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04月03日的《热心肠日报》，我们解读了 15 篇文献，关注：心血管，IBD，昼夜节律，紧密连接蛋白，肠神经，肠道运动，肠道生理，Gritstone bio，爱荷华州立大学，乐普医疗，济群医疗，Get Joy。 该篇日报由R·AI辅助创作生成，人工审核校对。 Cell：肠道菌群+代谢组分析，揭示出代谢胆固醇的肠菌 Cell——[64.5] ① 本研究对弗雷明汉心脏研究队列的1429人进行了粪便宏基因组学和非靶向代谢组学分析，探索肠道菌群对心血管疾病（CVD）的影响和机制；② 多组学分析揭示了与CVD指标相关的微生物和代谢物，并分析了与CVD相关的微生物途径（如类黄酮、γ-丁基甜菜碱和胆固醇代谢）；③ Oscillibacter 菌属物种与粪便和血液胆固醇水平降低相关；④ 结合分子网络和蛋白质语言模型进行功能预测，鉴定出 Oscillibacter 物种编码的保守的胆固醇代谢基因（如 IsmA 和 CgT 的同系物）和衍生产物（如胆甾烯酮和糖基化胆固醇）；⑤ 体外实验证实，源自人肠道的 Oscillibacter 分离株能有效摄取胆固醇并将其转化为胆甾烯酮、糖基化胆固醇和羟基胆固醇等代谢物；⑥ 这些发现为靶向肠道菌群以改善心血管健康提供了新的科学依据。 【原文信息】 Gut microbiome and metabolome profiling in Framingham heart study reveals cholesterol-metabolizing bacteria 2024-04-02 , doi: 10.1016/j.cell.2024.03.014 Cell：结肠炎中的细胞生物地理学研究 Cell——[64.5] ① 本研究利用MERFISH技术分析了小鼠结肠中的135万个细胞、940个基因的表达谱，揭示了结肠炎和恢复过程中的细胞和空间重塑；② 确定了健康细胞群和炎症相关细胞群的多样性，绘制了它们的空间组织，并揭示了它们在炎症中的极化或招募，炎症相关成纤维细胞（IAF）反应比预期更加多样化；③ 基于细胞群的空间组织特点，定义了25个细胞邻域（neighborhood），并揭示了这些邻域在肠道炎症不同阶段的进展性演变，这种组织重塑一定程度上是由多种IAF定义的，它们具有独特的表达谱、空间定位、细胞间互作和健康成纤维细胞起源；④ 在人类溃疡性结肠炎中发现了类似的特征，表明这些过程在人类中可能是保守的。 【原文信息】 Charting the cellular biogeography in colitis reveals fibroblast trajectories and coordinated spatial remodeling 2024-04-02 , doi: 10.1016/j.cell.2024.03.013 Nature子刊：发育过程中，肠道昼夜节律如何形成？ Nature Communications——[16.6] ① 本研究揭示了在果蝇成体肠道中昼夜节律时钟的突然出现及其与环境逐渐同步的过程，为理解昼夜节律在发育和干细胞系中的作用提供了新视角；② 生物钟在成体果蝇肠道中突然开始，并在肠道发育完成后逐渐与环境同步，这种延迟是因为早期阶段的个别细胞缺乏完整的生物钟基因网络；③ 随着肠道的发育，生物钟首先在肠道干细胞中形成，Ecdysone和Hnf4信号的变化影响Clk/cyc的转录活性，从而驱动tim、Pdp1和vri的表达；④ 在成熟肠道中，干细胞谱系的分化暂时中断了不同分化后代中的生物钟活性，类似于早期发育中没有生物的现象。 【原文信息】 The emergence of circadian timekeeping in the intestine 2024-02-27 , doi: 10.1038/s41467-024-45942-4 北肿团队Nature Reviews：紧密连接蛋白claudin 18.2——治疗胃癌新靶点 Nature Reviews Clinical Oncology——[78.8] ① 日本国立癌症研究中心东医院研究学者与北京大学肿瘤医院沈琳教授团队合作，围绕紧密连接蛋白claudin 18.2在胃癌治疗中的潜力进行综述性总结；② Claudin 18.2特异性地表达于非恶性胃黏膜上皮细胞，但在消化系统恶性肿瘤中会异位至肿瘤细胞表面并高表达；③ 两项关键的III期临床试验证明，针对claudin 18.2的抗体zolbetuximab显著提高了晚期胃癌患者的无进展生存期和总生存期，标志着claudin 18.2成为胃癌治疗的一个有效靶点；④ 除了单克隆抗体外，双特异性抗体、抗体药物偶联物、嵌合抗原受体T细胞和基于mRNA的方法等新型治疗手段在针对claudin 18.2表达的胃癌患者中展现出巨大潜力；⑤ 针对claudin 18.2的治疗策略有望扩展到其他claudin 18.2阳性的实体瘤疾病中。 【原文信息】 Claudin 18.2 as a novel therapeutic target 2024-03-19 , doi: 10.1038/s41571-024-00874-2 肠道紧密连接蛋白Claudin-2或是脓毒症的潜在治疗靶点 PNAS——[11.1] ① 本研究揭示了在脓毒症中，claudin-2的上调和孔径通道通透性的增加是导致菌群失调、肠道损伤、炎症、病原体控制无效和败血症患者死亡率增加的关键中间体；② 脓毒症患者和模型小鼠中，小肠上皮细胞的claudin-2表达被选择性上调，同时细胞间孔径通道的通透性增加；③ 在脓毒症模型中，claudin-2敲除（KO）可阻止孔径通道通透性的增加，减少IL-17的产生、T细胞活化，并限制肠道损伤，这些效应与KO小鼠腹腔液的中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和细菌数量的减少相关；④ claudin-2敲除显著提高了脓毒症小鼠的存活率，且将claudin-2敲除且诱导脓毒症小鼠的盲肠菌群移植给WT健康小鼠的致病性显著低于野生型小鼠；⑤ claudin-2的表达对败血症期间激活的致命级联反应的进展具有显著影响，表明claudin-2可能是败血症患者中非常具有潜力的治疗靶点。 【原文信息】 Claudin-2 upregulation enhances intestinal permeability, immune activation, dysbiosis, and mortality in sepsis 2024-02-27 , doi: 10.1073/pnas.2217877121 浙大团队：小鼠肠神经系统完全源自迷走神经嵴细胞 Gastroenterology——[29.4] ① 浙江大学医学院的王良与国外团队合作发表文章，通过遗传工程鼠胚和细胞迁移实验，揭示了哺乳动物肠神经系统（ENS）完全源自迷走神经嵴细胞（vNCCs），推翻了先前关于骶部神经嵴细胞（sNCCs）也有贡献的观点；② 构建基因改造小鼠，对包括vNCCs的pan-NCCs或不包括vNCCs的骶/躯干部神经嵴细胞（s/tNCCs）进行谱系追踪，发现pan-NCCs和s/tNCCs对已经建立的神经嵴细胞（NCCs）有贡献，但只有pan-NCCs对ENS有贡献；③ 双谱系追踪结合三维重建显示，s/tNCCs以复杂的模式定居在骨盆神经丛和直肠周围组织中，解释了以往对其贡献的混淆；④ 共培养实验显示，自主神经、感觉和神经管外植物向直肠的细胞迁移是非特异性的；⑤ 对ENS前体进行谱系追踪，证明小鼠ENS的起源是独家由vNCCs提供。 【原文信息】 Sacral neural crest-independent origin of the enteric nervous system in mouse 2024-03-05 , doi: 10.1053/j.gastro.2024.02.034 新方法更有效对肠神经进行计数 Gastroenterology——[29.4] ① 这项研究发现相比于传统的组织切片技术，组织透明化和三维成像技术能更好地分析肠神经系统（ENS）的结构信息，揭示了ENS结构在儿童期间会发生变化，这种三维ENS解剖学可能为人类肠道运动障碍，包括赫什朋病（Hirschsprung disease, HD），提供新的视角；② 对11个人类结肠和1个回肠样本以及已知无肠道问题的远端结肠标本进行清晰、染色和共聚焦显微成像；③ 从新生儿到60岁的人类结肠中，肠神经系统的结构随年龄变化，包括肌间丛面积、ENS神经节面积、肌间丛中神经节所占比例、每平方毫米神经元数量和神经元Feret直径等指标；④ 三维成像的神经元计数显示高度可重复性，新生儿结肠的高ENS密度使得在较小区域内（500 x 500 μm2）也能进行可靠的神经元计数；⑤ HD病的远端肠道缺乏ENS，其样本在近端边缘肠神经元密度上变化了8倍，并在切除的肠道中具有多样的ENS结构。 【原文信息】 Three-dimensional imaging of the enteric nervous system in human pediatric colon reveals new features of Hirschsprung disease 2024-03-15 , doi: 10.1053/j.gastro.2024.02.045 Cell子刊：肠神经系统如何影响肠道微生物和肠道生理? Cell Reports——[8.8] ① 本研究揭示了特定的外周神经元激活对小鼠肠道微生物群落及其代谢产物和宿主生理的影响，为理解肠道神经系统与微生物之间的相互作用提供了新见解；② 通过激活表达乙酰胆碱转移酶（ChAT）或酪氨酸羟化酶（TH）的肠道相关神经元，发现这些神经元的不同亚型在塑造微生物群落结构（包括调节胆汁酸谱和真菌定植方面）发挥着广泛作用；③ 激活ChAT+或TH+神经元均可增加粪便排泄量，但只有ChAT+激活才会导致结肠收缩增加和类似腹泻的液体分泌；④ 这些结果表明，特定的外周神经元亚型激活在不涉及大脑信号的情况下，以不同方式调节小鼠的肠道微生物群落和胃肠生理。 【原文信息】 Peripheral neuronal activation shapes the microbiome and alters gut physiology 2024-03-21 , doi: 10.1016/j.celrep.2024.113953 外周5-羟色胺神经元或调节肠道蠕动和焦虑样行为 Current Biology——[9.2] ① 本研究揭示了外周5-羟色胺神经元在调节肠道蠕动和焦虑样行为中的作用，为开发新型治疗方法提供了参考；② 通构建一种外周神经元中缺乏产生5-羟色胺酶Tph2、但中枢神经元中的Tph2保持完整的小鼠，发现全身敲除Tph2的小鼠会表现出领土攻击性的增加，而仅在外周神经元中敲除Tph2没有这种现象；③ 与全身Tph2敲除小鼠相似，这些条件性敲除Tph2的小鼠展现处肠道蠕动减少和焦虑样行为降低；④ 这些结果表明，外周5-羟色胺神经元对肠道蠕动和焦虑样行为的控制有重要作用。 【原文信息】 Peripheral serotonergic neurons regulate gut motility and anxiety-like behavior 2024-02-26 , doi: 10.1016/j.cub.2023.12.072 果蝇前肠通过感官信息协调消化和免疫反应 PNAS——[11.1] ① 本研究分析了果蝇前肠如何通过感官信息协调消化和免疫反应，发现在动物进化过程中，前肠以一种保守的方式协调饮食感知、激素调节和免疫；② 通过GFP标记和Gal4报告基因系列验证了不同细胞类型，发现与前肠相关的神经内分泌细胞通过协调肠道活动与营养、菌群和昼夜周期发挥重要的整合作用；③ 前胃（PV）由多种上皮细胞构成，PV分泌沿肠道排列的围食膜基质，控制消化和肠道菌群的相互作用，在靠近肠细胞的地方会产生大量黏液，类似于哺乳动物的肠黏膜；④ 食道和唾液腺表达的分泌蛋白排列在食道表面，其中一些可能产生前肠共生生态位，容纳特定的肠道菌群。 【原文信息】 Cellular and molecular organization of the Drosophila foregut 2024-03-05 , doi: 10.1073/pnas.2318760121 Gritstone bio公布癌症疫苗GRANITE治疗结直肠癌积极结果 ① 4月2日，Gritstone bio公司宣布，其个体化癌症疫苗GRANITE在结直肠癌临床2/3期试验中显示出积极结果；② GRANITE联合免疫检查点抑制剂及氟嘧啶/贝伐珠单抗作为一线维持治疗，可改善微卫星稳定性结直肠癌（MSS-CRC）患者的疾病无进展生存期（PFS）；③ MSS-CRC患者占结直肠癌患者的80-85%，其肿瘤通常对免疫疗法不敏感；④ 临床试验共104位患者入组，初步分析67位患者数据显示，GRANITE组患者PFS有早期获益趋势；⑤ GRANITE疫苗已获得FDA的快速通道资格，研究预计2024年第三季度获得成熟的PFS数据，2025年上半年获得总生存期数据。 【原文信息】 速递 | 改善结直肠癌患者PFS！有效治疗“冷”肿瘤的mRNA疫苗结果出炉 2024-04-02 , 药明康德 爱荷华州立大学获250万美元NIH资助研究肠-心脏轴 ① 近日，美国爱荷华州立大学科研人员Ajit Vikram博士获得美国国立卫生研究院（NIH）250万美元（约合人民币1808万元）资助，用以研究肠-心脏轴；② 该项目旨在揭示肠道微生物如何影响心脏健康，特别是在心脏超负荷工作条件下的健康问题；③ Vikram的实验室自2017年以来一直在研究肠道微生物如何能够保护心脏免受疾病影响，其近期研究发现，肠道微生物调节的microRNA（miR-204）在应对心脏压力中起着关键作用；④ 未来，研究将结合微生物组学、宏基因组学、代谢组学、免疫学以及microRNA相关知识，以期能发现治疗心力衰竭的潜在治疗靶点。 【原文信息】 Vikram receives $2.5M R01 to examine the heart-gut connection 2024-04-01 , University of Iowa 乐普医疗MWN101两项2期临床完成首例患者给药 ① 3月29日，乐普医疗宣布，旗下上海民为生物自主研发的MWN101注射液两项2期临床试验完成首例受试者给药；② MWN101是国内首个GLP-1/GCGR/GIP-Fc融合蛋白药物，用于治疗2型糖尿病和肥胖或超重；③ 该药物通过血糖依赖性刺激胰岛素分泌、延缓胃排空等机制调节人体代谢和控制血糖；④ 两项2期临床研究旨在评价MWN101治疗2型糖尿病和超重或肥胖患者的有效性、安全性及药代动力学特征。 【原文信息】 乐普医疗:关于自愿披露GLP-1/GCGR/GIP-Fc融合蛋白MWN101完成Ⅱ期临床试验首例受试者给药的提示性公告 2024-03-29 , 股吧 济群医药IBD新药GP-033临床获批 ① 近日，济群医药新药GP-033软胶囊获得国家药监局药品审评中心审评通过和临床批件；② GP-033拟定适应证为：治疗炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎和克罗恩病等；③ GP-033是一种新一代钙调磷酸酶抑制剂，与现有药物相比，GP-033活性强3倍以上，安全性更高，治疗窗更宽；④ 鉴于GP-033的活性和安全性，其在较低剂量下可用于中重度溃疡性结肠的缓解和维持治疗，临床有效性和安全性明显优于经典药物环孢素。 【原文信息】 再下一城！济群医药IBD新药GP-033喜获临床批件 2024-03-30 , 济群医药科技 Get Joy宣布与Phillips Pet Food and Supplies建立合作 ① 3月28日，Get Joy宣布与宠物食品分销商Phillips Pet Food and Supplies建立合作伙伴关系；② 本次合作旨在将Get Joy的犬类健康产品通过直销和零售渠道覆盖全美国；③ Get Joy成立于2019年，专注于研发营养健康产品来提升犬类及其家庭的生活质量；④ 其产品线包括冻干餐、新鲜餐食、冻干食品零食、咀嚼片以及即将推出的补充剂；⑤ 其产品将通过Phillips Pet Food and Supplies在美国的6000多家独立宠物零售商进行销售。 【原文信息】 Get Joy partners with Phillips Pet Food and Supplies 2024-03-28 , Pet Food Industry 感谢本期日报的审核者：mildbreeze，章台柳，RZN，Richard，lxx 点击阅读过去10天的日报： 0402 | 保肠护关节：高分研究揭示抵御关节炎的肠道因子 0401 | 3月，最值得关注的35篇肠道健康要闻！ 0331 | 聚焦特殊人群：老年人和孕妈妈的饮食新知 0330 | Akk菌或是免疫性肾病帮凶？Science子刊揭示机制 0329 | 33页综述纵论：超加工食品健康转型的新策略 0328 | Science子刊：锁定肠道中让病毒逃脱免疫的"避风港" 0327 | 10文聚焦菌群-肠-脑轴研究新进展 0326 | 100分综述详解：IBD细胞因子疗法最前沿 0325 | 大肠癌患病为何年轻化？遗传与生活方式的双重影响 0324 | 大型临床试验：补钙补D如何影响老年女性长期健康？

白细胞介素(IL)-12主要由激活的先天免疫细胞（如巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞）产生，是一种有效的Th1型细胞因子。IL-12可以通过增强IFN-γ的产生来激活T细胞和NK细胞，以驱动CD4 T细胞向Th1型分化，并通过颗粒酶B和穿孔素分泌增强NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞溶解能力。通过这些作用，IL-12有助于重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME），促进细胞毒性细胞在肿瘤细胞处募集，增强杀伤效率，介导肿瘤消退。然而，基于全身给药的重组IL-12蛋白治疗效果普遍不佳，并且存在严重的剂量限制性毒性，潜在解释是以耐受剂量向癌症患者TME递送的IL-12不足，无法使得肿瘤暴露于有效或高剂量的IL-12下。另一方面，与全身给药IL-12治疗相比，瘤内注射IL-12治疗具有明显的优势，包括提高IL-12的瘤内浓度，减少脱靶毒性和不良反应。然而，瘤内IL-12治疗的缺点也很明显，如可及肿瘤病灶的局限性和同一肿瘤病灶重复注射的局限性。因此，开发具有更优越治疗效果和更低毒性的IL-12治疗新型治疗方式将极大地造福晚期癌症患者。2024年3月28日，嘉晨西海研究团队在Scientific reports上发表了题为“Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses”的研究论文。嘉晨西海探究了其编码IL-12的脂质纳米颗粒（LNP）封装的自复制RNA（srRNA）候选产品JCXH-211静脉注射治疗癌症的可行性。JCXH-211在荷瘤小鼠中的局部（瘤内）和全身（静脉内）给药均诱导肿瘤组织中IL-12的高水平表达，导致肿瘤微环境的调节和抗肿瘤免疫的全身激活。在多个小鼠实体瘤模型中，静脉注射JCXH-211不仅根除了预先建立的大肿瘤，还诱导了保护性免疫记忆，阻止了肿瘤的复发生长，在荷瘤小鼠和非人灵长类动物中均没有引起明显的全身毒性。自复制RNA平台自复制RNA（srRNA）是一种治疗和疫苗RNA平台，源自工程化的正链RNA病毒基因组。srRNA由5'帽类似物、5'和3'非翻译区（UTR）、poly(A)尾以及编码四种病毒非结构蛋白（NSP）和目标蛋白的多个编码序列组成。这些NSP形成一个复合物，赋予RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，以启动srRNA编码的目的基因的复制。由于srRNA的自我复制活性，与传统mRNA疫苗相比，srRNA疫苗已被证明只需要低得多的剂量就能达到同等疫苗效果。病毒RNA是RNA感应模式识别受体（PRR）的有效激活剂，例如toll样受体（TLR）3、TLR7、TLR8 和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体，可诱导I型IFN的表达，例如IFN-α和IFN-β。I型干扰素是肿瘤疫苗和传染病疫苗的有效佐剂，也是有效的免疫调节剂，可以辅助将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。与病毒RNA一样，srRNA可以激活多种RNA感应PRR，促进人和小鼠细胞产生I型IFN，TME中激活的IFN信号通路已被证明与化疗和免疫治疗的多种癌症患者的良好预后呈正相关。因此，srRNA可以为癌症免疫治疗提供一个良好的平台。IL-12 srRNA-LNP序列与配方设计本研究中，IL-12 srRNA来源于正链RNA病毒家族中的甲病毒委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）TC-83株。该IL-12 srRNA包含Cap 0类似物、TC-83 5'和3' UTR、poly(A)尾部、TC83 NSP 1-4基因和单链IL-12基因（图1）。单链IL-12基因编码p40和p35亚基，通过柔性接头融合。图1. JCXH-211 srRNA序列设计JCXH-211使用了嘉晨西海专有的新型可电离阳离子脂质XH-07开发的LNP来进行IL-12 srRNA的体内递送（如图2）。srRNA-LNPs由XH-07，胆固醇，DSPC和DMG-PEG2000四种脂质组分以40:48:10:2的摩尔比和6的脂质/RNA（N/P）比混合组装而成。这些srRNA-LNP的平均直径约为80 nm，多分散指数为0.07-0.16，包封效率>85%。【JCXH-211使用的可电离阳离子脂质XH-07和srRNA序列在国际专利申请“INTERLEUKIN-12 SELF-REPLICATING RNA AND METHODS”（PCT/CN2022/139738）中进行了描述。】图2. 可电离阳离子脂质XH-07结构全身注射的JCXH-211药代动力学研究由于肿瘤具有快速但异常的血管生成和功能失调的淋巴引流，因此与正常器官相比，静脉内给药时，LNP在肿瘤中的滞留时间延长，积累可能增加。另一方面，恶性肿瘤由于其免疫抑制状态，可能具有较普通mRNA增强的srRNA复制和/或翻译的偏倚性。为此，嘉晨西海探究了全身注射JCXH-211的生物分布，以及是否能诱导与肿瘤内注射具有相当的抗肿瘤作用。srRNA生物分布如图3A所示，与注射前相比，静脉注射JCXH-211 12h后，肿瘤、血液、脾脏、肺、肾、肝脏、心脏、脑和卵巢中的srRNA水平显著升高。肿瘤引流淋巴结（DLN）和骨髓中的srRNA水平没有显著变化。其中，肿瘤表现出的srRNA水平明显高于其他器官组织部位（图3B）。有趣的是，静脉注射7天后，血液、肺、DLN、肝、心脏和骨髓中的srRNA水平恢复到注射前的水平，与注射后12 h的峰值水平相比，脾、肾、脑、卵巢中的srRNA水平虽然高于注射前，但也观察到显著降低（图3A）。相比之下，在静脉注射7天后，肿瘤内表达的srRNA水平比正常器官高200倍以上（图3C）。图3. JCXH-211的药代动力学研究IFN-γ水平全身注射JCXH-211后，肿瘤和血液中IFN-γ蛋白水平均显著升高，并在注射后3-7天达到峰值（图4C，D）。使用1.06 g/mL作为标准小鼠血清密度，则第7天血清中的平均IFN-γ浓度约为1098.28 pg/g，而第7天肿瘤中的平均IFN-γ浓度约为21,338.70 pg/g，因此肿瘤组织在注射后第7天的IFN-γ量比血液高19倍以上（P = 0.0077）。数据表明，静脉注射JCXH-211导致IL-12 srRNA和IL-12信号转导的下游效应分子IFN-γ主要在肿瘤组织中表达延长。图4. IL-12下游细胞因子IFN-γ的表达LNP生物分布研究团队进一步检测了LNP-srRNA制剂在不同组织中的直接生物分布。小鼠静脉注射Cyanine 5（Cy5）标记的LNP-srRNA-IL-12。在注射后2小时至24小时在肝脏中检测到强荧光信号。肿瘤、脾脏、肾脏和肺显示出低至中等水平的荧光信号，而在心脏中检测到极少的荧光（图5）。这一结果表明，LNP的积累似乎主要发生在肝脏中，而不是在静脉注射后立即发生在肿瘤中。图5. LNP-srRNA的生物分布结合srRNA的分布研究，研究团队推测，肿瘤细胞更倾向于srRNA复制和/或翻译，从而导致了IL-12的优先表达。体外实验中，小鼠B16F10、MC38、EMT6肿瘤细胞、健康小鼠脾细胞和结肠上皮细胞用编码IL-12p70的srRNA通过脂质胺或LNP进行转染。转染后48 h在上清液中测定IL-12p70的含量。结果显示，健康小鼠脾细胞和原代结肠上皮细胞均未表达IL-12p70，肿瘤细胞比健康的原代细胞更能驱动srRNA的IL-12p70表达（图5B）。小结JCXH-211的药代动力学研究表明，肿瘤组织中srRNA的选择性高表达水平可能是由于肿瘤环境中优先促进srRNA复制、表达而不是由于LNP在肿瘤局部高水平积累的结果，因此静脉注射JCXH-211后，小鼠肿瘤内srRNA积累水平明显高于其他正常组织。需要注意的是，本研究未评估静脉给药JCXH-211后每个器官中产生IL-12的特定细胞类型。数据显示，srRNA主要在注射部位肌肉、引流淋巴结和脾脏中表达。srRNA是直接分布到淋巴结和脾脏，还是进入免疫细胞，随后转运到淋巴结和脾脏，仍然难以捉摸。安全性研究为研究静脉注射JCXH-211是否会引起全身毒性，研究团队测定了JCXH-211治疗前后荷瘤小鼠血液中天冬氨酸氨基转移酶（AST）等肝毒性生物标志物的水平。在B16F10荷瘤小鼠中，对照组和JCXH-211处理组的血清AST水平无显著差异。后续观察到接受对照治疗的荷瘤小鼠随着肿瘤体积的增加而逐渐升高血清AST水平，这与先前研究表明的具有大B16F10肿瘤的小鼠血液中肝毒性生物标志物水平升高是一致的。图6. 注射后血清AST水平此外，将JCXH-211以100μg的剂量静脉注射给两只食蟹猴模型中，每周一次，持续3周。首次给药JCXH-211后血清中人IL-12p70的分析显示，两只动物中人IL-12p70的表达升高。治疗期间或治疗后体重、进食量、体温和心电图参数均无异常变化。在整个研究过程中，血液化学分析没有发现肝脏或肾脏毒性的证据。给药7天后，动物大体解剖结构没有观察到异常，表明静脉注射JCXH-211将减轻肿瘤负荷，而不会产生严重的全身毒性。表1. 食蟹猴模型给药实验有效性验证B16F10黑色素瘤B16F10小鼠黑色素瘤的肿瘤浸润T细胞量明显少于MC38小鼠结肠肿瘤，因此 B16F10小鼠黑色素瘤被认为是一种对免疫检查点抑制剂具有抗性的免疫“冷”肿瘤。前期实验证明，用IL-12 srRNA进行瘤内治疗可增加B16F10肿瘤中的T细胞和NK细胞并抑制B16F10肿瘤生长。实验观察到，静脉注射JCXH-211以剂量依赖性抑制B16F10小鼠黑色素瘤的生长，即使对肿瘤约为800毫米的小鼠也得到了显著抑制的治疗效果，尽管荷瘤小鼠的肿瘤浸润T细胞和NK细胞没有显著增加（图7A,B,C,D）。此外，JCXH-211静脉注射治疗降低了B16F10荷瘤小鼠中肿瘤浸润性多形核髓源性抑制细胞（PMN-MDSC）的水平，并增加了TME中程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阳性T细胞和NK细胞的水平（图7E,F）。图7. JCXH-21全身治疗后肿瘤浸润免疫细胞的分析与单独使用JCXH-211和抗PD-1抗体相比，JCXH-211和抗PD1抗体的联合使用显著提高了B16F10荷瘤小鼠的存活率，有50%的B16F10荷瘤小鼠在研究期间（53天）达到完全缓解（无肿瘤生存）（图8）。图8. JCXH-211和抗PD1抗体的协同抗肿瘤作用EMT6乳腺肿瘤已知EMT6乳腺肿瘤具有相对高水平的肿瘤浸润淋巴细胞，对免疫检查点抑制剂治疗敏感。研究显示，JCXH-211单药治疗呈剂量依赖性抑制EMT6荷瘤小鼠的肿瘤生长。在用JCXH-211单药治疗三次后，EMT6荷瘤小鼠的完全缓解率比B16F10小鼠高出六倍，且单次治疗也能够产生相当的完全缓解率（图9）。图9. JCXH-211对 EMT6乳腺肿瘤的治疗效果总结本研究表明，基于srRNA-LNP的IL-12疗法可以通过多种机制将IL-12浓缩在肿瘤组织中，包括先天免疫抑制TME和srRNA的自我复制特性，使肿瘤暴露于高剂量和有效剂量的IL-12。嘉晨西海肿瘤内给药JCXH-211治疗皮肤癌或晚期实体癌患者项目已经进入I期临床试验（NCT05539157和NCT05727839）。根据目前的研究结果，预计静脉注射JCXH-211将成为治疗不符合瘤内注射IL-12治疗条件的癌症患者的潜在选择。静脉注射治疗不需要特殊的医疗设备，如成像引导系统和专门操作团队，因此可以在社区医疗设施中使用，具有潜在的应用前景。参考资料[1]Wang, Z., Chen, Y., Wu, H.et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep 14, 7366 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-57997-w识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：IL-12作为一种天然存在的细胞因子，在机体对癌症的免疫抑制过程中起着关键作用，并且在多项临床前研究中IL-12始终显示出有效的抗肿瘤活性，但在人体可耐受剂量下，重组IL-12蛋白在临床试验中无法显示其预期的治疗效果。因此，人们开始考虑将IL-12局部递送至肿瘤微环境。随着LNP递送技术的日渐成熟，人们转向基于mRNA技术的IL-12抗肿瘤药物。2020年，Moderna研究团队在Clinical Cancer Research（1区, 影响因子11.5）发表文章：《Intratumoral IL-12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment》。研究者开发了一种IL-12 mRNA-LNP瘤内注射制剂，用于治疗实体瘤，在细胞、多种小鼠模型和肿瘤患者立体培养物中证实了IL-12 mRNA-LNP具有强效的抗肿瘤活性。本期内容，我们将详细讨论IL-12 mRNA-LNP的序列设计、体内外表达及其抗肿瘤机制。01IL-12抗肿瘤机制响应PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂（ICB）的患者往往具有炎性T 辅助细胞（TH1）极化肿瘤微环境 （TME），其特征是表达干扰素γ（IFNγ）和 PD-L1。因此，诱导患者肿瘤微环境转向TH1 可能会增强对 ICB 无反应患者的抗肿瘤反应。上篇文章中，我们详细解读了IL-12通过 TH1参与细胞免疫：一文读懂|IL-12 mRNA蛋白替代疗法实体瘤研究进展IL-12作为 TH1 免疫反应的中枢介质，在启动抗肿瘤免疫中发挥着关键作用。IL-12 诱导TH1 细胞分化，并增强自然杀伤细胞 （NK）、自然杀伤 T 细胞 （NKT） 和细胞毒性 T 细胞的活化和细胞毒性活性。IL-12 的许多下游效应是通过先天性和适应性免疫细胞诱导关键的 TH1 细胞因子 IFNγ 介导的。IL-12 直接或通过 IFNγ 起作用，以促进抗原呈递，减少髓系免疫抑制，并通过产生其他 TH1 趋化因子包括 IFNγ 诱导蛋白 10 （IP-10）来增强 T 细胞募集。02mIL-12 mRNA序列设计mIL-12 mRNA 由野生型小鼠 IL-12b 和 IL-12a 序列（NM_001303244.1 和 NM_001159424.2）组成。MEDI1191 mRNA由优化的人 IL-12A 和 IL-12B mRNA 序列（人 NM_002187.2 和 NM_000882）组成。在MEDI1191 和 mIL-12 mRNA序列中， IL-12B 和 IL-12A序列之间添加接头序列，以生成连接单体 IL-12p70 （IL-12B-IL-12A）。保留IL-12B信号肽，使其能够分泌。根据Uniprot（小鼠P43431和人P29459）序列，去除掉小鼠和人IL-12A的头22个氨基酸。对于膜结合型mIL-12来说，将单链 IL-12B-IL-12A C末端通过多肽连接子（SG3SG4SG4SG4SG3SLQ）与PDGFRβ 跨膜结构域相连，然后，在细胞内末端连接上G4S连接子和 V5 肽标签。在IL-12 mRNA 3′ UTR 中掺入了一个 miR122 结合位点，抑制肝细胞中 IL-12 蛋白的产生，而不影响癌细胞中的水平。除常规mRNA外，近年来自复制RNA(saRNA)和环状RNA(circRNA)也备受关注。耀海生物基于三种RNA技术，设计并制备了IL-12 mRNA、IL-12 saRNA和IL-12 circRNA预制品，均在细胞中高表达。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）。另一点需注意的是，由于人源IL12p70在小鼠体内没有生物学活性，因此研究者设计了小鼠(m) IL12 mRNA用于小鼠模型。03IL-12 mRNA表达验证3.1 mIL-12 mRNA体外表达验证mIL-12 mRNA-LNP转染MC38 细胞，mIL-12 表达水平呈现剂量依赖效应。mIL-12 mRNA 转染细胞后表达释放至上清中的mIL-12p70 蛋白与异二聚体重组蛋白 mIL-12p70 具有相当的活性，刺激CD8+T细胞分泌相同水平的IFNγ。左图:不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP转染MC38细胞24h后的mIL-12 表达水平右图: 异二聚体重组蛋白或者源自mIL-12 mRNA转染的Hela细胞上清的mIL-12p70刺激CD8+T细胞分泌相同水平的IFNγ。3.2 mIL-12 mRNA体内表达验证研究人员在皮下同基因肿瘤移植小鼠（对 ICB 具有不同敏感性）中研究了mIL-12 mRNA 的药效作用和抗肿瘤活性。SC A20 淋巴瘤模型是一个完善的ICB 敏感系统。与 MC38 敏感 (MC38-S) 肿瘤相比，在皮下植入MC38 结直肠细胞系的 MC38 耐药 (MC38-R) 变体后，小鼠对 PD-1 /PD-L1 的抑制反应较差。在这两种肿瘤模型中，mIL-12 mRNA 在瘤内诱导 mIL-12p70 呈现剂量依赖性表达，同时，这也使得循环血浆中的mIL-12p70 浓度增加。IL-12 水平在给药后 7 天仍保持升高，相反，注射重组 IL-12 只有5 至 10 小时的半衰期。 在MC38-R皮下荷瘤小鼠中瘤内注射不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP 在A20皮下荷瘤小鼠中瘤内注射不同剂量的mIL-12 mRNA-LNP04抗肿瘤活性研究在A20、MC38-S 和 MC38-R 荷瘤小鼠中，瘤内注射单剂量mIL-12 mRNA可剂量依赖性地延迟肿瘤生长、消退肿瘤，并且，在某些情况下，能够出现完全缓解（CR）。与 mIL-12 mRNA 相比，注射非翻译对照mRNA对于肿瘤生长或者小鼠存活率没有影响。在三种荷瘤小鼠模型中，即使注射最低剂量0.05ug mIL-12 mRNA也可显著延长小鼠存活率，当然，如果将注射剂量提升至0.5 μg 和 5 μg mIL-12 mRNA ，小鼠存活率也随之增加。与 MC38-R 模型相比，mIL-12 mRNA 在 A20 和 MC38-S 模型中具有更高的抗肿瘤活性，与之前观察到的 A20 和 MC38-S 模型对 PD-1/PD-L1 阻断的敏感性高于 MC38-R 一致 。在MC38-S、A20或MC38-R模型小鼠中，与单剂注射 mIL-12 mRNA ，每周重复注射并不能显著增强mIL-12 mRNA抗肿瘤活性。mIL-12 mRNA耐受性良好。更重要的是，在几乎所有对mIL-12 mRNA具有 CR 的三种小鼠模型中，重新植入肿瘤部位均未出现肿瘤生长。研究者认为，在大多数注射mIL-12 mRNA且出现CR的小鼠中，已经建立起对A20、MC38-S 或 MC38-R 肿瘤细胞的免疫记忆反应。在多个同基因模型中，单次瘤内注射 mIL-12 mRNA 可诱导剂量依赖性肿瘤消退05总结 研究设计了一款IL-12 mRNA-LNP(MEDI1191)药物，其mRNA序列特征为：优化后的人源IL-12b 和 IL-12a 序列通过多肽连接，并且在IL-12 mRNA的3′ UTR 中掺入了一个 miR122 结合位点，以抑制肝细胞中IL-12的产生，但不影响癌细胞的水平。但需注意的是，由于人源IL12p70在小鼠体内没有生物学活性，因此研究者设计了小鼠(m) IL12 mRNA用于小鼠模型。随后，研究通过体内外试验验证了IL-12 mRNA-LNP的翻译表达效率和抗肿瘤活性，一系列临床前研究为MEDI1191的进一步开发提高了数据支撑。后续文章，菌菌将持续更新MEDI1191的抗肿瘤机制和临床研究结果，敬请关注！专业名词解释同源肿瘤异体移植小鼠模型（Syngeneic model）：是将同种背景来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠。受体小鼠拥有完整的鼠源免疫系统，具有完全的免疫活性，其免疫系统与同种移植肿瘤组织相容，能最大化模拟肿瘤微环境的真实生活情况；且重复性和可操作性好，适用于大规模筛选。MC38：一种常用的小鼠结肠癌细胞系。它具有高突变负担，对免疫检查点免疫疗法敏感，并且已经报道了对新抗原的内源性CD8+ T细胞反应。SC A20：一种常用的小鼠B细胞淋巴瘤模型，20模型可作为皮下和全身（静脉注射）模型提供。A20模型适用于评估免疫治疗药物的效力，包括免疫检查点抑制剂和免疫激动剂的作用。参考文献 [1] Hewitt SL, Bailey D, Zielinski J, et al. Intratumoral IL12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6284-6298. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-047.[1] Hewitt SL, Bailey D, Zielinski J, et al. Intratumoral IL12 mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the Tumor Microenvironment. Clin Cancer Res. 2020 Dec 1;26(23):6284-6298. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-047. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。