PRMT7

2024年4月4日，叶飞教授等人在Journal of Medicinal Chemistry上发表题为“Development of (2-(Benzyloxy)phenyl)methanamine Derivatives as Potent and Selective Inhibitors of CARM1 for the Treatment of Melanoma”的文章。在这篇文章中，作者等人设计了一系列高效和高选择性的CARM1抑制剂；其中，化合物17e展现出非凡的药效和选择性（IC50 = 2 ± 1 nM），同时对黑色素瘤细胞系有显著的抗增殖活性。此外，化合物17e在黑色素异种移植模型中有良好的抗肿瘤活性，这意味着该化合物作为一种潜在的抗癌药物值得进一步研究。蛋白质精氨酸甲基化是由精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化的一种重要的翻译后修饰。PRMTs利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体去执行这一催化过程，从而产生S-腺苷-l-高半胱氨酸（SAH或AdoHcy）和甲基化底物。PRMT有9个成员：PRMT1到9，根据其甲基化不同可分为I型，II型和III型。I型PRMTs（PRMT1、2、3、4、6和8）催化单甲基化和不对称甲基化，产生ω-NG-单甲基精氨酸（MMA）或ω-NG和Ng-不对称二甲基精氨酸（aDMA）；II型PRMTs（PRMT5和9）催化单甲基化和对称二甲基化，产生MMA或ω-NG和NG对称二甲基精氨酸（sDMA）；III型PRMT（PRMT7）是只能催化单甲基化，专门产生MMA。与大多数的PRMTs相比，PRMT4又称为共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1（CARM1），表现出一个松散的作用基序，不会轻易被其他PRMTs识别，因此这是CARM1在其底物识别方面具有独特性的原因。另外，在胚胎的发育过程中，CARM1耐受性缺失意味着与靶向PRMT1或PRMT5抑制剂相比，CARM1抑制剂可能提供更广泛的治疗窗。这独特方面突出了CARM1作为治疗干预靶点的潜在优势。CARM1能够甲基化各种组蛋白和非组蛋白底物，包括H3R2、H3R17、H3R26、7RUNX1、BAF155、8PABP1、和TARPP。值得注意的是，组蛋白H3R17和H3R26的甲基化是CARM1的一个特殊的特点。因此，CARM1在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞自噬、代谢、早期发育和mRNA的预剪接。由于其重要的生物学功能，越来越多的证据表明CARM1的过表达与多种癌症有关，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病和黑色素瘤。另外，Kumar等人发现抑制CARM1可以通过对肿瘤细胞和T细胞的双重作用对耐药肿瘤进行免疫治疗。因此，CARM1是癌症治疗的一个潜在靶点，特别是对耐药肿瘤。作者提出目前大多数具有肿瘤抑制作用的CARM1抑制剂主要是针对血液肿瘤，而针对实体肿瘤的抑制剂却很少，其疗效也有限。因此，文章重点致力于更有效的CARM1抑制剂的开发，特别是提高对实体肿瘤的选择性和疗效。在前期研究工作中，作者报告了ZL-28-6 (6)对CARM1表现出强效的抑制作用，但其选择性没有明显提高（图1）。因此，对化合物6进行结构修饰旨在进一步提高该化合物的选择性和抑制活性。图1 化合物6的结构及生物活性作者把化合物6的化学结构分为三个部分。首先，N, N-二甲基乙二胺的尾部基团插入入口通道，模拟底物精氨酸的侧链，与残基E257和E266形成氢键和盐桥，这对CARM1的催化活性至关重要。第二，中间的苯环与保守的疏水界面相互作用。第三，位于非保守区域的头部基团。此外，该化合物两个芳环之间的乙氧基增加了两个芳香环之间的灵活性，导致π−π与F152的相互作用；头部基团的氯原子与Q148形成卤素键，从而增加了对CARM1的抑制活性。（图2）图2 化合物6与CARM1的相互作用因此，作者以化合物6作为先导化合物，针对头部和尾部进行结构修饰得到一系列衍生物，评价了合成衍生物对CARM1和PRMT1的抑制活性。其中与先导化合物相比，化合物14g、14h、17e、17g和17h对CARM1抑制作用更好，同时对PRMT1抑制活性较弱（表1）。初步评价了这五个化合物在浓度为1 μM和10 μM下在A375和A2058黑色素瘤细胞系中的抗增殖活性，结果发现这些化合物在黑色素瘤细胞系中均表现出显著的增殖抑制作用，超过了已报道的阳性CARM1抑制剂EZM2302（表2）。随后，作者评价了这些化合物在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性，化合物17e具有较低的体外清除率（CL = 132 mL/min/kg）以及半衰期延长（T1/2 = 41.55 min），展现出较高的微粒体代谢稳定性（表3）。因此，基于酶活性、细胞活性和体外代谢稳定性的评估，作者最终选择了化合物17e进行进一步的研究。表1衍生物对CARM1和PRMT1的抑制作用表2 选定的潜在CARM1抑制剂对两种细胞系的抗增殖活性表3 化合物在小鼠肝脏微粒体中的代谢稳定性首先，评估了化合物17e对不同癌细胞和正常乳腺细胞MDA-KB2的抑制作用。结果发现该化合物对黑色素瘤细胞A375具有特异性的抗增殖作用。此外，化合物17e抑制MDA-KB2细胞生长（IC50= 6.60 μM），但比A375的抗增殖半抑制浓度值大12倍，表明其有良好的安全性。图3 化合物17e对7种细胞系的抗增殖作用接下来评价了化合物17e对不同PRMTs的选择性。结果表明该化合物对不同的PRMTs表现出良好的选择性，PRMT1超过100倍，PRMT3超过450倍，PRMT6和PRMT8的选择性均超过30倍。此外，在浓度为100 μM时，17e对PRMT5和PRMT7均无抑制作用，这些结果表明该化合物具有显著的选择性。图4 化合物17e的选择性评价随后分析了化合物17e与CARM1的结合模式，利用分子对接技术预测了CARM1/17e复合物的结构，并进行了200 ns的分子动力学（MD）模拟，结果显示化合物17e在150 ns后达到平衡（图5 A）。紧接着利用MM-PBSA方法进行MD模拟，对相对结合能进行残基分解，研究与17e结合的关键氨基酸残基。Y149、F152、Y153、Q446氨基酸与化合物17e头部的苯和噻唑环形成π−π堆叠和疏水作用；氨基酸E257、M259、E266、H414和W415与化合物17e的尾部形成氢键相互作用（图5 B-D）。值得注意的是，F152和Q446在I型PRMT中是不保守的，表明它们与化合物17e的高选择性有潜在的关键作用（图5 E）。图5 （A）蛋白质和化合物17e的RMSD运动轨迹；（B-D）化合物17e与氨基酸的相互作用模式；（E）CARM1与PRMT1、3、6和8的序列比对随后，使用细胞热位移试验（CETSA）测定化合物17e是否可以进入细胞直接与CARM1蛋白相互作用。结果表明化合物17e以浓度依赖性的方式增强了CARM1的蛋白热稳定性，说明化合物17e可以进入细胞并直接与CARM1结合（图6 A，B）。此外为了探究17e是否能抑制细胞中CARM1的甲基化活性，作者检测了与17e孵育后CARM1底物的甲基化变化。用17e处理A375细胞72 h，结果显示化合物17e以剂量依赖的方式降低不对称二甲基-PABP1和整体aDMA的水平（图6 C）。另外，在A2058细胞中，17e也呈剂量依赖性地降低了不对称二甲基-PABP1的水平（图6 D）。这些发现证实了化合物17e可以通过抑制CARM1的甲基转移酶活性来影响细胞中CARM1底物的不对称二甲基化。图6 （A-B）化合物17e与CARM1蛋白之间的相互作用；（C）化合物17e降低A375中的精氨酸甲基化水平；（D）化合物17e降低A2058中的精氨酸甲基化水平最后，作者研究了化合物17e在体内的抗肿瘤活性，通过建立A375异种移植BALB/c裸鼠，分别以10 mg/kg/d和25 mg/kg/d腹腔注射药，持续14天。结果发现，化合物17e在体内可显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为63%（25 mg/kg）和55%（10 mg/kg）（图7 A-D），并且没有明显的毒性。此外，通过蛋白印迹分析了肿瘤组织中aDMA、PABP1和PABP1me2a的水平，结果显示不对称二甲基化显著降低，这与细胞研究的结果一致（图7 E）。图7 化合物17e在A375细胞来源的异种移植物中的体内抗肿瘤活性。（A）肿瘤体积；（B）体重；（C）化合物17e处理后小鼠肿瘤重量；（D）对照组和治疗组肿瘤体积的视觉图；（E）蛋白免疫印记检测PABP1不对称二甲基化和aDMA水平在本研究中，作者采用结构辅助药物设计，对先前鉴定的I型PRMT抑制剂化合物6进行化学修饰，得到了一系列衍生物。值得注意的是，化合物17e对CARM1表现出显著的抑制活性，并对其他PRMT表现出较高的选择性。化合物17e有效抑制各种肿瘤细胞的生长，特别是黑色素瘤A375细胞，在A375异种移植模型中也显示出了抗肿瘤活性，没有引起明显的毒性。总之，化合物17e是一种高选择性和高效的CARM1抑制剂，具有良好的药理活性。这一发现为探索精氨酸甲基化调节作为一种新的癌症治疗策略铺平了道路。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02265声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

1922年，哥伦比亚大学摩尔根实验室的遗传学家Calvin Bridges，在黑腹果蝇身上发现一种有趣的现象：当某两个特定的基因同时突变失活时，会导致果蝇的死亡；而这两个基因单独任何一个突变失活，都不会给果蝇带来致命的伤害。1946年，Theodosius Dobzhansky给这种现象取了个名字—— “合成致死”效应。所谓“合成致死”，就是对于细胞中的两个基因，其中任何一个单独突变或者不发挥作用时，都不会导致细胞死亡；而两者同时突变或者不能表达时，就会导致细胞死亡，利用该原理可实现选择性杀伤肿瘤细胞而不对正常体细胞产生影响。基于合成致死原理的肿瘤治疗尽管如今“合成致死”的概念已蓬勃发展，成为新兴热门赛道。但是其发展经历了漫长的过程。2014年，全球首款“合成致死”理念相关药物PARP（多聚ADP核糖聚合酶）抑制剂Olaparib，获FDA批准用于治疗卵巢癌。自此，“合成致死”由概念变成现实。如今，国内外大量资源投入到“合成致死”研究中，除了PARP外，PRMT5、WEE1、ATR、ATM等靶点的研究也逐渐展露头角，它们的研究进展到哪一步了呢？PRMT5抑制剂PRMT（蛋白质精氨酸甲基转移酶）能够使多种蛋白甲基化，并在基因表达、剪接和DNA损伤修复等生物学过程中发挥重要作用。在哺乳动物中，共有9种PRMTs, 分为I、II、III三种类型。其中I型包括PRMT1、2、3、4、6、8，主要催化生成单甲基精氨酸（MMA）和不对称二甲基精氨酸（ADMA）；Ⅱ型包括PRMT5、9，主要催化生成MMA和对称二甲基精氨酸（SDMA）；III型包括PRMT7，主要催化生成MMA。其中PRMT5是关注度最高的一种亚型。PRMT5通过对称二甲基化，翻译后修饰组蛋白和其他蛋白质；这种由PRMT5催化的蛋白质底物甲基化在调节关键细胞进程中起着重要作用，如DNA修复、细胞周期进展、转录调控和RNA剪接等。PRMT5被认为是一种潜在的致癌基因。PRMT5作用机制2016年，发表在《Science》的文章首次报道了抑制PRMT5在MTAP（甲硫腺苷磷酸化酶）缺失肿瘤中的“合成致死”效应，文章指出与PRMT5构成合成致死的基因是MTAP，这是一种抑癌基因，常在肿瘤中发生缺失。因此，PRMT5/MTAP抑制剂被认为是潜在的抗肿瘤药物。目前，大约有十几款PRMT5抑制剂已进入临床阶段。全球部分在研PRMT5抑制剂来源：公开资料其中，Epizyme和GSK共同研发的GSK3326595是目前进展最快的PRMT5选择性小分子抑制剂。它带有一个四氢异喹啉片段（THIQ），THIQ环与PRMT5特有的残基Phe327形成潜在的π-π堆积作用，可有效抑制肿瘤体积。另外，GSK3326595具有良好的脑通透性和抗肿瘤效果。WEE1抑制剂Wee1激酶最早发现于裂殖酵母中，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的重要成员之一。它是一种高度保守的细胞周期调节蛋白，主要由3个结构域组成，即N-端结构域、中心激酶结构域和1个短的C-端结构域。N-端结构域是Wee1激酶的激活结构域，也是抑制周期蛋白依赖性激酶1-周期蛋白B（CDK1-CyclinB）复合物去磷酸化的潜在位点，这些泛素化识别位点可以严格控制Wee1的细胞内半衰期；C-端结构域主要包含催化段和活化段。Wee1激酶作用机制来源：PROGRESS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES 2022,46 (1): 71-80Wee1激酶可通过磷酸化CDK的Thr14和Tyr15位点来抑制CDK激酶的活性，进而抑制细胞进入有丝分裂。与Wee1 形成合成致死效应的搭档是TP53。该基因翻译的P53蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。正常情况下，当细胞的DNA受损时，P53蛋白会阻止细胞增殖而停止于G1/S期，直到损伤修复好后才能进入G2期，如不能修复则促进细胞凋亡。因此，TP53属于抑癌基因，在多种恶性肿瘤中会发生TP53突变。由于TP53突变在多种癌症中普遍存在，因此Wee1抑制剂具有巨大的市场潜力，目前在研的Wee1药物有十余种。全球部分在研Wee1抑制剂来源：高特佳投资、公开资料在全球Wee1抑制剂研发进展中，Zentalis的ZN-c3进展最快。ZN-c3由Zentails公司开发，是一款治疗晚期实体瘤的Wee1口服抑制剂。它能使癌细胞在不修复DNA损伤的情况下进行有丝分裂，导致有丝分裂提前进行，造成癌细胞凋亡。ZN-c3作用机制ZN-c3已在单药和联合用药中展现出广泛疗效。与单药治疗相比，Wee1和PARP抑制剂联合用药具有更强的抗肿瘤能力。Wee1抑制剂加吉西他滨治疗铂类难治性复发性卵巢癌、单药治疗复发性或持续性子宫浆液性癌均取得较好的抗肿瘤效果。在国内Wee1抑制剂研发上，布局的企业仍只是少数，仅有英派药业、智康弘仁、首药控股等。ATR抑制剂ATR全称共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶，是一种在DNA损伤后能够激活细胞应答，进而阻滞细胞周期进程并稳定复制叉及修复DNA，从而回避细胞凋亡的重要激酶。当细胞内DNA复制压力、DNA损伤产生时，ATR被募集至DNA损伤部位，多种蛋白参与调控ATR的激活。当ATR激活后，可通过多种信号调控细胞生物过程，包括细胞周期阻滞、抑制复制起点、启动复制叉以及修复DNA双链断裂等。ATR作用机制由于肿瘤细胞的多种DNA修复通路存在缺陷，因此相对于正常细胞，肿瘤细胞更依赖ATR修复通路并对ATR抑制剂更加敏感。因此ATR抑制剂凭借选择性影响肿瘤细胞、而对正常细胞影响较小的优势，有望成为肿瘤治疗的优异潜在药物。ATR抑制剂赛道吸引了一批跨国药企入局，目前全球已有多款ATR抑制剂处于临床阶段。全球部分在研ATR抑制剂来源：公开资料Berzosertib是全球首款进入临床试验的ATR 激酶抑制剂。此前，由美国国家癌症研究所（NCI）开展的一项II期概念验证性研究的结果证实，Berzosertib联合拓扑替康（一种化疗药物）治疗复发性小细胞肺癌（SCLC）患者疗效显著，客观缓解率（ORR）达36%（n=9/25），试验达到主要疗效终点。而且在铂耐药患者中，大部分患者表现出持久的缓解（通常情况下铂耐药患者会在复发的数周内死亡）。目前国内布局ATR抑制剂的企业仍较少，进入临床阶段的仅有英派药业和智康弘义。ATM抑制剂ATM是PIKK家族的成员，主要参与对DNA双链断裂（DSB）的反应。ATM 有五个主要的自磷酸化位点：Ser367，Ser1893，Ser1981、Ser2996 和 Thr1885。正常状态下，ATM以二聚体的状态存在，当ATM 受到 DNA 损伤的刺激，其二聚体形式就会解离并转化为单体，导致上述残基（自磷酸化位点）的磷酸化。ATM的下游通路来源：Progress towards a clinically-successful ATR inhibitor for cancer therapyATM磷酸化后，会相继调控其他激酶活性，如细胞周期检测点激酶2（CHK2）；另P53曾经被用作ATM活化的标记物，其作用机制也被广泛研究。目前ATM抑制剂均处于临床早期阶段，仅有4款处于临床I期，分别是：阿斯利康的AZD-1390、默克的M-4076、XRadTherapeutics的XRD-0394，威尚生物的WSD0628。全球部分在研ATM抑制剂来源：公开资料今年1月18日，威尚生物宣布其创新药物WSD0628获FDA批准在美国开展临床试验。WSD0628是一款能穿透血脑屏障的ATM靶向抑制剂，拟开发联合放疗作为放疗增敏剂用于脑胶质母细胞瘤、间变型胶质瘤以及其他肿瘤的神经中枢转移。“合成致死”疗法为原本只能针对1个靶点的小分子靶向治疗打开了无限想象空间。这既有潜力针对部分传统上不可成药的常见致癌基因；又能克服由常规靶向疗法耐药突变的一些情况；此外，还可通过联合用药，造成主动合成致死的情况。可以说，合成致死作为肿瘤治疗的新兴领域，前途无限。当前，合成致死领域商业化成功运作的只有PARP抑制剂，也是竞争激烈的赛道。与其在PARP抑制剂这片红海中内卷，不如转而尝试以上刚刚崭露头角的靶点，寻找适合自己的差异化破局之道。参考来源Yuanxiang Wang et al; Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) as an Anticancer Target and ItsInhibitor Discovery; J. Med. Chem. 2018, 61, 9429−9441；Yudao shen et al; Discovery of First-in-Class Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) Degraders; J. Med. Chem. 2020, 63, 9977−9989；Genetic control of cell size at cell division in yeast[J]. Nature, 1975, 256(5518): 547-551；Nijman S M, Friend S H. Potential of the Synthetic Lethality Principle[J]. Science, 2013, 342(6160): 809-811.  DOI：10.1126/science.1244669；《“合成致死”赛道风再起，ATR抑制剂会是下一片蓝海？》，免疫时间，2022-06-06。END👇关注药渡数据媒体矩阵