Sialyltransferases

摘要:流感仍然是一个严重的全球健康问题，每年造成重大的发病率和死亡率。疫苗接种对于减轻其影响至关重要，但需要快速高效的制造策略来应对时间和供应问题。传统上依赖于基于鸡蛋的生产，该领域已经见证了向基于细胞培养的方法转变，这提供了增强的灵活性、可扩展性和流程安全性。本综述提供了可用细胞基质和技术进步的简洁概述。我们总结了向流程强化的关键步骤——从滚筒瓶生产到载体上的动态培养，从批量模式的悬浮培养到使用各种细胞保持装置的高细胞密度灌注。此外，我们比较了一次性使用和传统系统，并解决了包括干扰粒子缺陷在内的挑战。总的来说，我们描述了当前基于细胞培养的流感病毒生产的最先进技术，以可持续地满足疫苗需求，保证及时供应，并应对季节性流行病和全球大流行的挑战。 1.引言 呼吸道疾病，如流感，仍然是一个严重的全球健康和经济负担。流感疫苗包括灭活疫苗（IIV）、减毒活疫苗（LAIV）和重组疫苗（RV）等几种接种方式，这些疫苗获得了许可，构成了全球流感预防策略的基石。此外，基于核酸的平台技术正在开发中。通常，流感疫苗设计为三价或四价组合，包含一种/两种流感A型和B型病毒（IAV, IBV）株，根据国际卫生组织每年的推荐。生产传统上基于将目标株注入受精鸡蛋的过程，让它们复制。这种方法虽然广泛使用（约占全球IIV生产能力的84.5%），但耗时且易受鸡蛋供应短缺的影响，且难以处理废物。相比之下，基于细胞的生产提供了更快的时间线、改善的抗原匹配和效力、更好的可扩展性，并且不依赖于鸡蛋的可用性。因此，人们越来越感兴趣转向基于细胞培养的方法，这是由于需要更高效和灵活的制造平台来满足全球需求并应对短缺。 基于细胞培养的流感疫苗的早期开发可以追溯到20世纪中叶，当时越来越多的连续细胞系变得可用，一些创新已经实施用于动物疫苗的生产。但直到21世纪，生物加工技术的重大进步才使得它们广泛用于人类疫苗使用。最初用于小规模生产的静态细胞培养，为后续在生物反应器设计、培养基配方和流程优化方面的创新提供了基础。静态培养的固有限制，包括低细胞密度批处理和高效放大的障碍，促使探索动态培养系统以提高生产力和可扩展性。同时在适应细胞系悬浮生长、建立设计细胞系和改进培养基配方方面的进展，最终实现了高产生产系统，并允许进一步的流程优化和强化措施以提高生产力、可扩展性和流程稳健性。图1展示了使用MDCK细胞为例的技术进步及其在IAV基于细胞培养的过程中的应用的概述。通过实施高细胞密度（HCD）培养策略，可以克服传统批处理过程的限制。特别是，近年来已经有效地解决了实施进料批处理和灌注策略的几个工程挑战。 在接下来的部分，我们将描述可能鼓励进一步流程开发的关键步骤和创新，建立具有改进的流程效率、疫苗效力和降低生产成本的流感病毒生产的上游流程。我们涵盖了适合的宿主细胞系的识别和选择、使用静态培养的早期制造方式、过渡到悬浮培养，以及涉及粘附和悬浮细胞系的流程强化选项。我们探讨了技术进步的基本原理，以及每种方法相关的挑战。此外，我们讨论了一次性使用（SU）与常规不锈钢（SS）技术的适用性。通过理解正在开发和制造中的新方式，我们可以识别进一步优化和创新的机会，以满足日益增长的疫苗需求并增加全球可及性。 本综述的重点将是哺乳动物和禽类细胞培养基流感病毒生产；不考虑植物和昆虫细胞。当然，重要的是要承认优化的上游处理只是疫苗制造的一个方面。疫苗生产过程中的下游处理、混合和配方阶段同样至关重要。虽然认识到整个过程的重要性，但这方面的内容在本文中将不再进一步讨论。 图1. 使用MDCK细胞的基于细胞培养的流感病毒生产过程的技术进步。自20世纪40年代以来，传统的基于鸡蛋的过程就已经可用（红色箭头）。从1958年Madin和Darby从一只健康的可卡犬肾脏中分离出MDCK细胞开始，就建立了各种基于细胞培养的生产方法。培养基开发的进步和MDCK细胞适应悬浮生长的改进，为建立更高效和更密集的过程打开了可能性。对于依赖悬浮细胞系的灌注过程，生物反应器系统与细胞保留装置相连，该装置可以是基于膜的，或者是倾斜沉降器（重力）或声学过滤器。自千禧年之交以来，基于MDCK细胞的过程已获得许可，用于生产人类流感疫苗（蓝色箭头）。BR：生物反应器；CSTR：连续搅拌罐反应器。 2.基于细胞培养的流感病毒生产 开发基于细胞培养的流感病毒生产过程的关键是选择合适的宿主细胞系，它可以有效支持病毒复制并满足监管要求。细胞系通常带有推荐的生长培养基，支持粘附或悬浮细胞生长，但可以从那里进行调整和优化。组成是关键，确保营养和基本因素的平衡，允许快速的细胞生长，倍增时间少于30小时，以及高病毒复制。传统上，细胞在含有血清的培养基（SCM）中培养，因为它提供了所有必要的生长因子和营养物质。然而，血清容易引入批间变异，现在更倾向于使用无动物成分的过程，以最小化外来因子污染的风险。因此，现代选择包括无血清（SFM）或化学定义培养基（CDM），因为它们提供了更安全和一致的性能。然而，在这些培养基中实现可比较的细胞生长和病毒产量需要仔细优化配方和补充生长因子。培养基设计本身是一门艺术，为特定细胞系和目标病毒开发培养基大多超出了范围。因此，通常使用现成的培养基并结合使用，即使它们没有完全为预期的过程优化。根据组成和细胞的代谢，这可能导致不希望的次级副产品，如氨和乳酸，积累到对细胞生长和病毒生产产生不利影响的浓度。此外，细胞系、培养模式和系统决定了各种流程参数的最佳设计空间，这些参数应该在整个过程中严格控制。我们小组之前总结了适用于基于细胞培养的病毒生产的流程参数和强化策略的一般考虑。对于流感，温度通常保持在32°C和37°C之间，pH值在7.2和7.6之间，溶解氧浓度超过30%。在感染时，通常与蛋白酶（如胰蛋白酶）一起添加种子病毒，以增强病毒进入细胞。必须仔细调整蛋白酶的浓度和活性，以确保最佳病毒复制，而不会导致过度的蛋白质消化，导致粘附细胞培养中的细胞脱落甚至细胞死亡。同样重要的是准备种子病毒，考虑到可能适应特定细胞系，并确保感染性与非感染性颗粒的高比例。虽然众所周知，在胚蛋中病毒传播可能导致抗原编码基因的突变，从而对疫苗效力产生不利影响，但在使用MDCK细胞的序列分析研究中没有观察到细胞特异性适应性突变。在这里，通过MDCK细胞传代的种子病毒代表了在人类中分离的病毒。通常，种子病毒的传代次数限制在五次。虽然细胞特异性适应需要2-3个步骤，但仍有放大的空间。然而，我们清楚地看到需要通过测序和抗原性特征化，在大规模生产过程中持续监测种子病毒的遗传稳定性。一个非常有效和可靠的工具，用于监测从种子病毒到最终收获甚至下游纯化的糖组成是CGE-LIF（毛细管凝胶电泳与激光诱导荧光检测）。 流感病毒的最佳收获时间通常在感染后36至72小时，这时病毒滴度达到高峰。然而，这可能因细胞系、流程参数和使用的病毒株而异。特别是对于流感病毒生产，种子病毒输入不仅对复制速度至关重要，也对缺陷干扰粒子（DIPs）的出现至关重要。因此，感染的多重性（MOI），通常在10到10-5之间，需要根据研究目的仔细考虑。 以下，我们概述了基于细胞培养的流感病毒生产的当前最先进技术，首先关注细胞系的选择，然后详细讨论流程策略选项，最后讨论（一次性使用的）培养系统的选择。 2.1.用于流感病毒生产的粘附和悬浮细胞 目前，基于细胞培养的病毒生产没有普遍适用的解决方案或平台流程。这种限制主要源于病毒能够有效感染的宿主物种数量有限，这一属性被称为宿主范围。此外，不同宿主细胞系的病毒产量可能差异巨大，细胞系可能因疫苗安全性的高要求（例如肿瘤原性和外来因子）而不符合疫苗生产资格。因此，历史上建立的、但往往表现不佳的细胞系被广泛使用，需要系统地筛选监管当局批准用于疫苗生产的宿主细胞，以选择理想的候选细胞。识别是一个劳动密集型的挑战，涉及导航包括培养基选择、培养模式和流程条件在内的几个障碍。此外，潜在细胞系的商业甚至学术使用通常由于知识产权和许可问题而受到限制，这也可能限制筛选选项。 除了病毒产量和流程生产力，考虑因素还应包括疫苗产品的抗原匹配和免疫原性，因为几项研究表明，根据生产系统（鸡蛋或特定细胞系）的不同，存在明显差异。选择最佳宿主细胞系的标准之前已经概述，适合流感生产的候选细胞已经在接受过彻底审查的综述中进行了检查。已经评估了几种传统或设计细胞系用于流感病毒生产，包括MDCK、Vero、HEK293、AGE1.CR、PER.C6、EB66、CAP、DuckCelt-T17或PBG.PK2.1细胞。尽管这些候选宿主细胞系有多种好处，但只有少数已经合格并用于基于细胞培养的流感疫苗的生产，包括用于IIV和LAIV的MDCK和Vero细胞，以及用于RV的Sf9衍生细胞。事实上，行业的专有数据和这种选择性使用背后的决策过程没有向公众披露，这也限制了我们对为什么某些细胞系最终被选为疫苗生产的理解。从学术角度来看，我们可以假设包括监管批准、既定生产协议、市场首推决策和成本效益在内的障碍。 在一项头对头比较中，Genzel等人阐明了粘附MDCK或Vero细胞是否是流感疫苗生产最合适的细胞基质的问题。尽管在优化的小规模条件下（滚筒瓶、T型瓶），两者在上清中可以获得类似的病毒滴度，但在微载体上的生物反应器中，MDCK细胞表现更优。随着先进培养基开发和细胞系工程，现在有多种悬浮MDCK细胞可用，为生物过程操作和可扩展性提供了巨大优势。相比之下，Vero悬浮细胞的开发是一个更具挑战性的任务，已经吸引了多个研究小组超过三十年。在这里，迄今为止报告的最大细胞浓度高达8×106细胞/毫升；然而，这只是在13天的摇瓶培养中通过三次完全更换培养基才达到的；否则在批处理中达到约2×106细胞/毫升，在3升生物反应器灌注培养中达到6.8×106细胞/毫升。此外，倍增时间超过40小时和频繁形成聚集体仍然是重大问题，从而限制了有效或强化流程的选项。因此，MDCK细胞主要占据工业制造。 2.2.MDCK细胞在流感病毒生产中的作用 早在1958年，MDCK细胞就被SH Madin和NB Darby从一只健康的可卡犬的肾脏中分离出来，几年后存放在美国典型培养物收藏所（ATCC）。由于非常适合作为极化细胞的模型，MDCK细胞系成为最广泛研究和良好特征化的上皮细胞系之一，用于细胞生理学和病毒学调查。全球领先的研究机构已经使用粘附MDCK细胞进行人类流感病毒的分离和复制，主要用于流行病学研究和诊断目的。除此之外，MDCK细胞也主导了基于细胞培养的流感疫苗制造，因为它们对所有流感亚型都易感，并能产生各种高滴度的病毒株。因此，自上个世纪末以来，一直在努力利用MDCK细胞进行人类流感疫苗制造，而不是使用鸡蛋，这导致了广泛的安全性分析，以消除关于肿瘤原性和致癌性的担忧。 此外，学术和工业努力已经做出，以提高细胞特异性病毒产量（CSVY）和整体生产力。这些努力包括适应悬浮生长而不是将细胞粘附到微载体或瓶表面，这可以通过转染粘附MDCK细胞与人类siat7e基因或遵循先进的培养基开发来实现。此外，应用了提高细胞浓度、实时监测病毒感染动态以及时收获病毒、开发多尺度模型以改善流程理解或获得主要表达人类流感受体的细胞系的遗传操作等策略。最后，选择高产细胞克隆对于提高上游制造过程中的生产力具有重要潜力。这似乎特别相关，因为MDCK细胞显示出广泛的细胞间异质性，在形态、电生理和生化特性、碳水化合物表示以及最重要的病毒生产能力方面存在显著差异。 在单细胞水平上的研究可以揭示后代病毒产量和细胞内病毒RNA水平之间高达大约1000倍的差异。尽管如此，揭示这种异质性背后主要驱动因素的努力尚未得出一个简单的答案。然而，最近的转录组分析表明，抑制宿主细胞功能以转移细胞资源和维持足够活动以进行病毒复制之间的平衡是一个相关因素。由于多个学术和工业研究小组的这些密集努力，几种具有不同特性的MDCK细胞系变得可用，其中大多数细胞系源自存放在ATCC的CCL-34谱系。 2.3.涉及粘附细胞系的流程 如今，在许多生物处理环境中，悬浮细胞因能够支持高细胞密度生长、易于放大、灵活性、成本效益和流程控制选项而受到青睐，而不是依赖锚定的细胞。然而，悬浮细胞并不总是可用的，对于一些细胞系来说，适应或工程化它们以支持悬浮生长仍然是一个挑战。由于涉及这种依赖锚定的细胞的流程总是受到可用表面积的限制，过去已经做出了大量努力来优化生产以实现最大效率。这可以通过T型瓶、滚筒瓶、细胞工厂的表面积，或者在固定床反应器中或使用的微载体数量来确定。其中一些静态细胞培养系统不仅在表面积上有限，而且缺乏流程控制选项。尽管在滚筒瓶中可以实现适当的培养基混合和气体扩散，但并未对诸如pH和pO2等关键参数进行控制。然而，病毒生产可以轻松实现高滴度，并且只需要最少的操作者交互。在之前的研究中，涉及滚筒瓶中粘附MDCK细胞的流程产生了1.0×109 PFU/ml的A/PR/8/34 (H1N1)。尝试通过使用培养基中的丙酮酸代替谷氨酰胺来绕过氨积累以优化这种静态生产过程，并未导致显著更高的产量。相比之下，实施载体技术已经可以帮助缓解表面积限制并获得更多流程控制，同时拥有更小的占地面积。在批处理模式下，使用2 g/L的微载体浓度，MDCK细胞可以达到3.2×106细胞/mL的细胞密度，产生了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 µL)。实施波纹生物反应器允许更高的细胞密度和更好的附着，相比之下搅拌罐生物反应器（2 g/L Cytodex 1, 2 L规模），然而最大滴度仍然在3.3 log10(HAU/100 µL)范围内。使用重复进料批处理策略，可以实现11.2×106细胞/mL的高细胞密度，12.5 g/L Cytodex 1，产生了2.8 log10(HAU/100 µL)。在灌注中，甚至可以达到更高的总病毒滴度3.3 log10(HAU/100 µL)，在最大细胞浓度为5.5×106细胞/mL（10.5 g/L Cytodex 1）时。尽管微载体培养显示出多个优于静态培养的优势，剪切力、需要灭菌和清洁程序可能限制其使用。此外，并非所有细胞在SFM中培养时都表现出良好的附着。或者，在固定床生物反应器中，细胞被固定在生物反应器内的松散包装基质上，这提供了大表面积、高氧气转移和作为一次性选项的可用性。使用30 mL小规模模型，Sun等人报告了3.2×1010细胞的数量，提供了最大病毒滴度为2.9 log10(HAU/100 μL)和7.8×107 TCID50/mL，在感染后3天（MDCK细胞，A/New Caledonia/20/99 (H1N1)）。此外，实施中空纤维（HF）生物反应器可能是使用粘附细胞进行病毒生产时的一个有前景的方法。这些系统由一个装有数百个毛细管的盒组成，其中细胞在毛细管外的空间生长并产生病毒，而营养物质和氧气通过毛细管内的空间不断供应。在这里，可以实现最大总病毒滴度3.53 log10(HAU/100 μL)，单次收获步骤，这对应于1,604–3,209病毒/细胞的细胞特异性病毒产量（CSVY）（毛细管外空间1–2×109细胞/mL，A/PR/8/34 (H1N1)）。使用多次收获步骤和调整的条件，甚至可以达到更高的CSVY 4,055–8,110病毒/细胞。最近的发展，如一次性固定床生物反应器系统（scale-X, Univercells或iCELLis, Pall），允许克服先前描述的静态培养的几个限制。这些系统提供从2到600平方米的生长表面，提供可扩展的流程与自动化流程控制（pH, DO, 液体流速），同时作为预过滤器保留细胞碎片和杂质。例如，Berrie等人报告了10平方米单元的多达1×1010细胞，并且使用scale-X生物反应器与烧瓶和细胞工厂相比，使用Vero细胞生产的水泡性口炎病毒产量提高了两到四个数量级，然而，目前尚无流感数据。 2.4.涉及悬浮细胞系的流程 悬浮细胞作为病毒生产的宿主的可用性为流程开发和放大提供了许多新的可能性。为了满足对可持续和成本效益流程的日益增长的需求，已经出现了向开发强化和集成生产方法的转变。因此，现在有高通量筛选和流程优化的缩放模型以及具有小占地面积的准连续生产系统可用于大规模制造。产生悬浮细胞系可以通过适应适当的培养基或通过遗传工程来实现。现代培养基甚至允许MDCK细胞悬浮生长到高细胞浓度。然而，并非每种培养基都直接支持单细胞生长，细胞形成簇或聚集体。以下，我们总结了这种流感病毒生产的流程优化和强化策略，展示了这些方法的潜力。 2.5.简单直接：批处理培养 在批处理模式下进行病毒生产时，向生物反应器中添加有限数量的培养基，并将细胞生长到所需的细胞浓度。随后用种子病毒感染，启动病毒复制，当滴度达到最大时，通过收获步骤结束生产周期。清洁和消毒后，生物反应器可以为下一批操作做准备。大多数工业疫苗生产过程仍然以批处理模式运行，因为设置和维护相对容易，独立批次的生产有助于减轻安全性和批次放行的风险。不幸的是，这些行业流程的数据并不完全公开。然而，有学术描述在实验室规模上涉及悬浮HEK-293或MDCK培养的流感疫苗生产的潜在流程。在这里，Bissinger等人展示了一个集成的IAV生产流程的良好性能，其中MDCK悬浮细胞在化学定义培养基中培养。使用快速生长的MDCK细胞在1 L STR中感染流感A/PR/8/34 H1N1病毒，可以达到高达3.6 log10(HAU/100 µl)的滴度，细胞浓度高达9.5×106细胞/mL。上游生产能力估计为600剂/L。假设下游处理中总回收率为50%，大约每升生物反应器收获液可获得300剂单价疫苗（每剂15 µg）。相比之下，使用滚筒瓶只能获得大约10.4剂/L的单价疫苗，而根据制造商和株，需要3-4个鸡蛋来获得三价或四价疫苗剂。 2.6.迈向流程强化的第一步：进料批处理培养 虽然批处理过程易于设置和维护，但在大流行期间，当增加产量和速度的需求增加时，它们可能会受到限制。那时，更有效地利用生物反应器容量，从而进行强化变得至关重要。 采用进料批处理方法，包括初始生长阶段，然后逐步添加新鲜培养基，可以稀释积累的氨和乳酸（抑制病毒生产和细胞生长的代谢物），并补充消耗的营养物质，从而提高细胞浓度，并导致更高的病毒产量和特定病毒生产力。在进料批处理模式下，HEK293SF细胞中A/PR/8/34 (H1N1)的生产导致空间时间产量（STY）提高了2.7倍。然而，在涉及PBG.PK2.1细胞的研究中，采用进料批处理策略无法与批处理过程的结果竞争。然而，无论是否进行稀释步骤，进料批处理模式的操作仍然可能导致代谢副产品如乳酸和氨的积累达到抑制水平，特别是当使用浓缩饲料时，从而阻碍病毒生产。 2.7.流程强化的下一阶段：灌注培养 真正的连续流程对溶瘤病毒生产提出了挑战。因此，灌注策略的实施已成为流感病毒生产中的一项基本进步，通过提高细胞浓度、病毒产量和整体效率来强化流程。要实现高细胞密度（HCD）和高生产力，必须为细胞提供最佳代谢环境。这可以通过不断供应新鲜培养基，同时移除等量的耗尽培养基来实现。这种交换不仅为细胞生长提供营养物质，还允许部分移除不利的代谢副产品（例如乳酸和氨）或蛋白酶抑制剂、细胞产生的二氧化碳和用于pH控制添加的碱基中的碳酸氢盐。 与真正的连续培养不同，在培养系统中保留细胞是一个关键的技术方面，通常通过膜、沉降或离心来实现。Chotteau等人和Göbel等人的文献提供了现有技术的全面概述。 流程控制可以通过手动干预或自动化实现。对于后者，实时监测细胞生长和病毒生产的关键阶段，例如使用电容法，对于实现精确控制和优化培养条件（例如动态进料制度或收获时间点）非常有用。 半灌注培养提供了在小规模评估细胞是否可以在HCD下生长的最简单方法。在这里，细胞在摇瓶中生长，通过离心定期交换一定量的培养基，通常由细胞特定的灌注率指导。通过这种培养方式，Bissinger等人在化学定义培养基中达到了高达60×106细胞/mL的MDCK细胞浓度。然而，当细胞在40×106细胞/mL时感染A/PR8/34 (H1N1)，达到了最高滴度，总病毒滴度为4.2 log10(HAU/100 µL)，对应于近4.5 log10 (HAU/100 µL)的累积滴度和近1010 TCID50/mL的传染性滴度。对于生物反应器操作，通过离线离心保持细胞无菌性和连续性面临挑战，并且需要大量投资，特别是在大规模时。 对于使用生物反应器的放大，通常在工业中考虑使用基于膜的系统进行细胞保留，如旋转过滤器、切向流过滤（TFF）或交替切向流过滤（ATF）。在这里，ATF和TFF模式更受青睐，因为与细胞肉汤对过滤面的正交流相比，切向流可以防止膜污染。有多种报告使用ATF或TFF系统在悬浮MDCK、AGE1.CR、CAP和PBG.PK2.1中生产流感病毒，强调与批处理生产相比病毒生产的改善。 使用PBG.PK2.1细胞，Gränicher等人在ATF培养中达到了高达50×106细胞/mL的细胞浓度和最大HA滴度3.93 log10(HAU/100 µL)；然而，CSVY低于优化批处理或进料批处理培养获得的值。相比之下，在最大MDCK细胞浓度45×106细胞/mL时，Wu等人展示了非常高的滴度4.42 log10(HAU/100 µL)，对应于4.5 log10 (HAU/100 mL)的累积滴度和1.8×1010 TCID50/mL的传染性滴度（A/PR8/34 (H1N1)）。在这种培养中，可以确定非常高的产量：CSVY为11,690病毒/细胞；STY为8.0×1013病毒/L/d；体积生产力为1.02×1013病毒/L/d。对于CSVY低得多的禽细胞系（AGE1.CR.pIX），Vazquez-Ramirez等人（2019年）提出了一种混合进料批处理/灌注策略，使用ATF系统。通过这种组合策略，达到了3.3 log10(HAU/100 μL)的滴度，与仅参考灌注培养相比增加了5倍，与传统批处理过程相比增加了7倍。尽管培养基消耗增加，但混合策略实现了与传统批处理过程相似的体积生产力（5.4×1011 vs. 6.5×1011病毒/L/d）。总之，这证明了整合不同培养策略以实现最佳病毒产量和流程效率的潜力。 然而，由于溶瘤性质、大尺寸（痘病毒高达360 nm）和病毒的独特表面特性，传统的基于膜的细胞保留在病毒生产中面临挑战。病毒感染后的细胞凋亡和溶解缩短了流程时间，但增加了杂质水平，因为细胞碎片、蛋白质和宿主细胞DNA积累，导致常见的缺点，包括膜堵塞和生物反应器内不希望的病毒积累。尽管流感病毒颗粒直径仅在80至120 nm之间，但几项研究在使用50 kDa、0.2 µm和0.5 µm截止的ATF膜时观察到病毒保留和膜堵塞。 最近，出现了允许连续病毒收获的基于膜的技术，这可能通过缩短生物反应器内的停留时间来提高CSVY和产品质量。例如，Hein等人建立了一个自动化灌注过程，使用约10 µm孔径的管状膜（VHU）在ATF模式下连续生产和收获IAV DIPs。DIP生产在大约20×106细胞/mL的细胞浓度下启动。虽然细胞有效地保留在生物反应器中，但100%的产生的病毒颗粒通过了膜，并且没有观察到污染。在控制过程中，使用常规HF膜（孔径0.2 µm），大多数IAV DIPs保留在生产容器中。切向流深度过滤（TFDF）技术（Repligen）可能也是一个选项。在这里，使用2-5 µM孔径的膜在TFF模式下有效保留细胞，同时深度过滤允许通过过滤器收获病毒颗粒。Silva等人最近使用TFDF进料批处理/灌注设置在HEK293SF细胞中生产IAV，展示了病毒生产和通过膜的有效收获，而没有面临病毒保留、膜堵塞或增加剪切力的问题。我们实验室也使用这项技术在MDCK细胞中获得了有希望的IAV生产结果；然而，数据尚未发表。TFDF模块是可扩展的，并且从试点到2,000 L规模商业化，可能会推动疫苗流程开发朝着集成的连续下游处理发展。 克服膜污染和病毒保留问题的另一种选择是依靠重力或声波的细胞保留装置，这两种方法都已应用于流感病毒生产。声波和倾斜沉降器都允许连续病毒收获，优先保留活细胞，并且与基于膜的系统相比，施加的剪切力较低，这一点尤其关键，因为感染的细胞对剪切更为敏感。 使用声波沉降器，Petiot等人在浓度高达18×106细胞/mL的HEK293细胞中获得了有希望的结果。与批处理过程相比，灌注模式的滴度几乎高出一个数量级。随后，Granicher等人（2020年）比较了在浓度介于25至50×106细胞/mL的AGE1.CR.pIX细胞培养中声波沉降器的性能与ATF培养。由于能够连续收获病毒，至少实现了1.5倍的CSVY增加和高达3倍的体积生产力提升。这些结果再次强调了连续病毒收获对流感生产流程的重要性，并展示了声波沉降器应用的潜力。然而，这些设备主要在实验室规模上建立，在商业制造中较少见。类似地，Coronel和Gränicher等人使用倾斜沉降器在高达50×106 AGE1.CR.pIX细胞/mL的培养中达到了高细胞密度。连续收获病毒导致CSVY为3474病毒/细胞，与ATF对照培养相比增加了4.7倍，体积病毒生产力也提高了2.2倍。然而，该设备的局限性在于灌注率容量、缺乏现成的工业规模解决方案、高停留时间和温度梯度。总的来说，所有讨论的发现都强调了流感病毒生产中灌注策略的复杂进步，因为它们为细胞生长和病毒生产阶段提供了明显改善的代谢环境。 2.8.强化病毒生产的挑战：连续培养 近年来，对于各种生物制药应用，人们越来越感兴趣地使用连续制造方法替代批处理模式。在稳态下进行这样的操作可以允许延长生产阶段，同时可能导致提高生产力和效率。对于重组蛋白或非溶瘤病毒的生产，这可以通过化学计量器过程实现，其中维持进料和产品收获的均匀流速，确保一致的工作体积和营养供应。相反，许多病毒如流感是溶瘤的，需要在不同的容器中分离细胞生长和病毒传播，以避免凋亡和细胞溶解的影响。这种级联可以在最简单的情况下通过两级连续搅拌罐反应器（CSTR）系统实现。从专门用于细胞生长的初级STR，细胞被连续转移到仅用于感染和病毒传播的次级STR。 Frensing等人最初尝试在CSTR系统中连续在AGE1.CR细胞中生产IAV，未能达到预期的效益。相反，生产导致病毒滴度出现周期性振荡，与批培养相比显著降低了体积生产力。这种波动被描述为“von Magnus效应”，可以归因于DIPs的出现。DIPs本身不复制，但与感染性流感病毒颗粒的复制竞争和干扰，这可能严重限制连续流程用于IAV或其他产生DIPs病毒的生产。然而，随着管状Plug-flow生物反应器系统的发展，Tapia等人能够规避这些限制，并在AGE1.CR.pIX和MDCK细胞中展示稳定滴度的IAV生产。该系统由一个用于细胞生长的CSTR和一个用于病毒传播的105米长的管状Plug-flow生物反应器组成。通过这种方式，省略了滴度振荡，并实现了与传统批培养相比约2倍的STY。 然而，DIPs并不总是被视为IAV生产中不想要的副产品，因为它们也显示出作为预防性和治疗性抗病毒的潜力。为了进一步探索DIPs的演变，应用数学建模来描述在次级STR中不同停留时间的两个CSTR培养的实验结果。此外，Pelz等人最近使用简化的半连续设置来模拟小规模的连续病毒传播。而不是级联STRs，使用两个不同的摇瓶用于悬浮MDCK细胞的扩增和IAV生产。在21天的培养期内，由于DIPs和感染性颗粒的竞争动态相互作用，再次观察到病毒滴度的强烈周期性振荡。随后，使用下一代测序来加深对DIP形成的理解，并确定有前途的抗病毒治疗候选物。此外，这些研究还展示了DIPs在流感病毒种子病毒生产中的重要性。 尽管连续生产可能承诺与批处理相比在占地面积和制造成本上大幅减少，但进一步的限制包括对技术人员的高资质要求，以及由于设置的复杂性和延长的过程时间而增加的污染风险。因此，连续流感生产并不一定能超过提供极大灵活性和控制的批处理过程的优势。 图2. 用于流感疫苗制造的可用培养系统比较，包括贴壁细胞或悬浮细胞。STR：搅拌罐生物反应器；OSB：轨道摇动生物反应器（一次性使用）；Wave生物反应器（一次性使用）；摇瓶半灌注；ATF：交替切向流过滤；TFF：切向流过滤；TFDF：切向流深层过滤；AS：声学沉降器；IS：倾斜沉降器；HFBR：中空纤维生物反应器；半连续：两阶段半连续摇瓶培养系统；CSTR：两阶段连续搅拌罐培养系统。 2.9.一次性技术在流感病毒生产中的应用 一次性使用（SU）技术的实施在生物制药行业中逐渐获得普及，COVID-19大流行情况甚至加速了生物加工中对SU设备需求的稳定增长。根据最近的一项调查，临床上游处理中使用SU设备的运营从2014年的38.6%增加到2022年的62.9%。如今，市场上有多种生物反应器操作的SU选项，然而，决定疫苗生产中使用SU还是不锈钢（SS）技术涉及仔细平衡优势和挑战。由于它们的低周转时间，SU系统提供了极大的灵活性、快速的可扩展性和增加的生产率，使它们特别适合应对多样化市场需求和有效调整生产活动。此外，这些系统是扩大全球生产能力的关键因素，因为它们可以由于较低的资本投资、工程和运营成本而在不太发达的地区轻松建立。然而，大流行表明，当需求增加时，SU设备的供应和灭菌尤其有限。相比之下，以耐用性、安全性和适用于长期生产而闻名的SS反应器，适合可预测的大规模生产。SU与SS的可持续性问题和可提取物仍然存在争议。同样，一些SU设备由新公司提供，而这些公司并不总是在市场中保持存在。然而，特别是疫苗制造过程需要维持多年的生产，并且需要提供备选方案。因此，需要保证SU设备的质量，以允许长期供应和生产相应的疫苗。流程中的任何变化都需要证明产品质量的充分性。最后，临床和商业制造中SS系统的放大和适应性挑战可能会限制灵活性和对市场变化需求的响应能力。 对于流感病毒生产，迄今为止已经评估了几种一次性系统，包括中空纤维（HF）、固定床、轨道摇动、振荡和搅拌生物反应器系统。SU生物反应器系统的设计在质量传递和混合原理、规模和应用领域（研发或制造）方面差异很大。近年来，SU微生物反应器系统，如Sartorius的ambr系统（15 mL wv）或Merck的Erbi Breez（2 mL wv, 灌注）在早期开发中越来越受欢迎。在我们的实验室中，使用ambr15系统在微反应器规模上筛选多个单克隆MDCK细胞系进行流感病毒生产时取得了有希望的结果。平行运行多达48个SU容器，并在控制条件下自动采样，可以快速生成多个流程变化的数据。 将SU系统用于灌注模式的生产流程增加了另一层优势。例如，Coronel等人研究了在与基于膜的细胞保留装置耦合的SU轨道摇动生物反应器中的IAV生产。在比较分析中，采用ATF或TFF系统的灌注策略可以明显优于参考批处理过程。由于简单的袋式设计，无需耦合或搅拌器，系统设置容易实现，适合剪切敏感细胞，即使在高细胞密度下，AGE1.CR.pIX细胞的氧气需求也能得到满足。此外，该系统适用于放大，因为商业上可用的工作体积在1.5 L到2,500 L之间（Kühner）。许多其他供应商也提供高达6,000 L的SU系统（例如ABEC）。 总的来说，SU系统可以提供灵活、完全可扩展的即插即用生物反应器操作，特别是高效的灌注流程与一次性设备的有限体积容量完美契合。它们已经普遍用于重组蛋白的制造；我们在基于细胞培养的疫苗生产领域看到了类似的潜力。 3.展望和结论 在过去二十年中，为了建立和加强基于细胞培养的流感疫苗制造流程，已经取得了许多技术进步。从传统的基于鸡蛋的生产向基于细胞培养的方法转变似乎越来越不可避免，特别是随着准连续流程的选择，旨在提高效率和降低成本。然而，剩余的挑战包括优化细胞系和培养基以获得更高的病毒产量、实施先进的在线监测工具以及适应新方式的下游处理。实现具有高病毒生产力的小占地面积的稳健和可扩展的灌注策略可能是满足日益增长的疫苗需求的关键。然而，疫苗生产中批处理和连续模式之间的选择取决于多个因素，包括生产规模、成本效益、流程控制、产品质量和监管考虑。在某些情况下，具有高性能细胞系的稳健批处理过程仍然可以胜过灌注过程，并且以更简单的设置和较少的工程和运营任务要求而更具说服力。此外，行业正在积极探索在研发和制造两个领域整合SU技术。在这里，技术进步和加强流程的结合可以导致有效的上游流程，这些流程可以逐步使用更小的设备完成，这有利于SU技术的实施，除了提高灵活性和降低污染风险。随着基于细胞培养的流感疫苗生产的进展，解决这些挑战对于实现这种方法的全部潜力至关重要，最终可能取代基于鸡蛋的生产。这包括完善流程强化策略、建立平台流程、确保产品一致性以及优化整个生物加工工作流程，以满足大规模疫苗生产的需求和对新出现的流感毒株的快速响应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：疫苗用于控制动物的传染病。与其他类型的疫苗接种（如活疫苗、减毒或灭活疫苗）相比，基于mRNA的疫苗具有显著优势。由于只使用病原体遗传物质的一小部分，且mRNA疫苗的剂量率低，病原体逆转自身的可能性最小。为了传递mRNA疫苗，需要一种载体或运输工具来保护mRNA疫苗免受宿主细胞RNases的侵害。临床试验表明，mRNA疫苗在对抗影响动物的各种传染病（包括病毒性和寄生虫性）方面有效，能够诱导细胞介导的免疫反应和体液免疫反应，这些疾病包括狂犬病、口蹄疫、弓形虫病、寨卡病毒、利什曼病和COVID-19。当前的综述旨在强调mRNA疫苗在动物病毒性和寄生虫性疾病中的应用。 1.引言 疫苗用于控制和预防动物传染病的出现。由于疫苗的广泛使用，一些疾病如天花和小反刍兽疫已从世界中完全根除，许多其他疾病的发病率在全球范围内大幅降低。通过疫苗接种，天花和小反刍兽疫等疾病已从世界中根除，这是疫苗接种成功的故事。传统疫苗开发方法为动物的许多传染病和人畜共患病提供了持久的保护，此类疫苗的例子包括灭活疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。然而，通过这些传统方法未能预防或充分控制的疾病需要新的方法来开发疫苗，特别是针对那些更能欺骗和逃避宿主适应性免疫反应的病原体。对于病毒疫苗的开发，主要障碍是快速开发和大规模制剂及其部署，而不是传统方法的有效性。同样，传统疫苗开发方法对于非传染病（如癌症）也不适用。由于这个原因，迫切需要开发更有效和广泛适用的疫苗平台。 传统疫苗方法的有希望和有效的替代方法是使用mRNA疫苗。目前，许多技术和研究发明使mRNA疫苗成为预防和控制动物工业中许多病毒和寄生虫疾病的有效工具。使用mRNA疫苗有几个好处，如（i）安全性；感染逆转和插入突变的潜在风险最小，是一种非整合性和非感染性方法。抗原修饰减少了mRNA的免疫原性并增强了其安全性。（ii）有效性；mRNA疫苗的稳定性和翻译可以被修改，从而通过将mRNA分子制剂到载体分子中，可以实现mRNA在宿主细胞质中的快速吸收和表达。由于其最小的遗传物质，mRNA可以避免抗载体免疫，并且可以重复接种。（iii）生产；mRNA疫苗可以快速大规模生产。 细胞质含有RNases（酶），这些酶迅速降解裸露的mRNA。因此，也开发并使用了一种转染试剂用于mRNA疫苗，它保护疫苗遗传物质免受RNases的侵害，并促进mRNA被细胞吸收。一旦进入宿主体内，当mRNA到达细胞质时，核糖体（细胞翻译机制）开始从mRNA产生蛋白质，翻译后，这些新合成的蛋白质经历翻译后修饰，从而产生完全功能性和正确折叠的蛋白质（图1，使用Biorender创建）。这种mRNA药理机制使其对需要跨膜或细胞质蛋白的疫苗和蛋白质替代疗法有利。必须将这些蛋白质正确地输送到其功能位点。完成工作后，这些mRNA被宿主细胞的正常生理机制降解。 图 1. mRNA疫苗（纳米颗粒）在宿主细胞中的呈现和抗原翻译 通过动物中自我复制的纳米颗粒RNA疫苗的免疫接种，可以引起对各种传染病的强烈免疫反应（T细胞和B细胞）。在体内，mRNA的载体包括含有可离子化的氨基脂质的纳米颗粒，这些被认为是此目的的最佳选择。含脂质mRNA疫苗的最佳解剖部位是皮内途径，因为皮肤中存在大量异质免疫细胞。这种含脂质mRNA纳米颗粒疫苗的特性优于其他形式的疫苗。 2.mRNA疫苗引起的免疫反应 在过去疫苗开发过程中，各种形式（灭活或活减毒）疫苗的作用机制是未知的。然而，通过活减毒疫苗在动物、细胞系或不利生长条件下的开发，以及灭活或灭活疫苗在控制动物（牛瘟、猪瘟和马传染性贫血）和人类（麻疹、腮腺炎、天花、脊髓灰质炎和风疹）的传染病方面取得了成功。分子生物学理论和技术的进步导致了对疫苗机制的广泛了解，例如灭活疫苗产生抗原特异性抗体，而活减毒疫苗引起宿主的体液免疫反应，这对根除细胞内病原体是必要的。RNA基非病毒疫苗的免疫接种刺激了滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的产生（图2，使用Biorender创建）。这些疫苗模仿活微生物的疫苗接种或感染。 图2. mRNA疫苗接种引发的先天和适应性免疫反应。(1) 当mRNA疫苗被接种时，RNA感受器识别疫苗颗粒并激活先天免疫反应，导致干扰素和细胞因子的产生。(2) 这些干扰素和细胞因子促进树突状细胞的成熟，这些细胞迁移到淋巴结以呈现感兴趣的抗原。(3) 在淋巴结中，由树突状细胞启动T细胞和B细胞。树突状细胞激活T细胞。辅助性T细胞促进产生抗体的浆细胞的成熟。辅助性T细胞和细胞因子共同促进B细胞分化为记忆B细胞。(4) 细胞免疫和体液免疫被激活，免疫细胞向感染的组织或细胞移动。(5) 被病毒感染的细胞受到抗原特异性T细胞的攻击。(6) 通过抗体中和病毒。 mRNA疫苗引起的免疫反应机制仍需进一步阐述。mRNA疫苗被细胞受体感知和激活细胞受体的过程尚不清楚。细胞内有两种受体参与识别和诱导免疫反应，即内体性Toll样受体（TLRs）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）。TLRs进一步细分为TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9，它们存在于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中。TLR-3参与识别包括由单链RNA（ssRNA）产生的45个以上碱基对的双链RNA（dsRNA），而富含鸟苷、尿苷或多尿苷的RNA由TLR-7和TLR-8激活。TLR-8只能与ssRNA结合，而TLR-7可以与ssRNA和dsRNA结合，并增强抗原呈递、细胞因子分泌和B细胞免疫反应刺激。内体TLR-9受体参与抗原呈递细胞，并作用于激发宿主的免疫反应。 RIG-I样受体作为模式识别受体，RLR家族的其他成员包括黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和遗传学和生理学实验室2（LGP2）。RIG-1参与识别ssRNA和dsRNA，最终导致干扰素的产生，而MDA5存在于细胞质中，参与识别病毒RNA复制期间产生的长dsRNA。mRNA疫苗刺激了先天免疫。 mRNA疫苗接种激活了先天免疫系统和适应性免疫系统。mRNA疫苗激活宿主适应性免疫反应，增强了细胞因子和干扰素的产生，这些因子参与了免疫防御细胞的招募，即自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统损害了抗原的表达，从而降低了疫苗的有效性。有一份报告指出，当IFN拮抗剂与mRNA疫苗一起使用时，观察到疫苗的相当大的效果。因此，为了避免先天免疫系统（例如mRNA的修饰）的过度反应，必须共同给予拮抗剂，以维持疫苗的有效性。 3.动物传染病的mRNA疫苗开发 疫苗被认为是控制和预防人类和动物传染病最成功的预防性和治疗性工具（见表1和表2）。疫苗可以挽救成千上万的动物和人的生命，并节省资金。由于疫苗接种，麻疹、脊髓灰质炎和小天花等严重传染病已被根除或接近根除，许多其他疾病的发病率和死亡率也大幅降低。 3.1.口蹄疫 口蹄疫是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的有蹄动物的传染性病毒疾病，在发展中国家和不发达国家尤为常见。根据抗原和遗传属性，FMDV有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型。尽管口蹄疫的死亡率很低，但FMD的爆发会导致严重的经济损失，并对活体动物及其产品的国内外贸易产生负面影响。病毒的传播方式是通过气溶胶、直接接触感染动物、通过污染物、人类和其他非敏感动物。无口蹄疫国家通过严格的检疫和限制从口蹄疫流行国家进口敏感动物及其产品来维持这一状态。在控制家畜（牛、水牛、绵羊和山羊）中的FMD方面，最有效的方法是限制感染动物及其产品从其所在地向健康易感动物的流动，屠宰暴露和感染的动物，消毒受污染的地方和设备，以及接种疫苗。 表1：针对传染病的mRNA疫苗 表2：mRNA疫苗对动物和人类传染病的免疫反应 目前用于控制和预防FMD的传统疫苗通过激活先天免疫反应和适应性免疫反应来诱导保护。这些疫苗不提供长期保护，需要多次加强剂量来维持群体中足够的免疫水平。这些传统疫苗也有一些缺点，如基因毒性潜力、较低的细胞免疫、较短的保护期限，以及在接种和感染动物之间难以进行血清学区分。为了克服所有这些问题并在过去十年中开发更安全的下一代FMD疫苗，进行了许多尝试。2010年，进行了一项研究，阐述了在小鼠中由mRNA FMDV（基因工程）诱导的免疫，并证明它可以在实验室动物中引起强烈的免疫反应。这为开发基于mRNA的疫苗提供了可能性，以实现对动物自然感染的长期保护。口蹄疫病毒对干扰素（IFN）敏感。因此，Rodriguez-Pulido及其同事进行了一项研究，表明FMDV的dsRNA可以在IBRS-2（猪肾细胞系）和新生小鼠中引起免疫反应，并且体外转录RNA对预防FMD的有效性。结果表明，3'非编码区的dsRNA在SK-6细胞系中诱导了强大的IFN alpha/beta激活。进一步，这种dsRNA在新生小鼠体内也证实了自然免疫反应的诱导。这认识到dsRNA具有开发针对动物FMDV疫苗的潜力。同一组研究了对应于内部核糖体进入位点的非感染性RNA作为FMD疫苗设计的佐剂的潜力，当它与常规疫苗一起增强了小鼠对FMDV挑战的免疫反应时。此外，Rodriguez-Pulido及其同事分析了合成非感染性RNA在猪中的免疫调节效应。这项研究证明了这些RNA分子与常规疫苗共同给予可以增强针对FMDV的特异性抗体滴度。此外，FDMV能够与宿主细胞发生突变和重组。病毒与宿主细胞的重组可能比单独的非活性病毒引起更强的免疫反应。宿主细胞中存在的酶（RNAses）在它们进入细胞后如果不适当修饰和/或通过封装（加帽）保护，会迅速降解裸露的RNA。同样，在反向遗传过程中，体外合成的RNA也会被酶降解。Semkum及其同事建立了一个DNA载体pKLS3（FMDV的小型基因组），它最小化了RNAses对合成mRNA的降解。它可以用来驱动FMDV感兴趣的基因的转录，因为它包含转录和翻译病毒所需的最小顺式作用组分。用于生产疫苗的mRNA是在体外转录的，编码特定的抗原。pKLS3有潜力用作转录系统，用于表达mRNA，可能在生产基于mRNA的疫苗中有用。对于FMD疫苗（基于mRNA）的开发，现有信息提供了一个有希望的途径。 3.2.狂犬病 狂犬病是由狂犬病病毒引起的病毒性疾病，可以感染所有温血动物，包括人类。它是一种人畜共患病，每年大约有60,000人因狂犬病病毒感染而死亡。超过95%的狂犬病病例是由狂犬动物的咬伤引起的，特别是狂犬狗的咬伤。这是一种严重的病毒性疾病，以急性脑炎为特征，通过狂犬动物的咬伤或通过与狂犬动物的唾液接触粘膜从狂犬动物传播给人类和其他易感动物。病毒通过表面糖蛋白（狂犬病病毒糖蛋白）附着在其细胞受体上，并沿着周围神经传播到大脑。为了预防狂犬病，早期疫苗是在哺乳动物的神经组织中生产的，但后来被胚胎蛋和组织培养中开发的疫苗所取代。全世界都需要一种负担得起且有效的狂犬病疫苗，因为目前可用的疫苗由于某些限制（如生产能力、储存要求、成本和接种时间表）无法满足需求。以前为了开发狂犬病疫苗，使用了多种不同的病毒疫苗生产方法。CureVac®应用的新概念是使用mRNA编码主要的狂犬病病毒抗原狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）。在研究mRNA疫苗对狂犬病的免疫反应的第一阶段临床试验中，选择了疫苗候选物（CV7201）。CV7201证明可以诱导保护性免疫反应，这受到疫苗剂量和接种途径的影响。阳离子蛋白鱼精蛋白被用作CV7201中编码狂犬病病毒糖蛋白抗原的热稳定mRNA的稳定剂。与传统的商业灭活狂犬病病毒疫苗相比，mRNA疫苗诱导了更好的免疫反应，通过促进合成病毒中和抗体，这些抗体对保护是必要的。在第一阶段试验中，发现需要高剂量的狂犬病mRNA疫苗才能提供显著的抗体滴度以保护。为了降低狂犬病疫苗（CV7201）的剂量率，采用了一种新方法，即使用脂质纳米颗粒（LNPs）包裹mRNA抗原。这项临床试验表明，mRNA疫苗是安全的，其反应原性概况可能是可以接受的，这种技术形式比传统疫苗提供了许多优势。同样，在接种编码RABV-G的mRNA的家猪和老鼠中确认了中和抗体的产生。RABV-G mRNA疫苗诱导了CD4+和CD8+的产生，并提供了对脑内致死性感染挑战的保护。这项研究表明，编码RABV-G的基于mRNA的疫苗在小型和大型动物中是可行的，并且可能是控制动物病原体疾病的有希望的方法。 3.3.利什曼病 利什曼病是由雌性白蛉沙蝇叮咬传播的一种寄生虫性人畜共患病。引起该病的病原体是利什曼属（L.）的原生动物寄生虫。该病有不同形式，最常见的包括由不同种类引起的内脏利什曼病、皮肤利什曼病和粘膜皮肤利什曼病，如L. donovani、L. chagasi、L. infantum、L. braziziliensis、L. maxicana和/或L. archibaldi。狗是宿主，而人类是偶然宿主。第一代和第二代疫苗都是为了预防人类疾病而开发的，但缺乏完全保护。为了更好地提供保护，正在考虑基于mRNA的疫苗。Savar等人设计了两种组合的融合蛋白（LmSTI1-PpSP15和PpSP15-LmSTI1）用于疫苗开发。融合蛋白包括L. major的应激诱导蛋白1（LmSTI1）和来自白蛉沙蝇（PpSP15）的SP15。这种组合还基于alphavirus-derived self-amplifying mRNA以病毒复制子粒子的形式在in silico研究中设计。in silico分析显示了抗原组合的有效性。后来使用基于自复制mRNA（SAM）的疫苗在细胞系Baby Hamster Kidney成纤维细胞（BHK-21细胞）中表达了融合蛋白。结果表明，使用SAM载体的PpSP15-LmSTI1表达水平很高。同样，研究了其他融合重组抗原（LEISH-F2和LEISHF3+）对L. donovani的影响，采用异源主要增强方案进行免疫。C57BL/6和TLR7−/−小鼠接种了表达LEISH-F2抗原的RNA基疫苗，随后接种了亚单位疫苗。结果表明，单独使用RNA基疫苗的免疫（同源免疫）没有提供显著的保护。然而，当小鼠使用异源方案的增强剂免疫时，产生了强大的抗原特异性T细胞反应（CD4和CD8），并对细胞内寄生虫提供了显著的保护。需要进一步研究以识别新抗原并开发有效的针对利什曼病的基于mRNA的疫苗。 3.4.弓形虫病 弓形虫是一种专性细胞内原生动物，负责所有温血动物的弓形虫病。它的复杂生命周期包括在确定宿主（猫科动物）中的性繁殖和在中间宿主（猫和其他温血动物）中的无性繁殖。全球大约有一半的人类被弓形虫感染，但这种感染的流行率在不同国家之间变化，从10%到80%不等。人类可以通过食用未煮熟的肉类中的组织囊肿或污染食物中的卵囊偶然获得这种感染。主要为了保护免受弓形虫感染，免疫依赖于由CD4+和CD8+介导的细胞免疫反应，并最终刺激细胞因子（伽马干扰素）的分泌。除此之外，体液免疫也在限制弓形虫病方面发挥重要作用，通过抗弓形虫抗体抵抗寄生虫的入侵，通过调理作用促进寄生虫的吞噬作用，并最终激活经典补体途径。Chahal等人最近开发了一种完全合成的树突状纳米颗粒疫苗，其中包含封装的mRNA复制子编码抗原，这些抗原能够引发免疫反应并提供对弓形虫感染的保护。这种mRNA复制子同时编码六种抗原，如密集颗粒蛋白6（GRA6）、棘蛋白18（ROP18）、棘蛋白2A（ROP2A）、表面抗原1（SAG1）、顶端膜抗原1（AMA1）和表面抗原2A（SAG2A）。这是一种完全保护性的单剂量mRNA疫苗（mRNA复制子纳米颗粒），用于预防和控制弓形虫。尽管如此，它可能需要时间才能商业化。Luo等人分析了小鼠中针对弓形虫挑战的自复制RNA疫苗的活性，该疫苗编码核苷酸三磷酸水解酶-II（NTPase-II）。进一步，他们评估了疫苗与脂质纳米颗粒的联合效应。小鼠的免疫接种结果产生了强大的免疫反应。细胞和体液免疫反应都被激发，产生了高特异性抗弓形虫抗体和IFN-γ。与对照组相比，接种疫苗的小鼠大脑囊肿减少了62.1%，并显著延长了动物的存活时间。现有信息为生产预防弓形虫病的mRNA疫苗提供了一个有希望的途径。 3.5.寨卡病毒病 寨卡病毒最初是在1947年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴的血液中分离出来的。该病毒通过蚊子（埃及伊蚊）的叮咬传播。它具有人畜共患的重要性，是神经和胎儿异常（如脑钙化、小头症、听力和视力丧失）的罪魁祸首。最初，它与轻微的发热症状相关。然而，它传播到美洲和太平洋岛屿，导致严重的后果，如吉兰-巴雷综合征、先天性寨卡综合征和自然流产。最近，它已成为一种流行病，因此，需要开发一种有效且安全的疫苗。已表明有多种类型的疫苗可以保护非人灵长类动物和小鼠，如灭活疫苗、亚单位疫苗和/或基于腺病毒的疫苗。然而，开发一种针对寨卡病毒的有效且安全疫苗仍然是必要的。Essink及其同事评估了两种先前开发的基于mRNA的疫苗mRNA-1325和mRNA-1893在人类中的安全性和免疫原性。mRNA-1325脂质纳米颗粒包裹是第一代疫苗，编码来自2007年密克罗尼西亚寨卡病毒分离株的前膜（prM）和包膜E结构蛋白，即prME。而mRNA-1893是第二代疫苗，编码来自寨卡病毒（RIO-U1）分离株的相同蛋白prME。RIO-U1寨卡病毒是从巴西感染寨卡病毒的孕妇尿液中分离出来的。mRNA-1325和mRNA-1893疫苗的prME中分别有一个和五个氨基酸残基的差异。在小鼠的临床前研究中，编码prME的修饰mRNA疫苗显示出有希望的结果，并保护小鼠免受寨卡病毒挑战。在成年人类的第一阶段临床试验中，研究了两种mRNA疫苗的不同剂量反应。两种疫苗都被所有健康志愿者很好地耐受，并且没有向疫苗传达严重的不良反应。由于只有一个氨基酸残基，mRNA-1325的寨卡病毒特异性中和抗体（nAb）反应较差。另一方面，由于五个氨基酸残基，mRNA-1893疫苗以较小的剂量引起了强大的nAb反应，与mRNA-1325相比。所获得的结果是有希望的，Essink及其同事向第二阶段临床试验迈进。然而，为了检查疫苗的有效性，将需要第三阶段的临床试验。 3.6.冠状病毒病 许多动物种类，包括人类，都可能被冠状病毒感染。对兽医重要的冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎病毒。目前，冠状病毒被认为是一种新兴病原体，负责动物和人类的急性和慢性感染，包括肠道、呼吸和中枢神经系统。2003年，由于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）在人类中爆发，震惊了世界。2012年至2016年，在阿拉伯半岛，由于名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的冠状病毒，人类中报告了几次爆发。该病毒在中东和非洲的骆驼中流行。近年来，全球大流行感染了呼吸系统的冠状病毒病2019（COVID-19），由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的传染性病原体引起，它起源于蝙蝠。世界卫生组织宣布COVID-19是重大的公共卫生紧急情况。对于鸡来说，为了预防由传染性支气管炎病毒引起的传染性支气管炎病，有许可的疫苗可用。然而，对于预防其他动物的冠状病毒病，开发一种安全有效的疫苗是一个未满足的需求。对于COVID-19疫苗的开发，采用了几种方法，如灭活病毒、活减毒、重组蛋白、腺病毒载体、流感病毒载体、DNA和mRNA疫苗。mRNA疫苗方法是COVID-19预防的一场变革。一种编码刺突蛋白的自复制mRNA疫苗在小鼠中提供了针对SARS-CoV-2的保护。编码刺突蛋白三聚体受体结合域的RNA疫苗针对几种SARS-CoV-2变体在恒河猴和小鼠中显示出显著的保护。BioNTech和辉瑞合作开发了一种基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗。BNT162b2编码病毒刺突糖蛋白的全长。这是美国FDA批准的疫苗，在16岁及以上的人中两剂间隔21天的效力为95%，在随后的六个月，其效力变为91.3%。Moderna还开发了一种基于mRNA的疫苗（mRNA-1273），编码病毒融合刺突蛋白的全长。在18岁及以上的个体中，两剂间隔28天的第三阶段临床试验的效力为94.1%。 4.mRNA疫苗的类型 中心法则表明，mRNA在翻译（DNA编码蛋白）和由细胞质中的核糖体合成蛋白之间处于中心位置。目前，有两种主要类型的mRNA用于mRNA疫苗的开发，即自复制mRNA或复制体mRNA疫苗和非复制mRNA或非复制mRNA。在自复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA编码抗原以及病毒RNA的复制机制保持不变，这使得mRNA可以在细胞内自我复制，从而实现丰富的蛋白表达。而在非复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA仅编码感兴趣的基因，其中包含5'和3'的非翻译区。 4.1.自复制mRNA疫苗 在自复制mRNA疫苗中，感兴趣的抗原取代了阿尔法病毒基因组的结构蛋白，但RNA的复制机制保持不变。通过使用自复制mRNA，可以通过最小剂量的抗原编码RNA翻译，向宿主细胞传递大量的抗原。当自复制mRNA进入细胞质时，它与宿主核糖体结合产生非结构蛋白1（nsP1）、nsP2、nsP3和nsP4。它们是依赖核糖核苷酸的RNA聚合酶的组成部分。病毒蛋白酶（nsP2）进一步将这些蛋白质调节成单个蛋白质。这些蛋白质发挥许多重要作用，例如nsP1在建立RNA复制复合体和质膜复制复合体之间的联系方面的作用，nsP2作为蛋白酶和解旋酶，nsP3介导宿主-病毒与蛋白质的相互作用，nsP4是一种依赖RNA的RNA聚合酶。在编码区域基因组中，生成病毒RNA，表达病毒蛋白，并包装病毒基因组。自复制mRNA疫苗具有许多优点，包括由于能够自我复制而具有高表达水平，缺乏结构病毒蛋白基因，以及能够持续长达两个月。除了它们更大的尺寸和无法耐受各种合成修饰之外，还有一些缺点。 4.2.非复制mRNA疫苗 非复制mRNA疫苗包含编码感兴趣的蛋白，而不是像自复制mRNA疫苗那样需要mRNA复制的蛋白。非复制mRNA的基本结构与天然mRNA相同，包括5'帽子、聚(A)尾部、5'不饱和区、3'不饱和区，以及编码感兴趣基因的区域。5'和3'不饱和区元素在mRNA分子的稳定性和复制中起着至关重要的调节作用。5'是mRNA稳定性的重要元素，促进蛋白合成。聚(A)尾部具有保护功能，防止mRNA分子被RNases外切核糖酸酶降解。非复制mRNA疫苗的优点包括相对较小的尺寸（大约2-3 kb），与自复制mRNA疫苗（10 kb）相比，只携带所需的感兴趣基因，防止了任何其他可能导致宿主内不需要的免疫反应的蛋白表达，并且其构建容易。而缺点包括不稳定、半衰期短和表达水平低。 5.mRNA疫苗的配方和传递 mRNA疫苗的配方和传递系统决定了宿主细胞内抗原的表达效果和持续时间，以及它们引起的免疫反应的效力。mRNA分子的物理化学性质，如负电荷和大尺寸，使它们（裸露的mRNA）难以穿过细胞的质膜。模式识别受体可以轻易识别外源mRNA，并通过干扰素导致裸露mRNA的降解。因此，为了增强mRNA的细胞摄取和它们对核酸酶降解的抵抗力，需要一个传递载体。用于mRNA管理的传递载体包括树突细胞（体外）、电穿孔和基因枪（物理传递）、基于聚合物的传递和基于纳米颗粒的传递工具（LNPs）。LNPs是其中最有效和广泛使用的传递载体。 在体外，转录系统可以用来生产合成mRNA。这个转录系统由编码mRNA的DNA模板、噬菌体RNA聚合酶、RNA和合成帽子类似物组成。在某些情况下，也可以使用来自癌细胞的完整RNA用于疫苗。体外提取的mRNA或从肿瘤细胞获得的mRNA可以裸露或与载体一起管理。mRNA疫苗携带编码抗原的转录物进入宿主细胞，在那里使用宿主的翻译机制来产生抗原，然后刺激宿主的免疫系统。mRNA的细胞内稳定性和翻译效率很大程度上受其结构的影响。合成mRNA的设计基于真核RNA蓝图，在5'端有一个帽子，在3'端有一个聚A尾部。通过添加3'和5'非翻译区，可以进一步增强其稳定性和效力。这些非翻译区包含调节元素。 当mRNA疫苗被配制在脂质纳米颗粒中时，可以增强免疫反应，这也保护了mRNA免受细胞质RNases的侵害。由于其某些好处，如易于准备、毒性较小，以及能够被宿主细胞机制降解，脂质纳米颗粒长期以来被用作药物载体。脂质纳米颗粒有四个组成部分，如阳离子脂质（可离子化）、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇。由于RNA是带负电荷的分子，它与带正电荷的阳离子脂质颗粒形成复合物。脂质颗粒的可离子化特性使复合物无毒，并在宿主生理pH下保持中性或轻微带正电荷的表面。这种特性还通过最小化非特异性细胞表面脂质和蛋白质之间的相互作用，促进mRNA释放到细胞质中。还有许多其他mRNA传递系统，如精蛋白、脂质复合物、多聚体纳米颗粒、胶束复合物纳米颗粒、脂多聚体，以及阳离子纳米乳液。 6.未来展望 在人类中接种mRNA疫苗所取得的成功结果为mRNA基础疫苗在兽医医学中的发展打开了大门。目前，只有少数mRNA疫苗在动物中针对其自然宿主的特定传染病进行了研究。全球寄生虫和病毒感染对动物健康和工业家畜生产构成重大威胁。全球最严重的病毒感染缺乏适当的预防策略，包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、疙瘩皮肤病病毒（LSDV）、牛白血病病毒（BLV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）等。传统疫苗对上述许多疾病安全有效，但仍需要研究以更好地预防疾病。对于传染病疫苗的开发，mRNA有潜力解决疫苗学中出现的许多挑战。在未来，疫苗不仅用于预防措施，还用于预防、控制和治疗动物和人类的癌症和肿瘤。 非洲猪瘟病毒是导致猪的高死亡率和出血的原因。中国是最大的猪肉生产国，由于缺乏有效的策略，这种疾病传播到许多其他国家，导致2019年约有七百万头猪死亡。目前，使用活减毒疫苗进行控制。活减毒疫苗的开发需要猪骨髓细胞或肺泡巨噬细胞，这既耗时又成本高昂。作为这种方法的替代方案，最近通过iVAX（计算疫苗设计平台）识别了非洲猪瘟病毒编码蛋白中的T细胞表位。在细胞免疫反应中，T细胞执行重要功能，参与在识别病毒的T细胞表位后直接杀死病毒感染的细胞。因此，为了充分利用T细胞表位的潜力，需要进一步调查以促进mRNA疫苗（针对T细胞）的开发。 猪繁殖与呼吸综合征病毒是导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病的原因，影响猪农经济。PRRSV有两种抗原上不同的基因型。目前，使用活减毒或灭活疫苗预防性地控制疾病，但这些疫苗仅对同源菌株提供保护，对异源菌株的效力为零或部分。2019年，显示具有PRRSV GP5-Mosaic（糖蛋白5）序列的DNA疫苗候选物是免疫原性的，并对猪的病毒感染提供保护。借助in silico算法，可以组装不同PRRSV菌株的片段，这些片段诱导免疫反应，使用mRNA疫苗平台制作单一疫苗。这样的疫苗可以为两种类型的菌株提供广泛和有效的免疫，无论是同源还是异源菌株。 冠状病毒引起许多新兴大流行疾病，如严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒病，感染了牛、水牛、猫、狗和猪等各种动物。抗体通过与冠状病毒的刺突(S)糖蛋白结合来中和病毒，该蛋白由S1和S2亚基组成。受体结合域(RBD)位于S1亚基中，参与特异性受体结合，而S2亚基参与宿主和病毒细胞膜的融合。随着对动物冠状病毒(猪急性腹泻综合征冠状病毒、牛冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒)的细胞表面受体和新型受体结合域的研究进展，基于RBD的mRNA疫苗似乎是限制动物冠状病毒疾病出现和再现的有效策略。 在兽医领域经济上重要的 Pestiviruses，如牛病毒性腹泻病毒、经典猪瘟病毒和边缘病病毒。Pestiviruses 编码的三种糖蛋白包括 E1、E2 和 Erns(E 核糖核酸酶)。E2 是中和抗体的主要靶标。用作疫苗的 E2 亚基激活了体液免疫反应和细胞介导的免疫反应，因此基于 E2 的 mRNA 疫苗可以提供有效的保护。需要进一步评估 mRNA 疫苗，以评估在自然动物宿主中疫苗管理后发生的过敏反应。用于动物的疫苗必须是经济实惠且易于获得的，以便兽医可以访问它们。在未来，mRNA 疫苗在动物中的使用似乎是一种非常有效的方法，用于控制各种病原体疾病，由于上述讨论的许多优点。 7.结论 目前，科学家们对基于RNA的方法在疫苗开发中的兴趣日益增加，这些疫苗可用于预防和控制疾病。mRNA疫苗在用于临床前和临床试验的动物模型中激发了安全且持久的免疫反应。它在兽医领域对动物传染病有很强的潜力，并且比其他形式的疫苗具有某些优势，如感染风险消失、无逆转为毒力的风险，并且可以在一种疫苗中组装多种抗原，同时对多种病原体进行免疫，易于准备且处理和储存非常方便。mRNA疫苗为预防传染病提供了显著的保护性免疫来源，这一点已经通过COVID-19疫苗的成功应用得到证实。这一成功为预防一系列传统疫苗方法具有挑战性的传染病开辟了新的可能性。由于疫苗的快速发展，它可能是应对新兴传染病的一个有希望的平台。然而，要充分利用mRNA疫苗在未来的潜力，必须解决某些挑战，如配方、疫苗犹豫和广泛获取。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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关注并星标CPHI制药在线内皮素（ET）是一类由21个氨基酸组成的内源性多肽激素，具有强烈而持久的缩血管效应。此外，ET还参与心血管细胞的凋亡、分化和表型转化等多种病理过程，是心血管活动的重要调节因子之一。       ET包括ET-1、 ET-2和ET-3三种亚型，其中ET-1主要由血管内皮细胞合成，ET-2由肠道和肾脏产生，ET-3由神经组织释放。ET-2和ET-3与ET-1在N末端的2个和5个残基上存在差异，这决定它们在受体结合和亲和力上的差异。       ET通过作用于内皮素受体（ETR）调节人体多种重要的生理和病理过程。ETR属于典型的A类G蛋白偶联受体，包括ETA和ETB两种类型，其中ETA受体与ET-1和ET-2的结合亲、和力高于与ET-3，ETB受体与这三种异肽的结合亲和力相当。在被ET-1激活后，ETA受体和ETB受体呈现相反的血管调节作用：ETA受体激活导致长时间的血管收缩效应，而ETB受体则介导血管扩张。       内皮素系统在维持血管稳态中发挥着重要作用，与多种器官系统的血管疾病密切相关，是治疗心血管系统疾病的重要靶标之一。ETR作为内皮素系统的关键组成部分，因此成为药企积极布局的热门靶点。全球已获批的ETR靶向药       据不完全统计，目前全球监管机构已批准7款ETR靶向药，这些药物主要针对ETA受体，被批准用于治疗肺动脉高压。辉瑞的ETA受体拮抗剂西他生坦（sitaxentan，Thelin）也曾获监管机构批准，但因可能引起不能预测的严重肝损伤撤市。值得一提的是，近几年获批的ETR靶向药适应症与此前获批的不同，除了心脑血管疾病，还涉及肾病。       具体品种来看，克拉佐生坦是Idorsia公司开发的一种强效、选择性 ETA 受体拮抗剂，2022年1月在日本被批准用于预防脑血管痉挛、血管痉挛相关的脑梗死以及动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aSAH）术后脑缺血症状。       阿普昔腾坦是一款新型口服双重ETA/ETB拮抗剂，可有效抑制ET-1与ETA和ETB的结合，从而阻断ET-1的作用。该药是马昔腾坦的活性代谢产物，具有更长的半衰期（48 h vs. 14 h），可以1天1次使用，降低血压，是第一个用于高血压治疗的ET受体拮抗剂。2024年3月，该药被FDA批准用于治疗难治性高血压，成为30多年来高血压领域获批的全新机制药物。       Sparsentan是一种每日一次的口服小分子药物，选择性靶向ETA受体和血管紧张素II 1型受体（AT1R）。2023年2月，FDA加速批准Sparsentan用于降低有快速疾病进展风险的原发性IgAN成人的蛋白尿，通常尿蛋白/肌酐比(UPCR) ≥1.5g/g。这使Sparsentan成为首个获批治疗IgAN的非免疫抑制疗法。       不过Sparsentan上市后遭遇多重质疑，首先是收到了FDA肝毒性和胚胎/胎儿毒性的黑框警告，其次在跟厄贝沙坦（血管舒张素Ⅱ受体阻滞剂）的"头对头"较量中错过了III期研究的次要终点。       Sovateltide是一种高选择性ETB受体激动剂，可增加血流量，显示抗凋亡活性，保护神经线粒体，促进神经血管重塑。2023年5月，该药在日本被批准用于治疗高血压急性脑缺血性中风。ETR靶向药研究进展       此外，目前全球还有多款在研ETR靶向药，详见下表。在研ETR靶向药大多作用于ETA受体。在研ETB受体靶向药整体进展较ETA受体靶向药慢，且适应症涉及肿瘤。而且，在研ETR靶向药的药物类型也比较多样，除了小分子化药，还包括单抗、抗体偶联药物（ADC）。       Atrasentan进展较快，处于3期临床。该药是Chinook开发的ETA受体拮抗剂，可选择性阻断ETA受体，通过阻断肾小球系膜细胞活化，直接的抗炎和抗纤维化，降低球囊内压力和肾小球滤过屏障大分子通透性来减少免疫球蛋白A肾病(IgAN) 患者的尿蛋白。2023年6月，诺华通过收购Chinook将Atrasentan纳入囊中。2023年10月，atrasentan治疗高危进展型IgA肾病的关键3期临床试验ALIGN取得积极中期结果：研究达到主要疗效终点，IgAN患者中的蛋白尿具有统计学意义的显著减少。研究中Atrasentan的整体安全性及耐受性良好。       我国药企在ETR靶点也有布局。智康弘义的SC0062是针对慢性肾脏病的ETA受体小分子拮抗剂，其针对慢性肾脏病进行了全新的分子设计，具有独特的ETA高选择性，目标在保证疗效的同时进一步提升药物安全性。目前，SC0062正在开展针对IgA肾病和糖尿病肾脏病的2期临床研究。       临床前研究表明，SC0062具有良好的活性，能够有效改善急性肾损伤和慢性肾脏病模型的病理评分。在已完成的临床I期研究中，SC0062表现出良好的安全性和耐受性及药代动力学特征，同时未发现水钠潴留等副作用，有望成为潜在的Best-in-Class药物。       信立泰的SAL0120是其自主研发的小分子ETA受体拮抗剂，通过选择性拮抗ETA受体，在现有用药基础上达到进一步降低血压的目的，拟开发适应症包括轻、中度原发性高血压。       鸿运华宁开发了两款ETR靶向药。其中GMA131是其自主研发的一款ETA靶向单抗。临床前及临床研究显示：GMA131具有良好的安全性，且在高脂饲料联合STZ诱导的糖尿病肾病模型中表现出了优于小分子内皮素受体拮抗剂（ERA）的疗效。2022年11月，GMA131在美国获批临床，用于治疗糖尿病肾病。       ETB靶向药较少，其中DEDN6526A是一款ADC类候选药物，由人源化 IgG1 抗 ETB单克隆抗体MEDN6000A和一种强效抗有丝分裂剂(MMAE)通过蛋白酶抑制连接体马来酰亚胺基缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基 (MC-VC-PAB) 连接而成。MEDN6000A 在与其配体结合位点不同的表位上对 ETB 具有选择性和高结合亲和力。总结       整体来看，ETR是个多面手，其靶向药除被批准治疗肺动脉高压、高血压等疾病，还被批准用于治疗原发性免疫球蛋白A肾病。虽然全球监管机构已批准了７款ETR靶向药，但国内外药企还在积极挖掘ETR靶向药市场，在研ETR靶向药大多作用于ETA受体，适应症也在不断扩张。尤其是ETB受体靶向药，被开发用于治疗恶性肿瘤。期待在药企的不懈努力下，ETR靶向药可以可以开启更多的可能。【企业推荐】来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~