐剂不仅扩大了模式识别受体（PRR）的目标范围，而且还是针对基于毒素的佐剂的有前途的替代品，用于口服疫苗。我们认为，这种在粘膜免疫方面佐剂发现的进步可以为对抗病原体菌株提供新的希望，并且可以实现成功的疫苗设计。 目前佐剂的现状和临床试验 安全性一直是开发新型疫苗佐剂过程中的重大关注点；因此，许多佐剂在临床前和临床研究中进行了全面评估。例如，非常常用的佐剂，如铝盐，已在美国获得批准。含铝盐的疫苗在70多年前就获得了批准。与乳液基疫苗佐剂MF59配方的流感疫苗于1997年获得许可，并在欧洲上市。此外，如AS03这样的乳液基疫苗佐剂与流感疫苗一起被佐剂化，并在2009年获得许可。病毒体，一种脂质体佐剂，于2000年作为甲型肝炎和流感疫苗的重要组成部分获得批准。除此之外，AS04，一种包含吸附在明矾上的MPLA的组合佐剂，已在欧洲获得批准，并在美国获得许可。已批准用于人类的佐剂列在表1中。尽管提供了许多值得注意的好处，如降低成本、高产量和更安全的高纯度疫苗抗原，但由于缺乏内在的免疫刺激性因素，如各种PAMPs，大多数提供较弱的疫苗潜力。理解免疫细胞受体（如TLRs）如何被PAMPs刺激，即革兰氏阴性细菌的LPS，以及适应性免疫反应是如何被先天免疫反应协调和调节的，是至关重要的。有报道称，颗粒物质会刺激先天免疫信号。因此，鉴定了可以刺激先天免疫细胞上特定受体的佐剂，这些细胞可以轻松感知危险信号和细胞压力。不幸的是，由于高度的反应原性和耐受性差，早期开发的佐剂未能进入临床开发。由于HIV和疟疾疫苗的特征，出现了使用不同佐剂的组合是促进广泛的免疫反应（即体液和细胞）的更好选择的合理性。这种佐剂的组合涉及递送系统，如脂质体、明矾或乳液，以及自然免疫刺激免疫增强剂，如细菌MPLA、病毒dsRNA或植物Quillaja皂苷。新一代的佐剂大多被称为免疫刺激剂或免疫增强剂，已在人类中进行了测试，并且正在进行临床试验，列在表2中。这些新一代佐剂系统的设计基于现有的药物递送模型和已建立的药物原理。因此，执行的递送系统主要在免疫信号激活上，可以局部化并集中在配方疫苗抗原上。GSK的佐剂系统（AS）是这种进展的最佳例子，以制造有效的疟疾疫苗。递送系统对疫苗开发有多重要？在GSK两种替代疫苗的人类临床试验中提到并强调了这一点。两种疫苗都包含相同的免疫增强剂，但它们的配方不同。包含AS01佐剂系统（一种脂质体配方）的疫苗比包含相同成分的AS02佐剂系统（一种乳液配方）提供了更好的保护。因此，疫苗候选物RTS,S与佐剂系统AS01配方，这个例子证明了两种免疫增强剂的组合是实现目标所必需的。佐剂系统AS01包含MPLA和皂苷QS-21。研究表明，当这两种免疫增强剂（MPLA和QS-21）在脂质体中配方时，它们协同工作并引发先天免疫反应，进一步增强适应性免疫反应。AS01佐剂系统在人类中刺激各种疫苗抗原的强大T细胞免疫反应的能力是通过这种独特的免疫增强剂组合，例如MPLA和QS-21，所赋予的协同效应来阐明的。这些发现开辟了大门，为开发潜在的佐剂系统提供了新的途径。大多数佐剂作为候选或已获得许可的疫苗的理由从临床研究收集的数据中变得清晰。通常，这些佐剂已知能够非常快速和及时地在免疫部位刺激先天免疫反应，将刺激的免疫细胞排入淋巴结，这对于增强针对病原体的适应性免疫至关重要。PAMP和危险信号通路的刺激，即TLR、caspase-1和溶酶体不稳定-Syk/Card9，不仅促进效应细胞的招募，包括T和B细胞，还促进APCs的招募和激活。通过目标耗竭激活的APCs的许多研究表明，这一步对于有效诱导疫苗抗原特异性T细胞非常重要。将产生的抗原特异性T细胞表型将取决于先天免疫信号激活的性质。被刺激的胶囊下巨噬细胞分泌的IL-18可能促进分泌IFN-g的CD4+ T细胞的发展。同样，被刺激的APCs分泌的IL-6或IL-12也可能促进滤泡辅助T细胞（TFH）的产生，这促进了B细胞分泌高亲和力IgG，例如流感免疫。包含TLR配体的佐剂系统可以通过刺激具有更好TCR亲和力的T细胞克隆的扩增来调节抗原特异性T细胞的克隆安排和质量。Novavax, Inc.开发了一种重要的佐剂，名为matrix-M。它基于从Quillaja saponaria（皂树皮树）树皮中提取的皂苷化合物。目前，这种matrix-M佐剂正在与针对SARS-CoV-2的重组刺突（S）蛋白的配方中使用。目前，这种疫苗配方（COVID-19疫苗）正在进行I期临床试验。matrix-M佐剂不仅诱导产生高中和抗体滴度，还诱导强大的T细胞免疫反应，并对各种冠状病毒株具有高保护效力（193-195）。Matrix-M也已在其他疫苗配方中使用，如目前处于IIb期的疟疾疫苗（R21/Matrix-M）和已达到I期的流感疫苗。已观察到，如Q-21等皂苷通过激活胶囊下窦巨噬细胞（SSMs）中的caspase 1，通过在内吞作用时破坏溶酶体激活酪氨酸蛋白激酶SYK，具有佐剂活性，诱导OVA特异性CTL反应和高抗体滴度。此外，如matrix-M等皂苷在激活先天免疫系统、允许疫苗剂量减少以及诱导体液和细胞介导的免疫反应中发挥关键作用。然而，这种佐剂的分子机制仍有待阐明。这种佐剂的作用机制可以通过系统疫苗学方法来定义。目前，机制方法和理由与人类中佐剂疫苗的有效性和可接受性相关。这些信息可能有助于提供一种协议，如何在非临床模型和临床中评估和表征新的佐剂系统进行逐一比较。最近的一项研究表明，五种不同的佐剂疫苗只影响了针对疫苗抗原的CD4+ T细胞的数量，但未能调节这些细胞的表型范围。因此，并非总是佐剂对所有抗原的免疫反应质量产生影响。通常，疫苗的有效性在很大程度上也依赖于疫苗抗原本身以及保护所需的免疫类型，例如HIV疫苗研究。 表1 人类使用的许可疫苗佐剂 表2 正在开发中的疫苗佐剂 动物模型的开发和推进也可以用于评估潜在的佐剂疫苗。 此外，在临床中，大多数分子分析都是基于外周血样本和非人灵长类动物模型进行的，这允许评估免疫接种的局部免疫反应，并为已有的外周血签名提供逻辑验证的机会。对于快速发展新一代佐剂，非临床研究始终在连接临床解释方面发挥着至关重要的作用。佐剂主要由天然成分组成。当前技术不断发展，用于开发新的佐剂；很快，将有重要的进步，用于含有合成成分的佐剂。尽管批准的佐剂将始终被视为未来的宝贵资产，但这些佐剂的许多关键成分已从自然资源中开发出来，并且可以被具有类似功能的合成分子所替代。目前正在鉴定具有成为更有效的激活剂和激动剂潜力的新分子。这些分子可以以低成本大量生产，因为它们可以轻松纯化和评估，并且不易受到其内在生物学变异性的影响。此外，这些合成分子的大规模生产过程可能不易受到获取和提取天然成分的许多困难和挑战的影响。然而，在用这些新佐剂候选物替代现有佐剂中的天然成分之前，应通过临床试验解决安全性和保护效力的担忧。如前所述，在过去的100年中，已经研究了几个有前景的佐剂候选物；然而，只有少数佐剂被批准用于人类。由细菌Acinetobacter calcoaceticus产生的复杂酰化多糖emulsan可能是一个好候选物，因为它易于结构定制和其乳化行为。我们发现emulsan激活巨噬细胞，并显示出显著的佐剂活性，通过特异性抗体滴度确定。这种免疫反应以高免疫球蛋白G2a滴度为特征，与Th1反应一致。这种复杂聚合物所显示的显著免疫增强作用确立了emulsan作为一个新的令人兴奋的佐剂候选物。我们建议，通过操纵emulsan的化学结构，我们可以探索PRRs和巨噬细胞激活的物理基础。在过去的几年中，我们对先天免疫信号有了深入的理解和巨大的知识，这为关注具有更高潜力的佐剂靶点，即TLR、干扰素基因刺激因子（STING）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）、C型凝集素受体（CLRs）、寡聚化结构域、富含亮氨酸的重复和含吡啶结构域（NLRP）以及干扰素诱导蛋白（AIM2）提供了新的途径。此外，还开发了一些复杂的探索性佐剂概念，包括包含许多不同组分的多聚配方。尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果，但这些佐剂在理想的预防性疫苗中几乎没有发挥作用，但随着治疗性疫苗的出现，如果有额外的途径，解决了大规模生产、稳健性、可重复性的问题，可能会有额外的机会。尽管在佐剂方面取得了巨大进展，但仍存在一些值得注意的限制，例如无法在人类中刺激强大的CTL反应。然而，为了刺激广泛和多样化的免疫反应，佐剂也可以在核酸和载体中用于初次/增强背景下。这种尝试已经尝试开发针对HIV的有效疫苗，并且正在评估一种佐剂疫苗抗原作为增强蛋白，在用载体进行初次免疫后使用。因此，临床研究对于定义异种初次/增强设置的最佳组合至关重要。通过更好地方法来表征新开发的佐剂，即阐明特定于先天免疫的信号级联，这是支持特定疫苗潜力所需的，可以解决一些基本问题。疫苗效果的快速及时刺激有何影响？先天免疫反应的信号通路中是否存在冗余？是否可能通过更特定的刺激获得更好的结果？先天免疫效应物（如细胞-细胞相互作用和细胞因子信号）与适应性免疫效应物（如B细胞和T细胞）之间的确切时间和空间关联是什么？这些反应是否是时间依赖性的，其中疫苗抗原和佐剂保留在疫苗接种部位，以及局部APCs是如何激活的？在人类群体中，佐剂的特定免疫反应如何受到生态因素和个体遗传倾向的影响？几种同时使用的药物和已经患病的个体对免疫接种有何影响？ 结论 免疫接种的最终目标是提供针对各种传染病的有效和持久的保护。这种免疫保护只能通过使用携带适当佐剂和抗原的疫苗配方来实现。佐剂是疫苗配方的重要组成部分，可以调节疫苗反应。早期的疫苗配方方法专注于单一类型的佐剂，即铝盐或乳液。然而，新的疫苗配方需要刺激明确定义的细胞和体液免疫反应。因此，为了触发强大的免疫反应，如体液和细胞免疫反应，疫苗配方中迫切需要新的免疫增强剂或免疫刺激佐剂。粘膜佐剂dmLT是25年研究的成果。通过临床前和临床研究表明，dmLT是一种安全有效的佐剂，可以在适当的配方中诱导保护性免疫。需要关注一些未解决的问题，以改进dmLT佐剂，例如抗原-佐剂组合的安全性和稳定性问题。dmLT的佐剂机制以及由dmLT赋予的保护性免疫的诱导也值得进一步研究。有建议称dmLT可以促进婴儿的先天和适应性免疫反应。含有dmLT的疫苗制备已被发现对粘膜感染有效。得出结论，dmLT将有助于克服对其他全细胞或基于LPS的疫苗（如霍乱、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌疫苗）的低反应性，特别是在经济欠发达国家的婴儿中。我们预测，将来在婴儿疫苗制备中使用dmLT将非常有效。最近，我们对佐剂研究领域有了深入的了解；现在，我们可以选择一个合适的佐剂，而不是像免疫增强剂这样的经典佐剂，或者它们的组合，以增强疫苗的功效。最近，铝盐、MF59、AS03、CpG和matrix-M已获得许可，并在全球范围内用于COVID-19疫苗的制备。已经建议使用编码穗蛋白的合成基因，无论是前融合稳定还是仅有受体结合域，来工程哺乳动物细胞、杆状病毒或植物细胞以产生重组蛋白，然后将其纯化，与佐剂结合，并用作疫苗。在COVID-19期间的疫苗制备中，我们获得了使用基于蛋白质的疫苗结合许可佐剂的工业和临床知识，我们相信，将来基于这些方法的疫苗制备将是耐受性良好、有效且大量可用的。此外，在COVID-19大流行期间使用RNA成熟和病毒载体来创建疫苗已经为未来生产更有效的疫苗开辟了新的途径，以应对新出现的感染。最近完成的临床研究对新佐剂的建议是，将来在人类使用的疫苗配方中应使用一组新的免疫增强剂或免疫刺激剂。这些新一代佐剂的不同组合的可用性将使成功的疫苗开发策略得以合理化。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。