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mRNA 技术有着诸多让人无法抵挡的独特优势，使其成为传染病疫苗，肿瘤治疗，蛋白替代疗法，基因编辑等一系列领域最具吸引力的技术支撑平台。相比传统的蛋白疗法，在宿主细胞中，外源合成 mRNA 能合成具有天然构象的靶蛋白，保留所有的翻译后修饰。相比其他的核酸疗法（基于质粒 DNA 或者病毒载体），外源合成 mRNA 没有整合进基因组的风险，一般也不会触发针对载体的免疫反应，能够重复注射。此外，mRNA 和 LNP，本身具有佐剂效应，能够增强编码抗原触发的免疫反应。更加吸引人的是，mRNA 生产工艺不涉及细胞培养，只需借助酶促反应和简单的下游纯化工艺，极易扩大产能。尽管有诸多显著优势，但是，RNA 有个致命的弱点：非常不稳定，容易降解，这大大限制 mRNA 作为治疗药物的应用。即便通过加帽加尾和修饰核苷酸能够在一定程度上提升体外合成 mRNA 稳定性，但也仅仅只能将其在细胞内的活性维持几天而已。为延长体外合成 mRNA 在细胞内的表达时间，人们想出两种方法：一种将目光望向circRNA，通过环化反应让体外合成 mRNA 变得不那么容易降解，更加持久的表达靶蛋白；另外一种是向 RNA 病毒学习，设计出自复制 RNA（self-amplying RNA,saRNA），让体外合成 mRNA 在细胞内复制，以数量取胜。相比传统非复制线性 mRNA，使用相同剂量的 saRNA 会表达更高水平的靶蛋白。因此，circRNA 和 saRNA 被视为下一代 mRNA 技术平台。本期内容我们以自复制 RNA 质粒载体序列优化设计为主题，分享以下几个方面的内容：saRNA 自复制机制突变 saRNA 序列分割 saRNA 系统反式 saRNA 系统共表达干扰素调控因子1   saRNA 自复制机制saRNA 序列源自对正链 RNA 病毒（例如，alphaviruses）双顺反子基因组的改造，除了最基本的 mRNA 元件，例如帽子、5'UTR、3'UTR、PolyA 尾巴，在 saRNA 5'端还存在一个非常大的开放阅读框，编码来自委内瑞拉脑炎病毒（VEEV）、辛德毕斯病毒（SIN）或者塞姆利基森林病毒（SFV）的 4 个非结构蛋白（NSPs），而原本位于亚基因组启动子（SGP）后面的结构蛋白病毒基因被替换成编码靶蛋白的异源基因（GOI）。去除编码结构蛋白的病毒基因会使得 mRNA 无法产生感染性子代病毒颗粒。saRNA 一旦进入宿主细胞质中，首先翻译出 4 个非结构蛋白（NSP1,NSP2,NSP3,NSP4），通过一个复杂的、多步骤过程聚合形成依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶复合物（replicase）。NSP1 涉及复制酶复合物与细胞质膜之间的连接以及病毒 RNA 的加帽反应；NSP2 充当 RNA 解旋酶和多聚蛋白加工蛋白酶；NSP3 介导多种病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用；NSP4 是依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶。RNA 聚合酶复合物存在于一个内陷的球形膜泡中，该膜泡与细胞质膜紧密连接，以此来逃避宿主免疫系统的监控。mRNA 聚合酶复合物首先以正义链 RNA 合成出互补的负链 RNA 中间体，接着，以后者为模板合成出两个不同的正链 RNA。第一条正链 RNA 是原始全长基因组 RNA 的拷贝；第二条正链 RNA 是大量的编码异源靶基因的亚基组 RNA，这也是 saRNA 能够以低剂量实现高水平持久靶蛋白表达的原因。图 1：saRNA 质粒载体骨架结构和自我复制过程。2   saRNA 载体序列优化saRNA 要比非复制的线性 mRNA 超出 7000 多 bp，相比传统非复制线性 mRNA 来说，saRNA 编码靶蛋白实现更高的表达水平和更持久的表达时间，然而，由于宿主天然免疫系统的存在，saRNA 编码靶标蛋白的表达还是会逐渐减弱。近些年来，研究人员尝试各种策略来设计优化 saRNA 载体骨架序列，以提升 saRNA 表达强度和持续时间，降低宿主天然免疫反应。2.1   突变 saRNA 序列2019 年，YingzhongLi 等人基于 VEEV 复制子系统，构建体外演化策略，延长复制子转染细胞的培养时间，同时重复富集高表达水平的细胞将会筛选到携带有利突变的复制子，从而找到高表达，低免疫原性的突变复制子序列。很多复制子研究中采用缺乏 IFN 信号途径的 BHK-21 细胞，为筛选到能够有力限制宿主细胞天然免疫反应的复制子，YingzhongLi 等人选择拥有 IFN 信号通路的 Jurkat 细胞。体外转录表达 mCherry 荧光蛋白的 VEEV 复制子，转染 Jurkat 细胞。基于 RNA 病毒突变速率，将转染复制子的细胞培养 60 天，在此期间，借助流式细胞荧光分选技术（FACS），10 天为一轮，筛选 mCherry 表达量前 20%的细胞。随着每一轮的筛选，mCherry 阳性细胞比例和荧光强度会逐渐增加，到第 6 轮时达到平台值。从筛选到的阳性细胞（第 5 轮）中提取 Total RNA，反转录成 cDNA。用 7 对特异性的引物扩增 NSP1-4 和亚基因组启动子序列，将扩增片段分别克隆到质粒载体上，转化大肠杆菌，挑选克隆子进行测序。图 2：采取体外演化策略筛选促进亚基因组靶蛋白表达水平的 saRNA 有益突变。与原始复制子序列比对，发现 NSP2 和 NSP3 位置存在 5 个突变位点。将这些突变位点进行组合，转染细胞，结果发现，位于 NSP2 和 NSP3 序列上面的 2 个突变位点（b1 和 b2）能够增强整个复制子 RNA 和亚基组 RNA 水平，从而增强 mCherry 细胞内的表达强度和持续时间，而位于 NSP3 序列上面的 3 个突变位点(a 和 c1/c2)能够这种增强效应进行调控（不改变或者抑制）。此外，他们还发现，一般来说，b1/b2 位点突变会增强 IFN 信号通路，而 c1/c2 位点突变会减弱 IFN 信号通路。研究人员挑选了两个有效突复制子，采用瘤内注射或者肌肉注射 LNP-突变复制子，在小鼠体内 Luciferase 荧光表达强度和持续时间均明显优于野生型复制子。图 3:突变 RNA 复制子能够影响靶标基因在小鼠体内表达强度和持续时间。2.2   分割 saRNA 系统2018 年，Robin J. Shattock 首次开发出一种分隔式的自复制系统，称为 splitzicons，虽然使用两个独立的 RNA 分别编码非结构蛋白 NSPs 和靶标基因，但是，这种分隔式的 RNA 仍然展示出自我复制的特点。研究人员设计出编码 Luciferase 的正链 splitzicon 和负链 splitzicon，组成其序列的元件包括：5'UTR，来自 NSP1 的 51bp 保守序列元件（CSE），亚基因组启动子（SGP）以及相应的 UTR，IRES。通过与编码聚合酶复合物的 splitzicon-NSP 配对共同转染细胞，检测荧光蛋白的表达量，以此来判断到底哪些元件会影响 splitzicon-Luciferase 的扩增。51 CSE，SGP 以及对应的 UTR 序列对于正链 splitzicon-Luciferase 扩增是极其重要的，与此形成对比的是，负链 splitzicon-Luciferase 的扩增仅需要引入 SGP。在多个细胞类型中，splitzicon-Luciferase 均可得到扩增，其荧光蛋白表达量与 splitzicon-NSP 剂量成正比例。更加重要的是，在 splitzicon-NSP 存在下，正链/负链 splitzicon-Luciferase 可以持续扩增 72h，荧光蛋白表达量增幅超过 100000 倍。这项工作一方面鉴定出 RNA 自复制系统中亚基因组 RNA 发生扩增必需的序列元件，也为采用 splitzicon 编码多个抗原，设计多价 RNA 疫苗提供思路。图 4：设计编码 Luciferase 正链或者负链 RNA Splitzicon 和编码非结构蛋白的 NSP-splitzicon。2.3   反式 saRNA 系统在 Robin J. Shattock 工作的基础上，2022 年，Ugur Sahin 开发出分割的反式 RNA 复制系统（Trans-amplifying RNA system，taRNA），分为 TR 组分和复制酶组分。TR 组分将编码复制酶的 NSP 基因从 saRNA 序列中剔除掉，保留 5'CSE（保守序列）和 SGP，下游序列包括靶基因序列和 3'CSE。复制酶组分又可分为两种类型:第一种是标准的 saRNA 序列，只是编码区是无关序列 iTG，这个 saRNA-REPL 只用来递送复制酶，不会编码任何靶蛋白;第二种选择是采用编码复制酶的传统非复制 mRNA(nrRNA-REPL)。图 5：saRNA-REPL 反式系统与 nrRNA-REPL 反式系统构建策略。nrRNA-REPL 反式系统要比 saRNA-REPL 反式系统介导的荧光蛋白细胞表达水平高出 10-100 倍，可实现与传统 saRNA 自复制系统类似的高效蛋白表达水平。nrRNA-REPL 反式系统之所以优于 saRNA-REPL 反式系统可能是由于 nrRNA 具有非常高效的复制酶表达效应，而且对细胞整体的翻译不会造成干扰。在小鼠模型中，研究人员采用 50ng 编码 HA 抗原的 nrRNA-REPL 反式系统 b 便可以触发高水平的中和抗体，保护小鼠免受流感病毒触发的死亡。此外，由于复制酶不仅可以复制 RNA，而且还可以对 RNA 拷贝进行加帽和加尾。当省去构建 nrRNA-REPL 时的加帽和加尾反应时，对于其所触发的免疫原性并不会产生太大的影响。图 6：nrRNA-REPL 反式系统实现与传统 saRNA 自复制系统类似的高效蛋白表达水平。2.4   共表达干扰素调控因子saRNA 翻译过程中形成的 dsRNA 中间体会被细胞质中的 RNA 受体识别(MDA5/RIG-I/OAS/PKR)，激活 I 型 IFN 信号通路。与传统的非复制线性 mRNA 相比，低剂量 saRNA 这种强烈的天然佐剂活性会具有更高水平的免疫原性。然而，激活细胞内模式识别受体，特别是 PKR，会抑制细胞内整体的蛋白翻译过程。活化的 PKR 将翻译起始因子 eIF2α磷酸化，从而阻断依赖于帽子结构的翻译。图 7：细胞内模式识别受体感应 saRNA，触发 IFN 信号通路。为抵抗天然免疫对于细胞翻译的抑制，alphaviruses 核衣壳蛋白基因开放阅读框 5'端会形成 RNA 茎环结构（downstream loop，DLP），从而能够启动独立于 eIF2α翻译。当靶基因取代结构蛋白基因后，saRNA 缺乏 DLP，其翻译过程对 eIF2α磷酸化非常敏感。因为在靶基因前面插入核衣壳开放阅读 5'端的 DLP 序列（102 个核苷酸，编码 34 个氨基酸）可能会改变靶蛋白的功能，因此需要通过其他途径来解除天然免疫对 saRNA 翻译的抑制。与 alphaviruses 相反，绝大多数其他病毒通过编码大量的反作用于细胞质 RNA 受体的病毒蛋白来实现免疫逃脱。例如，牛痘病毒表达特异性的免疫逃脱蛋白：PKR 抑制剂；dsRNA 结合蛋白 E3；PKR 假底物 K3;IFN 诱饵受体 B18。实际上，很早就有人通过共转染编码牛痘病毒 E3/K3/B18 mRNA 来提升外源合成的非复制 mRNA 的蛋白翻译效率，这种方法早已经在商业上用于生产可诱导多潜能干细胞。有研究曾报道，流感病毒多功能免疫逃脱蛋白 NS1 也有助于增强外源合成的非复制 mRNA 翻译效率。在前面研究基础上，2017 年，Ugur Sahin 为减少 saRNA 对于胞内模式识别受体的刺激，解除 saRNA 翻译的抑制效应，首次将编码免疫逃逸蛋白 E3/K3/B18 的非复制 mRNA 组合与编码 Luciferase 荧光蛋白的 saRNA 共同递送，这种方法能够显著抑制细胞内的 PKR 和 IFN 途径，极大增强 saRNA 编码的 Luciferase 荧光蛋白在小鼠体内的翻译效率。图 8：在小鼠体内，共递送编码牛痘病毒免疫逃逸蛋白的 mRNA 组合显著增强 saRNA 编码的 Luciferase 表达水平，并且具有剂量效应。Ugur Sahin 采取的共转递送编码免疫逃逸蛋白 mRNA 的方式不足之处在于 2ug saRNA 需要共递送 6ug 或者 12ug E3 mRNA，这显著增加 RNA 注射剂量，而且，这些大量的反式编码产生的蛋白可能会抑制细胞摄取和表达两种类型的 RNA。在此基础上，2021 年，Robin J. Shattock 构建顺式编码天然免疫反应抑制蛋白（innate inhibiting proteins，IIPs）的 saRNA 文库，筛选增强 saRNA 靶标蛋白表达和免疫原性的 IIPs。他们发现 saRNA 通过顺式作用编码产生的副流感病毒 PIV5 蛋白和 MERS ORF4a 蛋白能够提升靶标蛋白在细胞水平和小鼠体内表达量以及编码狂犬病毒 G 糖蛋白 saRNA 在兔子中的免疫原性。非常有意的是，他们还发现 ruxolitinib（JAK/STAT 抑制剂）会显著提升 saRNA 体内靶标蛋白翻译效率。Robin 的工作说明在 saRNA 骨架序列中直接插入编码 IFN 信号通路抑制蛋白的基因能够显著增强 saRNA 蛋白表达水平，降低 saRNA 免疫原性。图 9：构建顺式编码天然免疫反应抑制蛋白（innate inhibiting proteins，IIPs）的 saRNA 文库，筛选增强 saRNA 靶标蛋白表达效率和降低 saRNA 免疫原性的 IIPs。3   结论相比传统的非复制线性 mRNA 而言，saRNA 最大的优势就是进入细胞后可以不断复制编码靶标基因的亚基因组 RNA，以极低剂量实现高水平的靶标蛋白表达。saRNA 质粒骨架序列优化目的是实现高效率和持久性的靶标蛋白表达，降低触发的天然免疫反应强度，沿着这个思路，研究人员采取体外演化 saRNA 序列，切割 saRNA 系统，构建反式 saRNA 以及共表达 IFN 信号通路抑制因子等一系列策略进行不断的尝试摸索，为基于 saRNA 技术的疫苗或者其他疗法的质粒载体序列优化奠定了一定的理论基础。此外，由于编码复制酶复合物的 NSP 基因长达 7000 多 bp，这大大增加 saRNA 在体外转录反应时的难度，降低 saRNA 生产时的产量和纯度。尽管此前 Robin J. Shattock 对合成超长片段 saRNA 的体外转录反应体系做出过优化，但是，未来还需要依赖能够高效合成超长片段的 T7RNA 聚合酶来做出根本性突破。An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development.In vitro evolution of enhanced RNA replicons for immunotherapy.Structural Components for Amplification of Positive and Negative Strand VEEV Splitzicons.A Trans-amplifying RNA Vaccine Strategy for Induction of Potent Protective Immunity.Innate Inhibiting Proteins Enhance Expression and Immunogenicity of Self-Amplifying RNA.Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.