SHH

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 在生物学研究中，理解细胞间的通信机制对于揭示复杂生物过程至关重要。近日，《Nature Methods》上发表的一项突破性研究《Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics》引入了一种名为FlowSig的新方法，该方法通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）数据推断由通信驱动的细胞间信息流。这项技术不仅为科学家们提供了深入洞察细胞内部运作的新视角，也为临床医生带来了探索疾病发生发展机制的新工具。 研究背景 细胞通过生化信号相互交流以组织生物活动，这些时空流动的“因果”关系推动着每一个生物学进程。然而，传统的分析方法往往将细胞间通信视为独立事件，忽略了其与细胞内基因调控模块之间的关联。为了填补这一空白，研究人员开发了FlowSig，这是一种基于图形因果模型和条件独立性的新方法，它能够从scRNA-seq或ST数据中推断出由通信驱动的细胞间信息流。 研究设计与结果 FlowSig的核心在于建模细胞间信息流动，即从流入的细胞间信号到捕捉细胞内调节响应的基因表达模块（gene expression module，GEM），再到流出的细胞间信号。具体而言，FlowSig利用额外的扰动数据和下游转录因子靶点路径知识来学习准确的细胞间流动。当处理难以精确推断配体-受体相互作用的数据时，FlowSig结合“对照vs.扰动”实验提供的信息，使用差异表达分析和条件不变性测试推断最可能驱动细胞间流动的输入输出变量集合。此外，FlowSig还支持从空间转录组学数据直接推断每个空间位置接收到的流入信号量，从而无需额外的扰动数据即可推断细胞间流动。 在验证过程中，研究人员首先使用合成数据集进行测试，确保FlowSig能正确反映数学模型模拟出的细胞间流动特征。随后，他们应用FlowSig分析了新生成的皮质类器官实验数据，展示了该方法捕捉刺激诱导变化、展现因COVID-19严重程度增加而引起的细胞间流动转变以及重建小鼠胚胎发育中形态发生素驱动激活剂-抑制剂模式的能力。 图1：对FlowSig模型的描述 研究者开发了FlowSig模型，用于描绘细胞间信息流动的方向性。该模型包含从流入信号（受体基因表达量与下游转录因子基因集平均表达量的乘积Ri×TFi）到基因表达模块（即细胞成员归属至潜在GEM因子GEMi），再到流出信号（信号配体基因表达Li）的有向边（图1a）。在“对照vs.扰动”实验中，系统可能因外部刺激、疾病或时间变化而改变。FlowSig通过差异表达分析和条件不变性测试，识别出分布显著变化的流入和流出变量，以确定最有可能驱动细胞间流动的因素，从而减少数据生成的所有可能网络的数量，并构建更精确的完全部分有向无环图（completed partial directed acyclic graph，CPDAG）（图1b）。 对于难以准确推断配体-受体相互作用的情况，FlowSig能从空间转录组学数据中更精准地估算每个位置接收到的流入信号量，使得即使没有额外的扰动数据，也能推断细胞间的流动（图1c）。具体来说，FlowSig使用COMMOT推断接收的信号配体量（rec. Li），并结合空间解析的GEM（GEMi），最终关联到流出变量（Li）。 图2：FlowSig的合成验证 为了验证FlowSig的有效性，研究人员生成了基于数学模型的模拟实验数据集，用以模拟真实的细胞间流动情况。结果表明，FlowSig能够准确恢复预期的细胞间流动网络结构，证明其算法设计合理且可靠。 研究进一步探讨了SHH信号诱导的单向细胞间流动（图2a）及其对组织模式化的影响（图2b），以及SHH与BMP4之间的竞争关系（图2c）。通过量化FlowSig的真阳性率（TPR）和真阴性率（TNR），研究人员发现：在所有场景中（图2d-f），结合受体表达作为信号流入或引入扰动数据并不会改变平均TPR。使用结合受体进行流入测量显著提高了平均TNR，尤其是在复杂的多方向流动模型中，如SHH驱动的模式化以及SHH与BMP4的竞争关系（图2e,f）。 通过条件不变性测试整合扰动数据，可以减少TNR值的变化，包括四分位数范围和异常值，从而获得更精确的细胞间流动估计。这些结果显示，FlowSig有效地减少了基线GSP和UT-IGSP算法推断中的假阳性数量，提升了细胞间流动预测的准确性。 图3：使用皮层样器官模型验证FlowSig的实验验证 研究者使用皮层发育的类器官模型进一步验证了FlowSig的有效性。从人类胚胎干细胞中生成皮层类器官，并在培养第18天（D18）和第35天（D35）收集样本进行scRNA-seq分析。在该模型中，皮层身份的细胞命运于D18确定，而FGF和BMP信号响应则在D35建立。研究者将D35的数据视为对D18“对照”数据的“扰动”，模拟了这些信号通路的影响。 通过CellChat分析，识别出77个独特的配体-受体相互作用，这些相互作用在细胞间流动中扮演不同角色。FlowSig进一步筛选出26种流入的差异信号（图3a）和16种流出的差异信号（图3b），包括关键的FGF和BMP信号。研究者利用pyLIGER从2,793个高度可变基因中构建了20个GEM，并基于此构建了用于推断细胞间流动的62个变量（图3c）。 为了确定主要驱动因素，研究者根据信号流入变量的总边频次进行了排序，发现FGF、MK（中胚层因子）、PTN（多效生长因子）和NRG（神经调节素）是细胞间流动的关键驱动者。特别是FGF流入通过多个GEM驱动了BMP4、IGF-II、NGF、NRG1和NRG3等信号的流出（图3d）。此外，EOMES被确定为潜在的FGF流入调控候选者。相比之下，BMP流入通过较少的GEM被调节，且可能由PAX6或NR2F1介导（图3e）。 为了验证FlowSig分析结果，研究者在D15-D21期间分别添加FGF8b和BMP4激活相应的信号通路，并在D35时收集样品进行RT-qPCR分析。结果显示，激活FGF信号显著下调了EOMES的表达（图3f），而激活BMP信号则下调了PAX6并上调了NR2F1的表达（图3g），证实了FlowSig预测的准确性。 图4：FlowSig在胰岛扰动非空间scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig在恢复由外部扰动驱动的细胞间流动方面的能力，研究者分析了干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人胰岛scRNA-seq数据。使用pyLIGER构建了10个GEM，这些模块与独立识别的5个细胞类型簇（alpha、beta1-3和delta）对齐（图4a）。基于这些细胞类型注释，CellChat推断出各细胞组之间显著的成对配体-受体相互作用。 IFN-γ刺激显著改变了多个信号通路的流入量：通过FGFR1增加了FGF信号通路的流入，通过IL-6R和IL-6ST增加了IL-6的流入，通过CD74和CD44增加了MIF的流入，通过NCL增加了MDK的流入，并通过SSTR2增加了SST的流入（图4b）。同时，IFN-γ刺激还影响了流出信号，增加了GCG、INHBA和NAMPT的流出量，减少了ANGPTL2、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出量（图4c）。FlowSig识别出FGF、IL-6、MDK和SST是主要驱动细胞间信息流动的因素，这些信号驱动了GCG、INHBA、NAMPT、SPP1、TGFβ1、TNFSF12和UCN3的流出（图4d）。 为了进一步探索IFN-γ刺激的影响，研究人员将全局细胞间流动网络分为两个子网络：上调子网络：对应于IFN-γ刺激上调的流出信号，连接到这些流出变量的GEM及相关的流入节点（图4e）。下调子网络：对应于IFN-γ下调的流出信号，以类似方式构建（图4f）。 这两个子网络共享相似的流入节点和GEM，但GEM-3仅存在于“上调”网络中，这表明它在IFN-γ刺激下具有专门的作用。GEM-3主要富集在α细胞内，表明刺激驱动了来自α细胞的GCG和NAMPT流出。其他流入信号和GEM则在两种条件下共享，显示了它们的双重调控功能。 图5：FlowSig在中度或重度COVID-19患者取样的人类BALF的scRNA-seq中的应用 为了验证FlowSig处理多个扰动的能力，研究者分析了健康对照组、中度和重度COVID-19患者支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞的scRNA-seq数据。使用CellChat结合原始研究中的细胞类型注释，推断出显著的配体-受体相互作用，结果显示健康对照组、中度和重度COVID-19组分别有46个、55个和54个活跃信号通路。 通过pyLIGER构建了20个GEM，这些GEM捕捉了不同条件下的差异（图5a）以及细胞类型间的差异（图5b）。FlowSig识别出每种COVID-19状态相对于健康对照组特有的流入和流出信号变化（图5c）。 为了深入分析这些流出信号驱动的细胞间流动，研究者提取了每个不同流出信号集上游的流入信号及相应的GEM（图5d-f）。尽管随着COVID-19严重程度增加，不同流出信号数量增多，但推断的流入信号数量却从健康对照组的37个减少到中度患者的32个，再到重度患者的25个。类似地，调节性GEM的数量也从健康对照组的16个减少到中度患者的13个，再到重度患者的8个。这表明随着疾病进展，某些特定的细胞间通信路径逐渐丧失。 进一步分析显示，在所有三种条件下共有20个信号流入，而没有发现仅在中度或重度COVID-19中特有的流入信号。TNFRSF12A（由TNFSF12驱动）以及ITGAX和ITGB2 （由C3驱动）的流入信号仅在健康对照组中存在。CAP（来自RETN1）的流入信号则仅在中度和重度COVID-19之间共享（图5g）。 观察到的GEM趋势相似，共享程度最高的GEM是在健康和中度COVID-19群体中的7个GEM，以及在所有三个条件下的5个GEM。GEM-4和GEM-10仅在健康个体中驱动信号流出，而GEM-7（与嗜碱性粒细胞相关）仅在中度和重度COVID-19群体中共享（图5h）。 图6：FlowSig在E9.5小鼠相关性空间立体序列数据中的应用 研究者利用FlowSig对胚胎发育阶段E9.5的鼠胚进行了ST-seq数据分析，揭示了Shh（Sonic Hedgehog）和Wnt5a信号通路之间的复杂双向流动。通过非负空间分解法，研究者从712个空间可变基因中构建了20个高分辨率的空间GEM，这些GEM捕捉了细胞间通信的关键特征（图6a）。 FlowSig识别出多个Shh外流的上游驱动因子，这些因子通过特定的GEM调节Shh外流，并推断出接收的Shh内流（r-Shh）驱动多个信号配体的外流途径，涉及多个GEM（图6c）。为了进一步确定Shh外流的上游调控TF，研究者使用随机森林模型分析了前10个TF的重要性，最终识别出Foxa2、Foxp2、Myc、Zc3h7a和Foxa1为Shh外流的主要上游调控TF（图6d）。 为了识别r-Shh流入的下游靶标，研究者使用pyGAM拟合每个推断出的下游基因表达网络中前10个r-TF的表达与r-Shh流入之间的关系，并根据Spearman相关系数排序。结果显示，Barhl1、Nkx2-1、Meox1、Tcf21和Foxp2与r-Shh的相关性较低，而Foxe1、Nkx2-2、Pou3f1、Tlx2和Nkx2-4等已知靶点表现出显著相关性（图6e）。 研究者观察到Shh和Bmp4、Cxcl12、Igf2、Mdk以及Wnt5a之间可能存在双向流动。为了验证这一假设，研究者分析了各配体与其下游r-Shh流入的关系。结果显示，只有Wnt5a通过GEM-5的转录因子显著受r-Shh流入调节（图6f）。此外，研究者发现r-Wnt5a流入通过空间扩散下调Myc介导的Shh流出，形成一个激活抑制系统（图6g）。这种激活抑制系统的三个关键特征如下：1）信号传播：Shh和Wnt5a配体都能扩散；2）自我上调：Shh通过Foxa2上调自身，Wnt5a通过Foxa1、Nkx6-1 和Sox21上调自身；3）抑制机制：Wnt5a通过下调Myc来抑制Shh。 这些观察结果表明，Shh和Wnt5a之间的双向流动类似于Turing模式生成系统，该系统在发育过程中驱动细胞命运图案化。因此，在E9.5时，Shh和Wnt5a信号通路可能共同作用于胚胎发育中的细胞命运决定过程（图6h）。 综上所述，FlowSig是一款强大的细胞间通信和信息流分析工具，对于分析发育过程中以及强烈单因素（比如药物）或多因素（比如病理微环境）扰动带来的细胞间信息流变化有着非常积极的作用，有助于推动对生命科学和生物医学复杂系统过程的动态理解。 拓展延伸 FlowSig技术在其他科研领域的广泛应用前景： ● 肿瘤微环境与癌症治疗 在肿瘤学领域，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）结合FlowSig方法的应用具有巨大的潜力。肿瘤不仅仅是单一类型的细胞集合，而是一个复杂的生态系统，包括癌细胞、免疫细胞、基质细胞等多种成分。通过scRNA-seq可以揭示肿瘤内部不同细胞亚群的异质性，以及它们之间的相互作用网络。例如，在乳腺癌研究中，科学家们利用scRNA-seq发现了多种肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞不仅促进了肿瘤生长，还影响了化疗药物的效果。借助FlowSig，研究人员能够更加细致地描绘出TAMs与其他细胞类型间的通信路径，从而找到新的治疗靶点或预测患者的预后。 此外，空间转录组学数据提供了额外的空间维度信息，这对于理解肿瘤组织内的结构特征至关重要。比如，某些类型的免疫检查点分子表达可能集中在特定区域，形成所谓的“免疫冷区”。通过整合ST和FlowSig分析，可以精准定位这些冷区，并探索其形成的分子机制，进而开发更有效的免疫疗法策略。这种多模态的数据融合为个性化医疗方案的选择提供了科学依据。 ● 再生医学与干细胞研究 再生医学旨在修复受损组织器官的功能，而干细胞则是实现这一目标的关键角色之一。scRNA-seq和ST技术可以帮助科学家深入了解干细胞分化过程中的基因调控变化，确保生成的组织具备正确的细胞组成。以心脏再生为例，心肌梗死后的心脏修复需要诱导内源性干细胞向心肌细胞方向分化。然而，实际操作中往往面临效率低下等问题。FlowSig可以通过构建详细的细胞间通信模型，指导优化培养条件，提高干细胞定向分化的成功率。 同时，对于移植后的干细胞存活率低的问题，scRNA-seq和ST有助于识别影响细胞存活的关键因素。例如，在骨髓移植过程中，宿主微环境中存在的炎症因子可能会抑制新植入干细胞的增殖。利用FlowSig解析这些不利信号通路，研究人员可以采取措施减少负面影响，改善移植效果。总之，scRNA-seq和ST结合FlowSig的方法为解决再生医学面临的挑战提供了强有力的支持。 ● 神经科学研究 神经系统由高度特化的神经元构成，每个神经元之间通过突触连接传递信息。scRNA-seq和ST技术使得我们能够在单细胞水平上研究神经元及其支持细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞等）之间的交流模式。这对于理解大脑发育、学习记忆等生理过程非常重要。例如，FlowSig已被用于分析皮质类器官中的细胞间流动，揭示了Wnt5a-Shh双向流动关系，其中Shh促进自身及Wnt5a的表达，而Wnt5a则抑制Shh的表达，形成了一个潜在的Turing模式。这种反馈机制有助于解释某些特定的空间结构形成，并可能成为未来研究的重点方向之一。 此外，scRNA-seq和ST还可以帮助探究神经系统疾病的发生机制。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征之一是β-淀粉样蛋白斑块沉积。通过scRNA-seq分析患者脑组织样本，发现了一些参与清除这些有毒蛋白质的免疫细胞类型。结合FlowSig，可以进一步探讨这些细胞如何响应损伤信号，并寻找增强其功能的方法，最终达到延缓疾病进展的目的。 ● 免疫学与感染性疾病 免疫系统负责保护机体免受外来病原体入侵。scRNA-seq和ST技术为解析免疫反应提供了前所未有的机会。特别是在病毒感染的情况下，了解宿主细胞对病毒复制的反应至关重要。例如，在新冠病毒（SARS-CoV-2）感染期间，肺泡灌洗液（BALF）中存在大量的免疫细胞。通过scRNA-seq分析，研究人员能够区分不同的免疫细胞亚群，并追踪它们随时间的变化情况。FlowSig则可用于推断这些细胞间的相互作用，特别是那些对抗病毒至关重要的细胞通讯。 另一个重要应用是在疫苗研发方面。为了评估疫苗诱导的免疫应答，通常需要监测接种者体内抗体水平和T细胞活性。scRNA-seq不仅可以检测到抗原特异性B细胞和T细胞的存在，还能提供关于它们克隆性和表型特征的信息。结合FlowSig分析，可以从整体上把握免疫系统的动态变化，为优化疫苗配方提供参考。此外，这种方法也有助于发现新型免疫调节剂，提升现有疫苗的效果。 临床应用与展望 FlowSig作为一种强大的数据分析工具，在转化医学领域具有广泛的应用前景。例如，在肿瘤学方面，了解肿瘤微环境中不同细胞类型的互动可以帮助识别新的治疗靶点；而在再生医学领域，FlowSig可以协助优化干细胞分化策略，提高组织工程产品的质量。此外，随着单细胞技术和空间转录组学技术的发展，FlowSig将帮助临床医生更深入地理解病理状态下细胞群体的行为变化，进而指导个性化医疗方案的选择。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Almet AA, Tsai YC, Watanabe M, Nie Q. Inferring pattern-driving intercellular flows from single-cell and spatial transcriptomics. Nat Methods. 2024 Oct;21(10):1806-1817. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~

关于FGF-4 成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factors，FGFs）是一类普遍存在于哺乳动物体内的促细胞分裂肝素结合蛋白，其与受体FGFR均在种间高度保守。FGFs可诱导调节细胞增殖分化、胚胎发育、血管再生、损伤修复、肿瘤发生等多个生理进程[1]。近岸类器官课堂：类器官培养关键细胞因子之FGF家族 FGF-4隶属FGF旁分泌亚家族，最初从人胃肿瘤中分离，正常情况下在成人体内少量表达于十二指肠、回肠和结肠中以维持肠干细胞稳态[2]。FGF-4通过硫酸乙酰肝素依赖性路径传递信号，可激活配体FGFR（与FGFR4结合特异性最强）启动损伤修复、器官再生和代谢调控[3]。在人胚胎发育过程中，FGF-4助力干细胞的自我更新与胚胎磨牙芽的发育。 FGF-4与类器官培养 1 肠道类器官 2014年，研究人员使用iPSC来源的类器官首度在体外构建了3D人体肠道组织模型。实验发现，生长因子FGF-4和WNT-3a可促进CDX2+后肠内胚层特异性模式化，并产生三维球状体[4]。2015年的一篇论文则提出，FGF-4在肠道类器官培养中的主要作用可能是抑制hPSC向肝谱系的分化[5]。在2017年和2018年相继发表的两项研究指出，类器官在短期暴露于FGF-4和CHIR 99021（一种Wnt/β-catenin信号通路激活剂）的培养条件下，更倾向于形成十二指肠类器官；而长期暴露则引导其向回肠组织的基因表达模式发展。值得注意的是，当完全缺乏CHIR 99021和FGF-4的添加时，体外实验中未能观察到后肠球状体的形成[6,7]。 图1 从iPSC体外分化肠道类器官的示意图[4] 2 胃类器官 2021年发表于Nature Protocol的文章介绍了使用hPSC产生功能性胃细胞的方法。该实验方法使用Activin A将hPSC分化成定形内胚层（DE），然后添加FGF 4与CHIR 99021产生自由漂浮的3D前肠后部球状体，并最终形成胃窦和胃底类器官[7]。 图2  hPSC诱导产生胃窦和胃底类器官的路径[7] 3 肺类器官 为了应对SARS-CoV-2等呼吸道疾病，体外肺部3D模型一直是研究的重点。来自美国密歇根大学医学院的研究团队通过添加Noggin、SB、FGF-4、CHIR99021，从hPSC开发出人肺类器官（HLO）[8]。该研究得到的HLO由肺的上皮和间充质隔室组成，具有上气道样上皮以及被平滑肌和肌成纤维细胞包围的基底细胞。与此同时，HLO还拥有未成熟纤毛细胞和肺泡样结构域。 2021年，发表于Nature的一篇文章使用FGF-4+CHIR 99021从hPSC获得肺类器官，并检测到类器官中肺泡II型细胞标志物的表达[9]。使用SARS-CoV-2感染肺类器官，观测到趋化因子被高度诱导，与COVID-19患者感染症状类似。基于肺类器官模型，研究者对FDA批准的药物进行了高通量筛选，发现SARS-CoV-2感染抑制剂伊马替尼、麦考酚酸（MPA）和盐酸奎纳克林（QNHC）等，为COVID-19治疗提供了新思路。 图3 肺类器官不同培养阶段的代表性图像[10] 4 肝脏类器官 脂肪型肝炎由多种因素导致，其中非酒精性脂肪肝（NAFLD）以及非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的全球患病率及病死率非常高。为了深入探究脂肪性肝炎基因型-表型关联及其与糖类代谢之间的联系，2022年，发表于Cell上的一篇研究通过添加FGF-4和CHIR 99021，构建了单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎的类器官模型[11]。实验发现葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）-rs1260326-T等位基因仅在同时患有糖尿病的前提下加重NASH，为糖尿病-NAFLD/NASH的治疗奠定了分子基础。 5 心脏类器官 FGF及其受体FGR1在心脏发育中发挥至关重要的作用，如FGF-4-FGFR1通路调节心肌细胞与其他细胞之间的增殖平衡以确保心室结构正确。为了探究心脏发育机制，2020年的一篇研究探索了体外心脏类器官模型建立的路径[12]。向来自小鼠胚胎干细胞的胚状体添加外源FGF-4后，成功诱导初始心肌细胞的增殖和第八天心室的形成。与家族内的其他因子比较，FGF-4的诱导效率最高（两次实验中，FGF-4为88%和78%，FGF10为42%和25%）。最终成功获得具有心肌细胞超微结构特性的心脏类器官，并表达相关转录因子与结构基因，为体外心脏药物筛选、诊疗等提供了新的平台。 图5 心脏类器官不同培养阶段的代表性图像[12] 近岸蛋白提供高活性，高批间一致性的重组FGF-4蛋白，并经过类器官培养验证，让您的类器官培养更可控！ 产品数据 高活性 Measured in a cell proliferation assay using MCF7 Human breast cancer cells.The ED50 for this effect is 2-20 ng/ml. 高批间一致性 Three independent lots were tested for activity and plotted on the same graph to show lot-to-lot consistency of FGF-4(Cat#CR08). 类器官培养验证 Human intestinal organoids (ipsc source) were cultured with Activin A(Cat#C687) , BMP-4(Cat#CR93) , EGF (Cat#C029) , Wnt3a (Cat#C22R), Noggin (Cat#C028), R-spondin 1 (Cat#CX83) and FGF-4 (Cat#CR08) . The organoids showed good morphology. 相关产品： 类器官培养类型 相关因子 胃类器官 Activin A、BMP-4、EGF、FGF-4、FGF-10、Noggin、R-spondin 1、Wnt3a 肠类器官 Activin A、BMP-4、EGF、FGF-4、Noggin、R-spondin 1、Wnt3a 肝类器官 Activin A、BMP-4、BMP-7、FGF-7、FGF-10、FGF-19、HGF、OSM、R-Spondin 1 肺类器官 Activin A、FGF-4、FGF-7、FGF-10、Noggin、SHH、Wnt3a 前列腺类器官 EGF、FGF-10、Noggin、R-spondin 1、Wnt-3a 脑类器官 BDNF、EGF、FGF basic、GDNF、NT-3 内耳类器官 BMP-4、FGF basic 视网膜类器官 SHH、Wnt-3a 乳腺类器官 EGF、FGF basic、FGF-7、FGF-10、Heregulinβ-1、Noggin、R-Spondin 1、R-Spondin 3、Wnt-3a 肾脏类器官 BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF basic、FGF-9、Activin A、FGF-7、GDNF、R-Spondin 1 心脏类器官 Activin A、BMP-4、FGF basic、TGF-beta 1、Transferrin 血管类器官 BMP-4、FGF basic、VEGF 参考文献 [1]Xie, Yangli et al. “FGF/FGFR signaling in health and disease.” Signal transduction and targeted therapy vol. 5,1 181. 2 Sep. 2020, doi:10.1038/s41392-020-00222-7 [2]Tian, Haoyu et al. “Fibroblast Growth Factors for Nonalcoholic Fatty Liver Disease: Opportunities and Challenges.” International journal of molecular sciences vol. 24,5 4583. 26 Feb. 2023, doi:10.3390/ijms24054583 [3]Morita, Hideaki, and Masaaki Hoshiga. “Fibroblast Growth Factors in Cardiovascular Disease.” Journal of atherosclerosis and thrombosis vol. 31,11 (2024): 1496-1511. doi:10.5551/jat.RV22025 [4]McCracken, Kyle W et al. “Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.”Nature protocolsvol. 6,12 1920-8. 10 Nov. 2011, doi:10.1038/nprot.2011.410 [5]Tamminen, Kaisa et al. “Intestinal Commitment and Maturation of Human Pluripotent Stem Cells Is Independent of Exogenous FGF-4 and R-spondin1.”PloS onevol. 10,7 e0134551. 31 Jul. 2015, doi:10.1371/journal.pone.0134551 [6]Tsai, Yu-Hwai et al. “In vitropatterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulatesin vivohuman development.”Development (Cambridge, England)vol. 144,6 (2017): 1045-1055. doi:10.1242/dev.13845 [7]Zhang, Ran-Ran et al. “Human iPSC-Derived Posterior Gut Progenitors Are Expandable and Capable of Forming Gut and Liver Organoids.” Stem cell reports vol. 10,3 (2018): 780-793. doi:10.1016/j.stemcr.2018.01.006 [8]Dye, Briana R et al. “In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.” eLife vol. 4 e05098. 24 Mar. 2015, doi:10.7554/eLife.05098 [9]Han, Yuling et al. “Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.”Naturevol. 589,7841 (2021): 270-275. doi:10.1038/s41586-020-2901-9 [10]Pei, Rongjuan et al. “Host metabolism dysregulation and cell tropism identification in human airway and alveolar organoids upon SARS-CoV-2 infection.”Protein & cellvol. 12,9 (2021): 717-733. doi:10.1007/s13238-020-00811-w [11]Kimura, Masaki et al. “En masse organoid phenotyping informs metabolic-associated genetic susceptibility to NASH.”Cellvol. 185,22 (2022): 4216-4232.e16. doi:10.1016/j.cell.2022.09.031 [12]Lee, Jiyoung et al. “In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF-4 and extracellular matrix.” Nature communications vol. 11,1 4283. 3 Sep. 2020, doi:10.1038/s41467-020-18031-5 上下滑动查看更多 北京拜尔迪是近岸蛋白的授权代理商，更多产品，敬请咨询！

OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769。 文章来源： 逸芯生命科学 类器官和芯片上器官是两种迅速兴起的3D细胞培养技术，旨在弥合体外2D培养和动物模型之间的差距，以实现临床相关的药物发现和人类疾病模型。尽管它们的目标相似，但它们采用不同的方法，对执行工作的要求也各不相同。综合方法有望以可以控制类器官的几何形状并提供流动、机械和电刺激的装置的形式提供改善的细胞保真度。加拿大多伦多大学生物医学工程研究所Milica Radisic团队在这篇综述中讨论了最近在肠，肾，肺，肝，胰腺，脑，视网膜，心脏和肿瘤等领域的综合方法。首先定义了这两个领域，并描述它们如何从组织工程、再生医学和干细胞领域中出现。比较了这两种方法的操作规模，集成类器官和器官芯片设备的研究。最后，研究人员定义了集成设备翻译的实施限制和要求，包括确定应将类器官放置到器官芯片设备中的分化阶段，在类器官内提供可灌注的脉管系统，并克服细胞系和批次间变异性的限制。 相关论文“Integrating organoids and organ-on-a-chip devices” 于2024年7月2日发表于杂志《Nature Reviews Bioengineering》上。 主要内容 01  微流控技术在组织功能模拟与再生医学中的应用 器官芯片（OoC）是一种工程化或微制造的培养系统，支持细胞组装成组织样结构，能够测量和模拟器官功能标志。它提供比传统二维细胞培养更精确的三维细胞模型，用以模拟器官或组织的生理反应。OoC系统可以组合不同组织以再现器官的特定功能，如跨上皮或内皮屏障的渗透性测量。尽管OoC设备通常包含流体流动，但流动并非必需，其核心在于精确控制微组织结构和物理刺激。器官芯片系统通常包括多种细胞类型，如血管细胞、实质细胞、基质细胞和免疫细胞，以更好地模拟天然组织中的异质性。其特征还包括促进营养和氧气运输的膜或柱结构、几何控制的细胞排列和多轴拉伸等。OoC系统可以组合多个组织在单一设备中，模拟器官间的相互作用。虽然这些系统的操作复杂且成本较高，但相比传统2D细胞培养或动物模型，它们能够更精确地研究生理变化。尽管类器官和类胶质细胞等技术可以模拟部分生物过程，但在血管化、药物反应和脱靶效应等方面仍有不足。OoC系统在疾病建模、药物测试以及再生医学等方面具有广泛应用，尽管其尺寸通常在微米到厘米之间，无法完全复制整个器官的复杂性。 图1 类有机物和OoC系统的主要方法 02 类器官和器官芯片融合的优势 器官芯片（OoC）和类器官的整合可以通过结合两者的优势来克服各自的局限性。OoC的微加工技术和水凝胶成型能够引导类器官在发育过程中保持一致性，促进形态成熟。OoC装置可支持类器官与脉管系统的结合，并通过集成传感器实现原位功能读出。类器官能够为OoC提供器官特异性的多谱系细胞，提升其细胞组成的复杂性。相比于类器官的自组装过程，OoC设备提供了精确控制的流体系统和物理刺激，集成传感器也更先进，使得对细胞和组织功能的测量更加精准。尽管类器官在细胞保真度上表现更好，尤其适合药物筛选，但它们在可控性和重复性方面不如OoC。二者的结合可以提升细胞培养和药物分布模拟的效率，为研究血管屏障、细胞收缩力等功能提供更多可能。通过电极和染料，OoC和类器官均可进行电生理读数及其他生理功能的测量，但复杂的单细胞分析可能在类器官中更具优势。 图2 集成类器官和OoC装置的时间轴和应用 图3 类器官和OoC系统整合的进展和挑战 03 单器官模型 1 肠 小肠和大肠类器官尽管保留了其天然组织结构，如肠隐窝、绒毛和细胞异质性，但仍然面临缺乏血管化、灌注、蠕动运动和肠道微生物群引入等问题。通过结合器官芯片技术，这些限制在一定程度上得以克服，例如通过iFlow板中的灌注系统对结肠炎症中的免疫细胞募集进行建模。类器官的腔空间封闭性限制了屏障功能研究，但与灌注装置相结合，模拟痉挛运动的直肠模型可以有效解决该问题。此外，集成系统能够更好地再现肠道生理学和免疫功能，通过机械线索诱导蠕动运动并形成绒毛。尽管取得了进展，但该模型仍缺乏肠道的管状几何形状。通过类似OoC设备的开发，具备粘液双层的结肠芯片模型也得以实现，进一步模仿了人类结肠的功能。尽管如此，类器官与胃肠平滑肌细胞的整合仍未实现，间充质、神经和免疫细胞的加入也需要优化，进一步的改进有望提升类器官与器官芯片的整合性能。 2 肾 肾单位是肾脏的基本功能单位，由肾小球、近端小管、Henle袢、远端小管和集合管组成。器官芯片（OoC）技术已经能够通过空间排列原代或永生化的肾小管上皮细胞或足细胞来重建部分肾单位，如近端小管和肾小球，使用水凝胶或多孔膜模拟其屏障功能。然而，这些模型的细胞类型有限，难以再现完整的肾单位结构。相比之下，hES或iPS细胞衍生的肾类器官能够形成包含足细胞、近端小管、远端小管和集合管细胞的连续肾单位样结构，尽管这些类器官缺乏成熟的血管系统且细胞发育不完全。通过在3D打印的可灌注芯片中培养类器官，血管化和细胞成熟问题得到了部分解决，并且在管状上皮类器官中也成功重现了跨上皮转运功能。虽然类器官与OoC的结合改善了部分肾单位亚结构的血管化和功能建模，但对整个肾单位的全面建模仍具挑战性。OoC可以为不同的肾细胞类型提供所需的空间排列，帮助控制不同节段的流动和运输特性。 3 肺 肺类器官通过调节FGF、Hedgehog、BMP和Wnt等信号传导途径，可从iPS细胞或hES细胞衍生出多种肺谱系细胞，包括基底细胞、纤毛细胞和肺泡祖细胞等。然而，这些类器官通常缺乏分支形态，并且产生的细胞仍为胎儿样细胞，成熟度有限。成人干细胞来源的气道类器官在SARS-CoV-2等感染模型中已有应用，但其分化谱系较单一，缺乏远端肺谱系和分支形态。相比之下，基于微流体的肺芯片通过在多孔PDMS膜上接种原代肺细胞，模拟肺泡-毛细血管界面及呼吸运动，能够重现更接近体内环境的肺组织功能。同时，气-液界面培养和剪切应力的引入进一步改善了上皮细胞的成熟，促进纤毛和粘液细胞的分化。尽管如此，传统的基于膜的肺芯片装置在整合基质细胞或自组织结构方面仍存在局限。在整合类器官与OoC技术的过程中，适度使用工程化的结构以避免干扰类器官的自组织特性显得尤为重要。此外，优化整合的时机也十分关键，不同分化阶段的类器官在增殖和分化能力上存在显著差异，过早或过晚接种都会影响功能性组织的构建。因此，整合类器官和OoC技术要求生物工程师与干细胞生物学家密切合作，调整接种条件和培养环境，以实现更接近体内肺功能的模型系统。 4 肝 肝脏类器官与芯片模型的发展在模拟肝脏功能和药物反应方面展现出巨大潜力。肝脏芯片系统通常利用水凝胶将人类原代肝细胞或iPS细胞衍生的肝细胞包裹在多孔膜中，膜另一侧的可灌注通道可增强传质并避免高剪切应力损伤。流动环境下培养的肝细胞表现出更成熟的表型，分泌更多白蛋白、尿素等代谢物，且用于肝病建模和药物效应研究中效果显著。类器官也能够较好地模拟体内肝芽的结构和功能，基因表达接近人类胎儿肝芽。OoC技术的整合进一步提升了类器官的功能，改善了白蛋白、β-淀粉样蛋白的表达，胆小管形成等生理特征。然而，模型仍面临血管化不足的问题，尤其是肝窦内皮细胞（LSECs）的缺失限制了对肝脏分区和大分子传输的模拟。尽管已经通过预血管化球状体与可灌注血管床结合等方法取得进展，但对HUVEC细胞的依赖性阻碍了肝脏生理的忠实再现。随着LSEC分化协议的出现，血管化问题有望得到解决。此外，未来的模型应重点关注肝窦空间异质性的再现，尤其是复制氧、营养物和信号分子的梯度分布，以提升对肝脏分区药物毒性的研究应用。 5 胰腺 胰岛由多种内分泌细胞组成，包括分泌胰岛素的β细胞和分泌胰高血糖素的α细胞等，传统的2D和3D培养物在模拟胰岛的生理功能方面存在局限，尤其是在控制离子通道活性和细胞骨架结构变化以调节胰岛素分泌方面。胰腺类器官培养能够克服这些不足，并提供更真实的模型以研究复杂疾病，如囊性纤维化，该疾病涉及胰腺导管细胞中突变的跨膜传导调节器通道。基于类器官的胰腺芯片改善了胰岛细胞与胰腺导管上皮细胞的相互作用，增强了对囊性纤维化与糖尿病关系的研究。微流体平台为胰岛类器官的功能评估提供了支持，能够量化葡萄糖反应、胰岛素分泌、氧消耗等重要参数。然而，PDMS材料的疏水性可能吸附小型疏水分子，从而影响药物作用的精确模拟。功能性胰岛的形成还依赖于细胞间通讯的精确调控、关键转录因子的激活和血流支持，OoC装置提供了必要的动态控制，有望进一步提升模型的生理相关性。 6 脑 在胚胎发育中，大脑的时空分子调控引导了人类皮质的快速扩张与功能成熟，脑类器官的构建在细胞组成、区域组织和基因表达上与人类产前新皮质高度相似，可用于后期神经发育研究。区域特异性类器官（如前脑、后脑）可通过调控Wnt、BMP和SHH信号通路在体外生成，并用于药物毒性筛选及疾病模型研究。然而，脑类器官仍面临缺乏功能性血管系统的挑战，限制其生长和成熟。通过与血管类器官融合，可研究新生血管相互作用。脑芯片装置通过内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的共培养，重现了血脑屏障（BBB）的选择性屏障功能，并通过微流控芯片和3D打印技术模拟脑内血管灌注，解决类器官营养输送问题。此外，类器官还可与免疫细胞结合，模拟神经损伤反应。未来通过整合微电极阵列（MEA）可实现大脑电活动的实时监测，进一步推进类器官平台的功能性建模。 7 心脏 心脏功能依赖于心肌细胞的机电耦合和血管网络的支持，而由于成年心肌细胞增殖能力有限，心脏类器官和芯片上的心脏模型主要依赖于hES或hiPS细胞分化。尽管心脏类器官能够在心脏发育和疾病建模中重现部分细胞-细胞和细胞-基质相互作用，但大多数类器官缺乏完整的空间功能分化和四腔结构，同时血管化仍具挑战。芯片上的心脏装置通过测量心肌收缩力、提供机械或电刺激以模拟疾病表型，并通过微流体技术实现血管灌注。微图案化技术进一步优化类器官的组织形态和收缩功能，促进血管网络形成。虽然在开发人类有室类器官方面已取得进展，但稳健的心腔重现仍然是难点，整合生物打印技术和芯片系统将有助于心脏遗传疾病的深入研究和复杂心脏表型的捕捉。 04  多器官模型 多器官系统通过组装体和芯片上的器官（OoC）技术模拟不同器官间的相互作用，组装体适用于紧密相邻的组织模型，如膀胱外肌肉层和内上皮层，而OoC在模拟远端器官的相互作用时具有优势。尽管无泵多器官系统可用于研究药物在肝脏、肿瘤和心脏中的代谢和疗v效，真实器官-器官通信的模拟仍需功能性血管系统的支持。液体处理的复杂性、不同器官培养基的需求差异，以及器官间比例定律的挑战，限制了多器官系统的应用。通过内皮细胞包被的选择性屏障，将成熟的心脏、肝脏、骨骼和皮肤组织连接后，器官保持了各自特异性功能，如心脏收缩性、骨密度、皮肤屏障功能和肝脏白蛋白分泌。此外，系统成功展示了多柔比星的药代动力学和心脏毒性，表明内皮屏障在多器官串扰中的重要性。然而，多器官系统的制备、技术复杂性及成本限制了其广泛应用。 05 血管化模型 血管化是类器官、器官芯片（OoC）、再生医学和组织工程的关键挑战，因氧气扩散限制，组织直径超过100 µm会导致坏死。血管化对于类器官的旁分泌通信、机械刺激、组织成熟、内皮屏障功能以及多器官系统中的相互作用至关重要。尽管类器官已在体内血管化，但在体外构建功能性血管网络仍存在困难。血管工程化主要通过两种方法：一是自组装方法，内皮细胞和支持细胞在水凝胶中自组装成血管网络；二是通过制造中空通道并接种内皮细胞。然而，长期灌注和直径控制仍是挑战。微流体装置能够促进血管化，且新型材料如AngioChip通过孔隙结构提高了血管与实质组织的连通性。类器官血管化的主要障碍在于干细胞分化培养基与促血管生成培养基的兼容性问题，通常类器官分化后再与内皮细胞结合以诱导血管形成。 展望 类器官与器官芯片（OoC）的整合方法为再生医学、疾病建模和药物开发提供了前景广阔的工具，但也面临技术挑战。类器官研究人员可以借助商用OoC系统，而OoC领域的技术人员则可通过类器官分化试剂盒减少变异性。然而，集成类器官与OoC系统需要克服多重障碍，如血管化、培养基不匹配、硬件要求、微流体设计优化、细胞变异性以及不同器官特异性需求。此外，复杂的物理刺激和生物材料的引入是提升模型生理保真度的关键。自动化、可扩展的生产与高级传感器技术有望提高OoC平台的效率，减少人为误差并加快药物筛选进程。要解决的核心问题包括标准化评估方法、人工智能辅助数据分析以及体外模型与体内复杂性的一致性，这些进展将推动综合系统的广泛应用与产业化。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769