GSDMD

引言 程序性细胞死亡主要包括凋亡、程序性坏死、焦亡。凋亡由一系列caspases 蛋白介导，焦亡主要由caspases和gasdermin蛋白介导，而坏死通常发生在caspases被抑制的情况下。因此，不同的程序性细胞死亡具有相同/类似的分子特征。然而这些程序性死亡是否通过相同或类似的机制来启动仍然未知。 肿瘤坏死因子TNF是一种主要的促炎细胞因子，受体互作蛋白激酶RIPK1是TNF通路中的关键节点。RIPK1可以通过其激酶功能诱导凋亡和/或程序性坏死。正常生理情况下，RIPK1激酶活性被多个保护性的“刹车”，即细胞死亡检查点，所抑制，从而避免细胞死亡的发生。这些检查点由一系列复杂的翻译后修饰，主要包括泛素化和磷酸化，共同决定细胞是否发生死亡。任何一个检查点的缺失，都会使得RIPK1被激活，进而导致细胞死亡的发生。多种人类炎症性和自身免疫性疾病都与检查点缺失和RIPK1被激活有关。近年来，领域内已经鉴定出了多个RIPK1的保护性检查点。然而，当这些检查点失活时，RIPK1的激活以及细胞死亡的启动是否需要特定的信号仍不清楚。 2024年10月28日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心许代超课题组在Molecular Cell杂志在线发表了题为Palmitoylation licenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway的研究论文，报道了RIPK1介导细胞死亡的启动机制，揭示了该机制以泛素化依赖的棕榈酰化的形式调控RIPK1的激活和程序性细胞死亡的分子机制。 S-棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，其特点是在棕榈酰基转移酶的催化下，棕榈酸通过硫酯键共价连接到蛋白的半胱氨酸残基。棕榈酰化可赋予蛋白疏水特性，促进蛋白的向膜迁移或影响蛋白互作。该研究发现，在TNF刺激短时间内可诱导RIPK1发生棕榈酰化修饰。修饰位点位于其激酶结构域内一个保守的半胱氨酸残基C257。进一步研究发现DHHC5是介导RIPK1棕榈酰化的主要棕榈酰基转移酶，且DHHC5的功能发挥依赖于RIPK1的K63泛素化对其进行的招募（图1）。 现有的理论认为，RIPK1的激活通过二聚体内的反式自磷酸化进行，这意味着其激酶结构域需要发生同源相互作用。然而，目前还不清楚RIPK1激酶结构域如何实现这种同源互作以促进自身磷酸化激活。该研究结果建立了以下模型详细阐明了当细胞死亡检查点被破坏时，RIPK1介导的细胞死亡如何被启动：①当细胞感应到TNF后，RIPK1被迅速招募到临近细胞膜区域的TNF受体复合物；在该复合物中，RIPK1在E3酶cIAP1/2的作用下发生K63连接的泛素化修饰。②这些K63泛素链会招募定位于细胞膜上的DHHC5，使之靠近RIPK1。③随后，DHHC5催化RIPK1激酶结构域上的棕榈酰化，增加激酶结构域的疏水特性，促进其同源相互作用；④在细胞死亡检查点受阻的情况下，上述过程可以增强RIPK1的反式自激活，最终导致下游的RIPK1介导的细胞死亡，包括凋亡和程序性坏死（图1）。 图1. 当TNF通路中的保护性检查点失活时，K63泛素化依赖的棕榈酰化促进RIPK1激活和启动细胞死亡的分子机制模式图（Credit: Molecular Cell） 该研究进一步表明这种修饰在体内至关重要，因为阻断RIPK1棕榈酰化可以保护小鼠免受TNF诱导的致死性休克。此外，在患有代谢功能障碍相关的脂肪性肝病(MASH)小鼠肝脏中，脂肪酸的累积促进了MASH肝脏中DHHC5的扩增和RIPK1的棕榈酰化，使得RIPK1过度激活导致肝细胞死亡和肝损伤。因此，该研究表明DHHC5介导的RIPK1棕榈酰化是治疗炎症性疾病的潜在靶点。 值得注意的是，许代超团队之前的研究发现gasdermin D的棕榈酰化是焦亡启动的必要条件。但棕榈酰化在不同细胞死亡类型中的作用方式有所不同。在焦亡中棕榈酰化促进gasdermin D的剪切激活和上膜成孔，而在凋亡和程序性坏死中，棕榈酰化促进RIPK1的反式自激活。总之，这些系列的研究表明棕榈酰化修饰是一种广谱的程序性细胞死亡启动机制。 参考文献 https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.002 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 细胞焦亡是一种依赖于炎症小体激活的程序性细胞死亡形式，通常伴随着细胞膜破裂和炎性细胞因子的释放。与凋亡和坏死不同，焦亡以炎症反应为主要特征。炎症小体是一类多蛋白复合物，能够感知细胞内外的危险信号【1-4】。典型的炎症小体包括NLRP3、AIM2和NLRC4等。炎症小体的组装涉及两个诱导信号：1）由Toll样受体（TLR）配体引起的NF-κB激活炎症小体组分和促炎细胞因子的转录上调；2）由多种触发因素引起的炎症小体组装和caspase-1的激活【5, 6】。Caspase-1被激活后切割Gasdermin D（GSDMD），释放其N端结构域，这一结构域能够插入细胞膜，形成孔洞导致细胞膜破裂，同时这些孔洞还可以释放炎性细胞因子，从而引发炎症反应。通过中和IL-1β和IL-18等炎性细胞因子不能完全削弱焦亡和GSDMD激活的影响，表明还存在其他因素。然而，焦亡过程中还可能释放哪些其他小分子和代谢物及其对组织环境的影响仍不清楚。 近日，来自比利时根特大学的Kodi S. Ravichandran课题组在Nature上发表了研究论文Oxylipins and metabolites from pyroptotic cells act as promoters of tissue repair。在本研究中，作者通过分析焦亡细胞分泌物发现了一类Oxylipins及其他小分子代谢物在促进组织修复中的重要作用，其中PGE2的释放促进了巨噬细胞在伤口的聚集从而加速了组织损伤修复。 为了识别独立于IL-1β的焦亡分泌物作用，作者利用了NLRP1B炎症小体在无需TLR引发的情况下诱导焦亡的能力，在这一模型中，炭疽致死毒素（LeTox）通过NLRP1B炎症小体在骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中诱导焦亡性细胞死亡，而不会引起IL-1β或IL-1α的释放，作者将这种焦亡定义为Pyro-1。为了研究Pyro-1分泌物如何与其他细胞进行交流，他们将LeTox处理的对照和Nlrp1b-Tg（Pyro-1）小鼠来源的BMDMs上清液加入到C57BL/6小鼠的初始BMDMs中孵育4小时，并进行了RNA-seq分析。研究发现，Pyro-1上清液显著富集了与细胞迁移、增殖和免疫反应相关的基因，其中包含了一些与伤口愈合和组织修复相关的基因，如Thbs1、Vegf、Nr4a1、S1pr1和Tgm2等；相比之下，脂质代谢基因呈下调趋势。并且作者发现这些诱导的基因特征是独立于IL-18的，敲除在BMDMs中持续表达的Il-18并不影响Pyro-1上清液诱导的基因表达。 接下来，作者分析了Pyro-1上清液中小分子介质是否发挥作用。通过脂质组学分析，研究人员发现Pyro-1上清液中富含Oxylipins，包括PGE2。由于PGE2与伤口愈合有关，所以当添加来自Pyro-1的上清液时，作者发现Pyro-1上清液可以促进细胞划痕的愈合，细胞迁移也得到了有效增强，而这些效应都是独立于IL-18的。对PGE2释放动力学、来源以及释放方式进行研究后，发现：1）LeTox处理后90分钟就可以检测到PGE2，并在120分钟显著增加；2）在焦亡过程中COX1和COX2的活性诱导可能导致了新的PGE2合成和释放；3）焦亡细胞中的PGE2释放需要在焦亡过程中形成的GSDMD孔。此外，作者还研究了Pyro-1上清液在体外的生物活性，他们发现Pyro-1上清液也可以有效促进结肠伤口的愈合。 作者更进一步的分析了Pyro-1上清液中小分子在伤口愈合中的作用。他们在小鼠全层皮肤损伤模型中进行了研究，这是因为该模型仅部分依赖于PGE2进行组织修复，使得作者能够研究PGE2及其他成分的贡献。皮内注射Pyro-1上清液时，在损伤后的第2天和第4天（修复的炎症阶段）可以观察到最大的有益效果。当通过添加阿司匹林（抑制PGE2合成）时也可以观察到部分的促进伤口愈合的效果，这表明其他成分也发挥了有助于组织修复的功能。机制上的研究表明，Pyro−1上清液处理的伤口显示出CD45+细胞和CD45-细胞的数量增加，这也符合了在伤口修复早期阶段通常伴随着巨噬细胞和中性粒细胞迅速渗入损伤部位的现象。这些巨噬细胞通过表达凝集素CD301和细胞因子IL-27来发挥促进组织修复的作用。 总的来说，这篇文章探究了焦亡分泌的小分子和代谢物在组织环境中的生理功能，发现了焦亡细胞释放的PGE2和其他小分子在促进组织修复中的意料之外的有益效果。这些发现丰富了人们对焦亡这种程序性细胞死亡在组织中独特作用的认知。 参考文献 1. Kesavardhana, S., Malireddi, R. S. & Kanneganti, T.-D. Caspases in cell death, inflammation, and gasdermin-induced pyroptosis. Annu. Rev. Immunol. 38, 567–595 (2020). 2. Mariathasan, S. et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature 430, 213–218 (2004). 3. Shi, J. et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526, 660–665 (2015). 4. Liu, X. et al. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature 535, 153–158 (2016). 5. Broz, P. & Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat. Rev. Immunol. 16, 407–420 (2016). 6. Bauernfeind, F. G. et al. Cutting edge: NF-κB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J. Immunol. 183, 787–791 (2009). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07585-9 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读：多形性胶质母细胞瘤(GBM)因其独特的血脑屏障生理结构而成为最具治疗挑战性的原发性脑肿瘤。近年来，胶质瘤靶向治疗的研究重点已转向肿瘤微环境和局部免疫反应。细胞焦亡是一种新发现的以释放大量炎性因子为特征的细胞死亡方式。虽然细胞焦亡在阻止GBM的发生和发展中显示出希望，但在胶质瘤中调控这一过程的机制仍需进一步研究。zeste基因增强子同源物2 (EZH2)在细胞焦亡中的作用尚不清楚。 7月28日，安徽医科大学林宁研究团队在期刊《Cell Death Discovery》上发表了题为“EZH2–STAT3 signaling pathway regulates GSDMD-mediated pyroptosis in glioblastoma”的研究论文，本研究中，研究人员发现EZH2抑制剂3-Deazaneplanocin A (DZNep)可以诱导GBM细胞焦亡。此外，本研究揭示了信号转导和转录激活因子(STAT3)可以作为受EZH2影响的下游调节因子，影响GBM中的细胞焦亡。DZNep和STAT3抑制剂(SH-4-54)处理后，细胞焦亡相关因子nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)和Gasdermin D (GSDMD)水平升高。同时抑制EZH2和STAT3可导致IL-1β和IL-18等炎症因子的表达。 综上所述，本研究发现EZH2通过STAT3调控胶质母细胞瘤中的细胞焦亡，而细胞焦亡有可能成为胶质母细胞瘤免疫治疗的靶点。 https://www.nature.com/articles/s41420-024-02105-0#Sec10 背景知识 01 多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性脑肿瘤，具有生长迅速、侵袭性强、致死率高等特点。目前GBM的治疗以手术为主，辅以放疗和化疗。然而，由于GBM独特的组织结构，肿瘤与正常组织界限不清，术后复发率仍然较高。GBM患者的中位生存期仅为15个月。此外，化疗对GBM的疗效欠佳，血脑屏障的存在影响了GBM的疗效。目前的研究主要集中在揭示GBM的发病机制，诱导GBM中的程序性细胞死亡是主要的研究方向。GBM中凋亡和自噬的研究相对成熟，有多条经过验证的分子通路。然而，对于GBM中细胞焦亡的研究尚处于实验阶段，缺乏相关的分子机制。了解GBM中调控细胞焦亡的分子信号通路，可为胶质瘤患者提供潜在的治疗方向。 细胞焦亡是一种受调控的细胞死亡形式，依赖于Gasdermin蛋白家族，导致膜穿孔。焦亡细胞发生肿胀直至膜破裂，导致细胞内因子外排。在此过程中，IL-1β和IL-18等促炎细胞因子的大量释放，从而引发强烈的炎症反应。在细胞焦亡的经典途径中，Caspase-1裂解Gasdermin D (GSDMD)，产生裂解的n -末端GSDMD (N-GSDMD)。因此，膜孔形成，钾外流，大量炎症因子释放到细胞外空间。这些事件最终导致细胞死亡并改变肿瘤微环境。此外，细胞焦亡的激活需要NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NLRP3)炎性小体，而NLRP3炎性小体是组装炎性小体的关键分子。炎症小体与Caspase-1结合后，GSDMD被裂解，诱导细胞焦亡。近年来的研究普遍认为，细胞焦亡可直接裂解细胞并诱导免疫细胞浸润，抑制肿瘤生长，在多种细胞生理过程中发挥作用，尤其是在恶性肿瘤的生长中。 DZNep抑制GBM细胞功能并诱导细胞死亡 02 为了评估EZH2抑制后GBM细胞活力的变化，研究人员用浓度为20 μM的DZNep测定了U87的细胞活力。CCK-8检测显示，DZNep处理后第3天，U87细胞活力显著降低。随后，在菌落形成实验中，DZNep显著降低了U87细胞形成的菌落数量。在U87伤口愈合实验中，研究人员观察到dznep处理组的划痕宽度明显大于对照组。在迁移实验中，dznep处理组的U87细胞通过间隙和基质的迁移能力明显低于对照组。显微镜观察发现DZNep处理后U87细胞呈典型的热噬泡形态。随后的Calcein/PI染色显示DZNep处理后死细胞增多，活细胞显著减少。流式细胞术分析进一步证实，DZNep处理后的部分死亡细胞属于凋亡类型。综上所述，DZNep显著抑制GBM细胞功能，诱导细胞凋亡。 DZNep抑制GBM细胞功能，诱导细胞死亡 EZH2作为STAT3的上游调控因子，通过炎性体调控焦亡 03 研究人员深入研究了EZH2和STAT3之间的联系，特别关注p-STAT。免疫荧光(IF)染色证实EZH2(绿色)和p-STAT3(红色)在U87中共定位，主要集中在细胞核内。与正常胶质瘤细胞系HA1800相比，定量PCR (qPCR)分析显示，EZH2和STAT3在胶质瘤细胞系U87、H4和A172中表达较高。此外，DZNep处理后，U87和LN229的STAT3总量没有明显变化，而p-STAT3随着剂量的增加而减少。同时，DZNep治疗后炎性小体成分NLRP3蛋白水平升高，在20 μM时显著升高。同样，DZNep处理(20 μM)后，焦亡蛋白GSDMD和N-GSDMD的蛋白水平显著升高。这些发现表明EZH2和STAT3之间存在相互关系，使它们能够调节胶质瘤焦亡。 抑制STAT3激活焦亡并抑制胶质瘤细胞增殖 04 根据前期研究，EZH2可通过炎性体调控STAT3的磷酸化水平，激活胶质瘤细胞的焦亡。随后，研究人员使用STAT3抑制剂SH-4-54进行干预，SH-4-54 (10 μM)可以抑制p-STAT3蛋白的表达。它还具有提高活化NLRP3、GSDMD和N-GSDMD蛋白表达水平的能力。在光学显微镜下，研究人员观察到SH-4-54处理后的U87细胞有明显的焦亡泡。SH-4-54组U87细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量显著升高。用EdU检测胶质瘤细胞系的增殖，SH-4-54可以抑制U87和LN229的增殖。 RO8191逆转sh -4 - 54介导的胶质瘤细胞死亡和焦亡 05 前期研究表明STAT3作为EZH2的下游靶点，可以调控焦亡。使用STAT3激动剂(ro8191,10 μM)可以逆转sh -4 - 54激活的U87和LN229的焦亡。同时，在显微镜下观察到SH-4-54使U87和LN229失去了原来的细胞形态，而RO8191可以逆转这些形态变化，使细胞恢复到原来的形态。此外，RO8191可以减少SH-4-54引起的细胞死亡，与SH-4-54组相比，RO8191组的死亡细胞明显减少。这些结果表明EZH2通过STAT3调控胶质瘤细胞的凋亡和功能，而RO8191可以逆转这一过程。 研究小结 06 本研究首次将EZH2引入胶质瘤焦亡领域。EZH2抑制剂DZNep的使用不仅可以抑制胶质瘤的发生发展，还可以激活胶质瘤焦亡。同时，研究人员证明通过EZH2抑制p-STAT3可增强NLRP3炎性体活性，促进胶质瘤焦亡和炎症因子IL-1β和IL-18的表达。本研究发现为神经胶质瘤焦亡的研究提供了一个潜在的信号通路。 参考资料： https://www.nature.com/articles/s41420-024-02105-0#Sec10 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情