TFs and related regulators x SHH

OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。PART1导 语生物医学研究领域迎来革命性突破，类器官与器官芯片两大前沿技术的深度融合，正在重塑药物研发与疾病建模的科学范式。国际权威期刊Nature Reviews Bioengineering发表的综述论文“Integrating organoids and organ-on-a-chip devices” ，由多伦多大学Milica Radisic教授领衔，系统阐述了两大技术的融合路径及转化前景。作为革新传统研究体系的双子星技术，类器官与器官芯片分别从不同维度突破二维培养局限。类器官在三维空间完美复刻器官发育，器官芯片则通过微流控技术精准模拟生理环境。二者的战略融合，通过精密调控类器官三维构型，同步施加流体力学、机械力及电刺激等微环境控制，显著提升细胞功能保真度，为建立更具临床价值的研究模型开辟新径。研究团队已成功构建肠、肝、肺、肾等九大核心器官系统的高仿真模型，其突破性进展体现在三大维度：时空控制革新：实现类器官发育阶段与芯片系统整合的精准时序控制血管网络构建：攻克类器官内部可灌注脉管系统构建技术瓶颈标准化突破：建立细胞系异质性控制与批次稳定性的系统解决方案当前转化研究聚焦三大攻坚方向：确立类器官芯片整合的黄金时间窗口、开发可规模化制备的血管化方案、建立标准化质量评价体系。此项研究获加拿大创新基金会重大专项支持，其阶段性成果已进入产业化验证阶段。作为生物医学工程领域的里程碑式突破，类器官芯片融合技术正在重新定义精准医学研究的边界。PART2综述主要内容01 微流控技术在组织功能模拟     与再生医学中的应用在生物医学研究中，3D细胞培养技术正逐渐成为推动精准医学发展的关键力量。其中，器官芯片（OoC）技术以其高度模拟人体器官功能的能力，成为突破传统细胞培养瓶颈的重要工具。器官芯片（OoC）是一种微制造或工程化的培养系统，能够支持细胞组装成类似组织的结构，并精准测量和模拟器官功能标志。与传统的二维细胞培养相比，器官芯片通过三维结构设计，更真实地模拟了器官或组织的生理反应。它不仅可以整合多种组织，重现器官的特定功能，如跨上皮或内皮屏障的渗透性测量，还能通过精确控制微组织结构和物理刺激，实现更复杂的生理模拟。器官芯片系统通常包括多种细胞类型，如血管细胞、实质细胞、基质细胞和免疫细胞，以更好地模拟天然组织中的异质性。其特征还包括促进营养和氧气运输的膜或柱结构、几何控制的细胞排列和多轴拉伸等。OoC系统可以组合多个组织在单一设备中，模拟器官间的相互作用。虽然这些系统的操作复杂且成本较高，但相比传统2D细胞培养或动物模型，它们能够更精确地研究生理变化。尽管类器官和类胶质细胞等技术可以模拟部分生物过程，但在血管化、药物反应和脱靶效应等方面仍有不足。OoC系统在疾病建模、药物测试以及再生医学等方面具有广泛应用，尽管其尺寸通常在微米到厘米之间，无法完全复制整个器官的复杂性。图1  类有机物和OoC系统的主要方法02 类器官和器官芯片融合的优势类器官和器官芯片（OoC）的整合可以通过结合两者的优势来克服各自的局限性。1. 融合优势：互补与协同器官芯片凭借其微加工技术和水凝胶成型能力，能够为类器官的发育提供高度一致的环境，促进形态成熟。同时，OoC装置支持类器官与脉管系统的整合，并通过集成传感器实现原位功能读出。另一方面，类器官以其丰富的器官特异性多谱系细胞，为器官芯片带来了更高的细胞组成复杂性。与类器官的自组装过程相比，OoC设备通过精确控制流体系统和物理刺激，进一步提升了细胞培养的可控性和重复性。2. 功能提升：从细胞培养到药物模拟类器官与器官芯片的结合提升了细胞培养和药物分布模拟的效率。在血管屏障、细胞收缩力等复杂功能研究中，这种融合技术为科学家提供了更多可能性。通过电极和染料，OoC和类器官均可实现电生理读数及其他生理功能的测量，而类器官在单细胞分析方面的优势，使其在复杂细胞功能研究中更具竞争力。图2 集成类器官和OoC装置的时间轴和应用图3 类器官和OoC系统整合的进展和挑战PART3单器官模型01  肠器官模型 小肠和大肠类器官虽然高度保留了天然组织结构，如肠隐窝、绒毛和细胞异质性，但在血管化、灌注、蠕动运动以及肠道微生物群引入等方面仍存在缺失。器官芯片技术的引入为解决这些问题带来了曙光。例如，通过iFlow板的灌注系统，研究人员能够成功模拟结肠炎症中的免疫细胞募集过程，为炎症性肠病的研究提供了新的模型。此外，类器官的腔空间封闭性限制了其屏障功能研究，但结合灌注装置后，模拟痉挛运动的直肠模型能够有效突破这一限制，为肠道屏障功能研究提供了新的思路。此外，集成系统能够更好地再现肠道的生理学和免疫功能。通过机械线索诱导蠕动运动并形成绒毛。尽管如此，但该模型仍缺乏肠道的管状几何形状。通过开发类似器官芯片（OoC）的设备，成功构建了具备粘液双层的结肠芯片模型，进一步模仿了人类结肠的功能。然而，类器官与胃肠平滑肌细胞的整合仍未实现，间充质细胞、神经细胞和免疫细胞的加入也需要进一步优化。02  肾器官模型肾单位是肾脏的基本功能单位，由肾小球、近端小管、Henle袢、远端小管和集合管组成。器官芯片（OoC）技术已经能够通过空间排列原代或永生化的肾小管上皮细胞或足细胞来重建部分肾单位，如近端小管和肾小球，使用水凝胶或多孔膜模拟其屏障功能。然而，这些模型的细胞类型有限，难以再现完整的肾单位结构。相比之下，hES或iPS细胞衍生的肾类器官能够形成包含足细胞、近端小管、远端小管和集合管细胞的连续肾单位样结构，尽管这些类器官缺乏成熟的血管系统且细胞发育不完全。通过在3D打印的可灌注芯片中培养类器官，血管化和细胞成熟问题得到了部分解决，并且在管状上皮类器官中也成功重现了跨上皮转运功能。虽然类器官与OoC的结合改善了部分肾单位亚结构的血管化和功能建模，但对整个肾单位的全面建模仍具挑战性。OoC可以为不同的肾细胞类型提供所需的空间排列，帮助控制不同节段的流动和运输特性。03  肺器官模型肺类器官通过调节FGF、Hedgehog、BMP和Wnt等信号传导途径，可从iPS细胞或hES细胞衍生出多种肺谱系细胞，包括基底细胞、纤毛细胞和肺泡祖细胞等。然而，这些类器官通常缺乏分支形态，并且产生的细胞仍为胎儿样细胞，成熟度有限。成人干细胞来源的气道类器官在SARS-CoV-2等感染模型中已有应用，但其分化谱系较单一，缺乏远端肺谱系和分支形态。相比之下，基于微流体的肺芯片通过在多孔PDMS膜上接种原代肺细胞，模拟肺泡-毛细血管界面及呼吸运动，能够重现更接近体内环境的肺组织功能。同时，气-液界面培养和剪切应力的引入进一步改善了上皮细胞的成熟，促进纤毛和粘液细胞的分化。尽管如此，传统的基于膜的肺芯片装置在整合基质细胞或自组织结构方面仍存在局限。在整合类器官与OoC技术的过程中，适度使用工程化的结构以避免干扰类器官的自组织特性显得尤为重要。此外，优化整合的时机也十分关键，不同分化阶段的类器官在增殖和分化能力上存在显著差异，过早或过晚接种都会影响功能性组织的构建。因此，整合类器官和OoC技术要求生物工程师与干细胞生物学家密切合作，调整接种条件和培养环境，以实现更接近体内肺功能的模型系统。04  肝器官模型肝脏类器官与芯片模型的发展在模拟肝脏功能和药物反应方面展现出巨大潜力。肝脏芯片系统通常利用水凝胶将人类原代肝细胞或iPS细胞衍生的肝细胞包裹在多孔膜中，膜另一侧的可灌注通道可增强传质并避免高剪切应力损伤。流动环境下培养的肝细胞表现出更成熟的表型，分泌更多白蛋白、尿素等代谢物，且用于肝病建模和药物效应研究中效果显著。类器官也能够较好地模拟体内肝芽的结构和功能，基因表达接近人类胎儿肝芽。OoC技术的整合进一步提升了类器官的功能，改善了白蛋白、β-淀粉样蛋白的表达，胆小管形成等生理特征。然而，模型仍面临血管化不足的问题，尤其是肝窦内皮细胞（LSECs）的缺失限制了对肝脏分区和大分子传输的模拟。尽管已经通过预血管化球状体与可灌注血管床结合等方法取得进展，但对HUVEC细胞的依赖性阻碍了肝脏生理的忠实再现。随着LSEC分化协议的出现，血管化问题有望得到解决。此外，未来的模型应重点关注肝窦空间异质性的再现，尤其是复制氧、营养物和信号分子的梯度分布，以提升对肝脏分区药物毒性的研究应用。05  胰腺器官模型胰岛由多种内分泌细胞组成，包括分泌胰岛素的β细胞和分泌胰高血糖素的α细胞等，传统的2D和3D培养物在模拟胰岛的生理功能方面存在局限，尤其是在控制离子通道活性和细胞骨架结构变化以调节胰岛素分泌方面。胰腺类器官培养能够克服这些不足，并提供更真实的模型以研究复杂疾病，如囊性纤维化，该疾病涉及胰腺导管细胞中突变的跨膜传导调节器通道。基于类器官的胰腺芯片改善了胰岛细胞与胰腺导管上皮细胞的相互作用，增强了对囊性纤维化与糖尿病关系的研究。微流体平台为胰岛类器官的功能评估提供了支持，能够量化葡萄糖反应、胰岛素分泌、氧消耗等重要参数。然而，PDMS材料的疏水性可能吸附小型疏水分子，从而影响药物作用的精确模拟。功能性胰岛的形成还依赖于细胞间通讯的精确调控、关键转录因子的激活和血流支持，OoC装置提供了必要的动态控制，有望进一步提升模型的生理相关性。06  脑器官模型在胚胎发育中，大脑的时空分子调控引导了人类皮质的快速扩张与功能成熟，脑类器官的构建在细胞组成、区域组织和基因表达上与人类产前新皮质高度相似，可用于后期神经发育研究。区域特异性类器官（如前脑、后脑）可通过调控Wnt、BMP和SHH信号通路在体外生成，并用于药物毒性筛选及疾病模型研究。然而，脑类器官仍面临缺乏功能性血管系统的挑战，限制其生长和成熟。通过与血管类器官融合，可研究新生血管相互作用。脑芯片装置通过内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的共培养，重现了血脑屏障（BBB）的选择性屏障功能，并通过微流控芯片和3D打印技术模拟脑内血管灌注，解决类器官营养输送问题。此外，类器官还可与免疫细胞结合，模拟神经损伤反应。未来通过整合微电极阵列（MEA）可实现大脑电活动的实时监测，进一步推进类器官平台的功能性建模。07  心脏器官模型心脏功能依赖于心肌细胞的机电耦合和血管网络的支持，而由于成年心肌细胞增殖能力有限，心脏类器官和芯片上的心脏模型主要依赖于hES或hiPS细胞分化。尽管心脏类器官能够在心脏发育和疾病建模中重现部分细胞-细胞和细胞-基质相互作用，但大多数类器官缺乏完整的空间功能分化和四腔结构，同时血管化仍具挑战。芯片上的心脏装置通过测量心肌收缩力、提供机械或电刺激以模拟疾病表型，并通过微流体技术实现血管灌注。微图案化技术进一步优化类器官的组织形态和收缩功能，促进血管网络形成。虽然在开发人类有室类器官方面已取得进展，但稳健的心腔重现仍然是难点，整合生物打印技术和芯片系统将有助于心脏遗传疾病的深入研究和复杂心脏表型的捕捉。PART4多器官模型多器官系统通过组装体和器官芯片技术，能够模拟器官间的复杂交互作用，组装体适合构建紧密相邻的组织模型，例如膀胱的外肌肉层和内上皮层；而器官芯片则在模拟远端器官相互作用时更具优势。尽管无泵多器官系统已能用于研究药物在肝脏、肿瘤和心脏中的代谢和疗效，真实的器官间通信的模拟仍需功能性血管系统的支持。当下，多器官系统的应用仍面临诸多挑战。液体处理的复杂性、不同器官对培养基需求的差异，以及器官间比例定律的难题，都限制了其大规模应用。通过内皮细胞包被的选择性屏障，将成熟的心脏、肝脏、骨骼和皮肤组织连接后，各器官能够保持其特异性功能，如心脏的收缩性、骨密度、皮肤屏障功能和肝脏的白蛋白分泌。此外，该系统还成功展示了多柔比星的药代动力学和心脏毒性，进一步证明了内皮屏障在多器官串扰中的关键作用。然而，多器官系统的制备过程复杂、技术要求高、成本投入大，这些因素仍在一定程度上限制了其广泛应用。PART5血管化模型血管化是类器官、器官芯片、再生医学和组织工程的核心挑战之一。由于氧气扩散的限制，当组织直径超过100 µm时，内部细胞导致坏死。因此，血管化对于类器官的旁分泌通信、机械刺激、组织成熟、内皮屏障功能以及多器官系统间的相互作用至关重要。尽管类器官在体内能够自然实现血管化，但在体外构建功能性血管网络仍面临诸多困难。目前，血管工程化主要通过两种方法实现：一种是自组装法，即内皮细胞和支持细胞在水凝胶中自组装成血管网络；另一种是通过制造中空通道并接种内皮细胞。然而，这两种方法在长期灌注和血管直径控制方面仍存在挑战。微流体装置的出现为促进血管化带来了希望。其独特的设计能够促进血管网络的形成和维持。此外，新型材料如AngioChip通过优化孔隙结构，显著提高了血管与实质组织之间的连通性。类器官血管化的主要障碍在于干细胞分化培养基与促血管生成培养基的兼容性问题，通常类器官分化后再与内皮细胞结合以诱导血管形成。未来展望类器官与器官芯片（OoC）的融合正在重塑再生医学、疾病建模和药物开发的未来。这种创新整合为生命科学研究带来了前所未有的机遇，但同时也伴随着诸多技术挑战。一方面，类器官研究者可以借助成熟的商用OoC系统，实现更精准的细胞培养与模拟；另一方面，OoC领域的技术专家则可通过类器官分化试剂盒降低细胞变异，提升模型的稳定性和可重复性。然而，将类器官与OoC系统深度融合并非易事。血管化难题、培养基不匹配、硬件要求差异、微流体设计优化、细胞变异控制以及不同器官的特异性需求，都是亟待解决的关键问题。为了提升模型的生理保真度，引入复杂的物理刺激和先进的生物材料成为关键策略。同时，自动化、可扩展的生产工艺和高级传感器技术的应用，有望大幅提高OoC平台的效率，减少人为误差，并加速药物筛选进程。未来，推动类器官与OoC融合的核心任务包括：建立标准化的评估方法，以确保模型的可靠性和一致性；利用人工智能辅助数据分析，提升研究效率；以及探索体外模型与体内复杂性之间的最佳匹配。这些进展不仅将推动综合系统的广泛应用，还将加速其产业化进程。END免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!

撰文 | 胡峰源  责编 | 周叶斌 髓母细胞瘤（Medulloblastoma）是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，占儿童中枢神经系统 (CNS) 肿瘤的20％。在 16 岁以下的儿童中最常见，大多数患儿在 5-9 岁时被诊断出罹患这些肿瘤。但是，年龄较大的青少年也可能会出现髓母细胞瘤，而成人中不常见。 髓母细胞瘤根据肿瘤细胞的分子特征可分为四种分型：WNT 型 ， SHH 型,，3 型 （G3）和4 型 （G4）。ZIC1基因在中枢神经系统的发育中起关键作用，尤其是在小脑的发育过程中。尽管许多驱动基因已经被识别，但ZIC1基因在髓母细胞瘤中的作用机制仍不明确。 近日，贝勒医学院、德克萨斯儿童癌症中心、多伦多大学、圣裘德儿童研究医院和梅奥诊所医学院的研究人员于Nature Genetics 发表题为 ZIC1 is a context-dependent medulloblastoma driver in the rhombic lip 的研究论文。在本研究中，作者深入探讨了ZIC1基因在中枢神经系统发育中的关键作用， 揭示了ZIC1基因在不同类型的髓母细胞瘤中通过不同的机制驱动肿瘤生长。 研究背景与实验设计 这项研究为髓母细胞瘤在小脑发育过程中如何发生提供了新的见解。研究人员发现，同一基因ZIC1可以通过不同的、特定环境相关的机制驱动高度相似的癌症。研究人员分析了G4和SHH两种类型的髓母细胞瘤，这两种类型被认为起源于小脑发育过程中的同一细胞。通过基因组测序、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、RNA测序（RNA-seq）等技术，研究了ZIC1基因在不同类型髓母细胞瘤中的突变模式和功能。使用细胞系和小鼠模型验证了ZIC1基因的功能及其对肿瘤生长的影响。 研究发现 G4髓母细胞瘤中ZIC1基因的突变导致功能丧失（LOF），即突变后的蛋白质失去了原有的功能。而在SHH髓母细胞瘤中，ZIC1基因的突变导致功能获得（GOF），即突变后的蛋白质获得了新的功能，与原始基因的功能不同。ZIC1基因的突变在小脑的菱形唇区域（rhombic lip）中表现出截然不同的作用，表明ZIC1在正常和肿瘤化的菱形唇中都是一个关键的发育调控因子。 ZIC1在G4髓母细胞瘤中的突变和表观遗传抑制 Paul Northcott博士是圣裘德儿童研究医院发育神经生物学系和神经肿瘤学卓越中心的主任，他指出：“G4髓母细胞瘤中的ZIC1突变导致蛋白质功能丧失，而SHH髓母细胞瘤中的ZIC1突变则导致蛋白质获得新的功能。这表明在不同的生物学背景下，ZIC1基因的突变在髓母细胞瘤中的作用和影响是不同的。” ZIC1在SHH髓母细胞瘤中的功能获得（GOF）机制 过表达ZIC1基因在SHH髓母细胞瘤的前体细胞中促进了肿瘤的恶性表型，而在G4髓母细胞瘤模型中则抑制了肿瘤的生长。这一发现进一步支持了ZIC1基因突变作为髓母细胞瘤的真正驱动事件。 研究的挑战与不足 ZIC1基因的突变在不同类型的髓母细胞瘤中表现出截然不同的功能，这增加了研究的复杂性。理解这些突变如何在不同细胞环境中发挥作用是一个巨大的挑战。尽管研究揭示了ZIC1基因在髓母细胞瘤中的重要作用，但仍有一些机制尚未完全阐明，例如ZIC1基因突变如何具体影响肿瘤细胞的增殖和分化。 对患者及家属的指导意义 研究结果表明，针对不同类型的髓母细胞瘤，治疗策略应有所不同。对于SHH髓母细胞瘤，抑制ZIC1突变蛋白的功能可能是一个有效的治疗策略；而对于G4髓母细胞瘤，恢复ZIC1基因的功能可能更为重要。Northcott博士强调：“识别同一基因在不同肿瘤类型中的作用机制对开发治疗方案具有重要意义。我们的研究结果表明，在一种亚型中，ZIC1突变产生的活性蛋白可能是抑制的良好靶点；而在另一种亚型中，功能丧失的突变可能需要通过恢复其功能来治疗。” 了解ZIC1基因在不同类型髓母细胞瘤中的作用机制，有助于开发更精确的诊断工具，从而在早期阶段识别肿瘤类型并制定相应的治疗方案。 结论 本研究揭示了ZIC1基因在髓母细胞瘤中特定环境相关的驱动机制，表明同一基因在不同类型的肿瘤中可以通过不同的机制驱动肿瘤生长。这一发现不仅加深了我们对髓母细胞瘤发病机制的理解，还为开发个性化治疗方案提供了新的思路。未来的研究应进一步探索ZIC1基因突变的具体作用机制，并验证其在临床治疗中的潜在应用。通过这些研究发现，我们可以更好地理解髓母细胞瘤的发病机制，并为未来的治疗策略提供新的方向。 撰文 责编 制作 排版 | Sheila   校对 | uu 延伸阅读 超5000儿童癌症患者数据全面揭示致癌融合基因特征及临床治疗意义 3型髓母细胞瘤中发现可靶向的代谢节点 绘制髓母细胞瘤基于神经递质受体的分子亚型特异性转录调控图谱 *本文由深圳市拾玉儿童公益基金会“儿童肿瘤前沿”团队编译或约稿，文中图表均源引自文献原文。本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。如需转载，请留言或联系shiyu@curekids.cn。本文旨在分享儿童肿瘤科研前沿成果，不是治疗方案推荐。如需获得疾病治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 ▼滑动查看更多▼ 原文摘要（Abstract） Transcription factors are frequent cancer driver genes, exhibiting noted specificity based on the precise cell of origin. We demonstrate that ZIC1 exhibits loss-of-function (LOF) somatic events in group 4 (G4) medulloblastoma through recurrent point mutations, subchromosomal deletions and mono-allelic epigenetic repression (60% of G4 medulloblastoma). In contrast, highly similar SHH medulloblastoma exhibits distinct and diametrically opposed gain-of-function mutations and copy number gains (20% of SHH medulloblastoma). Overexpression of ZIC1 suppresses the growth of group 3 medulloblastoma models, whereas it promotes the proliferation of SHH medulloblastoma precursor cells. SHH medulloblastoma ZIC1 mutants show increased activity versus wild-type ZIC1, whereas G4 medulloblastoma ZIC1 mutants exhibit LOF phenotypes. Distinct ZIC1 mutations affect cells of the rhombic lip in diametrically opposed ways, suggesting that ZIC1 is a critical developmental transcriptional regulator in both the normal and transformed rhombic lip and identifying ZIC1 as an exquisitely context-dependent driver gene in medulloblastoma. DOI: 10.1038/s41588-024-02014-z 👇点击此处，直达原文

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 在生物学研究中，理解细胞间的通信机制对于揭示复杂生物过程至关重要。近日，《Nature Methods》上发表的一项突破性研究《Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics》引入了一种名为FlowSig的新方法，该方法通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）数据推断由通信驱动的细胞间信息流。这项技术不仅为科学家们提供了深入洞察细胞内部运作的新视角，也为临床医生带来了探索疾病发生发展机制的新工具。 研究背景 细胞通过生化信号相互交流以组织生物活动，这些时空流动的“因果”关系推动着每一个生物学进程。然而，传统的分析方法往往将细胞间通信视为独立事件，忽略了其与细胞内基因调控模块之间的关联。为了填补这一空白，研究人员开发了FlowSig，这是一种基于图形因果模型和条件独立性的新方法，它能够从scRNA-seq或ST数据中推断出由通信驱动的细胞间信息流。 研究设计与结果 FlowSig的核心在于建模细胞间信息流动，即从流入的细胞间信号到捕捉细胞内调节响应的基因表达模块（gene expression module，GEM），再到流出的细胞间信号。具体而言，FlowSig利用额外的扰动数据和下游转录因子靶点路径知识来学习准确的细胞间流动。当处理难以精确推断配体-受体相互作用的数据时，FlowSig结合“对照vs.扰动”实验提供的信息，使用差异表达分析和条件不变性测试推断最可能驱动细胞间流动的输入输出变量集合。此外，FlowSig还支持从空间转录组学数据直接推断每个空间位置接收到的流入信号量，从而无需额外的扰动数据即可推断细胞间流动。 在验证过程中，研究人员首先使用合成数据集进行测试，确保FlowSig能正确反映数学模型模拟出的细胞间流动特征。随后，他们应用FlowSig分析了新生成的皮质类器官实验数据，展示了该方法捕捉刺激诱导变化、展现因COVID-19严重程度增加而引起的细胞间流动转变以及重建小鼠胚胎发育中形态发生素驱动激活剂-抑制剂模式的能力。 图1：对FlowSig模型的描述 研究者开发了FlowSig模型，用于描绘细胞间信息流动的方向性。该模型包含从流入信号（受体基因表达量与下游转录因子基因集平均表达量的乘积Ri×TFi）到基因表达模块（即细胞成员归属至潜在GEM因子GEMi），再到流出信号（信号配体基因表达Li）的有向边（图1a）。在“对照vs.扰动”实验中，系统可能因外部刺激、疾病或时间变化而改变。FlowSig通过差异表达分析和条件不变性测试，识别出分布显著变化的流入和流出变量，以确定最有可能驱动细胞间流动的因素，从而减少数据生成的所有可能网络的数量，并构建更精确的完全部分有向无环图（completed partial directed acyclic graph，CPDAG）（图1b）。 对于难以准确推断配体-受体相互作用的情况，FlowSig能从空间转录组学数据中更精准地估算每个位置接收到的流入信号量，使得即使没有额外的扰动数据，也能推断细胞间的流动（图1c）。具体来说，FlowSig使用COMMOT推断接收的信号配体量（rec. Li），并结合空间解析的GEM（GEMi），最终关联到流出变量（Li）。 图2：FlowSig的合成验证 为了验证FlowSig的有效性，研究人员生成了基于数学模型的模拟实验数据集，用以模拟真实的细胞间流动情况。结果表明，FlowSig能够准确恢复预期的细胞间流动网络结构，证明其算法设计合理且可靠。 研究进一步探讨了SHH信号诱导的单向细胞间流动（图2a）及其对组织模式化的影响（图2b），以及SHH与BMP4之间的竞争关系（图2c）。通过量化FlowSig的真阳性率（TPR）和真阴性率（TNR），研究人员发现：在所有场景中（图2d-f），结合受体表达作为信号流入或引入扰动数据并不会改变平均TPR。使用结合受体进行流入测量显著提高了平均TNR，尤其是在复杂的多方向流动模型中，如SHH驱动的模式化以及SHH与BMP4的竞争关系（图2e,f）。 通过条件不变性测试整合扰动数据，可以减少TNR值的变化，包括四分位数范围和异常值，从而获得更精确的细胞间流动估计。这些结果显示，FlowSig有效地减少了基线GSP和UT-IGSP算法推断中的假阳性数量，提升了细胞间流动预测的准确性。 图3：使用皮层样器官模型验证FlowSig的实验验证 研究者使用皮层发育的类器官模型进一步验证了FlowSig的有效性。从人类胚胎干细胞中生成皮层类器官，并在培养第18天（D18）和第35天（D35）收集样本进行scRNA-seq分析。在该模型中，皮层身份的细胞命运于D18确定，而FGF和BMP信号响应则在D35建立。研究者将D35的数据视为对D18“对照”数据的“扰动”，模拟了这些信号通路的影响。 通过CellChat分析，识别出77个独特的配体-受体相互作用，这些相互作用在细胞间流动中扮演不同角色。FlowSig进一步筛选出26种流入的差异信号（图3a）和16种流出的差异信号（图3b），包括关键的FGF和BMP信号。研究者利用pyLIGER从2,793个高度可变基因中构建了20个GEM，并基于此构建了用于推断细胞间流动的62个变量（图3c）。 为了确定主要驱动因素，研究者根据信号流入变量的总边频次进行了排序，发现FGF、MK（中胚层因子）、PTN（多效生长因子）和NRG（神经调节素）是细胞间流动的关键驱动者。特别是FGF流入通过多个GEM驱动了BMP4、IGF-II、NGF、NRG1和NRG3等信号的流出（图3d）。此外，EOMES被确定为潜在的FGF流入调控候选者。相比之下，BMP流入通过较少的GEM被调节，且可能由PAX6或NR2F1介导（图3e）。 为了验证FlowSig分析结果，研究者在D15-D21期间分别添加FGF8b和BMP4激活相应的信号通路，并在D35时收集样品进行RT-qPCR分析。结果显示，激活FGF信号显著下调了EOMES的表达（图3f），而激活BMP信号则下调了PAX6并上调了NR2F1的表达（图3g），证实了FlowSig预测的准确性。 图4：FlowSig在胰岛扰动非空间scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig在恢复由外部扰动驱动的细胞间流动方面的能力，研究者分析了干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人胰岛scRNA-seq数据。使用pyLIGER构建了10个GEM，这些模块与独立识别的5个细胞类型簇（alpha、beta1-3和delta）对齐（图4a）。基于这些细胞类型注释，CellChat推断出各细胞组之间显著的成对配体-受体相互作用。 IFN-γ刺激显著改变了多个信号通路的流入量：通过FGFR1增加了FGF信号通路的流入，通过IL-6R和IL-6ST增加了IL-6的流入，通过CD74和CD44增加了MIF的流入，通过NCL增加了MDK的流入，并通过SSTR2增加了SST的流入（图4b）。同时，IFN-γ刺激还影响了流出信号，增加了GCG、INHBA和NAMPT的流出量，减少了ANGPTL2、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出量（图4c）。FlowSig识别出FGF、IL-6、MDK和SST是主要驱动细胞间信息流动的因素，这些信号驱动了GCG、INHBA、NAMPT、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出（图4d）。 为了进一步探索IFN-γ刺激的影响，研究人员将全局细胞间流动网络分为两个子网络：上调子网络：对应于IFN-γ刺激上调的流出信号，连接到这些流出变量的GEM及相关的流入节点（图4e）。下调子网络：对应于IFN-γ下调的流出信号，以类似方式构建（图4f）。 这两个子网络共享相似的流入节点和GEM，但GEM-3仅存在于“上调”网络中，这表明它在IFN-γ刺激下具有专门的作用。GEM-3主要富集在α细胞内，表明刺激驱动了来自α细胞的GCG和NAMPT流出。其他流入信号和GEM则在两种条件下共享，显示了它们的双重调控功能。 图5：FlowSig在中度或重度COVID-19患者取样的人类BALF的scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig处理多个扰动的能力，研究者分析了健康对照组、中度和重度COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞的scRNA-seq数据。使用CellChat结合原始研究中的细胞类型注释，推断出显著的配体-受体相互作用，结果显示健康对照组、中度和重度COVID-19组分别有46个、55个和54个活跃信号通路。 通过pyLIGER构建了20个GEM，这些GEM捕捉了不同条件下的差异（图5a）以及细胞类型间的差异（图5b）。FlowSig识别出每种COVID-19状态相对于健康对照组特有的流入和流出信号变化（图5c）。 为了深入分析这些流出信号驱动的细胞间流动，研究者提取了每个不同流出信号集上游的流入信号及相应的GEM（图5d-f）。尽管随着COVID-19严重程度增加，不同流出信号数量增多，但推断的流入信号数量却从健康对照组的37个减少到中度患者的32个，再到重度患者的25个。类似地，调节性GEM的数量也从健康对照组的16个减少到中度患者的13个，再到重度患者的8个。这表明随着疾病进展，某些特定的细胞间通信路径逐渐丧失。 进一步分析显示，在所有三种条件下共有20个信号流入，而没有发现仅在中度或重度COVID-19中特有的流入信号。TNFRSF12A（由TNFSF12驱动）以及ITGAX和ITGB2 （由C3驱动）的流入信号仅在健康对照组中存在。CAP（来自RETN1）的流入信号则仅在中度和重度COVID-19之间共享（图5g）。 观察到的GEM趋势相似，共享程度最高的GEM是在健康和中度COVID-19群体中的7个GEM，以及在所有三个条件下的5个GEM。GEM-4和GEM-10仅在健康个体中驱动信号流出，而GEM-7（与嗜碱性粒细胞相关）仅在中度和重度COVID-19群体中共享（图5h）。 图6：FlowSig在E9.5小鼠相关性空间立体序列数据中的应用 研究者利用FlowSig对胚胎发育阶段E9.5的鼠胚进行了ST-seq数据分析，揭示了Shh（Sonic Hedgehog）和Wnt5a信号通路之间的复杂双向流动。通过非负空间分解法，研究者从712个空间可变基因中构建了20个高分辨率的空间GEM，这些GEM捕捉了细胞间通信的关键特征（图6a）。 FlowSig识别出多个Shh外流的上游驱动因子，这些因子通过特定的GEM调节Shh外流，并推断出接收的Shh内流（r-Shh）驱动多个信号配体的外流途径，涉及多个GEM（图6c）。为了进一步确定Shh外流的上游调控TF，研究者使用随机森林模型分析了前10个TF的重要性，最终识别出Foxa2、Foxp2、Myc、Zc3h7a和Foxa1为Shh外流的主要上游调控TF（图6d）。 为了识别r-Shh流入的下游靶标，研究者使用pyGAM拟合每个推断出的下游基因表达网络中前10个r-TF的表达与r-Shh流入之间的关系，并根据Spearman相关系数排序。结果显示，Barhl1、Nkx2-1、Meox1、Tcf21和Foxp2与r-Shh的相关性较低，而Foxe1、Nkx2-2、Pou3f1、Tlx2和Nkx2-4等已知靶点表现出显著相关性（图6e）。 研究者观察到Shh和Bmp4、Cxcl12、Igf2、Mdk以及Wnt5a之间可能存在双向流动。为了验证这一假设，研究者分析了各配体与其下游r-Shh流入的关系。结果显示，只有Wnt5a通过GEM-5的转录因子显著受r-Shh流入调节（图6f）。此外，研究者发现r-Wnt5a流入通过空间扩散下调Myc介导的Shh流出，形成一个激活抑制系统（图6g）。这种激活抑制系统的三个关键特征如下：1）信号传播：Shh和Wnt5a配体都能扩散；2）自我上调：Shh通过Foxa2上调自身，Wnt5a通过Foxa1、Nkx6-1 和Sox21上调自身；3）抑制机制：Wnt5a通过下调Myc来抑制Shh。 这些观察结果表明，Shh和Wnt5a之间的双向流动类似于Turing模式生成系统，该系统在发育过程中驱动细胞命运图案化。因此，在E9.5时，Shh和Wnt5a信号通路可能共同作用于胚胎发育中的细胞命运决定过程（图6h）。 综上所述，FlowSig是一款强大的细胞间通信和信息流分析工具，对于分析发育过程中以及强烈单因素（比如药物）或多因素（比如病理微环境）扰动带来的细胞间信息流变化有着非常积极的作用，有助于推动对生命科学和生物医学复杂系统过程的动态理解。 拓展延伸 FlowSig技术在其他科研领域的广泛应用前景： ● 肿瘤微环境与癌症治疗 在肿瘤学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）结合FlowSig方法的应用具有巨大的潜力。肿瘤不仅仅是单一类型的细胞集合，而是一个复杂的生态系统，包括癌细胞、免疫细胞、基质细胞等多种成分。通过scRNA-seq可以揭示肿瘤内部不同细胞亚群的异质性，以及它们之间的相互作用网络。例如，在乳腺癌研究中，科学家们利用scRNA-seq发现了多种肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞不仅促进了肿瘤生长，还影响了化疗药物的效果。借助FlowSig，研究人员能够更加细致地描绘出TAMs与其他细胞类型间的通信路径，从而找到新的治疗靶点或预测患者的预后。 此外，空间转录组学数据提供了额外的空间维度信息，这对于理解肿瘤组织内的结构特征至关重要。比如，某些类型的免疫检查点分子表达可能集中在特定区域，形成所谓的“免疫冷区”。通过整合ST和FlowSig分析，可以精准定位这些冷区，并探索其形成的分子机制，进而开发更有效的免疫疗法策略。这种多模态的数据融合为个性化医疗方案的选择提供了科学依据。 ● 再生医学与干细胞研究 再生医学旨在修复受损组织器官的功能，而干细胞则是实现这一目标的关键角色之一。scRNA-seq和ST技术可以帮助科学家深入了解干细胞分化过程中的基因调控变化，确保生成的组织具备正确的细胞组成。以心脏再生为例，心肌梗死后的心脏修复需要诱导内源性干细胞向心肌细胞方向分化。然而，实际操作中往往面临效率低下等问题。FlowSig可以通过构建详细的细胞间通信模型，指导优化培养条件，提高干细胞定向分化的成功率。 同时，对于移植后的干细胞存活率低的问题，scRNA-seq和ST有助于识别影响细胞存活的关键因素。例如，在骨髓移植过程中，宿主微环境中存在的炎症因子可能会抑制新植入干细胞的增殖。利用FlowSig解析这些不利信号通路，研究人员可以采取措施减少负面影响，改善移植效果。总之，scRNA-seq和ST结合FlowSig的方法为解决再生医学面临的挑战提供了强有力的支持。 ● 神经科学研究 神经系统由高度特化的神经元构成，每个神经元之间通过突触连接传递信息。scRNA-seq和ST技术使得我们能够在单细胞水平上研究神经元及其支持细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞等）之间的交流模式。这对于理解大脑发育、学习记忆等生理过程非常重要。例如，FlowSig已被用于分析皮质类器官中的细胞间流动，揭示了Wnt5a-Shh双向流动关系，其中Shh促进自身及Wnt5a的表达，而Wnt5a则抑制Shh的表达，形成了一个潜在的Turing模式。这种反馈机制有助于解释某些特定的空间结构形成，并可能成为未来研究的重点方向之一。 此外，scRNA-seq和ST还可以帮助探究神经系统疾病的发生机制。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征之一是β-淀粉样蛋白斑块沉积。通过scRNA-seq分析患者脑组织样本，发现了一些参与清除这些有毒蛋白质的免疫细胞类型。结合FlowSig，可以进一步探讨这些细胞如何响应损伤信号，并寻找增强其功能的方法，最终达到延缓疾病进展的目的。 ● 免疫学与感染性疾病 免疫系统负责保护机体免受外来病原体入侵。scRNA-seq和ST技术为解析免疫反应提供了前所未有的机会。特别是在病毒感染的情况下，了解宿主细胞对病毒复制的反应至关重要。例如，在新冠病毒（SARS-CoV-2）感染期间，肺泡灌洗液（BALF）中存在大量的免疫细胞。通过scRNA-seq分析，研究人员能够区分不同的免疫细胞亚群，并追踪它们随时间的变化情况。FlowSig则可用于推断这些细胞间的相互作用，特别是那些对抗病毒至关重要的细胞通讯。 另一个重要应用是在疫苗研发方面。为了评估疫苗诱导的免疫应答，通常需要监测接种者体内抗体水平和T细胞活性。scRNA-seq不仅可以检测到抗原特异性B细胞和T细胞的存在，还能提供关于它们克隆性和表型特征的信息。结合FlowSig分析，可以从整体上把握免疫系统的动态变化，为优化疫苗配方提供参考。此外，这种方法也有助于发现新型免疫调节剂，提升现有疫苗的效果。 临床应用与展望 FlowSig作为一种强大的数据分析工具，在转化医学领域具有广泛的应用前景。例如，在肿瘤学方面，了解肿瘤微环境中不同细胞类型的互动可以帮助识别新的治疗靶点；而在再生医学领域，FlowSig可以协助优化干细胞分化策略，提高组织工程产品的质量。此外，随着单细胞技术和空间转录组学技术的发展，FlowSig将帮助临床医生更深入地理解病理状态下细胞群体的行为变化，进而指导个性化医疗方案的选择。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Almet AA, Tsai YC, Watanabe M, Nie Q. Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics. Nat Methods. 2024 Oct;21(10):1806-1817. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~