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摘要：登革热病毒（DENV）通过感染的伊蚊传播给人类，引起的疾病从轻微的登革热到致命的登革休克综合征不等。不同DENV血清型或不同黄病毒之间相似保守的结构和序列导致了交叉反应的发生，随后是抗体依赖性增强（ADE）。迄今为止，能够提供针对不同DENV血清型感染的有效保护的疫苗仍然是最大的挑战。因此，深入研究对于开发有效和有效的治疗药物至关重要。此外，黄病毒的交叉反应性导致临床环境中的误诊，可能会导致适当干预管理的延迟。因此，迫切需要具有高特异性和敏感性的准确诊断，以便及时诊断并为DENV感染的个体提供早期治疗。在这篇综述中，将讨论DENV感染治疗平台中中和抗体、抗病毒药物和疫苗候选物的最新发展。此外，还将介绍抗原隐蔽表位的发现、分子模拟原理以及单链或单域抗体在DENV应用方面的进展。 1.引言 登革热病毒感染是热带和亚热带地区最常见的蚊媒传播疾病之一，全球每年约有1亿至4亿感染病例。目前，DENV感染在非洲、东地中海、美洲、东南亚和西太平洋等国家流行。全球登革热流行的分布表明，登革热感染的爆发正在全球范围内发生（图1）。根据最近的WHO报告，2020年感染病例的增加使得DENV成为COVID-19之后最严重的病毒性疾病。在这些国家中，菲律宾、越南、印度、哥伦比亚和巴西报告了最多的DENV感染病例。导致蚊子传播疾病在全球传播的主要因素之一是快速的城市化和不适当的基础设施规划，这可能导致无效的病媒控制管理。此外，商务团队或个人旅行也促进了这些蚊子传播疾病在他们从一个地方到另一个地方旅行时传播到新环境中。2013年，在马来西亚沙捞越发现了一种新发现的DENV血清型。最初，这起DENV病例被认为是DENV4的森林登革热感染，涉及蚊子Aedes nivalis和非人类灵长类动物之间的传播。经过一系列遗传验证过程，它被确定为新的DENV5血清型，主要发生在东南亚的森林中。尽管DENV5的实际传播途径仍不清楚，但可能导致其出现的因素可能是由于森林株到人类株的遗传变化、DENV的高变异频率和大规模的森林砍伐。这种新的DENV5血清型与另外4种现有血清型在系统发育上有明显的不同，表明DENV的新出现正在进行中，预示着可能会有更多的病毒出现，这可能是由于气候和生态系统的变化导致的动物源性传播。到目前为止，针对DENV感染的特定治疗药物或疫苗仍然不可用。原因之一是DENV和其他黄病毒之间通常发生的交叉反应，因为黄病毒在包膜蛋白（E）上呈现的相似保守结构。如前所述，DENV E蛋白与ZIKV E蛋白的同源性高达50%，因此，在第二次感染任何黄病毒科成员时，由于免疫系统产生的交叉反应性抗体的特异性和数量，会发生交叉反应随后是ADE。此外，不同黄病毒如寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）或不同DENV血清型的共感染总是呈现类似的起始症状，因此可能导致临床诊断管理的复杂化。为了解决这个问题，准确且快速的诊断工具对于早期药物治疗至关重要。在这篇综述中，将重点讨论DENV感染问题，如由于不同血清型DENV感染和不同黄病毒感染导致的交叉反应、ADE、免疫逃避和商业诊断试剂盒的限制。此外，将回顾和介绍不同的诊断和治疗方法的最新进展，以建议可能解决交叉反应问题的方法。事实上，潜在的治疗剂和诊断标记的发现永远不会结束，直到产生特定的、敏感的诊断标记和疫苗或治疗剂，它们在治疗DENV感染方面既敏感又有效。 图1. 2020年和2021年全球登革热疫情。受影响的国家包括孟加拉国、菲律宾、越南、印度、马尔代夫、印度尼西亚、新加坡、哥伦比亚、巴拉圭、秘鲁、肯尼亚、斐济、库克群岛、留尼汪岛、斯里兰卡、泰国、苏丹、毛里塔尼亚、东帝汶、也门、尼泊尔、马约特岛、厄瓜多尔和巴西。 1.1.登革热病毒基因组和结构 DENV是来自黄病毒科的黄病毒属。通常，如登革热休克综合征（DSS）和登革热出血热（DHF）等严重症状可能由四种抗原性不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）中的任何一种连续感染引起。DENV是一种小的二十面体包膜病毒，由11 kb的正单链RNA组成，其成熟的包膜结构称为病毒粒子，包含三种结构蛋白，包括衣壳（C）、包膜（E）和膜（M），以及七种非结构（NS）蛋白，如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5（图2）。结构蛋白主要参与病毒组装。例如，C蛋白与RNA相互作用以组装核衣壳。成熟病毒粒子的形成需要M蛋白的帮助，M蛋白在识别不同黄病毒感染的不同类型免疫反应中很重要。它也是DENV的主要组成部分，作为表面蛋白，协助病毒附着和融合在宿主细胞膜上。除此之外，M蛋白可以通过寡聚化形成结构病毒粒子。另一方面，非结构蛋白和细胞蛋白对于病毒基因组的复制、翻译、封装和病毒蛋白的正确折叠至关重要，所有这些都发生在与粗面内质网相关的细胞质中。 图2. DENV基因组和NS1蛋白结构域图。病毒基因组经过翻译产生单一多聚蛋白。多聚蛋白处理后，通过蛋白水解裂解产生病毒蛋白。对于NS1，涉及DENV病理学的三个结构域包括β-卷、翼状结构域和β-梯。 1.2.登革热病毒的生命周期 人类通常通过感染的蚊子如埃及伊蚊或白纹伊蚊感染登革热病毒（DENV）。DENV在感染的第一天就会针对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞。从其他综述中总结，DENV生命周期包括病毒进入和附着、病毒和内体膜融合、核衣壳释放、蛋白合成和处理、RNA复制、核衣壳形成、病毒组装、病毒成熟，最后是成熟DENV粒子的释放。对于宿主细胞附着，DENV E蛋白将与目标细胞的细胞因子如树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素（DC-SIGN）、甘露糖受体、硫酸肝素等相互作用。接下来，DENV通过网格蛋白介导的内吞作用进入目标细胞，内体隔室内的低pH值允许DENV与内体膜融合。在酸性内体环境的帮助下，RNA基因组从解包的核衣壳释放到细胞质中进行蛋白处理和复制。最初，RNA基因组作为mRNA并进行翻译以产生病毒蛋白。RNA基因组的复制发生在病毒诱导的细胞内膜上，称为复制复合体，由病毒RNA、病毒蛋白和宿主细胞因子组成。这个复合体在内质网（ER）膜上形成，也有助于保护复制产物免受宿主先天免疫系统的识别。核衣壳形成后，DENV粒子开始组装，当它进入ER腔时形成未成熟的DENV粒子。在跨高尔基体网络（TGN）的分泌途径中，DENV的成熟需要通过类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的作用将前膜/膜（prM/M）切割成M蛋白，以释放成熟和传染性的DENV。为了避免过早的DENV膜在病毒粒子从感染细胞释放之前与宿主细胞融合，pr将继续与E二聚体结合，包裹疏水融合环。最后，成熟的DENV一旦释放到细胞外空间，pr最终会从病毒粒子表面脱离。 1.3.临床表现 登革热感染包括发热期、危重期和恢复期。发热期通常持续一周，症状包括高热、流感样症状、头痛、呕吐和关节痛。危重期也称为生命威胁期，会出现血浆渗漏和内出血等更严重的症状。在恢复期，随着血管通透性的恢复，症状会减轻。DENV感染可以引起一系列广泛的症状。在第4天至第10天的潜伏期内，疾病可能是无症状的或表现为称为登革热（DF）的轻微急性发热疾病，而危重期通常从第3天至第7天开始。登革出血热（DHF）伴随着异常的血管通透性，可能会导致突发性低血容量休克，称为登革休克综合征（DSS），这是感染严重登革热患者的危重阶段。DENV感染可能导致不同程度的严重性，这取决于血清型、遗传变异和病毒毒力。不同的登革热血清型可能因其结构差异和病毒复制率而对病理产生不同的影响。此外，核苷酸的变化，如氨基酸突变或替换，会影响病毒毒力，因为核苷酸的变化最终会导致不同的病毒-宿主相互作用和传播能力。 2.关于DENV未解决问题的综述  在这一部分，简要回顾了涉及先天和适应性免疫反应的免疫反应。我们还回顾了一些未解决的问题，如DENV的免疫逃避、DENV血清型内的交叉反应、不同黄病毒间的交叉反应、不同的抗体依赖性增强（ADE）机制及其影响。第4.2节将讨论当前诊断试剂盒的限制。 2.1.对DENV感染的免疫反应 树突状细胞（DCs）是病毒颗粒入侵期间先天和适应性免疫反应之间的连接。它负责上调促炎细胞因子和共刺激分子的表达，这有助于激活人体免疫反应。因此，当NS1通过调节相关基因表达干扰其成熟和迁移时，DCs将无法刺激Th1细胞分泌IFN-γ。为了确保灭活流感病毒NS1，抗病毒药物必须能够恢复宿主的抗病毒反应，如与IFN产生相关的先天免疫，并限制病毒复制。DCs将目标抗原扩展到T细胞，如CD8+和CD4+，作为引流淋巴结（LNs）中先天免疫反应的起点。激活的皮肤肥大细胞在激活招募细胞毒性细胞如CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞到感染部位中起着至关重要的作用，以刺激病毒终止，同时控制引流LNs中的感染。CD8+ T细胞可以直接通过靶向登革蛋白（如NS3）的各种变异，借助激活的CD4+ T细胞来终止感染细胞（Mathew等人，1996）。CD8+ T细胞通常关注非结构蛋白，而CD4+ T细胞更多地关注衣壳、包膜和NS1表位。CD4+ T细胞的作用包括帮助B细胞反应，协助从CD8 T细胞中提取记忆反应，并提供细胞毒性效应，以及Mapalagamage团队回顾的专门CD4+ T细胞的许多其他功能。补体系统的激活对于在先天免疫反应的早期阶段阻断病毒感染很重要。然而，DENV的免疫逃避可以通过NS1实现，当它与不同补体激活途径（如经典途径和凝集素途径）中的相应补体组分相互作用时。这将导致补体组分的功能改变，并抑制补体介导的反应。通过这些策略，DENV增加了其生存和病毒复制的机会。此外，NS1和NS4B之间的相互作用将通过与双链RNA共定位来调节RNA复制。 DENV的病毒复制在早期通常由干扰素（IFNs）的产生控制，这是第一道防线。一旦病毒进入人体皮肤，TLRs和C型凝集素受体（CLRs）作为模式识别受体（PRRs），由免疫哨兵产生，会识别DENV的存在。PRRs的激活通过产生IFNs和肿瘤坏死因子（TNF）激活人体的抗病毒先天反应。TLR-3和TLR-7的激活将导致产生IFN-α和IFN-β，这对于抑制DENV感染很重要。IFNs与IFN受体之间的结合反应将触发Janus激酶-信号转导和激活转录因子（JAK-STAT）途径，进一步增强效应蛋白的产生高达100单位。除了IFNs，包括视黄酸诱导基因1（RIG-I）和螺旋酶黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在内的细胞内传感器也是负责病毒RNA识别的第一线防御，它们也有助于产生IFN-β。激活的RIG-I在检测到病毒RNA后会被转移到线粒体，与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用。RIG-I和MAVS之间的相互作用将进一步导致MAVS聚集，充当免疫信号体，启动核因子κB（NF-κB）和转录因子IRF3，诱导转录因子转移到细胞核后产生I型IFN。 2.2.DENV逃避免疫系统 DENV逃避免疫系统通常发生在抑制免疫反应激活途径的情况下。例如，DENV设法通过抑制MAVS途径来绕过人类的第一道防线。一种策略是通过干扰NS3蛋白阻断RIG-I进入线粒体。除了NS3，NS4A也能通过结合MAVS的半胱天冬酶激活和招募域（CARDs）来抑制RIG-I和MAVS之间的结合。病毒逃避宿主病原体识别受体的另一种方式是通过干扰TLR-3抗病毒信号的激活。另一方面，DENV也能够通过几种机制抑制干扰RNA（RNAi）途径，这是产生先天抗病毒反应的重要途径。亚基因组黄病毒RNA（sfRNA）将从病毒RNA的3′-非翻译区产生，以防止Dicer酶切割双链RNA。通过表达NS4B调节宿主RNAi/microRNAs途径，RNAi途径将受到干扰，从而促进DENV的复制。NS5可以通过阻断转录复合体PAF1C的招募来影响IFN的产生，以阻止IFN刺激基因（ISGs）的产生。此外，DENV还可以通过几种机制影响IFN机制的功能。例如，非结构蛋白NS2B/3能够通过中断IFNα/β诱导途径来下调抗病毒反应，而其他非结构蛋白如NS2A、NS4A和NS4B可以通过部分阻断STAT信号途径来影响细胞间的IFN信号传导。 2.3.不同DENV血清型间的交叉反应和不同黄病毒间的交叉反应 所有DENV血清型的NS1蛋白共享相似的序列高达70%，并且其序列与其他黄病毒也有40-50%的相似性。因此，不同血清型DENV之间以及DENV与其他黄病毒之间总会发生交叉反应。根据在巴西发生的DENV-1和DENV-2的共感染以及在索马里、台湾和中国检测到的DENV-2和DENV-3的共感染，Araújo, F. M.和他的团队表明埃及伊蚊可能被不同病毒的组合感染，或者它们可能有能力同时传播多种病毒。正如Wenming等人（2005）所假设的，如果一个地方存在多种血清型，那么通过感染蚊子传播DENV-2和DENV-3的共感染可能会发生。此外，也有报道DENV和寨卡病毒（ZIKV）以及DENV和基孔肯雅病毒（CHIKV）之间的共感染。 与DENV类似，寨卡病毒（ZIKV）也是一种正单链RNA病毒，源自黄病毒科。寨卡病毒感染通常显示非特异性的临床症状，如结膜炎、轻度发热、头痛和皮疹，这很容易与其他黄病毒感染如登革热和基孔肯雅病混淆。此外，ZIKV感染还可能影响孕妇，导致胎儿畸形和婴儿出生缺陷，如小头畸形。一个最初被检测为登革热病毒感染的旅行相关病例，由于NS1抗原测试的假阳性结果，后来被怀疑为急性寨卡病毒感染。当ZIKV对先前感染过另一种黄病毒感染（如DENV）的患者造成二次感染时，这个人可能体内有DENV背景免疫，并在DENV检测中呈阳性结果，导致IgM测试的交叉反应。然而，如果ZIKV是初次感染，IgM测试中的交叉反应会很低。正如George等人所报告的，先前感染过ZIKV的患者会有更高水平的DENV-2原发病毒血症，随后与严重DENV感染相关的变化。这是因为ZIKV感染触发的高浓度DENV交叉反应性抗体对DENV-2的中和效果很低，导致DENV-2交叉反应性抗体反应的非中和浓度。这些反应还增加了从DENV-1、3或4获得异型血清型感染的机会，这意味着对ZIKV的预先存在的免疫反应可能会诱导所有DENV血清型的ADE。 2.4.ADE的机制和影响 ADE的第一种机制被称为内在ADE，其中DENV免疫复合物的内化将通过抑制细胞内抗病毒反应增加感染细胞的“爆发大小”。DENV可以通过与亚中和抗体形成DENV-抗体复合物并通过抗体介导的吞噬作用进入宿主细胞。当2个巨噬细胞Fcγ受体配对并诱导白介素-10（IL-10）产生时，它将导致偏向T辅助细胞-2（Th2）反应，由于RIG-I/MDA5和JAK-STAT途径的抑制，导致释放的1型干扰素、白介素12、干扰素γ和TNF变得下调。简而言之，内在ADE通过改变先天免疫系统和细胞内机制来增强病毒复制。 另一种ADE机制是外在ADE。两种常见的ADE机制是Fc受体（FcR）依赖性ADE和C1q依赖性ADE（图3）。FcR依赖性ADE是广泛病毒感染（如HIV、流感A、登革热和埃博拉）的最常见机制。具有FcR的细胞，如单核细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，很容易被病毒-抗体复合物附着，因为抗体的Fc区域将与细胞表面的FcR结合，导致病毒附着到细胞表面的增加。一旦DENV-免疫复合物抑制负责产生白介素-12（IL-12）、干扰素γ（IFN-γ）、TNF-α和一氧化氮自由基（NO）的抗病毒免疫反应，IL-6和IL-10的表达将被激活，并刺激病毒颗粒的传播，导致感染细胞和病毒颗粒的增加，随后发生ADE。 图3. 抗体依赖性增强（ADE）的不同机制。病毒进入可以通过不同的途径，在(A) Fc受体或(B) C1q受体的帮助下被吞噬进入细胞膜，并进一步引起ADE。 C1q依赖性ADE机制是补体经典途径的启动，这在埃博拉病毒（EBOV）感染中很常见。在这种机制中，ADE是通过补体蛋白C1q和C1q受体（C1qR）来促进的，它在大多数哺乳动物细胞中被区分出来，尽管FcRs在免疫系统中完全表达，包括B细胞、中性粒细胞和单核细胞或巨噬细胞。 当病毒与非中和抗体或亚中和水平的抗体结合时，这将有助于病毒进入并进一步增强病毒感染，这可能是二次感染。这种情况指的是抗体依赖性增强（ADE）。最初，预先存在的抗体可以通过阻止DENV与细胞表面的天然受体之间的结合来中和同源DENV感染，但它将允许异型登革病毒进入并穿过初次感染途径，导致由于高病毒负荷而发生ADE。 通过多年感染后刺激免疫记忆产生的交叉反应性抗体可以中和多种DENV血清型。这些抗体通常具有较差的中和活性，并倾向于附着在可用性低的免疫显性表位上，导致ADE和交叉反应的更高比率。正如Mongkolsapaya等人所报告的，异型记忆和交叉反应性CD4+T细胞的存在将在二次感染的免疫回忆反应期间加剧感染。 在异型血清型二次感染期间由抗体反应诱导的非中和抗体可能导致内在ADE，这可能导致更严重的登革热感染。这种类型的ADE与外在ADE相比，可以在感染的早期阶段大大增强病毒复制。这是因为它能够逃避先天免疫反应，并通过抗体介导的内化自由迁移，不容易被内源性干扰素途径检测到。 3.针对DENV感染的治疗剂  3.1.中和抗体及其机制  中和抗体在抑制DENV包膜（E）蛋白的功能位点与宿主细胞相互作用中发挥重要作用。高度中和的抗体通常结合在E蛋白上容易接近且暴露在病毒粒子表面的表位上。然而，非中和抗体，包括亚中和水平的中和抗体，当它们结合到DENV粒子时，可能会导致ADE。 以西尼罗河病毒的中和机制为例，该机制被称为“多重打击”模型，与使用抗体“包被”病毒粒子模型的其他病毒的中和也类似。中和效果取决于中和抗体的浓度。对于潜在的中和抗体达到中和的最小化学计量学，大约需要30个抗体占据一个病毒粒子。可能影响中和抗体与病毒表位之间相互作用的因素包括病毒表位的可接近性、抗体浓度和结合亲和力。 被中和抗体包被的病毒粒子的传染性可以通过不同方式被阻断，其中之一是通过抗体的Fab臂交叉链接病毒粒子，以形成大的交叉链接病毒/抗体聚集体，这可以通过降低可以感染细胞的病毒粒子浓度来阻止病毒粒子的传播。除了交叉链接，抑制E蛋白构象变化和受体结合可以避免病毒粒子与内体膜之间的膜融合，从而允许病毒基因组释放到细胞质中。一些中和抗体可能具有双重活性，可以阻断膜融合，同时中断受体结合机制，从而阻断病毒通过内体进入。当预连接测定格式中中和抗体的中和滴度超过后连接中的中和滴度时，总体中和可能会发生，并允许对DENV粒子进行双重保护。 关于中和逃逸的问题，可以通过利用针对不同表位的潜在中和单克隆抗体（mAbs）混合物来解决，以阻断突变逃逸。Wang等人的研究表明，通过LALA突变工程化的重组四价对称抗体在小鼠模型中通过中和从每个亲本抗体单独发展出来的逃逸突变体，非常有效地抑制了ZIKV感染，逃逸突变体的生长被抑制。 3.2.针对DENV感染的潜在中和抗体 DENV的E蛋白始终是开发中和抗体的主要关注点。每个DENV E蛋白的外域由三个独特的域组成，如域I（EDI）、II（EDII）和III（EDIII），它们连接在一起作为二聚体存在。通常，中和表位位于EDI内的铰链区、EDII末端和EDIII侧面。在与E蛋白三种域匹配的中和小鼠单克隆抗体（mAbs）中，大多数强烈中和的mAbs识别EDIII的表位和A链。潜在的中和抗体通过与病毒粒子表面的E二聚体交叉链接，靶向成熟病毒粒子上的暴露四聚体结合位点，从而抑制构象变化，阻止融合膜的形成。 1A1D-2是一种中和抗体，可以通过阻断EDIII位置来防止E蛋白的构象变化和膜融合的形成。Gandham和他的团队开发了硫代适体（DENTA-1），利用中和抗体1A1D-2的中和机制针对EDIII，因为其出色的结合特性。由于过滤结合测定表明硫代适体能够紧密地结合在DENV-2 EDIII上，DENTA-1有很大可能表现出与1A1D-2相同的中和效果。对于静态下的成熟病毒粒子，中和抗体与EDIII的结合区域位于非表面暴露的β−1链，这表明未暴露区域可以很容易地与溶剂接触，并通过靶向结合区域来增强抗体的中和活性。Deng等人的另一项研究也证明，特异性结合EDIII的抗体2B8能够抑制DENV血清型2在BHK细胞上的附着。 Dejnirattisai及其团队报道了发现广泛中和抗体的潜力，这种抗体有可能中和所有DENV血清型。他们发现，针对包膜二聚体表位（EDE）的mAbs能够与针对融合环表位（FLE）的抗体相比，更有效地中和感染人类细胞和昆虫细胞的DENV。原因之一可能是由于抗EDE抗体的能力，它们可以在不同的成熟阶段识别具有不同prM浓度的DENV，与依赖于prM存在进行融合环结合的抗FLE抗体不同。 除此之外，工程化抗体如双特异性抗体的发现也是开发针对DENV的治疗性抗体的一种流行方法。将两个具有特定功能的mAbs结合起来产生双特异性抗体（DVD-1A1D-2A10），已被发现保留并表现出亲本活性。这种双特异性抗体能够在DENV早期感染期间阻断病毒附着和融合过程，因为它由能够与EDIII相互作用以抑制DENV在宿主细胞上的附着的1A1D亲本抗体组成，以及另一个能够与EDII域结合以干扰病毒粒子和内体膜之间融合过程的2A10亲本抗体。具有双重阻断功能的优势，病毒附着和融合的阻断可能同时发生，或者可以抑制其中任一过程，作者预测，这可能更有效地抑制DENV感染。DENV E蛋白在病毒附着和融合过程中分别具有转变为二聚体和三聚体结构的能力，然而双特异性抗体由于其亲本活性的优势，能够同时结合EDII和EDIII域，从而避免E蛋白结构的变化。此外，这种双特异性抗体在1.33 µM的浓度下还显示出完全的中和活性，与其各自的亲本抗体相比，在相同浓度下仅显示出70%的中和效果。双特异性抗体的产生非常有希望被开发成针对DENV的治疗性抗体。 3.3.抗病毒肽 作为抗病毒剂之一，肽类抑制剂旨在通过影响病毒蛋白的功能来中断DENV生命周期。抗病毒肽可以通过几种途径抑制DENV感染，如（i）识别宿主细胞受体以阻止病毒进入，避免宿主细胞与病毒蛋白结合，（ii）靶向结构蛋白，通过阻止宿主细胞与病毒之间的结合来防止病毒进入，（iii）靶向非结构蛋白，主要处理抑制病毒复制。然而，抗病毒肽作为有效治疗药物使用存在一些缺点，如稳定性弱和生物利用度有限。解决这些问题的方法之一是应用化学修饰来改变肽的物理化学性质，另一种方法是通过突变分析改进抗病毒肽的性质。 一些抗病毒肽靶向登革热蛋白酶，如NS2B-NS3，它参与病毒多聚蛋白的切割，以在成熟时释放结构和非结构蛋白。Ltc 1在高温（40°C）下表现出更好的抑制能力，降低了感染细胞中的病毒载量。因此，Ltc 1可能通过抑制NS2B-NS3蛋白酶的活性来干扰DENV的生命周期。还有其他针对NS2B-NS3蛋白酶的抑制剂，有潜力被开发为抗病毒剂。 Hrobowski及其团队建议，可以使用模拟II类融合蛋白高度保守区域的肽来阻断病毒进入和融合。他们鉴定了一种肽抑制剂DN59，模拟DENV E蛋白的茎域，能够以低浓度抑制DENV-2感染。它在20 µM时显示出最高的抑制活性100 ± 0.5%，其IC50记录在大约10 µM。它还对DENV-2感染显示出极好的特异性，以低浓度超过99%的抑制活性抑制斑块形成。除了对DENV-2具有抑制活性外，这种肽抑制剂还对西尼罗河病毒（WNV）显示出抑制效果，由于它们具有相似的保守区域，因此它可能作为黄病毒的广谱肽抑制剂。进一步的研究表明，这种肽抑制剂对所有DENV血清型都有抑制效果，IC50在2到5 µM之间。有趣的是，他们还发现DN59能够破坏病毒膜并释放病毒基因组。基因组在用DN59处理后完全从E蛋白中分离出来，因为它在病毒膜上形成孔洞，由于其与脂质体囊泡的强烈相互作用并破坏脂质双层，导致病毒失去感染性。 此外，MLH40肽的模拟能力使其能够通过模拟M蛋白外域的螺旋疏水茎区和保守的疏水环来中断DENV M-E相互作用，当它结合到DENV时会引起同源二聚体E蛋白结构的改变，从而抑制所有类型的DENV的病毒感染。 DENV C蛋白与脂滴（LDs）之间的相互作用对于登革病毒颗粒的形成很重要。利用分子模拟的原理，肽可以通过模拟C蛋白无序的N端区域，包括NML + R基序（被认为是LD-C蛋白的相互作用位点）来抑制DENV颗粒的形成。还有另一种发现涉及DENV C蛋白的抗病毒机制。一种名为ST148的复合抑制剂显示出抑制DENV复制的潜力，它与两个衣壳二聚体“接吻”相互作用，形成一个抑制剂结合的衣壳四聚体，这可能在病毒感染新细胞之前或期间发生。含有这种复合抑制剂的病毒在感染新细胞时的核衣壳解包过程中会有故障效果。这将进一步导致C蛋白和RNA基因组的降解。因此，这种机制可能是未来抗病毒方法的有用见解。 另一方面，Kaptein和合作研究者鉴定了一种有前途且有效的泛血清型DENV抑制剂，称为JNJ-A07。它是一种靶向NS3和NS4B相互作用的抑制剂。NS3-NS4B复合物的形成是病毒复制的重要部分，因此该抑制剂通过在细胞质环上引起构象变化来阻断复合物的形成。他们的研究表明，抑制NS3和NS4B之间的相互作用显示出有前途的抗病毒机制和很好的抑制效果。这种抑制剂具有良好的药代动力学，并且对不同的21种基因型和血清型组合显示出有前途的抑制活性。 3.4.疫苗开发和针对DENV感染的潜在疫苗候选物 由于其四种抗原性不同的血清型可能引起的复杂感染，疫苗的开发一直是登革热治疗的巨大挑战。一种DENV血清型的初次感染将导致长期同型保护，但对其他血清型的短期异型保护，因此一个人在第二次异型感染期间可能会面临疾病加重。通过在二级淋巴组织中形成生发中心（GC），在滤泡辅助T细胞（Tfh）的帮助下，产生长期抗体分泌浆细胞对于开发有效的登革热疫苗很重要。 到目前为止，全球唯一授权的疫苗是Dengvaxia（CYD-TDV），它是一种活体嵌合、减毒和四价疫苗，由非结构黄热病17D株病毒骨架组成，结合了四种DENV血清型的结构前膜（prM）和包膜（E）基因。然而，Dengvaxia仅适用于9至16岁之间的感染人群。 其他疫苗候选物仍在通过不同阶段的临床试验，从第一阶段到第三阶段。正在进行第三阶段临床试验的疫苗候选物包括TV003/TV005（NCT01506570）和TDV/DENVax/TAK003（NCT02302066）。疫苗候选物TDEN-LAV（NCT01702857）仍在进行第二阶段临床试验，TDEN-PIV（NCT01666652）和D1ME100/TVDV（NCT00290147）目前处于第一阶段临床试验阶段，而V180（DEN-80E）（NCT01477580）已完成第一阶段临床试验。 Graham及其团队最近开发了一种新的活体减毒四价疫苗（DLAV），在接种疫苗后的8到14天内迅速产生DENV特异性多功能T细胞，并至少保留6个月。此外，DLAV还诱导效应记忆T细胞重新表达CD45RA（TEMRA），在接种疫苗后1年内保持其高频率。这表明这种疫苗诱导的免疫保护非常有希望。 在先前的研究中，Pinto团队展示了基于E蛋白的DNA疫苗（pE1D2）和基于NS1的DNA疫苗（pcTPANS1）都能在免疫小鼠模型中诱导免疫保护。在他们最近的研究中，他们更感兴趣的是找出两种DNA疫苗候选物组合所能诱导的保护性免疫。他们的研究表明，用pE1D2+pcTPANS1 DNA疫苗接种的小鼠由于结合的免疫反应而获得了出色的免疫保护。即使在DENV-2的致命挑战之后，pE1D2+pcTPANS1免疫的小鼠也没有发现病态，由于免疫反应的加强，它们也没有表现出感染的临床迹象。 所有上述讨论的潜在治疗剂总结在表1. 4.DENV诊断 在登革热诊断中，提供高特异性定量评估的传感器对于更好的监测和早期检测很重要。用于DENV诊断的常见检测方法之一包括酶联免疫吸附测定（ELISA）。这种测定有一些限制，如昂贵的测试套件和需要几个小时才能检测到目标兴趣。除此之外，在急性阶段使用病毒分离来诊断DENV感染既耗时又需要非常熟练地处理细胞培养或动物模型。对于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，它能够在发热阶段检测早期DENV感染，但也耗时且程序复杂。免疫层析测定法也常用于DENV检测，特别是应用了金纳米颗粒偶联抗体作为捕获蛋白的测定法。金纳米颗粒（AuNPs）是由于其稳定性、无毒性、生物相容性和易于与许多生物分子功能化等优点而在侧流测定中应用的有前途的纳米材料。 由于感染患者血清中NS1抗原水平高，使其成为许多商业免疫测定类型（如侧流快速测定和ELISA试剂盒）中一个有前途的生物标志物，因此NS1的检测已被应用于许多类型的单克隆或多克隆抗体基础免疫测定。与病毒RNA相比，病毒抗原在登革热感染患者的血液中循环时间更长，因此在RT-PCR中病毒RNA不可检测时，检测NS1抗原更受青睐。 图4说明了初次和二次感染期间NS1抗原、IgM和IgG的水平。在初次感染期间，从第0天起就可以检测到NS1抗原，并且在第4天会获得一个小高峰。即使NS1和IgM从感染的第3天到第9天同时存在，抗原检测也不会受到IgM存在的影响。另一方面，IgM的检测只能在发病后3到4天进行，并且从第5天起在血清中会保持持续量。从症状发作后第10到15天起，才能有效检测IgG。通常，IgG检测测定会用于根据IgG水平区分初次和二次感染。这是因为IgG只有在初次感染后几周或几个月才会显著提高。在二次感染期间，由于其快速的记忆反应，从第3天起就可以检测到IgG，这导致早期IgG水平高。 图4. 原发性和继发性登革热感染的NS1、IgM和IgG水平。(A) 在原发性感染期间，从第0天起可以检测到NS1，从第3天起可以检测到IgM，而IgG只能在第10天起检测到。(B) 对于继发性感染，IgG水平用于区分原发性和继发性感染，因为在急性期由于快速的免疫记忆IgG反应，IgG水平非常显著。 4.1.当前商用诊断试剂盒 NS1的检测是早期诊断DENV感染的有效方法，一旦发热开始，由于其在早期阶段出现，即在第0天至第9天内，第6至10天可以检测到最大水平。在Alcon等人的研究中，从症状发作的第一天开始，NS1抗原在血清中循环，长达9天，NS1的浓度从第0天的0.04lb/mL增加到第7天的2.00 lb/mL，而恢复期血清样本从第8天开始的浓度为0.04 lg/mL。对于二次感染，NS1在血淋巴中的浓度约为0.01至2 lb/mL，且在恢复期血清样本中未检测到。因此，大多数商用试剂盒侧重于检测NS1作为DENV诊断的生物标志物，因为它在早期阶段有可检测的显著量。 根据S. D. Blacksell及其团队的评估，商用NS1抗原现场诊断测试的敏感性和特异性分别在48.5%至58.6%和92.5%至99.4%之间。根据Osorio L.团队对不同商用NS1诊断测试的敏感性和特异性进行的比较，SD BIOLINE™ NS1/IgM/IgG检测提供最高的检测敏感性，高达80.7%，其次是SD BIOLINE™ NS1/IgM（78.4%）和第二代Pan E™（71.1%）。还有其他研究对不同类型的商用诊断试剂盒进行了审查。 商用SD Bioline Dengue Duo检测是常见的诊断测定，包括2种评估测试，用于检测患者血清中的DENV NS1和抗-DENV IgG或IgM。它的益处在于对DENV IgM和IgG的额外评估，增加了检测敏感性，这对NS1检测测定是补充的。SD Duo测试的改进敏感性再次通过比较NS1/IgG/IgM的联合检测和每个单独生物标志物的检测得到证明。NS1/IgG/IgM测试显示最高的敏感性（90.65%），其次是IgG测试（90.06%），NS1测试（87.50%）和最后是IgM（60.515）。将两个或更多登革热生物标志物（如NS1与IgM或NS1与IgM和IgG）的组合似乎对诊断试剂盒的整体性能有改善作用，从53.5%提高到88.7%和从60.61%提高到90.65%。 然而，无论是IgG还是IgM检测的单独阳性结果也可以表明过去几个月的感染，这只能被视为推定诊断。此外，当IgM测试作为单一生物标志物使用时，其敏感性被报道为低，从IgM测试获得的阴性结果不能完全排除登革热感染的嫌疑，因此IgM测试更适合用于检测近期感染，而不是作为急性感染诊断的标志。 4.2.当前诊断测试的限制 在Jayathilaka及其团队的研究中，大多数特异性检测NS1的抗体是针对高度保守的NS1区域，这导致与JEV和WNV的交叉反应超过65%。NS1抗体的产生可能是由于其他黄病毒的感染，并在DENV的二次感染期间增加到更高的抗体滴度。此外，RDTs中的假阳性通常是由于先前由任何类型的黄病毒或不同登革热血清型感染的残留抗体引起的，这在流行区经常发生。 Chung提到，商用诊断试剂盒似乎存在高变异性，范围从37%到98.9%，这可能是由于在二次感染期间，特别是在病毒血清型2、血清型4的发热开始后，随着时间的推移，敏感性降低，血清中发现大量DENV反应性IgG时，这一点在Osorio等人（2010）的研究中得到证明，即在二次感染的发热开始4天后和严重感染的情况下，检测敏感性降低。与诊断试剂盒的时间依赖性敏感性相关的是，疾病的持续时间据说会影响诊断试剂盒的敏感性，因为Guzman团队的研究报告称，与后期收集的血清样本相比，试剂盒在测试亚洲患者的急性血清样本时更为敏感，这些样本是在疾病初期的前3至4天内收集的。 此外，诊断试剂盒的敏感性也因不同类型的DENV血清型而异。在Guzman等人（2010）的研究中，Platelia试剂盒对DENV-2的敏感性最低，与其他血清型相比，诊断试剂盒对不同血清型的敏感性差异可能与不同血清型和同一血清型不同来源的特定NS1表位有关。 尽管有各种商用DENV诊断试剂盒的可用性，但仍存在一些现有的限制，如表2所列。 4.3.改善DENV诊断和发现有前景的诊断标记 Nascimento等人的研究发现，抗登革热NS1 IgG和IgG3有潜力被开发为长期DENV感染的生物标志物，而不是通常用于检测急性感染的生物标志物，如IgA和IgM抗体。这可能是因为它们在感染症状出现后的第一周内持续存在，有助于早期检测，并且检测窗口期更长，即在症状出现后4至6个月内。相比之下，NS1抗原检测的检测时间限于发病后的前几天，以最大化检测灵敏度。 生物功能化的锥形光学纤维可作为DENV诊断中的无标签定量诊断工具，因为它具有快速检测时间、简单过程、便携式可用性和易于制造的优点。在二次感染的早期，IgG抗体的存在量会比初次感染时更高，因此为抗体通过抗原生物受体的捕获提供了更高的可能性。Mustapa及其团队专注于通过在锥形多模光纤（TMMF）上固定DENV NS1抗原来检测抗NS1 IgG抗体。他们确定生物功能化的TMMF能在5分钟内检测到100 pg/mL的抗体，其灵敏度可达7 × 10-6a.u/pg/mL。这种生物功能化的TMMF可被用于DENV诊断，以获得更好的灵敏度和快速诊断结果。 Mustapa及其团队最近的研究是改进TOF的生物传感性能，通过整合纳米材料如聚酰胺胺（PAMAM）树状分子。这是一种超支化大分子，当集成到TOF中时，可以作为活性层。这种策略可能会增加TOF传感器的活性位点，以便于目标抗原的附着，主要是由于PAMAM树状分子的极性功能，它能够在其边缘锚定蛋白质并改善蛋白质装载。他们的研究将PAMAM树状分子集成到TOF传感器中作为活性层，以增强抗体吸收，从而在固定过程中为DENV-2 E蛋白的结合提供更多的活性位点。这种改进的PAMAM集成TOF传感器显示出与Kd值为1.02 ×10-10M的传感亲和力，比他们之前的研究更好。这可能是因为使用了PAMAM，它提供了更多的结合位点，并为E蛋白附着提供了更大的表面积。他们的研究证明，将PAMAM树状分子作为活性层在生物功能化的TOF传感器中大大增强了其在识别DENV E蛋白方面的性能。 之前，许多工作已经进行了利用血清型特异性抗体在DENV诊断测定中的应用，但这些方法在区分所有DENV血清型方面效果不佳。与其使用杂交瘤技术产生的抗体，不如使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体，据报道它们可以通过与单一泛反应性捕获抗体结合来进行多重诊断，因为它们具有特定的表位。这些表位与NS1中最易接近的表位之一的翼状结构域表位不同。因此，使用来自人类天然噬菌体展示库的血清型特异性抗体的应用可能为解决DENV血清型鉴别的挑战提供了思路。 研究人员成功地产生了能够检测所有DENV血清型和ZIKV的杂交瘤抗体，且不会与小鼠免疫接种的重组DENV1、DENV2、DENV3、DENV4和重组ZIKV蛋白发生交叉反应。有效的检测仅适用于在急性期收集的血清样本，因为这是NS1和RNA都可检测的阶段。杂交瘤抗体对血清型特异性测试和泛DENV测试的检测限从1到20 ng/mL不等，而20 ng/mL是ZIKV NS1检测的检测限。 含有高浓度IgG的血清样本可能会导致NS1抗原与IgG形成免疫复合物而无法被检测，这进一步影响了诊断试剂盒的灵敏度。IgG的高水平通常存在于二次登革热感染患者的血清样本中。对于一些血液传播病毒如乙型和丙型肝炎，解离的抗体-抗原免疫复合物在早期诊断中起着重要作用。根据Koraka及其团队的说法，NS1抗原和IgG形成的免疫复合物需要被分解，以检测二次感染患者血清中NS1的存在。 针对病毒的sdAb研究越来越受欢迎，他们发现sdAb可以作为治疗和诊断领域的有前途的工具。纳米抗体是指具有最小分子大小的抗原结合片段，大约为15 kDa。它可以从鲨鱼和骆驼科动物（如羊驼和驼）中获得，这些动物没有轻链。纳米抗体的一个例子是单域抗体（sdAb），它由互补决定区（CDRs）组成，如CDR1、CDR2和CDR3。CDR3是一个不寻常的环，它长且延伸，能够穿透并结合到抗原的裂缝中，使其在目标结合上具有高亲和力。sdAb具有极高的热稳定性，高达95°C，并能在热变性过程中重新折叠，保持其结合亲和力。sdAb的热稳定性可以是解决使用传统mAb进行快速诊断测试时遇到的问题的方案之一。 具有特定结合亲和力的人类单链可变抗体片段（HuScFv）针对NS1的R和E域，被证明在暴露于HuScFv时，通过干扰细胞内NS1的产生和恢复宿主先天免疫活性，有效减少流感病毒感染的宿主细胞中的病毒复制。众所周知，具有Fc区域的抗NS1抗体会以某种方式诱导补体介导的细胞溶解，这可能加剧DENV感染。因此，首个专注于完全针对NS1的HuScFv的抗体开发被报道。这种HuScFv不包含Fc区域，并且比传统的IgG小得多。HuScFv与NS1的结合能力，无论是在天然形式还是分泌形式，表明它可能能够中断NS1的作用。这项研究表明，通过HuScFv和NS1之间的相互作用，可以中断病毒复制过程，因为病毒释放减少了。 与商用试剂盒SD Bioline Dengue Duo、固定mAb试剂盒和固定VHH抗体试剂盒相比，固定VHH抗体试剂盒在3种诊断试剂盒中实现了最高的特异性（99.50%），其对重组NS1的检测限为4.5 ng/mL，远低于固定mAb试剂盒（9 ng/mL）。从固定VHH抗体试剂盒获得的检测限不仅在急性期循环NS1的检测限范围内（10 ng/mL至50 µg/mL），而且远低于该范围，表明该试剂盒对检测低水平的DENV2 NS1具有显著的灵敏度。Fatima及其团队还使用表位绘图来识别VHH抗体和mAb的潜在表位。他们发现，两种类型的所有结合肽都有与NS1抗原的氨基酸序列从位置224到232相对应的同源区域。His和Trp几乎出现在每个克隆中，表明这两种氨基酸对抗体结合至关重要，特别是His残基。这种固定VHH抗体试剂盒是一个非常有前景的诊断工具，与其在效率、灵敏度、特异性和结合亲和力方面相比固定mAb试剂盒的优势。 基因工程改造可以应用于单域抗体（sdAb）以提高免疫分析的检测限。将sdAb作为捕获蛋白在与复杂基质的大总面积发生共价相互作用时存在局限性。它的小分子大小在与广泛的结合界面结合时会遇到困难，这将进一步影响目标蛋白的检测和分析的灵敏度。一种有趣的方法是通过蛋白质工程改造sdAb，获得二聚体形式的SpyTag融合sdAb，通过固定在SpyCatcher涂层微球上形成SpyCatcher/SpyTag对。应用SpyCatcher/SpyTag对有助于显著增加与非定向sdAb相比，所有DENV血清型污染的人血清中NS1的检测信号。检测限提高至5倍的增加是SpyTag融合sdAb在DENV诊断和其他蛋白质捕获应用中的有希望的结果。 上述讨论的主题的启示性部分总结在表3中。 5.结论  DENV的广泛传播早已是一个长期的公共卫生问题，随着COVID-19大流行的爆发，一些亚洲国家将需要面对双重负担，特别是对经济和卫生部门的影响。更令人担忧的是，大多数COVID-19病例从轻到中度疾病，与登革热感染常见的症状（如发热和皮疹）相似，因此存在很高的可能性，COVID-19病例和登革热病例可能会被误诊，或者一个人可能会同时感染两种病毒，就像DENV和其他黄病毒一样。此外，也有报道称在印度尼西亚、泰国和新加坡等国家存在交叉反应的案例。到目前为止，由于不同DENV血清型和不同黄病毒的感染导致的交叉反应问题仍未解决。此外，也存在更高的可能性发生ADE状况，并恶化病情。除了这些问题，DENV逃避免疫反应的习惯也是有效控制DENV感染时需要考虑的因素之一。为了解决交叉反应问题，已经持续进行了许多方法来发现有用和潜在的抗病毒药物、中和抗体和疫苗候选物，它们可以有效地发挥作用。这些方法包括基因工程的应用、纳米抗体的衍生、分子模拟、抗原隐蔽表位的发现、结构研究和抑制机制。此外，开发更敏感和特定的诊断替代品也非常需要，以解决当前商用诊断试剂盒的限制，以便能够快速和早期诊断黄病毒或其他新出现的烈性病毒，以便对感染患者进行立即的临床管理。纳米抗体衍生物和抗体工程等方法在开发敏感和特定的生物标志物检测器方面是一个有趣的想法。有趣的是，NS1可能作为DENV检测的潜在生物标志物，因为许多生物标志物检测器可以如上所述特别针对NS1抗原。总之，治疗和诊断方面的开发为未来的发展提供了有用和有趣的想法。

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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