CEP250

——背景——传统药物化学任务是找到蛋白质的配体（抑制剂或激动剂），体系可抽象为蛋白A-小分子（二元体系），通常在确定蛋白质A之后，小分子有多种来源：虚拟化合物库筛选、实体化合物库筛选、DNA编码化合物库筛选或者基于片段的药物设计（FBDD），基于结构的药物设计（SBDD）等等。与传统小分子发现任务不同，分子胶系统由蛋白A-分子胶-蛋白B组成，是一个三元系统，在确定蛋白质A之后，即使确定了小分子库，也需要在庞大的蛋白质组中寻找蛋白质B，小分子×蛋白质B，这是一个相当大的空间，其次，表征分子胶的手段往往比抑制剂/激动剂困难的多。目前发展最为成熟的分子胶发现案例当属CELMODs类药物，它固定了蛋白质A（CRBN），小分子库为CELMODs，蛋白质B可通过蛋白质组学监控蛋白质含量变化确定。蛋白质量的多少是较容易监控的指标。但最初的分子胶是靶向蛋白抑制，即改变下游信号通路，这种信号的监控不如蛋白质的量那么直观，因为信号传导是张网，具体节点的确定很难。今年，分子胶祖师爷Stuart Schreiber与诺华合作，开发了基于FKBP12的线性分子胶化合物库，并成功筛选到了新的分子胶。相关工作发表在了预印本上。同时，该实验的阴性结果，也同期发表在Cell chemical biology上，这两篇工作互为补充，较为完整的展示了分子胶开发的全流程。——摘要——近期，Stuart Schreiber联合诺华发表了关于化学诱导临近（chemical induced proximity,cip）分子的最新工作，他们构建了基于FKBP12的DNA编码化合物库，该化合物库包含320万个分子。作者在不同的靶标上进行了测试，成功地发现新的分子胶，并解析了三元复合物结构，该工作表明FKBP12蛋白表面的有一定的灵活性，能在分子胶诱导下与多种蛋白形成稳定的三元复合物。——化合物库构建——化合物库中的化合物由三个片段组成：1：FKBP12结合片段（FKBP12 binding motif），2：linker，3：效应片段（effector）。FKBP12 binding motif和效应片段通过linker连接。其中FKBP12结合片段为SLF（synthesized ligand for FKBP12），该片段源于天然产物FK506，但消除了FK506的免疫抑制活性。Linker大多为刚性含氮杂环。化合物结构通式如图1所示，其中可变部分为(building block1，分子砌块)bb1,bb2,bb3。Bb1为linker，bb2，bb3为有机胺，它们通过SNAr反应添加至三嗪环中。化合物库包含约320万分子。bb1（44）×bb2（290）×bb3（249）。图1. A SLF与FKBP12的晶体结构（1FKH） B Linker结构「双编码子库」（double-encoded subset）是通过一种编码策略提高筛选结果可信度的关键方法。通过为每个化合物分配两套独立的编码序列（DNA barcode），降低假阳性率，增强筛选结果的可靠性。作者在构建化合物库时，将一部分有机胺building block同时放入bb2和bb3中，由因三嗪环的对称性，导致化合物库有约110万个重复化合物，但这些结构相同的化合物拥有不同DNA barcode，以此构建了一个双边编码子库。该化合物库实际包含210万个化合物。——化合物库表征——通过固定Connector上的酰胺键，将连接体的构象向外投射，作者评估了化合物在FKBP12表面覆盖的三维空间（图2C）。结果表明Connector能够从 FKBP12 结合位点以不同的角度和距离均匀地将不同化合物片段投射出去，完全覆盖从酰胺键开始的广阔空间。此外，作者还评估了该化合物库与其它基于FKBP12的化合物库的化学空间（图2E），结果表明该化合物库结构新颖，与之前的化合物库并无重叠。其余化合物库就包含本公众号之前介绍过的Liu jun课题组开发的Rapafucin。图2 C.化合物库投射空间 E.化合物库化学空间——蛋白质B的选择——基于FKBP12的分子胶化合物库，如何在蛋白质组中寻找蛋白B，这是该课题最重要的问题之一。目前能实际指导分子胶开发的计算工具还不多，作者基于经验从PDB中挑选了一组well-behaved targets（24个），这些蛋白质结构多样。作者将这些蛋白表达纯化后用于化合物库筛选（图3）。图3. 作者用于测试的目标蛋白——化合物筛选——将纯化后的靶标，在FKBP存在/不存在（0 或200 um）条件下，与化合物孵育，然后将洗脱下的化合物进行测序，找到目标化合物。化合物根据其表现，可分为四类（图4），分别是non-binder，bead-binder，bifunctionals or binders，molecular glue。图4. 化合物库中的分子，它们所有可能的结果筛选结果如图所示，简单地说，处于右下方，接近X轴的点，有可能是分子胶；处于右上角的点，可能是双功能分子。图5. 筛选结果最终作者发现了两个符合条件的靶点：BRD9和QDPR。图6A展示了化合物库在BRD9筛选上的表现，在横轴上方出现了几个点，符合分子胶特征，作者将其单独合成后，进行了表征实验，发现这些化合物确实以分子胶机制发挥功能。图6. A.化合物库在BRD9上的表现，1，2，3为阳性化合物 B.SPR测试阳性化合物与BRD9二元结合力 C.SPR测试，在FKBP12存在下阳性化合物与BRD9的结合 D.细胞上测试阳性化合物诱导FKBP12-分子胶-Bromodomain三元互作 E.细胞上测试阳性化合物诱导FKBP12-分子胶-全长BRD9三元互作 F. BRD9抑制剂BI-7273与阳性化合物竞争实验最后，作者解析了FKBP12-cpd1-BRD9的三元复合物晶体结构（图7）。cpd1利用了 BRD9识别 PTM（翻译后修饰，即丁酰化赖氨酸）的能力，其方式是在 FKBP12（FK506 结合蛋白 12）表面展示化合物 1，这非常类似于免疫调节药物（IMiD）通过模拟CRBN天然底物——C 末端环状酰亚胺，从而利用 CRBN降解靶标蛋白。图7. A.三元复合物晶体结构 B. BRD9的ZA-loop，FKBP12的40s loop，80s loop参与了PPI C.cpd1的片段模拟了丁酰胺化赖氨酸醌二氢蝶啶还原酶（QDPR）是一种酶，它利用NADH催化醌型二氢生物蝶呤的还原。高通量筛选也发现了靶向QDPR的分子胶。作者单独合成了cpd4并进行后续验证。结论1. cpd4单独不与QDPR的结合。2. FKBP12存在时，cpd4 与QDPR有结合（KD = 3 μM）。3.在NADH存在下，没有发现FKBP12-化合物4-QDPR三元复合物形成（图8c）。以上结果表明cpd4可与FKBP12、QDPR形成三元复合物，且三元复合物界面在NADH结合口袋附近。图8 . A QDPR筛选结果 B.cpd4单独不与QDPR结合（NADH为阳性化合物）三元复合物晶体结构与QDPR-NADH二元复合物的叠加图，证实了cpd4确实部分占据NADH口袋（图9B）。图9 . A. QDPR-cpd4-FKBP12三元复合物结构B. cpd4部分占据NADH口袋——小结——通过DEL策略，作者成功发现了新的基于FKBP12的分子胶。化合物1结合BRD9的酰基赖氨酸结合口袋;对于QDPR，化合物4占据部分NADH结合口袋。在这两个例子中，分子胶与靶蛋白之间均仅观察到一个单一的氢键，并且化合物与靶标蛋白的其他相互作用是非极性相互作用，这是分子胶的一个特征，并且化合物与靶标蛋白无任何显著亲和力。已知与其他分子胶靶标接触的FKBP12 loop（40s、50s、80s）与BRD9和QDPR都形成接触，而FKBP12的His87是两个三元复合物之间唯一的共享蛋白质-蛋白质接触残基，这表明FKBP12的可塑性。有趣的是，FKBP12的His87也与mTOR、钙调神经磷酸酶和CEP250形成蛋白质-蛋白质相互作用，为80s loop在不同靶标识别中的重要性提供了更多证据。参考文献1. Zandi, T.A. et al. Discovery of molecular glues that bind FKBP12 and novel targets using DNA-barcoded libraries. bioRxiv, 2024.2012.2009.627499 (2024).作者：任宇浩审稿：黄志贤编辑：黄志贤版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。往期推荐乐威医药荣获2024年度EcoVadis承诺奖牌乐威医药再获三项国家专利知识产权乐威医药公益3.12植树行动

——背景——传统药物化学任务是找到蛋白质的配体（抑制剂或激动剂），体系可抽象为蛋白A-小分子（二元体系），通常在确定蛋白质A之后，小分子有多种来源：虚拟化合物库筛选、实体化合物库筛选、DNA编码化合物库筛选或者基于片段的药物设计（FBDD），基于结构的药物设计（SBDD）等等。与传统小分子发现任务不同，分子胶系统由蛋白A-分子胶-蛋白B组成，是一个三元系统，在确定蛋白质A之后，即使确定了小分子库，也需要在庞大的蛋白质组中寻找蛋白质B，小分子×蛋白质B，这是一个相当大的空间，其次，表征分子胶的手段往往比抑制剂/激动剂困难的多。目前发展最为成熟的分子胶发现案例当属CELMODs类药物，它固定了蛋白质A（CRBN），小分子库为CELMODs，蛋白质B可通过蛋白质组学监控蛋白质含量变化确定。蛋白质量的多少是较容易监控的指标。但最初的分子胶是靶向蛋白抑制，即改变下游信号通路，这种信号的监控不如蛋白质的量那么直观，因为信号传导是张网，具体节点的确定很难。今年，分子胶祖师爷Stuart Schreiber与诺华合作，开发了基于FKBP12的线性分子胶化合物库，并成功筛选到了新的分子胶。相关工作发表在了预印本上。同时，该实验的阴性结果，也同期发表在Cell chemical biology上，这两篇工作互为补充，较为完整的展示了分子胶开发的全流程。——摘要——近期，Stuart Schreiber联合诺华发表了关于化学诱导临近（chemical induced proximity,cip）分子的最新工作，他们构建了基于FKBP12的DNA编码化合物库，该化合物库包含320万个分子。作者在不同的靶标上进行了测试，成功地发现新的分子胶，并解析了三元复合物结构，该工作表明FKBP12蛋白表面的有一定的灵活性，能在分子胶诱导下与多种蛋白形成稳定的三元复合物。——化合物库构建——化合物库中的化合物由三个片段组成：1：FKBP12结合片段（FKBP12 binding motif），2：linker，3：效应片段（effector）。FKBP12 binding motif和效应片段通过linker连接。其中FKBP12结合片段为SLF（synthesized ligand for FKBP12），该片段源于天然产物FK506，但消除了FK506的免疫抑制活性。Linker大多为刚性含氮杂环。化合物结构通式如图1所示，其中可变部分为(building block1，分子砌块)bb1,bb2,bb3。Bb1为linker，bb2，bb3为有机胺，它们通过SNAr反应添加至三嗪环中。化合物库包含约320万分子。bb1（44）×bb2（290）×bb3（249）。图1. A SLF与FKBP12的晶体结构（1FKH） B Linker结构「双编码子库」（double-encoded subset）是通过一种编码策略提高筛选结果可信度的关键方法。通过为每个化合物分配两套独立的编码序列（DNA barcode），降低假阳性率，增强筛选结果的可靠性。作者在构建化合物库时，将一部分有机胺building block同时放入bb2和bb3中，由因三嗪环的对称性，导致化合物库有约110万个重复化合物，但这些结构相同的化合物拥有不同DNA barcode，以此构建了一个双边编码子库。该化合物库实际包含210万个化合物。——化合物库表征——通过固定Connector上的酰胺键，将连接体的构象向外投射，作者评估了化合物在FKBP12表面覆盖的三维空间（图2C）。结果表明Connector能够从 FKBP12 结合位点以不同的角度和距离均匀地将不同化合物片段投射出去，完全覆盖从酰胺键开始的广阔空间。此外，作者还评估了该化合物库与其它基于FKBP12的化合物库的化学空间（图2E），结果表明该化合物库结构新颖，与之前的化合物库并无重叠。其余化合物库就包含本公众号之前介绍过的Liu jun课题组开发的Rapafucin。图2 C.化合物库投射空间 E.化合物库化学空间——蛋白质B的选择——基于FKBP12的分子胶化合物库，如何在蛋白质组中寻找蛋白B，这是该课题最重要的问题之一。目前能实际指导分子胶开发的计算工具还不多，作者基于经验从PDB中挑选了一组well-behaved targets（24个），这些蛋白质结构多样。作者将这些蛋白表达纯化后用于化合物库筛选（图3）。图3. 作者用于测试的目标蛋白——化合物筛选——将纯化后的靶标，在FKBP存在/不存在（0 或200 um）条件下，与化合物孵育，然后将洗脱下的化合物进行测序，找到目标化合物。化合物根据其表现，可分为四类（图4），分别是non-binder，bead-binder，bifunctionals or binders，molecular glue。图4. 化合物库中的分子，它们所有可能的结果筛选结果如图所示，简单地说，处于右下方，接近X轴的点，有可能是分子胶；处于右上角的点，可能是双功能分子。图5. 筛选结果最终作者发现了两个符合条件的靶点：BRD9和QDPR。图6A展示了化合物库在BRD9筛选上的表现，在横轴上方出现了几个点，符合分子胶特征，作者将其单独合成后，进行了表征实验，发现这些化合物确实以分子胶机制发挥功能。图6. A.化合物库在BRD9上的表现，1，2，3为阳性化合物 B.SPR测试阳性化合物与BRD9二元结合力 C.SPR测试，在FKBP12存在下阳性化合物与BRD9的结合 D.细胞上测试阳性化合物诱导FKBP12-分子胶-Bromodomain三元互作 E.细胞上测试阳性化合物诱导FKBP12-分子胶-全长BRD9三元互作 F. BRD9抑制剂BI-7273与阳性化合物竞争实验最后，作者解析了FKBP12-cpd1-BRD9的三元复合物晶体结构（图7）。cpd1利用了 BRD9识别 PTM（翻译后修饰，即丁酰化赖氨酸）的能力，其方式是在 FKBP12（FK506 结合蛋白 12）表面展示化合物 1，这非常类似于免疫调节药物（IMiD）通过模拟CRBN天然底物——C 末端环状酰亚胺，从而利用 CRBN降解靶标蛋白。图7. A.三元复合物晶体结构 B. BRD9的ZA-loop，FKBP12的40s loop，80s loop参与了PPI C.cpd1的片段模拟了丁酰胺化赖氨酸醌二氢蝶啶还原酶（QDPR）是一种酶，它利用NADH催化醌型二氢生物蝶呤的还原。高通量筛选也发现了靶向QDPR的分子胶。作者单独合成了cpd4并进行后续验证。结论1. cpd4单独不与QDPR的结合。2. FKBP12存在时，cpd4 与QDPR有结合（KD = 3 μM）。3.在NADH存在下，没有发现FKBP12-化合物4-QDPR三元复合物形成（图8c）。以上结果表明cpd4可与FKBP12、QDPR形成三元复合物，且三元复合物界面在NADH结合口袋附近。图8 . A QDPR筛选结果 B.cpd4单独不与QDPR结合（NADH为阳性化合物）三元复合物晶体结构与QDPR-NADH二元复合物的叠加图，证实了cpd4确实部分占据NADH口袋（图9B）。图9 . A. QDPR-cpd4-FKBP12三元复合物结构B. cpd4部分占据NADH口袋——小结——通过DEL策略，作者成功发现了新的基于FKBP12的分子胶。化合物1结合BRD9的酰基赖氨酸结合口袋;对于QDPR，化合物4占据部分NADH结合口袋。在这两个例子中，分子胶与靶蛋白之间均仅观察到一个单一的氢键，并且化合物与靶标蛋白的其他相互作用是非极性相互作用，这是分子胶的一个特征，并且化合物与靶标蛋白无任何显著亲和力。已知与其他分子胶靶标接触的FKBP12 loop（40s、50s、80s）与BRD9和QDPR都形成接触，而FKBP12的His87是两个三元复合物之间唯一的共享蛋白质-蛋白质接触残基，这表明FKBP12的可塑性。有趣的是，FKBP12的His87也与mTOR、钙调神经磷酸酶和CEP250形成蛋白质-蛋白质相互作用，为80s loop在不同靶标识别中的重要性提供了更多证据。参考文献1. Zandi, T.A. et al. Discovery of molecular glues that bind FKBP12 and novel targets using DNA-barcoded libraries. bioRxiv, 2024.2012.2009.627499 (2024).作者：任宇浩审稿：黄志贤编辑：黄志贤GoDesignID：Molecular_Design_Lab（ 扫描下方二维码可以订阅哦！）

今天分享的文章是一篇2019年发表在Nature Chemistry上的文章Rapamycin-inspired macrocycles with new target specificity，通讯作者是约翰霍普金斯医学院的Jun O. Liu.，该课题组近年构建了FK506/雷帕霉素类似物库，试图发现基于FKBP的分子胶。 ——背景—— 雷帕霉素/FK506这些天然大环化合物，在体内先与FKBP（FK506-binding -protein）结合形成二元复合物，二元复合物会和第二个蛋白结合进一步形成三元复合物，最终发挥药物的功能。受此启发，作者试图构建一系列雷帕霉素/FK506类似物，希望找到新的FKBP-雷帕霉素类似物-靶蛋白的互作对。 方法：保留雷帕霉素与FKBP结合部分（FKBD），用四肽替换掉雷帕霉素中mTOR结合的部分，构建了4万余个类似物。 ——正文—— 天然产物往往以意想不到的机制发挥作用，这给药物设计提供了灵感。雷帕霉素/FK506就是这样的分子。它们进入细胞后，会首先和FKBP家族蛋白结合，尤其是FKBP12，形成二元复合物。FKBP12-雷帕霉素复合物会靶向mTOR，进一步形成三元复合物，导致mTOR激酶活性被抑制；FKBP12-FK506类似物会靶向calcineurin(一种磷酸酶)，抑制Ca2+依赖的信号传导及T细胞激活。结构上，FK506和雷帕霉素可简单地划为两个部分：1）FKBP结合片段2）效应片段（结合效应蛋白：calcineurin或mTOR）（Fig 1）。 Figure 1. 雷帕霉素与FK506结构，蓝色部分为FKBP结合片段，FKBD，红色部分为效应片段 二者FKBP结合片段非常类似，而效应片段有较大差别。通过替换效应片段构建雷帕霉素类似物，是否可以找到新的能够诱导三元复合物的大环？（Fig 2）这是本文的主要问题。注：就在本文发表的第二年（2020），就又发现了雷帕霉素类似物（WDB002，诱导FKBP12与CEP250蛋白形成复合物）。前人的工作已经合成了类似的化合物，这些多肽衍生物保留了与FKBP的结合，但没有活性。 Figure 2. 作者的设想，用四肽替换掉现有天然产物的效应片段 作者之前也做过类似的尝试，包括构建大的FKBP衍生物库（但库中化合物丧失了对FKBP的结合）。本文是作者的后续成果，构建了一个45000的雷帕霉素衍生物库，从中成功鉴定出ENT1的抑制剂。 Rapafucin的合成：作者使用固相合成+split pool策略去组装四肽。具体反应路径如下所示，1）将带有烯烃的仲胺linker固定在beads上，2）四肽的羧基与仲胺缩合，固定四肽（Fig 3）。 Figure 3. 固定Linker和四肽 3）FKBD的羧基与四肽末端氨基缩合，固定FKBD（Fig 4） Figure 4. 固定FKBD 4）通过烯烃复分解，将FKBD中的烯烃与仲胺linker连接，一步完成关环和脱beads（Fig 5）。 Figure 5. 通过烯烃复分解关环并脱Beads 优化点1：对linker的筛选。trans构型的烯烃C5只有较低的关环产率，cis构型的产率高于trans构型，其中C6,C8高于C4，但是C8的产物不单一，所以最后选择了cis-C6（Fig 6）。 Figure 6. Linker的选择 优化点2：FKBD上烯烃片段对反应产率的影响，结论是作者选取的几种结构，都不影响烯烃复分解的产率。 优化点3：反应温度、反应时间、催化剂用量等。 优化点4：不同FKBD对FKBP的亲和力。FKBD3是直接从雷帕霉素上截取而来，FKBD6是基于SLF(Synthetic Ligand of FKBP)而来。线性化的FKBD3对FKBP12的亲和力相较于雷帕霉素下降了三百倍（(Kd = 327 nM for FKBD3 and 1nM for rapamycin)），将FKBD3环化，亲和力有一定的提升（Kd = 174 nM）；FKBD7-9对FKBP的亲和力严重下降，提示更刚性的酰胺键不如酯键；线性化的SLF衍生物FKBD6对FKBP亲和力较强（Kd = 62 nM），但成环以后活性大幅丧失。将FKBD6中刚性的苯环用脂肪链替代，得到了FKBD10（Kd = 4 nM），FKBD11(Kd = 11 nM)。将二者环化之后，活性仅有轻微下降，FKBD10（Kd = 25 nM），FKBD11(Kd = 37 nM)。不同的环化不会导致含FKBD10,11的大环对FKBP的亲和力下降（Fig 7）。 Figure 7. FKBD的结构 化合物库的合成：以FKBD10，11和cis-c6 linker为基础开始构建化合物库。首先是构建四肽效应片段。氨基酸选择带有疏水侧链的天然/非天然氨基酸。同时将2，4位氨基酸胺基甲基化封闭，用于改善分子整体性质。使用split-pool策略固相合成四肽。1-4位每个位置上氨基酸残基可用数为15，10，15，10，一共构建了15 x 10 x 15 x 10 = 22500个四肽片段。每个片段可以和FKBD10和11成环，所以一共合成了45000个雷帕霉素衍生物（rapafucin），FKBD10系列环原子数36，FKBD11系列环原子数34。至此化合物构建完成（Fig 8）。 Figure 8. 四肽部分的构建及两类终产物的结构式 基于细胞表型的筛选体系：筛选能够抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的化合物，发现FKBD10系列中的一个pool的化合物有较好的抑制活性。将这15个化合物单独合成并验证活性，只有三个化合物有亚微摩尔活性，最好的化合物活性为426 nM。将四肽的顺序颠倒后重新与FKBD10成环，得到的化合物SH-13抑制活性为 366 nM。对SH-13进行三轮改造后得到活性最强的化合物95-15-3（Rapadocin），抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的IC50为5 nM（Fig 9）。 Figure 9. a）Rapadocin结构式 b）Rapadocin抑制胸苷摄取 ENT1是Rapadocin的靶点：Rapadocin对表达hENT1的PK15细胞的腺苷转运有明显抑制（IC50 = 3.2 nM），而对表达hENT2的细胞几乎没有抑制活性，重要的是，这一活性是FKBP依赖的（Fig 10）。 Figure 10. 左图Rapadocin选择性抑制PK15-hENT1细胞腺苷转运，右图Rapadocin对胸苷转运的抑制部分依赖于FKBP12 ——小结—— 通过模仿天然产雷帕霉素，作者成功找到了hENT1的抑制剂Rapadocin，且Rapadocin发挥功能部分依赖于FKBP12。雷帕霉素和FK506的靶点都是细胞内的蛋白质，而Rapadocin的靶点为膜蛋白，扩充了分子胶靶点蛋白的范围。 参考文献： Guo, Z., Hong, S.Y., Wang, J.et al. Rapamycin-inspired macrocycles with new target specificity. Nature Chem 11, 254–263 (2019). https://doi.org/10.1038/s41557-018-0187-4 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓