PI3Kα x HDACs

10 月 29 日晚间，君实生物发布 2024 年第三季度报告。Q3 期间，公司营业收入 4.85 亿元，同比增长 53.16%；前三季度总营收 12.71 亿元，同比增长 28.87%。 君实营业收入增长主要来自商业化药品销售收入的增长。其中，核心产品 PD-1 抑制剂拓益（特瑞普利单抗，JS001）第三季度国内销售收入约 3.97 亿元，同比增长约 79%。加上上半年的收入，拓益今年前三季度的国内销售额已达约 10.68 亿元，同比增长约 60%。 截图来源：君实公告  报告期内，特瑞普利单抗取得了一些重要的里程碑进展，包括： 两项新适应症上市申请获得中国国家药监局（NMPA）受理，分别为联合贝伐珠单抗用于不可切除或转移性肝细胞癌患者的一线治疗，以及特瑞普利单抗用于不可切除或转移性黑色素瘤的一线治疗。 获得欧盟委员会（EC）批准用于治疗两项适应症：特瑞普利单抗联合顺铂和吉西他滨用于复发、不能手术或放疗的，或转移性鼻咽癌成人患者的一线治疗，以及特瑞普利单抗联合顺铂和紫杉醇用于不可切除的晚期/复发或转移性食管鳞癌成人患者的一线治疗。 截至目前，特瑞普利单抗的 10 项适应症已于中国内地获批，并已在中国香港、美国、欧盟、印度等国家和地区获得批准上市。 报告期内其他管线进展还包括： 昂戈瑞西单抗注射液（重组人源化抗 PCSK9 单克隆抗体注射液，商品名：君适达）获得 NMPA 批准上市，用于治疗原发性高胆固醇血症（非家族性）和混合型血脂异常成人患者； 靶向组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂 WJ47156 片（JS125）的临床试验申请获得 NMPA 批准。 君实在公告中表示，未来将加快推进抗肿瘤抗 BTLA 单抗 Tifcemalimab（TAB004/JS004）、抗 IL-17A 单抗（JS005）等后期阶段管线的研发和上市申请等工作，并持续探索包括 Claudin18.2 ADC 药物（JS107）、PI3K-α 口服小分子抑制剂（JS105）、CD20/CD3 双特异性抗体（JS203）、PD-1/VEGF 双特异性抗体（JS207）、抗 DKK1 单克隆抗体（JS015）等产品在内的早期阶段管线，尽快推动更多优势产品和适应症进入注册临床试验阶段。 封面来源：企业 Logo 免责声明：本文仅作信息分享，不代表 Insight 立场和观点，也不作治疗方案推荐和介绍。如有需求，请咨询和联系正规医疗机构。 编辑：馨药 PR 稿对接：微信 insightxb 投稿：微信 insightxb；邮箱 insight@dxy.cn 多样化功能、可溯源数据…… Insight 数据库网页版等你体验 点击阅读原文，立刻解锁！

摘要：来自成人干细胞（ASCs）和多能干细胞（PSCs）的类器官是研究癌症和开发治疗方法的重要临床前模型。在这里，我们回顾了来自原始组织的和PSC衍生的癌症类器官模型，并详细说明了它们如何在不同的器官环境中有潜力为个性化医疗方法提供信息，并有助于理解早期癌变步骤、癌症基因组和生物学。我们还比较了基于ASC和基于PSC的癌症类器官系统之间的差异，讨论了它们的局限性，并强调了最近对类器官培养方法的改进，这些改进使它们成为人类肿瘤的更好代表。 1.引言 全球癌症负担每年导致近1000万人死亡，并且预计这一数字还会增加。遗憾的是，有效的癌症治疗数量未能跟上这一趋势。其中的一个原因是缺乏能够准确模拟人类肿瘤、它们多样化的形态、分子特征和微环境的体外临床前模型。数十年来，由于相对容易使用、可扩展性和低成本，2D细胞培养已成为研究癌细胞生物学和药物发现的基石。它们使我们能够在分子机制上取得开创性的工作，这些机制是肿瘤发生的，帮助确定生物标志物和药物靶点以指导患者的治疗。然而，它们的功能有限，只代表一小部分癌症——其中只有少数来自早期或癌前阶段。2D培养通常不需要与原代细胞培养相同的生存利基因子，这意味着它们已经由于基因组中的异常和畸变以及表观遗传学上的修饰而失去了对利基的内在依赖。此外，2D癌细胞系，由于长期在体外传代，会发生快速的基因漂移，导致药物反应的显著差异。此外，匹配的正常细胞系并不总是存在，使得对癌症早期阶段的研究大多依赖于基因工程小鼠。在某些情况下，基因工程小鼠和患者衍生的异种移植（PDX）模型弥补了2D细胞系的不足，但高昂的成本、技术难度和缺乏可扩展性仍然是它们的限制。 最近，3D类器官培养的出现为癌症研究提供了一种替代方法，可以弥合体外2D细胞系和体内小鼠模型之间的差距。类器官可以从两种类型的干细胞中建立：成人干细胞（ASCs）来自成人组织，具有组织特异性，或者多能干细胞（PSCs）可以是诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞。在这篇综述中，我们特别关注这些类器官模型在癌症研究中的使用，描述并比较代表肿瘤形成不同阶段的各种基于类器官的癌症模型，并讨论它们对癌症研究的贡献以及它们的局限性。 2.类器官类型 ASC和PSC类器官的衍生协议基本上不同。ASC类器官由培养基中的生长因子混合物支持，这些生长因子模仿正常干细胞稳态期间存在的因素。PSC类器官建立涉及通过逐步添加生长因子的方式进行分化，这种方式模仿胚胎发育期间的细胞信号。产生的癌症模型也具有不同的优缺点（表1），在选择适当的研究模型时应考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官是互补的方法，它们共同提供了研究几乎所有人类癌症整个肿瘤进展过程的机会（图1）。 图 1. 用于癌症模型的类器官 由成人干细胞（ASC）和多能干细胞（PSC）衍生的各种类型的癌症类器官模型及其应用。CTC，循环肿瘤细胞；CAF，与癌症相关的成纤维细胞。 3.ASC衍生的类器官和生物银行 2009年，一项开创性研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASCs中建立3D肠道类器官。细胞在Matrigel中生长，并在长期培养中维持，补充干细胞利基调节因子（noggin、R-spondin1和表皮生长因子[EGF]）。从本质上讲，这个系统旨在模拟肠道干细胞（ISCs）通常所在的利基的各个方面。在体内，肠道上皮组织被组织成数百万的隐窝绒毛结构，其中ISCs位于隐窝的基部。Wnt信号和R-spondin1作为Wnt激动剂，在支持隐窝增殖方面的重要性已经得到了很好的确立。此外，EGF通过激活Ras信号通路增强隐窝增殖。noggin抑制绒毛中的骨形态发生蛋白（BMP）信号，导致形成许多异位隐窝单元。引人注目的是，为了在培养中复制这一点，只需要添加R-spondin1、EGF和noggin就可以成功形成类器官。后续研究表明，位于Lgr5+干细胞之间的Paneth细胞提供了Wnt来源。Matrigel提供了形成3D类器官的基质成分，因为它类似于富含层粘连蛋白的肠道隐窝基部。这些类器官展示了肠道隐窝绒毛结构，包含所有肠道细胞类型，重现了来源组织的生理肠道结构。 同时，另一组开发了一种替代方法来培养肠道类器官：空气-液体界面（ALI）模型，涉及在部分空气暴露的胶原蛋白基质中培养包含上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。自这两项突破性研究以来，已经成功地适应了从一系列正常组织及其相应的癌症中培养人类ASC衍生的类器官。对协议的改进提高了类器官形成的效率，使得从小活检、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞（CTCs）中建立肿瘤类器官成为可能。结果，成为可能建立大型的人类肿瘤类器官活体生物银行（图2A，在表2中详细总结）。近年来，类器官生物银行的数量激增，作为基础研究和临床设置中宝贵的资源。类器官模型也已通过各种途径商业化，如人类癌症模型倡议、美国典型培养物收集或MilliporeSigma。这些生物银行涵盖了广泛的肿瘤模型，重现了患者肿瘤的形态和分子异质性。相比之下，许多分子亚型没有代表性2D癌细胞系。 图 2. 现有的人类癌症和癌前类器官模型 (A 和 B) 文献中描述的(A) 癌症和(B) 癌前ASC衍生类器官的类型。ALC，酒精性肝硬化；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；PSC，原发性硬化性胆管炎；PanIN，胰腺上皮内瘤变；UC，溃疡性结肠炎；TSA，传统锯齿状腺瘤；SSA，静止性锯齿状腺瘤；HP，增生性息肉。 此外，已建立了来自这些器官的癌前病变，如肠道增生性息肉、静止性锯齿状腺瘤（SSAs）/息肉、管状绒毛腺瘤、常规管状腺瘤癌前子宫内膜异位症、子宫内膜增生17 宫颈鳞状上皮化生胃肠上皮化生胃萎缩 Barrett上皮胰腺上皮内瘤变（PanIN）和一系列癌前肝病（图2B）。从携带杂合性胚系癌症易感性基因突变的个体中还生成了额外的ASC类器官（图2B；表3）。通过基于多组学的分析比较肿瘤衍生类器官和原始肿瘤组织，证实类器官在长期培养中稳定保持了亲本肿瘤的分子谱。 4.衍生ASC类器官的挑战 建立癌症类器官的当前协议已在其他地方详细总结。每个协议都是根据对器官/癌症类型的深入生物学知识以及广泛的试错研究来提高效率而开发的。图3总结了正常和肿瘤类器官培养的条件。每种癌症类型都进行了特定的修改，以帮助避免正常细胞污染，同时增强癌症干细胞的活力（在表2中总结）。尽管如此，原始混合中的正常类器官可以胜过肿瘤类器官，最终在培养中占主导地位，特别是当培养条件不能特别有利于肿瘤细胞时。前列腺胃肺结肠和胰腺癌症类器官的研究都报告了这一有问题的现象。因此，通过全外显子组测序（WES）或目标捕获面板测序验证肿瘤纯度至关重要，因为癌症类器官的形态常常与正常类器官无法区分。减轻正常细胞污染和提高协议效率的策略包括撤回一些癌症中不再需要的利基因子，因为普遍存在的致癌突变。例如，撤回Wnt3a和R-spondin1大大改善了结直肠癌（CRC）类器官的形成，而撤回EGF在创建胰腺导管腺癌（PDAC）类器官时有效，因为>80%的CRCs和>90% PDACs分别携带APC和KRAS突变。在胃癌（GC）中，添加nutlin3a，同时从培养基中去除Y-27632、A8301、EGF和FGF10也提高了成功率，样品获取方式的调整也可以产生影响。例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样增加了肿瘤纯度，并在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞污染。提高肿瘤类器官活力的其他方法包括在培养横纹瘤类器官时添加Y-27632以及在培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂。使用无血清、Afamin稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC类器官，因为标准Wnt3a条件培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。 图3. 热图显示了各种正常和肿瘤类器官培养的条件 每一列代表之前针对特定类器官类型报告的培养条件协议。彩色框表示在类器官扩增协议中使用指定的生长因子成分。大多数类器官类型都在包含AdDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX和青霉素/链霉素的基础培养基中培养，但也有一些例外。星号表示使用肝细胞培养基、GlutaMAX和Primocin，而^表示使用DMEM/F12培养基、神经基础培养基、GlutaMAX和低谷氨酸非必需氨基酸混合物。#Jung等人69在培养正常结肠类器官时添加了前列腺素E2，其中使用LY2157229代替A8301来抑制TGF-b信号。LGG，低级别胶质瘤；BLCA，膀胱尿路上皮癌；KIRC，肾透明细胞癌；MRTK，肾脏恶性横纹肌样瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；MEC，小细胞癌；ACC，腺样囊性癌；AciCC，腺泡细胞癌；SDC，唾液腺导管癌；ESAD，食管腺癌；STAD，胃腺癌；CRC，结直肠癌；PDAC，胰腺导管腺癌；HCC，肝细胞癌；CC，胆管癌；NSCLC，非小细胞肺癌；GEP-NENs，胃肠胰神经内分泌肿瘤；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；UCC，子宫体子宫内膜癌；OVC，卵巢浆液性癌；PRAD，前列腺腺癌。 即使有了这些协议修改，一些常见的癌症类型仍然难以用类器官来模拟，这表明需要进一步优化协议。有趣的是，一种称为条件重编程的替代方法，涉及辐照的小鼠成纤维细胞饲养层细胞与消化后的原代健康或癌细胞在rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）存在的条件下共同培养，允许几乎所有细胞类型来源的原代上皮细胞长期培养长达一百天，而无需遗传操作。这项技术已成功用于从非小细胞肺癌（NSCLCs）、前列腺癌和腺样囊性癌（ACC）细胞培养物生成患者衍生的细胞培养。条件重编程的前列腺和ACC癌细胞在异种移植的小鼠中产生了肿瘤，表明这可能是形成类器官率低的癌症类型的潜在替代方法。 5.ASC衍生的癌症类器官与2D癌细胞系的独特特征 5.1.利基因素和细胞-细胞/细胞-基质依赖性 ASC癌症类器官与2D癌细胞系之间的一个主要区别是，类器官仍然依赖于利基因素和细胞-细胞/细胞-基质相互作用来生存。因此，可以通过系统地撤回基本的利基因素、添加/撤回抑制剂或在无基质条件下培养，在肿瘤类器官上进行深入的功能表征。在此过程中，揭示了在癌变过程中发生的基因型-表型关联。 几项关于没有WNT下游基因突变的ASC衍生癌症类器官的研究，例如APC或CTNNB1，已经揭示了赋予Wnt/R-spondin独立的机制。这些研究为Wnt信号在塑造肿瘤内细胞状态形态多样性和异质性方面的贡献提供了见解。在正常胃类器官中双敲除CDH1/TP53导致与R-spondin独立相关的弥漫性GC表型。同样，撤回试验鉴定了PDAC类器官中独立于Wnt和R-spondin的亚群。还评估了撤回ROCK抑制剂和/或无Matrigel生长条件。一项关于GC类器官的研究表明，细胞-细胞/细胞-基质独立性与浸润性肿瘤边缘、晚期肿瘤分期和转移相关，并且与公共GC患者数据集中的总体和无病生存时间较短的转录组特征相关。从早期GC的深层黏膜中分离的肿瘤类器官比来自浅表黏膜的配对肿瘤类器官更不依赖于细胞-细胞粘附，表明同一患者的肿瘤的不同部分可能表现不同。 5.2.谱系多样性、细胞可塑性和细胞状态转换 类器官保留了来源组织的谱系多样性和细胞可塑性。例如，健康的前列腺和乳腺类器官包含能产生基底和腔系谱系的腔系和基底祖细胞。有趣的是，来自BRCA1突变携带者的乳腺上皮类器官显示出更高比例的腔系祖细胞，重现了在BRCA1突变携带者中作为癌症起始人群的腔系祖细胞的增加。单细胞RNA测序揭示了Wilms瘤衍生的类器官由三种不同的细胞类型（上皮、基质和胚细胞）组成，并且带有RSPO融合的APC野生型结肠癌细胞在Wnt撤回后仍保持其分化潜力，类似于健康的结肠类器官。撤回或补充外源性Wnt3a和R-spondin能够调节弥漫型GC或CDH1/TP53双敲除的正常胃类器官的组织学亚型规范和细胞可塑性，允许它们分别适应签戒细胞或非签戒细胞形态。这些观察结果与人类GC中的体内情况非常相似，签戒细胞在RSPO3低表达的区域中可见，非签戒环细胞弥漫形态与基质中RSPO3的表达相关。同样，PDACs在转录上可以分为两种细胞状态，更具侵略性的基底样状态和经典状态。通过单细胞RNA测序，一项研究确定了癌细胞在从经典状态过渡到基底样状态时可能经历的中间细胞状态。引人注目的是，使用患者活检和匹配的类器官的研究报告称，类器官在体外倾向于失去基底状态，这可以通过撤回培养基中的基本利基因素来恢复。用TGF-b处理的类器官被推向更具侵略性的基底样状态，而撤回TGF-b导致类器官恢复到经典状态。这些发现表明，生长条件或微环境可以调节细胞可塑性和细胞状态。不同的细胞状态随后导致不同的抗癌药物敏感性。这些结果与另一项谱系追踪研究一致，该研究将表达多色荧光蛋白的PDAC类器官移植到小鼠中，证明经典和基底样表型可以来自单个植入的细胞。因此，肿瘤的亚型受微环境的影响大于遗传学。 这项工作清楚地表明，类器官对于未来研究人类癌症中肿瘤可塑性和细胞状态转换的机制具有巨大的前景，这两个过程由于它们有限的异质性而无法在细胞系中研究。结合CRISPR-Cas9编辑将报告基因、谱系追踪和消融盒敲入癌症类器官，然后进行小鼠异种移植，可以进一步利用类器官技术评估肿瘤细胞亚群，包括癌症干细胞和癌症启动、转移和药物耐受性。例如，在患者衍生的CRC类器官中敲入EGFP和谱系追踪盒到LGR5位点证实了EGFP-LGR5+癌细胞干细胞以高效率启动肿瘤异种移植，并且肿瘤细胞采用类似于正常结肠上皮的层次结构。另外两项研究将CRISPR工程化的LGR5特异性消融盒的CRC类器官异种移植，观察杀死LGR5+癌细胞干细胞在肿瘤中的效果。在这两项研究中，LGR5+细胞的消除最初阻止了肿瘤生长，但当LGR5特异性消融关闭后，由分化谱系中再生Lgr5+细胞的人群推动了肿瘤的再生。异种移植的类器官携带可诱导的Lgr5-EGFP-Confetti报告基因，证明肝脏转移是由Lgr5细胞播种的，但转移性生长取决于Lgr5+细胞的重新出现。在异种移植的人类CRC类器官中进行的活体遗传谱系追踪系统鉴定了休眠的LGR5+p27+细胞，这些细胞赋予了可逆的药物耐受状态，该状态依赖于细胞基质界面上COL17A1的粘附。类似地，另一项谱系追踪研究表明，一种独特的CRC干细胞群体，潜伏的Lgr5+细胞，表达高水平的Mex3a，可以下调Wnt/干细胞基因程序以保护自己免受化疗，并成为治疗后的主要残留肿瘤群体。然而，另一项研究发现，负责CRC复发的残留肿瘤细胞特征是高EMP1表达，CRISPR工程化的EMP1+细胞消融防止了异种移植小鼠中转移的复发。 5.3.保留异质性和病毒基因组 癌症类器官保留原发性肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构是其另一个独特特征。在胃类器官队列中，几个案例显示了具有和不具有ERBB2或FGFR2的致癌性扩增的细胞亚群，模仿了体内肿瘤组织中观察到的区域异质性。引人注目的是，这种异质性在长期培养中得以维持。癌症类器官还显示出在长期培养中维持病毒基因组，使得能够研究与感染相关的癌症。从与Epstein-Barr病毒（EBV）相关的胃癌或鼻咽癌（NPCs）中建立的类器官能够保留EBV病毒基因组和病毒潜伏期，与大多数2D NPC细胞系已经失去了它们的EBV基因组形成对比。因此，与2D细胞系相比，癌症类器官更密切地重现了原发性肿瘤，为研究信号通路、肿瘤内异质性和与感染相关的肿瘤发生提供了强大的工具。 6.ASC衍生的类器官用于研究癌症发病机制 能够从多种器官中培养出健康的上皮细胞，为研究癌症逐步发展和理解环境致癌物暴露的影响提供了激动人心的机会。图4总结了使用正常结肠ASC类器官或癌前/早期肿瘤类器官来模拟早期肿瘤转化和肿瘤进展的研究报告示例。上皮器官的癌症是与老龄化人群相关的最常见的恶性肿瘤，但导致ASCs中体细胞突变积累的因素以及它们如何促进恶性转化尚不清楚。肠道隐窝提供了一个独特的模型，用于研究体细胞突变和克隆扩展。从肠道粘膜中建立的混合类器官培养通常是多克隆的，来源于许多腺体的集合，每个隐窝都有由亚克隆体细胞突变特征的，主要是乘客突变（图4A和4B）。ISCs在个别隐窝内竞争，最终走向单克隆性。因此，来自单个正常细胞的克隆类器官可以进行功能研究，对于理解癌症相关过程可能非常有价值。例如，从患有溃疡性结肠炎的患者中分离的克隆类器官显示出经常是双等位基因的截断突变，涉及IL-17-NF-kB途径，这与在溃疡性结肠炎组织中观察到的克隆扩展一致（图4D）。尽管这些突变在癌症中没有富集，但它们赋予了克隆类器官对IL-17A诱导的凋亡的抗性，提高了炎症环境中的细胞存活率。 图4. 结肠类器官的类型，从正常到癌前病变及其应用 (A) 正常结肠上皮包含不同异质性克隆的混合物。(B) 正常结肠类器官的长期培养导致克隆优势。克隆类器官可以长期培养，有或没有CRISPR工程化的肿瘤驱动基因突变，或暴露于细菌/药物。亚克隆培养，随后进行测序是一种可以用来询问基因组景观随时间或添加剂变化的方法，这一点通过在LS正常结肠上皮中确认基因组稳定性和在各种类器官模型中识别几种突变特征的原因得到了证明。(C) 在正常结肠类器官中重新创建特定组合的癌症驱动基因突变或进行全基因组CRISPR筛选，产生了各种癌前和肿瘤类器官模型，以及识别赋予Wnt激活和TGF-b抗性的目标。(D) 溃疡性结肠炎(UC)上皮展示了克隆扩展的概念，炎症微环境推动了抵抗IL-17途径的突变克隆的扩展。(E) 不同腺瘤类器官模型在研究癌症发病机制中的多种用途。正常类器官工程化了5个肿瘤驱动基因突变发展了微小转移，而CIN腺瘤但不是GS腺瘤类器官工程化了3个肿瘤驱动基因突变在异种移植小鼠模型中发展了巨大转移。UC，溃疡性结肠炎；LS，Lynch综合征；SSA，静止性锯齿状腺瘤；TSA，传统锯齿状腺瘤；CRC，结直肠癌；FAP，家族性腺瘤性息肉病；GS，基因组稳定；CIN，染色体不稳定性。 克隆健康类器官也可以在有无药物、感染因子的情况下进行长期培养，或使用CRISPR-Cas9基因编辑来识别固有的遗传不稳定性、表征突变特征，并识别致突变剂（图4B）。在培养的终点，可以进行最终的克隆步骤，以扩展单个克隆细胞进行测序。随后，从亲本克隆中筛选出突变，以揭示体外获得的突变。一项研究使用CRISPR-Cas9删除DNA修复基因，MLH1和NTHL1，然后进行亚克隆和WGS。他们发现，MLH1缺陷的类器官具有与错配修复缺陷的CRC一致的突变特征，而NTHL1缺陷的类器官具有与突变特征30相关的特征，这之前在一名携带NTHL1胚系无义突变的乳腺癌患者中被识别出来。 此外，将肠道类器官暴露于两种药物的组合，更昔洛韦（GCV）和莫昔芬（MMF），重新创建了在之前接受这两种药物治疗巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病的CRC患者中观察到的突变特征，表明类器官中的突变特征是由GCV诱导的，并且被MMF进一步增加。相比之下，来自携带杂合性胚系突变的Lynch综合征患者的正常胃或肠道类器官没有显示出增加的突变率，表明在第二个失活突变建立之前不存在单倍体不足。 6.1.与正常和癌前类器官共培养的微生物 通过感染微生物可以在类器官中重现突变特征。经过5个月反复腔内注射基因毒性pks+大肠杆菌的肠道类器官，这种病原体已知会在培养细胞中诱导双链DNA断裂，显示出在一部分人类CRC患者中观察到的突变特征，但在其他癌症类型中没有。这一发现暗示了过去暴露于pks+ E. coli可能是那些患者的潜在致癌因素。健康的人类类器官也被其他类型的微生物感染，包括已知与癌症发展相关的细菌和病毒。例如，人类胃类器官被幽门螺杆菌感染，这种病原体会导致胃溃疡和胃癌，导致通常在体内观察到的炎症反应和上皮增殖增加。另一项研究从正常人类口腔粘膜组织中生成类器官，并将它们分别暴露于HSV和HPV感染。这两种类器官系都显示出病毒DNA的增加，即使在传代后也得以维持，暗示持久感染。此外，iPSC和ASC模型突出了人类肝脏类器官模型在体外研究乙型肝炎病毒（HBV）感染和复制方面的潜力，未来可能用于研究与HBV相关的HCC进展。这些研究为解决微生物组在肿瘤发生中的参与提供了方法，由于缺乏适当的体外和动物模型，这一点以前探索得很少。 6.2.ASC衍生的小鼠类器官模型用于研究癌症发病机制 直接从患者样本中建立肿瘤类器官仍然是一个挑战。或者，可以从基因工程小鼠模型（GEMMs）中衍生ASC类器官，并在体外快速扩展以建立生物银行。来自人类或GEMMs的正常或早期肿瘤类器官作为研究癌症早期演变途径的良好工具（图4E）。一项共培养研究表明，小鼠Apc突变类器官分泌Notum。当这些Apc突变类器官与野生型小鼠肠道类器官共培养时，Notum通过推动野生型ISCs分化并导致Apc突变ISCs的克隆固定，抑制了野生型类器官的生长（图4E）。与这些发现一致，在小鼠中诱导Apc突变之前用Notum抑制剂处理减少了腺瘤的形成。这些研究突出了遗传小鼠模型和类器官如何协同工作并被利用，从而显著加速研究发现。小鼠类器官易于基因组编辑以诱导驱动突变，并且可以植入同种型和免疫能力的小鼠中以模拟肿瘤发生和转移。例如，为了模拟CRC的发展，携带不同组合驱动突变的小鼠类器官，无论是来自GEMMs的肿瘤/转移还是通过体外基因编辑，都被移植到同种型小鼠的盲肠壁上，用于原位肿瘤形成和转移发展。这些模型证实了TGF-b信号在肿瘤微环境中的作用，促进免疫逃逸并介导癌症转移。另一项研究生成了一种人类化的微卫星稳定的CRC小鼠模型，并确定EMP1+细胞是转移复发的起源细胞。类似地，乳腺肿瘤类器官可以从GEMM肿瘤中衍生出来，在2-3周内并原位移植形成肿瘤，重现原始肿瘤的上皮形态和药物反应。也已经开发了免疫能力的基于类器官的小鼠模型用于卵巢癌和肺腺癌。它们可能代表了与GEMMs相比，模拟癌症发病机制的更强大的平台，GEMMs可能开发起来耗时且技术上具有挑战性。 7.CRISPR-Cas9编辑ASC衍生的类器官 CRISPR-Cas9被用来在健康类器官中工程化组合驱动突变，以重新创建癌症（图4C；表4）。两项开创性研究同时证明，工程化APC、TP53、KRAS或PIK3CA和SMAD4突变的组合结果是人类肠道类器官，这些类器官在所有干细胞利基因素的独立下生长，并能够在小鼠中形成具有侵袭性癌症特征的肿瘤移植物。这些四重突变类器官的原位移植到小鼠盲肠引起了宏观的肺和肝转移。在三重敲除（APC-/-，TP53-/-和KRASG12D）人类类器官中过表达Noggin，当Noggin没有过表达时，在体内具有有限的生长潜力，导致与四重突变类器官相似的肝脏转移。由于这些类器官能够独立于所有利基因素生长，这些发现提出了利基独立可能介导转移的可能性。然而，不能排除其他未知因素。例如，患者衍生的原发性CRC和配对的转移性类器官总是显示出一致的利基因素依赖性，一些患者衍生的肝转移类器官仍然高度依赖于利基因素。染色体不稳定性也可能是一个贡献因素， 如下文更详细讨论。 已经发表了几种CRC的锯齿状肿瘤途径模型。一项研究通过工程化大染色体重排来生成RSPO融合基因，以及在人类结肠类器官中的BRAFV600E和TP53突变（图4C）。将这些人类结肠类器官异种移植到小鼠结肠中产生了锯齿状病变，重现了人类的SSAs。在类器官中除了BRAFV600E、TP53敲除和RSPO融合外，过度表达GREM1，结果在小鼠中形成了息肉状肿瘤，其组织学特征类似于传统的锯齿状腺瘤。有趣的是，与正常结肠类器官相比，RNF43-/-人类SSA类器官对RSPO的依赖性较小，为RNF43突变在锯齿状肿瘤途径中的致病作用提供了功能支持。另一项研究将正常结肠类器官与BRAFV600E突变工程化后，用TGF-b处理。TGF-b在正常类器官中触发了凋亡，但在BRAFV600E突变类器官中没有，而是诱导了上皮-间充质转化（EMT）和转录特征，模仿了在人类锯齿状肿瘤病变中观察到的特征。除了由癌症驱动基因突变引起的遗传损伤外，使用类器官还可以探索肿瘤进展过程中染色体不稳定性的作用。具体来说，工程化了五种肿瘤驱动突变（APC、SMAD4、TP53、KRASG12V和PIK3CAE545K）的正常结肠类器官能够在注射到小鼠脾脏后在肝脏形成微小转移灶（图4E）。相比之下，染色体不稳定而不是染色体稳定的腺瘤类器官，工程化了三种驱动因素（SMAD4、TP53、KRASG12V或PIK3CAE545K），在肝脏中形成了大的转移肿瘤，显示出组织学恶性。随着越来越多的癌前或早期肿瘤类器官模型的可用性，这些模型捕获了不同形式的遗传或表观遗传异常，研究人员现在有了前所未有的机会进行精细的调查，以确定有助于肿瘤发生的因子。 使用CRISPR-Cas9基因编辑在各种组织的正常类器官中成功模拟其他癌症类型的示例总结在表4中。这些包括在人类胃类器官中工程化ARID1A和TP53突变以模拟胃肿瘤；在胰腺类器官中KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4突变以模拟PDAC38；在乳腺类器官中TP53、PTEN、RB1和NR1突变以模拟管腔肿瘤；在人类导管类器官中TP53、SMAD4、NF1、PTEN和BAP1突变以模拟胆管癌；在小鼠食管类器官中Sox2过表达和p53和p16突变以模拟食管鳞状细胞癌。 全基因组CRISPR筛选也已在正常类器官中使用，以确定肿瘤发生的目标。两项研究在人类肠道类器官中进行了CRISPR-Cas9筛选，并确定了赋予对TGF-b介导的生长抑制的抗性的基本目标，这对于CRC发展至关重要。在培养中对小鼠胃类器官进行Wnt3a撤回，进行了类似的筛选，以确定以前未被重视的赋予Wnt激活的因素。总的来说，这些在正常或早期肿瘤类器官中的研究表明，多个癌症驱动基因的基因组编辑，无论是顺序还是组合，都可以模拟体内癌症发病机制。它们为这些基因在癌症进展中的基本功能提供了宝贵的见解。此外，将全基因组CRISPR筛选应用于正常类器官的成功，为将来在肿瘤类器官中识别治疗反应或抗性的遗传脆弱性提供了概念验证。 8.PSC衍生的类器官 类器官也可以从PSCs，无论是胚胎的还是诱导的，生成。人类胚胎干细胞受到伦理规定的限制，这阻碍了它们的广泛使用。相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程回到多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）。然后，细胞在3D基质中培养，使用特定的生长和信号因子引导它们朝着所需器官的细胞系发展。这一模型的主要挑战是在体外忠实地模拟所有体内生化线索，这些线索在正确的时间、位置和浓度下推动细胞分化和3D组织形成，就像在胚胎发育过程中发生的那样。最初通过使用活化素A处理人类PSCs来建立PSC衍生的类器官，以驱动内胚层身份，随后与FGF4和Wnt3a共同孵化以促进后肠分化。这一协议最终产生了表达特定肠道标记物的肠道类器官，如CDX2和KLF5。自那时以来，PSC类器官技术已广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功创建了许多PSC衍生的类器官，包括用于大脑、 胃、 肺、 胰腺、食管、肾脏、肝脏、等等。所有这些模型都为干细胞生物学和器官发育提供了重要的见解。然而，使用PSC衍生的类器官进行癌症研究的一个重要警告是，它们缺乏直接从肿瘤组织中衍生的ASC类器官在培养中保留的获得性癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们尝试将癌细胞直接重新编程为PSCs以了解肿瘤过程。然而，成功的结果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括从急性髓性白血病、 慢性髓性白血病、和幼年型单核细胞白血病。有趣的是，尽管携带相同的遗传异常，从白血病细胞衍生的iPSCs通常缺乏白血病潜力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。尽管如此，这种方法为存储白血病样本和研究患者特定突变与疾病表型之间的相互作用提供了机会。或者，将致癌突变工程化到PSC细胞中，然后诱导分化为特定器官以模拟来自胰腺、肺、胃、视网膜和大脑的癌症是另一种策略（表4）。这种方法在从PSCs生成大脑类器官方面特别成功，使用CRISPR-Cas9编辑用于工程化大脑类器官，这些类器官具有在脑肿瘤中观察到的最频繁的单次和组合突变。产生的肿瘤性脑类器官代表了不同的脑肿瘤类型，包括中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤和胶质母细胞瘤。此外，分化的PSC衍生的脑类器官被用作健康大脑替代品，以研究肿瘤-胶质细胞相互作用。通过与胶质瘤干细胞或传统的肺癌细胞系共培养，可以模拟大脑环境并分析细胞迁移和细胞-细胞相互作用，模仿胶质母细胞瘤侵袭或上皮性恶性肿瘤转移到大脑。最后，从患有癌症易感性综合征的患者的体细胞中重新编程为PSCs被用来模拟来自具有胚系APC、GNAS或BRCA1突变的患者的癌症类型（表3）。 9.使用类器官研究药物反应 体外模型相对于动物模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛选的适应性。具体来说，癌细胞系几十年来一直被用于在应用到体内模型之前评估药物效力。这由癌症细胞系百科全书（CCLE）和癌症药物敏感基因组学（GDSC）进行的研究证实。这些项目的目标是构建一个有用的数据库，以识别药物反应和癌症基因组之间的相关关联，并反过来指导个性化治疗。同样，癌症患者衍生的类器官可以适应大规模机器人药物筛选。使用患者衍生的CRC类器官的概念验证研究说明了西妥昔单抗和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官生长抑制的有效性。在癌症类器官中还进行了其他药物筛选测定，包括乳腺癌、 膀胱、头颈鳞状、肝脏、NPC、 卵巢、 胰腺、前列腺、和胃癌症类器官。其中一些体外药物反应进一步使用体内异种移植进行了验证。进行药物筛选的详细协议，从细胞分离到数据分析，已在其他地方总结。最近对协议的改进使得可以在正常、前体和肿瘤类器官中进行筛选；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性测定扩展到基于图像的高含量表型分析。在HER2过表达的乳腺癌类器官中也描述了有利的基因-药物相关性，这些类器官对阿法替尼敏感，在ARID1A突变的胃类器官中对共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶（ATR）抑制剂敏感，在MTAP突变的胰腺癌类器官中对PRMT5抑制剂有反应，40 在CHFR表观遗传学沉默的结肠癌类器官中对紫杉醇有反应。除了使用癌症类器官来确认已知的基因-药物关联外，类器官模型预测标准疗法的临床反应的能力也经过了严格的测试。一个转移性CRC和食管胃类器官的生物银行证明了患者和癌症类器官对标准治疗药物紫杉醇和5-氟尿嘧啶之间的一致反应。其他癌症类器官类型的研究也证明了它们在预测患者治疗反应方面的稳健性。此外，从同一个体建立的纵向PDAC类器官反映了逐渐获得对化疗治疗的抗性。除了预测药物反应外，几个先进的直肠癌症类器官模型在体外以及在通过内窥镜注射到小鼠直肠后显示出预测对化疗放疗的反应的潜力。值得注意的是，这些研究大多数只涉及少数患者，需要进行更大规模的相关研究和更长时间的患者随访，以验证这些患者衍生的类器官的真正预测潜力。 类器官药物筛选的另一个目标是确定新的治疗靶点。不同类器官队列的初步药物筛选研究已经取得了令人鼓舞的数据，为癌症患者提出了几种治疗策略，尽管需要在更大的癌症类器官队列中进一步验证。例如，一部分原发性肝癌类器官在接受细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂（SCH772984）治疗后显示出生长抑制，但它们对其他大多数临床相关化合物都具有抗性，这些结果在异种移植的小鼠中得到了验证。另外，儿童Rhabdoid癌症类器官模型和相应的PDX模型已经确定Neddylation作为一个有吸引力的治疗靶点。更重要的是，这项研究评估了Neddylation抑制剂MLN4924对健康组织（包括肾脏、肝细胞和小肠类器官）的毒性，强调了使用正常类器官进行毒性测试的可行性。另一项研究产生了一大型针对癌症干细胞的双靶点双特异性抗体库，并使用患者来源的CRC类器官生物库进行功能性筛选。作者还使用了配对的健康类器官来评估治疗抗体在药物筛选管道的最早阶段的毒性。该研究成功鉴定了一种针对几种表达LGR5的上皮癌症类型的潜在治疗性双特异性抗体，MCLA-158，具有EGFR和LGR5臂。尽管ASC癌症类器官是探索药物-基因相互作用的探索性模型，但具有CRISPR工程化致癌突变的ASC或PSC衍生类器官，具有低体细胞突变背景，可以精确地确定合成致死伙伴或药物（单一或组合）以针对特定基因或途径。最近，在ARID1a/TP53敲除胃类器官中对>2,000种小分子进行了高通量筛选，确定了ARID1a突变细胞对组蛋白去乙酰化酶和Survivin抑制剂的敏感性。类似地，在携带Trp53、Rb1和Pten突变以及Kras和c-Myc过表达的小鼠来源的膀胱癌类器官上进行了表观遗传药物的小分子筛选，确定了Sirt1作为治疗靶点。此外，在PSC衍生的肿瘤性脑类器官上成功进行了一小组EGFR抑制剂的药物筛选。尽管需要长达40天的治疗期，但这项研究证明了Afatinib对EGFR过度激活的GBM类器官亚群的生长抑制作用。与正常视网膜类器官相比，用卡铂、雷帕霉素或两种脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂处理PSC衍生的RB1缺陷类器官模型的视网膜母细胞瘤，提供了除人类视网膜母细胞瘤细胞系之外的替代模型，以进一步验证它们的有效性。最后，来自经过验证的转基因小鼠模型的ASC衍生类器官允许快速表征药物反应及其细胞、机制、功能和药理效应。来自代表不同GC亚型的转基因小鼠模型的肿瘤样本的胃类器官在体外显示出不同的药物治疗效果。另一项研究表明，表达RhoAY42C/+与Cdh1缺失的弥漫性GC细胞系以及来自弥漫型GCs转基因小鼠模型的胃类器官都对焦点粘附激酶（FAK）抑制剂敏感，支持FAK作为这种癌症类型的治疗靶点的相关性。这些配对的类器官-小鼠模型允许高效、无偏见、并行地测试由一组定义的基因组异常引起的药物反应。 10.使用类器官衍生的异种移植作为临床前模型 尽管PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们成本高，移植成功率低，需要长时间的培养。患者衍生的类器官异种移植模型可能为这一未满足的需求提供解决方案，并在表2中进行了总结。最简单的方法涉及将健康、癌症或基因修饰的类器官与Matrigel共注射到小鼠侧腹， 这不需要高级的外科技术来执行，并给出一个容易观察的读数。然而，皮下类器官移植的植入率可能很低，并且不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了为肿瘤生长提供必要的利基因素。为了解决这个问题，几个小组将癌症/工程化类器官注射到裸鼠的肾下囊或脾脏中，这两个都是高度血管化的环境，确保了丰富的营养、激素、生长因子和氧气供应给移植的类器官，大大增强了植入率。移植的细胞可以直接进入血液并转移到肝脏，在那里它们增殖形成次级病变，这使得它成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。然而，这个模型仍然不能复制癌症的自然肿瘤微环境。这个限制由一个研究所说明，在该研究中，依赖Wnt和R-spondin的GC类器官未能在肾下囊植入，除非它们与产生Wnt和R-spondin的、来自肠道类器官的成纤维细胞共注射。 已经开发了几种原位异种移植模型，为异种移植形成提供了更具生理学相关性的微环境。然而，它们涉及复杂和侵入性的外科手术。与肾囊或皮下空间相比，原始组织环境提供了支持类器官植入的生长因子，这一点通过在结肠环境中弥漫型GC类器官的异种移植效率增加得到了证明，最有可能是由于该位置的Wnt和R-spondin的可用性。到目前为止，癌症类器官已经被直接注射到胰腺尾部、胃浆膜和卵巢囊的NGS小鼠中，这些研究都证明了类器官重现肿瘤过程的能力。几项研究还成功地进行了小鼠类器官的原位移植到盲肠粘膜壁，这不需要外科切口。这种方法随后被改编为将患者来源的CRC类器官和正常人类结肠类器官移植到小鼠结肠中。这些方法允许对异种移植形成进行内窥镜监测，并可以应用于正常人类类器官进行体内谱系追踪。另一项研究报告说，体外药物敏感性可以在其体内原位模型中重现。总的来说，这些报告强调了基于类器官的原位异种移植模型在促进我们对相关生理环境中肿瘤发生的了解方面的高价值，为它们在转化研究和个性化治疗中的使用铺平了道路。 11.局限性与未来展望 尽管类器官技术已经彻底改变了癌症研究，并具有广泛的潜在应用，但它仍然面临技术限制。尽管来自ASC的肿瘤类器官在基因组上通常是稳定的，但也有例外。如上所述，来自肠道腺体的普通类器官在长期培养中可能会倾向于克隆优势，这影响了用于全基因组CRISPR筛选的普通类器官的使用。类器官在长期培养中也可能获得新的突变，尽管这些突变通常是亚克隆的、随机的，并且主要影响非编码区域。具有固有基因组不稳定性的类器官可能会更快地获得突变，正如一项研究所示，该研究使用了一个微卫星不稳定的肿瘤类器官。有趣的是，这种固有的不稳定性已被用来模拟肿瘤演化的早期阶段。例如，一项研究追踪了经TP53突变工程化的胃类器官中染色体拷贝数的变化，并注意到在2年的时间里逐渐出现的非整倍性。即使类器官基因组和突变谱是稳定的，表型不稳定性也可能由生长条件的变化引起。一个亚群的尿路上皮癌类器官在亲本肿瘤中显示了腔系亚型，但随后作为类器官转变为基底亚型，尽管亚克隆突变的频率没有可检测的变化。这些基底类器官在异种移植中生长时又恢复了腔系表型，表明类器官培养条件与异种移植环境是这种表型可塑性的原因。显然，对调节表型的因子的更好理解将导致类器官模型的改进。已经改良生长因子，以提高肠道类器官中的分泌系规范和肝脏类器官中的肝细胞规范。在低氧或无锚定条件下培养也可能为肿瘤类器官相对于普通类器官提供选择优势。 目前，使用类器官的高通量药物筛选大多涉及直接对肿瘤类器官有影响的药物。除非使用更复杂的共培养模型，否则单独的类器官在筛选阻断肿瘤-基质或肿瘤-免疫相互作用的药物时不会提供有用的结果。利基因子的存在可能进一步限制筛选中使用的小分子抑制剂的类型。例如，BMP和TGF-b抑制剂在常规类器官培养中是必需的，这阻止了相关激动剂在药物清单上的使用。只有在肿瘤类器官自分泌Wnt的情况下，Wnt抑制剂筛选才有可能，但它无法模拟来自肿瘤基质的Wnt来源的阻断。类器官培养中增殖性干细胞的主导地位可能会夸大它们对针对细胞周期的药物的反应。最后，培养条件和类器官大小已被证明可以改变细胞可塑性，如在PDAC和CRC类器官中所示，这反过来可能影响药物反应。因此，基于类器官药物筛选的发现将需要通过临床前研究和临床试验进行广泛验证。 迄今为止，几种类器官培养方法已经开始将微环境的一些组分，如基质细胞、血管和免疫细胞，纳入它们的类器官中，使它们在生理上更具相关性（图1和4）。与癌症相关成纤维细胞共培养的胰腺肿瘤类器官表明，来自基质的外源性Wnt供应可以增加依赖Wnt的PDAC细胞的肿瘤潜力。此外，将肿瘤类器官和自体T细胞共培养导致患者特异性肿瘤反应性T细胞的扩增，这是采用性T细胞转移的潜在临床策略。另一种方法涉及基于3D生物打印的模型，该模型由组织基质的关键组分组成，包括癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，创建了一个多层的“组装体”。引人注目的是，内皮细胞能够形成功能性的血管网络，支持肿瘤生长。对组装体的分析揭示了一个旁分泌循环，即成纤维细胞分泌的BMP在肿瘤中诱导FOXA1表达，这反过来又推动了增强子重编程，赋予肿瘤亚型可塑性。与传统的膀胱肿瘤类器官相比，组装体对化疗药物的敏感性也较低。此外，还描述了一个“器官-血管网”模型，该模型涉及将人类CRC或正常肠道类器官与修饰形式的内皮细胞共培养，这些细胞过度表达胚胎限制E26转化特异性（ETS）变异转录因子2（ETV2），形成可灌注的血管网络。有趣的是，这种共培养模型表明，与CRC类器官中预后不良和转移相关的基因上调。最后，AL方法已成功适应建立100个ALI肿瘤类器官，来自28种不同的癌症类型。另一种方法从患者肿瘤的针刺活检中生成微器官球体。将肿瘤消化成Matrigel中的悬浮细胞，然后与油混合以生成基于微流体的液滴进行后续培养和药物筛选，可在14天内得出结果。这两种模型都能保留肿瘤微环境，包括肿瘤浸润性淋巴细胞，使未来在免疫肿瘤学研究中具有潜在应用。当然，这些改进和对现有协议的调整是令人兴奋的，但模拟癌前环境又是另一个挑战。癌前细胞与基质组分之间的相互作用无疑在肿瘤发生中起作用。事实上，与L2-IL-1B小鼠的中性粒细胞共培养的小鼠Barrett食管类器官以剂量依赖性方式增加增殖和类器官生长，表明中性粒细胞对BE上皮细胞有直接刺激作用。未来，看到其他方法如何将癌前微环境纳入类器官模型将是有趣的。 用于类器官培养的试剂和协议，无论是用于癌前研究还是更普遍的研究，都需要改进和标准化，如果类器官要在临床应用中使用的话。目前，Matrigel是类器官培养协议中最广泛使用的支架，但它是动物来源的，定义不清，批次间变化，并且存在免疫原转移的风险。所有这些限制都阻止了它在临床应用中的使用。也许在低百分比基质条件下的悬浮培养技术或使用下一代设计基质将解决这个问题，并将类器官的应用扩展到临床环境。重要的是，类器官系仍然大多是手动生成的，每个实验室都使用自己的修改协议。最终，类器官衍生/增殖协议将必须标准化和自动化，以增加可重复性和可扩展性。 12.结论 鉴于迄今为止已经成功建立的健康和癌症类器官的广泛多样性，发展微流体方法以提高药物筛选的吞吐量，以及将肿瘤微环境纳入这些设备的潜力（在图5中总结），我们可能会在不久的将来看到类器官模型测试作为患者药物处方的补充。此外，类器官模型及其与动物模型的协同作用将为分析复杂的旁分泌相互作用提供手段，加速发现到癌症发展的最早步骤，从而提供发现有效的癌症预防策略的机会。 图5. 显示了癌症模型中类器官培养技术进展的时间线。与ASC衍生类器官相关的主要事件以蓝色文本列出，而与PSC衍生类器官和ALI类器官模型相关的事件分别以黄色和绿色文本显示。ASC，成人干细胞；PSC，多能干细胞；ALI，空气-液体界面；PDAC，胰腺导管腺癌。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

整理：肿瘤资讯来源：肿瘤资讯乳腺癌的治疗在最近几十年历经了巨大的变革。从最初的化疗和激素治疗，到后来靶向治疗和免疫治疗的兴起，治疗手段不断丰富，但如何实现个体化精准治疗仍是临床面临的核心问题。随着众多临床试验的成功，美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）批准了一系列创新药物用于乳腺癌的治疗。本文整理了近70年来乳腺癌领域的获批药物，以梳理乳腺癌治疗发展脉络和重要节点。本篇章概述了乳腺癌靶向治疗的获批药物，以期为临床医生了解行业进展和治疗用药提供参考。本文上接《乳腺癌领域获批药物盘点——化疗、内分泌治疗及免疫治疗篇》靶向治疗——个体化精准治疗新阶段过去，手术、放疗和化疗都无法精确定位并选择性杀伤肿瘤细胞，大量正常细胞也会受到损伤。针对这一局限，靶向药物应运而生。靶向药物又被称为“生物导弹”，它能够特异性地识别并结合肿瘤细胞上的靶点发挥作用，对肿瘤细胞实施精确打击。自1997年利妥昔单抗（Rituximab，抗CD20单克隆抗体）获FDA批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤，这是首个获批用于治疗肿瘤的单克隆抗体，标志着靶向药物正式进入肿瘤治疗领域。随后在1998年，曲妥珠单抗（抗HER2单克隆抗体）也获得FDA批准，用于治疗转移性乳腺癌。近10年来，获批的靶向药物数量大幅增加，并逐渐成为抗肿瘤治疗的重要组成部分。肿瘤分子靶向治疗是针对肿瘤细胞的特异性分子靶点进行干预，影响细胞发生癌变的环节。主要通过抑制肿瘤细胞增殖、干扰细胞周期、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞转移、诱发肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤血管生成等途径发挥治疗作用。与传统治疗不同，靶向治疗能够精确作用在肿瘤细胞上，对正常细胞的毒副作用较小。肿瘤细胞表面的生长因子受体、信号转导分子、细胞周期调控蛋白、凋亡相关因子、蛋白酶类以及血管内皮生长因子等都可作为靶向治疗的分子靶点。图1 肿瘤领域获批小分子抑制剂的靶点1乳腺癌的靶向治疗目前乳腺癌靶向治疗所针对的靶点或通路主要包括HER2、VEGF、EGFR、PARP、PI3K/Akt/mTOR、CDK4/6等。根据分子靶向药物的作用部位可概括为：作用于细胞膜的药物：主要是靶向跨膜生长因子受体，包括作用于成纤维细胞生长因子受体（FGFR）的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），如在研的Dovitinib、lucitanib、仑伐替尼（lenvatinib）、infigratinib和erdafitinib等；作用于表皮生长因子受体（EGFR）及作用于HER2受体的单克隆抗体曲妥珠单抗等；作用于细胞质的药物：靶向于细胞内信号转导过程，如mTOR抑制剂依维莫司等；作用于细胞核的药物：靶向于DNA或RNA，例如细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)抑制剂、PARP抑制剂等；作用于肿瘤细胞外环境的药物：目前临床使用较为广泛的靶向于肿瘤相关血管的药物就属于此类，如血管内皮生长因子单克隆抗体贝伐珠单抗、重组人内皮抑素等。FDA批准的抗肿瘤药物时间轴如下，2000年以前，获批的抗肿瘤药物以化疗药物和激素类药物为主。2000年之后，获批的靶向治疗药物开始快速增加。图2 FDA批准的抗肿瘤药物时间轴18表1整理了FDA批准的乳腺癌领域的靶向治疗药物。下表所列药物中，除margetuximab已提交NMPA上市申请待审批外，其他药物均已获得我国药监部门批准上市。表1 FDA批准乳腺癌领域的靶向治疗药物01抗HER2治疗药物单克隆抗体（mAb）mAb通过与 HER2的胞外配体结合域结合，阻断细胞内HER2信号转导、抑制癌细胞周期；同时，可激活患者自身免疫系统的抗肿瘤活性，引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应（ADCC）。如曲妥珠单抗（trastuzumab）、帕妥珠单抗（pertuzumab）和Margetuximab。曲妥珠单抗2022年10 月，据 NMPA 官网显示，罗氏旗下基因泰克研发的曲妥珠单抗注射液（皮下注射）在国内获批上市，联合化疗用于治疗早期和转移性 HER2 阳性乳腺癌患者。适应症：1）HER2阳性的转移性乳腺癌：作为单一药物治疗已接受过1个或多个化疗方案的转移性乳腺癌；与紫杉醇或者多西他赛联合，用于未接受化疗的转移性乳腺癌患者；2）HER2阳性早期乳腺癌：接受了手术、含蒽环类抗生素辅助化疗和放疗（如果适用）后的单药辅助治疗；多柔比星和环磷酰胺化疗后序贯本品与紫杉醇或多西他赛的联合辅助治疗；与多西他赛和卡铂联合的辅助治疗；与化疗联合新辅助治疗，继以辅助治疗，用于局部晚期（包括炎性）或者肿瘤直径>2cm的乳腺癌。2020年8月14日，国内首个曲妥珠单抗——HLX02获得NMPA批准用于HER2阳性早期乳腺癌、转移性乳腺癌和转移性胃癌。2020年7月29日，HLX02获得欧盟委员会批准，成为欧盟首个国产的单抗生物类似药。从此国人拥有了国际认证的国产曲妥珠单抗。帕妥珠单抗2018年12月，帕妥珠单抗在我国获批，现已批准多个适应症：1）早期乳腺癌：与曲妥珠单抗和化疗联合用于HER2阳性、局部晚期、炎性或早期乳腺癌患者（直径>2cm或淋巴结阳性）的新辅助治疗，作为早期乳腺癌整体治疗方案的一部分；用于具有高复发风险HER2阳性早期乳腺癌患者的辅助治疗；2）转移性乳腺癌：帕妥珠单抗与曲妥珠单抗和多西他赛联合，适用于HER2阳性、转移性或不可切除的局部复发性乳腺癌患者，患者既往未接受过针对转移性乳腺癌的抗HER2治疗或者化疗。2023年1月，据中国国家药监局药品审评中心（CDE）信息显示，齐鲁制药的帕妥珠单抗注射液的上市申请已获受理，用于治疗HER2阳性乳腺癌，这是国内首个申报上市的帕妥珠单抗生物类似药。另外，2023年5月24日，据CDE官网显示，正大天晴的帕妥珠单抗注射液生物类似药上市申请获得受理。Margetuximab2018年11月，再鼎医药从MacroGenics获得在大中华区开发和商业化margetuximab的权利。2020年12月，FDA批准margetuximab联合化疗，用于治疗既往接受过两种或两种以上抗HER2方案的转移性HER2阳性乳腺癌成人患者，其中至少一种方案是针对转移性疾病。2022年1月，再鼎医药宣布NMPA已受理margetuximab治疗经治转移性HER2阳性乳腺癌的新药上市申请。伊尼妥单抗（Inetetamab）三生制药旗下三生国健药业自主研发的注射用伊尼妥单抗，是我国自主研发的针对抗HER2治疗的一款“仿创结合”的抗HER2单抗。2020年获NMPA批准适用于HER2阳性，与长春瑞滨联合治疗已接受过1个或多个化疗方案的转移性乳腺癌患者。抗体偶联药物（ADC）ADC药物由抗体+连接子+细胞毒药物构成，即将有选择性的、只杀伤癌细胞的靶向药与泛性的细胞毒药物相结合。ADC具有双重抗肿瘤效应：一是特异性mAb与靶向的细胞表面抗原结合，被肿瘤细胞内化并由内溶酶体系统处理，有效载荷释放并杀灭肿瘤细胞；二是通过ADCC效应诱导肿瘤细胞死亡。代表药物为恩美曲妥珠单抗（trastuzumab emtansine，T-DM1）和德曲妥珠单抗（trastuzumab deruxtecan，T-DXd）等。恩美曲妥珠单抗2013年FDA获批T-DM1的乳腺癌适应症，2021年NMPA批准T-DM1用于：1）早期乳腺癌：T-DM1单药适用于接受了紫杉烷类联合曲妥珠单抗为基础的新辅助治疗后仍残存侵袭性病灶的HER2阳性早期乳腺癌患者的辅助治疗；2）晚期乳腺癌：T-DM1单药适用于接受了紫杉烷类和曲妥珠单抗治疗的HER2阳性、不可切除局部晚期或转移性乳腺癌患者。患者应具备以下任一情形：既往接受过针对局部晚期或转移性乳腺癌的治疗，或在辅助治疗期间或完成辅助治疗后6个月内出现疾病复发。德曲妥珠单抗2019年FDA批准T-DXd乳腺癌适应症，2023年，T-DXd获得NMPA正式批准，单药适用于治疗既往在转移性疾病阶段接受过至少一种系统治疗的，或在辅助化疗期间或完成辅助化疗之后6个月内复发的，不可切除或转移性HER2低表达（IHC 1+或IHC 2+/ISH-）成人乳腺癌患者。小分子TKIs小分子TKIs通过与 HER2 胞内酪氨酸激酶结合，以抑制酪氨酸激酶的磷酸化，从而抑制下游通路的活性。代表药物为拉帕替尼（lapatinib）、奈拉替尼（neratinib）、吡咯替尼（pyrotinib）。拉帕替尼2013年拉帕替尼被NMPA批准与卡培他滨联合使用，适用于HER2过表达且既往接受过包括蒽环类、紫杉类和曲妥珠单抗治疗的晚期或转移性乳腺癌。奈拉替尼2020年，NMPA批准奈拉替尼用于HER2阳性的早期乳腺癌成年患者，在接受含曲妥珠单抗辅助治疗之后的强化辅助治疗。吡咯替尼吡咯替尼是恒瑞医药自主研发且具有知识产权的口服HER1/HER2/HER4酪氨酸激酶抑制剂。吡咯替尼联合卡培他滨，适用于HER2阳性、既往未接受或接受过曲妥珠单抗的复发或转移性乳腺癌患者。使用吡咯替尼前患者应接受过蒽环类或紫杉类化疗。02CDK4/6抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）在癌细胞的增殖中起重要作用。CDK4/6活化通过磷酸化导致Rb活化。激活的Rb通过开启E2F转录使细胞周期进展成为可能。此外，CDK4和CDK6通过磷酸化支持FOXM1的稳定和活化，这反过来促进G1/S期基因的上调和避免细胞衰老。CDK4/6抑制剂，如哌柏西利（palbociclib）、瑞波西利（ribociclib）、阿贝西利（abemaciclib）或达尔西利（dalpiciclib），通过抑制CDK4/6下游信号传导事件来阻滞细胞周期。哌柏西利哌柏西利于2015年2月获得FDA批准上市，国内于2018年7月获批用于HR+/HER2-晚期或转移性乳腺癌成人患者：1）与芳香化酶抑制剂（AI）联合使用作为绝经后女性或男性患者的初始内分泌治疗；2）联合氟维司群（fulvestrant）用于接受内分泌疗法后病情进展的患者。瑞波西利瑞波西利于2017年3月获FDA批准上市；于2023年1月19日获得NMPA批准，与AI联合用药，作为HR+/HER2-局部晚期或转移性乳腺癌绝经前或围绝经期女性患者的初始内分泌治疗，使用内分泌疗法治疗时应联用黄体生成素释放激素（LHRH）激动剂。并且，2023年5月，瑞波西利获NMPA批准新增适应症（新增绝经后人群适应症）。自此，瑞波西利成为我国首个且目前唯一一款在晚期乳腺癌一线治疗领域覆盖绝经前/围绝经期、绝经后人群的CDK4/6抑制剂。阿贝西利阿贝西利于2017年9月获得FDA批准上市，并于2020年12月获得NMPA批准，用于HR+/HER2-的局部晚期或转移性乳腺癌：1) 与AI联合使用作为绝经后女性患者的初始内分泌治疗；2) 与氟维司群联合用于既往曾接受内分泌治疗后出现疾病进展的患者。2021年1月，阿贝西利获NMPA批准早期乳腺癌适应症：联合内分泌治疗（他莫昔芬或AI）适用于HR+/HER2-、淋巴结阳性，高复发风险且Ki-67≥20%早期乳腺癌成人患者的辅助治疗，成为国内首个且唯一被批准用于早期乳腺癌患者的CDK4/6抑制剂。达尔西利 2021年，恒瑞医药研发的首款国产CDK4/6抑制剂达尔西利获NMPA批准联合氟维司群，适用于既往接受内分泌治疗后出现疾病进展的HR阳性、HER2阴性的复发或转移性乳腺癌患者。03PARP抑制剂PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase，PAR）的抗癌疗法。PARP是一种DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用，能够有效治疗带有BRCA突变蛋白之类缺乏DNA同源重组修复机制的肿瘤，抑制PARP可阻止DNA修复并导致DNA链断裂。代表药物有奥拉帕利（olaparib）和他拉唑帕利（talazoparib）等。奥拉帕利2018年1月，FDA批准奥拉帕利用于治疗携带BRCA突变的HER2阴性转移性乳腺癌。这是PARP抑制剂首次获批用于治疗乳腺癌。奥拉帕利在我国获批了上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌及前列腺癌适应症，暂未获批乳腺癌适应症。他拉唑帕利他拉唑帕利于2018年10月由FDA批准上市，用于治疗BRCA突变、HER2阴性晚期或转移乳腺癌的患者，成为第二个治疗该类型患者的PARP抑制剂。2023年4月1日，CDE官网公示，辉瑞（Pfizer）递交了甲苯磺酸他拉唑帕利胶囊的上市申请并获得受理。04靶向VEGF药物血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的关键因素，而血管新生是导致肿瘤发生、发展、转移的主要原因，因此，靶向血管新生的治疗也是乳腺癌治疗的重要策略之一。 目前，乳腺癌领域针对VEGF靶点的抗血管新生药物包括：靶向VEGF的贝伐珠单抗和靶向血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）的雷莫芦单抗，以及多靶点的舒尼替尼（sunitinib）、索拉非尼（sorafenib），这些药物均尚未获批乳腺癌的适应症。贝伐珠单抗贝伐珠单抗是一种抗VEGF单克隆抗体，基于E2100试验（NCT 00028990）的结果，FDA在2008年2月批准了贝伐珠单抗联合化疗（紫杉醇）用于治疗转移性乳腺癌。然而，由于贝伐珠单抗不能改善总生存期且药价昂贵，该方案的疗效和成本效益存在争议。这导致 FDA 于 2011 年撤销了该批准。相比之下，欧洲肿瘤内科学会 (ESMO) 和美国国家综合癌症网络 (NCCN)指南仍推荐该方案。05靶向PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）是细胞内存在的一个重要的信号通路，在乳腺癌的发生发展过程中，PI3K/AKT/mTOR通路发挥重要作用。它一方面处于HER2通路下游，PI3K/AKT/mTOR通路活化参与曲妥珠单抗治疗耐药；另一方面，它还与雌激素受体信号通路交互激活，参与内分泌治疗继发耐药的发病机制。mTOR抑制剂的代表药物为依维莫司（everolimus）。PI3K抑制剂代表药物为阿培利司（alpelisib）。依维莫司2013年8月NMPA批准依维莫司联合依西美坦用于治疗来曲唑或阿那曲唑治疗失败后的HR阳性、HER2阴性绝经后晚期女性乳腺癌患者。阿培利司阿培利司于2019年5月24日获美国FDA批准上市，与氟维司群联用治疗男性和绝经后女性的HR+/HER2-、携带PIK3CA突变的晚期转移性乳腺癌。同FDA还批准了一个筛选试剂盒，用以检测组织和/或液体活检中的PIK3CA突变。阿培利司是首个用于治疗该类乳腺癌的PI3K（具体是PI3Kα）抑制剂，目前已在我国香港获批上市。06Trop-2靶向ADC戈沙妥珠单抗戈沙妥珠单抗（sacituzumab govitecan）是一种由靶向滋养层细胞表面抗原-2（Trop-2）的抗体和拓扑异构酶抑制剂偶联组成的ADC。Trop-2是一种在许多类型肿瘤（包括超过 90% 的乳腺癌和膀胱癌）中均过度表达的细胞表面抗原。戈沙妥珠单抗有一个可与有效载荷拓扑异构酶Ⅰ抑制剂SN-38相连的可水解接头。这种独特的设计保证了在Trop-2 表达细胞和邻近微环境中的有效活性。2020年，FDA批准戈沙妥珠单抗的乳腺癌适应症。2022年，NMPA批准戈沙妥珠单抗用于既往至少接受过两种系统治疗（其中至少一种治疗针对转移性疾病），不可切除的局部晚期或转移性三阴性乳腺癌成人患者。07组蛋白去乙酰化酶抑制剂组蛋白是真核细胞染色质中的碱性蛋白质，与 DNA 共同组成核小体结构。组蛋白修饰（包括乙酰化、甲基化/去甲基化、泛素化/去泛素化等）可以改变染色质构型，导致转录激活或者基因沉默，从而调控基因表达。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂作为抗癌药的原理是通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高组蛋白的乙酰化水平引发染色质重塑，改变肿瘤发生的多条信号通路的基因表达，促进肿瘤细胞生长停滞、分化及凋亡。西达本胺西达本胺是我国自主研发生产的新一代HDAC抑制剂，西达本胺通过选择性抑制相关 HDAC亚型，产生针对多条信号传递通路基因表达的改变（即表观遗传改变），进而抑制肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡，同时对机体细胞免疫具有整体调节活性，诱导和增强自然杀伤细胞（NK）和抗原特异性细胞毒 T 细胞 （CTL介）导的肿瘤杀伤作用，与抗雌激素治疗药物具有抑制肿瘤生长的协同作用。2019年，NMPA批准西达本胺联合AI用于HR+/HER2-、绝经后、经内分泌治疗复发或进展的局部晚期或转移性乳腺癌患者。小结随着生物技术和医药研发的进步，肿瘤治疗已经从早期的化疗时代迈入了高度个体化的精准医疗时代。靶向治疗和免疫治疗的问世给肿瘤患者带来了更多希望，生存期和生活质量都得到明显改善。同时，我们也要注意合理使用药物，规范治疗方案，为每一位患者选择最合适的药物和治疗方式。通过积极开展基础研究，不断优化临床设计，我们有理由相信，随着科技的进一步发展，肿瘤治疗将会更加准确和高效。相关阅读1. 乳腺癌｜新型抗肿瘤药物临床应用指导原则（2022年版）2. 靶向HER2阳性乳腺癌：研究进展和未来方向（上）3. 靶向HER2阳性乳腺癌：研究进展和未来方向（下）4. PHARMACOL REV｜靶向雄激素受体治疗三阴性乳腺癌5. 乳腺癌靶向治疗和免疫治疗的临床进展——靶向治疗篇参考文献[1] edard PL, Hyman DM, Davids MS, Siu LL. Small molecules, big impact: 20 years of targeted therapy in oncology. Lancet. 2020 Mar 28;395(10229):1078-1088. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30164-1.[2] FDA (1998). These highlights do not include all the information needed to use Herceptin safely and effectively. See full prescribing information for Herceptin. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103792s5250lbl.pdf.[3] FDA (2018). These highlights do not include all the information needed to use TYKERB safely and effectively. See full prescribing information for TYKERB. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/022059s007lbl.pdf.[4] FDA (2010). Drugs at FDA. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/022334s6lbl.pdf.[5] FDA (2012). Drugs at FDA. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/appletter/2012/125409orig1s000ltr.pdf.[6] FDA (2019). FDA approves ado-trastuzumab emtansine for early breast cancer. Available at: https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-ado-trastuzumab-emtansine-early-breast-cancer[7] FDA (2015). These highlights do not include all the information needed to use IBRANCE safely and effectively. See full prescribing information for IBRANCE. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2019/207103s008lbl.pdf.[8] FDA (2022). Drugs at FDA. Available at: https://investor.lilly.com/news-releases/news-release-details/us-fda-broadens-indication-verzenior-abemaciclib-hr-her2-node.[9] FDA (2018). FDA approves first cancer drug through new oncology review pilot that enables greater development efficiency. Available at: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-cancer-drug-through-new-oncology-review-pilot-enables-greater-development[10] FDA (2017). Assessed date drugsatfda. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2017/208051s000lbl.pdf.[11] FDA (2022). FDA approves olaparib for adjuvant treatment of high-risk early breast cancer. Available at: https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-olaparib-adjuvant-treatment-high-risk-early-breast-cancer[12] FDA (2018). FDA approves talazoparib for gBRCAm HER2-negative locally advanced or metastatic breast cancer. Available at: https://www.fda.gov/drugs/drug-approvals-and-databases/fda-approves-talazoparib-gbrcam-her2-negative-locally-advanced-or-metastatic-breast-cancer#:~:text=On%20October%2016%2C%202018%2C%20the%20Food%20and%20Drug,%28gBRCAm%29%2C%20HER2%E2%80%91negative%20locally%20advanced%20or%20metastatic%20breast%20cancer[13] FDA (2019). FDA approves alpelisib for metastatic breast cancer. Available at: https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-alpelisib-metastatic-breast-cancer[14] FDA (2022). FDA approves fam-trastuzumab deruxtecan-nxki for HER2-low breast cancer. Available at: https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-fam-trastuzumab-deruxtecan-nxki-her2-low-breast-cancer[15] FDA (2020). FDA approves margetuximab for metastatic HER2-positive breast cancer. Available at:https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/fda-approves-margetuximab-metastatic-her2-positive-breast-cancer.[16] FDA (2023). Drugs at FDA. Available at: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2023/213411s004lbl.pdf.[17] Wahby S, Fashoyin-Aje L, Osgood CL, et al. FDA Approval Summary: Accelerated Approval of Sacituzumab Govitecan-hziy for Third-line Treatment of Metastatic Triple-negative Breast Cancer. Clin Cancer Res. 2021 Apr 1;27(7):1850-1854. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-3119.[18] Mohini Chaurasia, Romi Singh, Srija Sur,et al. A review of FDA approved drugs and their formulations for the treatment of breast cancer. Frontiers in Pharmacology. Volume 14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fphar.2023.1184472.责任编辑：肿瘤资讯-Paine排版编辑：肿瘤资讯-Paine               版权声明本文专供医学专业人士参考，未经著作人许可，不可出版发行。同时，欢迎个人转发分享，其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容，须获得授权，且在醒目位置处注明“转自：良医汇-肿瘤医生APP”。