CLEC4K

导读：经典脂质纳米颗粒（LNP）由4种类型的脂质分子构成：可电离阳离子脂质（Ionizable lipid）、辅助性磷脂(helper lipid)、胆固醇(Cholesterol)和聚乙二醇偶联脂质(PEGylated lipid)。利用微流控芯片将溶解在酸性水相中的mRNA分子与溶解在乙醇相中的各种脂质分子按照一定比例快速混合便可制备成mRNA-LNP制剂。可电离脂质在酸性环境中被质子化携带正电荷，与带负电荷的mRNA分子结合，从而实现对mRNA的包封。最后，用中性磷酸盐缓冲液透析，将体系改变为中性环境，促使可电离脂质转变为不带电状态，此时，LNP表明一般呈现微弱负电状态。当mRNA-LNP进入胞内体，可电离脂质重新带上正电荷，并与负电性的生物膜发生融合，促使mRNA释放到细胞质中。可电离脂质的这一特性使得LNP递送系统成为安全、高效递送mRNA的工具。目前，通用的LNP递送系统，有着非常明显的肝富集性。尽管耦合乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 的siRNA-脂质体，可靶向肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体，并且已被 FDA 开发并批准用于治疗肝脏疾病，但是，仍然缺乏有效的纳米载体来选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APCs）。2023年11月，台湾中央研究院基因体研究中心翁启惠院士团队在bioRxiv发表预印本文章：《Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses》，他们合成了一种可生物降解的聚合物纳米颗粒 (PNP)，采用胍和两性离子基团修饰，偶联芳基三甘露糖苷，用于封装和选择性递送 mRNA 至树突状细胞 (DC)。与非靶向性PNP或者LNP相比，树突细胞靶向性的spike mRNA-PNP新冠疫苗在小鼠体内可触发更强烈的保护性免疫反应。一、含二硫键和胍的聚合物近年来，具有二硫键的聚合物已成为广泛应用的功能性材料。由于其动态和可逆特性，这些聚合物被用于各种物质的胞内递送。具有二硫键的聚合物不仅在细胞内环境中可生物降解，而且能够通过硫醇介导的摄取（thiol-mediated uptake ），有效地将蛋白质、siRNA和mRNA递送至胞质。硫醇介导的摄取是一种细胞摄取机制，它涉及到细胞表面的巯基（thiol）与底物上的二硫键（disulfide）发生动态共价交换（dynamic covalent exchange）。这种交换使得底物与细胞表面形成共价键，然后通过不同的方式进入细胞，如融合、内吞或直接跨膜转运。硫醇-二硫化物交换已被证实在某些病毒和毒素进入细胞中发挥重要作用。事实上，白喉毒素和艾滋病毒是最先被发现通过硫醇介导的摄取进入细胞的毒素。二硫键聚合物作为一种高效通用载体来递送不同形式（DNA、mRNA和RNP）的CRISPR-Cas9机器包含嵌段阳离子聚合物的聚离子复合物胶束 (PIC)是有前景的 mRNA 载体。嵌段共聚物的聚阳离子片段中的胍部分与mRNA中的磷酸基团之间的多价相互作用是稳定mRNA/胶束以提高mRNA递送效率的关键因素。聚乙二醇-聚缩水甘油基甲基胍(PEG-PGMG)和PEG-聚缩水甘油基甲胺(PEG-PGMA)两种不同的嵌段共聚物二、筛选高转染效率的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒首先，研究人员设计了一系列合成聚合物的传播剂（propagator），探索它们递送GFP mRNA和Spike mRNA的效率。P1携带一个胍基团。传播剂P2携带三个胍基团。P1和P2聚合物被设计为通过胍基团和mRNA的磷酸基团之间形成强盐桥来促进mRNA的封装。传播剂P3在胍基团附近含有两个胍基团，被设计为有分支的聚合物。含有二亚乙基三胺基团的传播剂 P4 被设计为促进被捕获的分子从降解中逃脱，其末端胺残基用于功能化。传播剂P5含有两性离子基团，旨在减少血清蛋白吸附并增强膜融合，并使mRNA从纳米载体递送至免疫细胞。两性离子旨在增强细胞膜融合以促进吸收。一旦聚合物封装的mRNA到达细胞质，二硫键就会被细胞内谷胱甘肽降解，释放出mRNA，以避免高分子量聚合物在细胞内积累而引起细胞毒性。用于聚合反应的引发剂（initiators）和传播剂（propagators）为了确定有效的细胞内递送 GFP-mRNA 的最佳聚合物，通过不同传播剂的共聚反应合成了同聚物和异聚物，并评估了它们在 HEK293T 细胞中的包封能力和转染效率。具有三价胍基团的P2/P3、P2/P4和P2/P5共聚物表现出更高的包封mRNA的能力，并且与传统转染剂聚乙烯亚胺(PEI)的结果相当。P1聚合物不利于细胞内递送，而异质聚合物P1/P4、P2/P4、P1/P5或P2/P5能够转染HEK293T细胞并释放mRNA。特别是，含有两性离子基团的聚合物非常有效。然而，支化聚合物 P1/P3 和 P2/P3 并未表现出令人满意的 mRNA 递送效率。这些结果表明，传播剂是影响转染效效率的重要成分，P1/P5和P2/P5产生的共聚物表现出最高的转染效率，并且在mRNA-Polymer=1:3的比例下，它们没有表现出任何明显的细胞毒性。P1 聚合物与 mRNA 混合，形成接近球形的电子致密纳米颗粒，但由于血清不稳定，这种颗粒通常效果较差。相比之下，P1/P5 共聚物与 mRNA 的复合物被发现是脂质体样的。聚合物可能形成带正电荷的层，可以封装 mRNA，并通过两性离子的结合促进随后的细胞摄取。不同类型的mRNA聚合物纳米颗粒转染HEK293T细胞的效率、尺寸大小及电位将Spike mRNA与P1/P5 共聚物按照不同的N/P比例混合，结果表明，P1/P5共聚物在N/P比为1时便可表现出良好的捕获spike mRNA的能力，所得mRNA-P1/P5共聚物复合物的平均粒径约为50μm。在 10 mM GSH 存在的情况下，mRNA 的释放以时间依赖的方式放生，这表明GSH 介导的聚合物降解导致mRNA释放。mRNA-P1/P5 复合物 (3 µg) 转染到 HEK293T 细胞，转染后 48 小时后，WB胶图上可明细观察到250 kDa 处的Spike蛋白。这些数据说明P1/P5共聚物是体外mRNA转染的有效纳米载体。为了可视化 mRNA-PNP 在细胞中的位置，从 P1/P4/P5 合成了 FITC 标记的聚合物，其中 FITC 通过 P4 上的胺基与聚合物缀合。共聚焦荧光成像表明mRNA-PNP (I1-P1/P4/P5)在2小时内便表现出溶酶体逃逸；然而，mRNA-PNP (I1-P1/P4) 即使在内化后 4 小时内也没有从溶酶体中逃逸出来。溶酶体与mRNA-PNP（I1-P1/P4/P5）的共定位比例低于mRNA-PNP（I1-P1/P4），表明烷基化两性离子残基可以显着改善膜融合和溶酶体逃逸。溶酶体和mRNA-PNP聚合物颗粒共聚焦荧光成像三、树突细胞靶向性的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒为了选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APC），尤其是树突状细胞，研究人员设计了携带可被凝集素受体识别的不同聚糖头的引发剂。凝集素受体DC-SIGN 可识别高甘露糖聚糖，引发强大的免疫反应，尤其是 CD4+和 CD8 +T 细胞反应，使其成为选择性 mRNA 疫苗递送的有吸引力的受体。研究人员首先合成有芳基甘露糖苷的引发剂 I5 用于 mRNA-PNP 制备，因为它显示优先结合 DC-SIGN。通过流式细胞术在不同时间点评估 DC-SIGN 介导的 APC 细胞摄取。结果显示，在BMDCs中，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 要比不携带的mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 高出约34%。另一方面，当用 mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 处理时，DC-SIGN 表达不显著的 B 细胞和 T 细胞仅显示荧光信号轻微增加。这些数据表明树突状细胞可以通过 DC-SIGN 受体有效内化和选择性摄取 mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 。树突状细胞通过 DC-SIGN 受体可选择性摄取携带携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP聚合物颗粒基于上述结果，研究人员合成了具有不同甘露糖苷化合价和间隔的I6、I7、I8、I9和I10，并制备了相应的mRNA-PNP用于研究。线性三甘露糖配体（linear trimannose ligand）对甘露糖受体（MR） 更具特异性，而芳基三触角甘露糖（aryl tri-antennary mannose ）更容易与DC-SIGN结合。此外，抗原内化和信号转导依赖于 DC-SIGN 在细胞表面和内体中的参与以及每个环境中的不同PH。由I5-P1/P5、I8-P1/P5、I9-P1/P5 和 I10-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在 pH 7.4 和 5.0 下与 DC-SIGN 胞外结构域 (ECD) 结合具有几乎相同的亲和力 ，然而，由I6-P1/P5 和 I7-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在较低 pH 值下失去了与 DC-SIGN 的结合亲和力，可能是因为在低 pH 值下与钙离子的配位减少。该说明芳基三甘露糖苷可以同酸性内体区室中的 DC-SIGN 相互作用。这种结合稳定性将增强 DC-SIGN 介导的信号传导及其与内体驻留 Toll 样受体（如 TLR7）的协同作用。此外，对于受体靶向递送，配体通常与载体连接，并且载体和配体之间的距离通过间隔的存在来调节。携带较长配体的 mRNA-PNP（带有 Man-Ar-PEG12 的 I6-P1/P5 和带有 Man-PEG12 的 I7-P1/P5）对 DC-SIGN 显示出稍高的亲和力。总体而言，具有芳基三甘露糖苷的 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 对 DC-SIGN 表现出最高的亲和力。增加的亲和力可能是由于聚合物中配体的聚集效应和空间排列，并且芳基部分可以促进其疏水相互作用。ELISA测定在PH 7.4和PH5.0条件下，不同mRNA-PNP与DC-SING 之间的解离常数研究人员还进一步发现 C2C12 肌肉细胞（不表达甘露糖受体）对 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 不具有靶向性的优先摄取。与直链型芳基三甘露糖苷 I10 相比，支链型芳基三甘露糖苷 I9 对 DC-SIGN 表现出更好的偏好。此外，I10 与 DC-SIGN、MMR、Dectin-2 或 langerin 强烈结合，没有显着的选择性。然而，I9 对 DCSIGN 呈现出更具选择性的结合。这些数据支持 DC 对 mRNA-I9-P1/P5 的有效摄取更有可能是由 DC-SIGN 介导的。四、Spike mRNA-PNP疫苗免疫效果BALB/c 小鼠在第 0 天使用疫苗进行免疫，并在第 14 天接受加强免疫。与采用LNP作为递送系统的疫苗或者不具携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗相比，加强免疫后，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I9-P1/P5)疫苗触发的血清IgG抗体滴度要高出3倍。mRNA-PNP (I1-P1/P5) 的中和抗体水平与 mRNA-LNP 组相似，但在 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 组会出更加显著的中和抗体水平。mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗、mRNA-PNP (I9-P1/P5) 及mRNA-LNP免疫小鼠后的抗体反应五、小结研究人员设计合成了一系列用于合成递送mRNA的聚合物传播剂，并证明含有胍和两性离子基团的共聚合物（P1/P5）在体外和体内对于 mRNA 疫苗递送都表现出很高的效率。此外，由带有芳基三甘露糖苷头的引发剂 I9 和传播剂 P1/P5 产生的聚合物是选择性地将 mRNA 疫苗递送至树突状细胞进行翻译、加工、呈递和触发有效免疫应答的有效载体。总的来说，这项研究开发了一种靶向DC细胞的、触发强烈免疫反应的、可简单制备的新型共聚物mRNA递送系统，未来还需要对起触发的免疫机制做出更加详尽的研究。参考文献[1] Chen-Yo Fan, Szu-Wen Wang, Cinya Chung, et al. Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses. doi: 10.1101/2023.11.13.566827.[2] Yuan P, Zhang H, Qian L, Mao X, Du S, Yu C, Peng B, Yao SQ. Intracellular Delivery of Functional Native Antibodies under Hypoxic Conditions by Using a Biodegradable Silica Nanoquencher. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 2;56(41):12481-12485. doi: 10.1002/anie.201705578.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：随着对适应性免疫在细胞和分子水平上的认识，靶向免疫细胞的抗原因其可能提高疫苗效力和/或调节免疫反应质量，同时减少脱靶效应，被证明是开发创新、强效疫苗的成功策略。随着mRNA疫苗的发展，近几年已经探索了几种将包裹mRNA的纳米颗粒递送系统靶向免疫细胞（树突状细胞DC）的方法，DC是最有效的抗原呈递细胞，也是B细胞和T细胞免疫的关键介质，被认为是细胞特异性抗原递送的理想靶标。那么如何设计mRNA疫苗递送系统以靶向免疫细胞呢？2023年11月，GSK团队在Front Immunol期刊发表综述文章：《Straight to the point: targeted mRNA-delivery to immune cells for improved vaccine design》。文章汇总了mRNA定向递送免疫系统的潜在特异性靶点、靶向受体-配体类别以及递送系统的研究进展。一、免疫细胞靶向由于常规疫苗（抗原、灭活病原体）开发周期长（5-10年），针对新发和再发疾病的疫苗开发难度大，科学家们致力于探索新的疫苗平台，最近，mRNA疫苗在设计和疗效方面有较大突破，其之所以能脱颖而出，与以下特性有关：1、安全性：mRNA的非感染性和非整合性避免感染或插入诱变的潜在风险。2、稳定性：mRNA疫苗可通过纳米载体（如LNPs）实现体内递送，使其免于降解、快速摄取和细胞质递送，避免抗载体免疫。3、高产量：由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有经济高效、可扩展生产的潜力。4、可修饰性：可进行快速修饰调节半衰期和免疫原性特征，用于个性化治疗或紧急适应新出现的病原体。但同时mRNA疫苗具有以下不足：1、潜在的脱靶效应：肌肉注射后，会有少部分到达血流，最终主要进入肝脏和脾脏，出现脱靶效应。2、非特异性：mRNA-LNPs的给药会诱导中性粒细胞、单核细胞和DCs快速和局部浸润到给药部位及引流淋巴结（LNs），但主要是单核细胞和DCs翻译mRNA并上调关键的共刺激受体（CD80和CD86）和细胞因子产生。3、针对某些蛋白（如刺突蛋白）的抗体反应持久性较短，需要连续给予加强剂量以保持对感染的保护。mRNA选择性靶向免疫细胞因可增强免疫应答、减少疫苗使用剂量、增加保护时长、最大程度减少脱靶及副作用的特性，成为解决上述问题的关键技术。而抗原呈递细胞（APCs），尤其是DCs，因其通过启动幼稚T细胞来启动适应性免疫的独特能力成为mRNA靶向递送的候选细胞。研究表明，即使在低抗原剂量下，DC靶向也能增强和加速特异性抗体反应。使用与特定细胞表面的受体特异性相互作用的配体可实现靶向，不同受体的参与会影响所诱导免疫反应的类型，从而获得特定的结果。DCs可表达多种靶向递送疫苗的受体，包括C型凝集素受体（CLRs）、Toll样受体、清道夫受体、趋化因子受体、补体受体和Fc受体等。DC靶向不仅可提高mRNA疫苗的功效，还能扩大其作用的病原体范围。除DC亚群，参与免疫反应的其他细胞类型（如巨噬细胞）也可作为靶标。图1. APC靶向LNP-mRNA作用机制二、靶细胞下表从起源、分布、特征/功能等方面对多种抗原呈递细胞（APC）进行比较：每种APC都有优点和局限性：与pDCs相比，cDCs在抗原呈递和T细胞活化方面更有效；与巨噬细胞相比，DCs因其拥有卓越的抗原呈递及从外周组织迁移到淋巴结的能力而具有更强引发抗原特异性免疫反应的能力，使其在进行靶向递送方面更具优势。最终靶向何种APC还取决于要靶向的病原体或抗原的特征，多种APCs（如DCs和巨噬细胞）的组合可引发协同效应并产生更强大和多功能的免疫反应。三、靶受体免疫反应的类型和程度取决于捕获抗原的环境，包括用于内化的受体。因此，靶向递送平台的成功取决于配体-受体对的正确选择。3.1  C型凝集素（CLRs）受体3.1.1 CLRs的通性CLRs是由1,000多种蛋白质组成的超家族，因其在各种免疫细胞（包括DCs、巨噬细胞和中性粒细胞等）表面大量表达，并在识别自身和非自身抗原、内化、抗原加工、启动免疫反应、调节免疫细胞间相互作用中发挥作用，被作为靶向抗原和mRNA递送的靶标：CLRs具有一个保守的结构基序-碳水化合物识别结构域（CRD），通过与保守的钙螯合结合位点的相互作用来识别病原体（病毒、细菌和真菌）相关的碳水化合物结构，促进识别和吞噬作用；CLRs信号转导可分为两组：第一组通过基于整合免疫受体酪氨酸的激活（ITAM）样基序（Clec-2、Dectin-1）转导细胞内信号，或通过与携带ITAM的FcRγ接头分子（Dectin-2、Mincle、BDCA-2）结合转导细胞内信号。磷酸化后，ITAM 基序募集并激活 Syk，Syk通过激活转录因子NF-kB复合体的亚基来诱导促炎细胞因子的转录。第二组CLRs在其胞浆末端具有基于免疫受体酪氨酸的抑制（ITIM）基序（例如 MICL）。3.1.2 甘露糖受体甘露糖受体（CD206， MR）为巨噬细胞和DCs表达的内吞受体，介导甘露糖苷（从简单甘露糖到高级甘露聚糖结构）以及岩藻糖和硫酸化LacdiNAc的可溶性配体的交叉呈递，上述特性使基于甘露糖的靶向成为最常见的CLR靶向策略之一。2006年White等人在体外模型中使用甘露糖基化脂质体来增加单核细胞来源的DCs（moDCs）对OVA的摄取。大量报告表明，基于甘露糖的策略通过受体介导的机制增加了免疫细胞中mRNA疫苗的内化和转染。2011年首次报道了MR靶向癌症疫苗的临床试验，但MR靶向mRNA疫苗的临床活性尚不清楚。3.1.3 其他C型凝集素1、DC-SIGN：钙依赖型，存在于人的DCs和巨噬细胞亚群上，可结合高甘露糖基化糖缀合物和含岩藻糖的抗原，通过促进T细胞粘附到DC表面以查找肽抗原的存在来介导DC-T细胞相互作用。DC-SIGN会诱导细胞内信号转导，从而调节其他病原体识别受体PRRs（如TLRs）的信号转导。2、DEC-205（CD205）：在DCs、单核细胞和LCs上表达，也在B细胞、T细胞和NK细胞上低水平表达，具有识别凋亡和坏死信号、参与内吞作用并增加MHC II呈递的功能。大多数DC205靶向依赖于抗体或抗体片段的使用，从而产生有效的DC靶向和增强的抗原交叉呈递，2011年进行了针对抗HIV DEC-205靶向疫苗的临床试验。3、Dectin-1：由DCs、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和T细胞亚群表达，能特异性识别具有不同亲和力的可溶性和颗粒性β（1-3）和/或β（1-6）连接葡聚糖，通过肌动蛋白依赖性吞噬作用促进颗粒摄取并通过ITAM样基序参与细胞活化，因可以与CD4+和CD8+T细胞结合并促进增殖被认为是一种共刺激分子。4、Langerin（CD207）：由LCs、真皮DCs和其他DCs亚型表达，已成功使用抗体或小分子糖作为靶向配体在体外进行LC靶向，Wamhoff等人发现了一种Langerin拟糖配体，并使用功能化脂质体证明了其对Langerin+细胞的选择性。Schulze等人用这种Langerin配体在体外选择性地将纳米颗粒（脂质体）靶向人LCs，该配体可用于功能化封装药物、抗原或毒素的纳米颗粒以递送至LCs中。5、DNGR-1（Clec9a）和MGL（Clec10a）：DNGR-1/Clec9a在人cDC1上选择性表达。与该受体的特异性相互作用可促进非人灵长类动物的体液免疫，最近研究发现DNGR-1特异性肽可将纳米颗粒靶向Clec9a+ DC。MGL在人cDC2（CD1c+ DCs）上特异性表达，选择性地结合GalNAc末端和具有不同糖基化谱的粘蛋白-1肽。Heger等人发现，使用Clec10a结合糖肽，可以选择性靶向PBMCs中的CD1c+细胞（cDC2），但未观察到单独的Clec10的配体可诱导CD1c+ DCs的激活或细胞因子分泌。6、hDCIR（Clec4a）：存在于外周血中的CD14+单核细胞、CD15+粒细胞、所有DC亚群（包括pDCs）和B细胞上，T细胞中未发现，使用抗体将抗原靶向DCIR可增加LCs、血液mDCs和pDCs的交叉呈递，并增强体外人细胞中CD8+ T细胞触发。3.2 用于mRNA靶向递送的其他受体1、Toll样受体（TLRs）：由先天免疫系统细胞（如巨噬细胞和DCs）、适应性免疫细胞亚群表达，通过识别病原体相关分子模式PAMPs在先天免疫系统中发挥关键作用，研究使用Pam3CSK4（一种TLR-2激动剂）作为靶向配体将纳米颗粒靶向DCs。2、X-C基序趋化因子受体1（XCR1）：可识别XCL1的趋化因子受体，在cDC1上选择性表达。Fossum等人研究Clec9a、DEC-205和XCR-1作为靶标，使用编码与抗原融合的单链可变片段（scVf）的DNA疫苗注射到小鼠体内，发现靶向XCR-1导致脾脏和肺中IFN-γ+CD8+ T细胞反应增强，细胞毒性更强，尽管Clec9a和XCR1都是cDC1特异性的，但导致不同的结果，因此不仅细胞亚型，受体本身也决定了靶向的结果和疗效。表1 免疫细胞靶向案例、靶向策略和结果四、纳米颗粒作为靶向mRNA递送载体将mRNA与载体结合以保护其免于降解并实现胞内递送。目前输送系统简单分为病毒和非病毒载体。病毒载体利用其自然进化的能力将遗传物质有效地转移到细胞中，实现高效率翻译，但其自身的趋向性并不总是满足治疗需求，且诱导的免疫反应可转化为反应原性损害治疗效果。目前纳米颗粒（特别是脂质纳米颗粒LNP）为首选的非病毒载体，提供了定制其特性以优化其作为转染剂性能的可能性。脂质纳米颗粒（LNPs）已从脂质体和脂质复合体进化为更有效的mRNA载体，出现了可电离脂质，其优势在于：1、可电离脂质在酸性pH值下带正电，在生理pH值下带中性电，该特性大大改善了永久性阳离子脂质的固有缺点，如耐受性差和细胞毒性；2、可电离脂质在内体中酸化后，胺基团被质子化并促进氯离子转运以平衡膜电荷和渗透压，直到膜被破坏并将遗传物质递送到胞质溶胶中；3、通过增加可电离脂质疏水尾部的不饱和度以及调整其pKa，可增加内体逃逸，增强疫苗效力；4、可电离脂质能实现高速率mRNA包封，由于生产过程中水相的pH值较低，可电离脂质带正电，从而促进了与带负电荷的mRNA骨架的相互作用。LNPs另一个成分是聚乙二醇化脂质，由亲水性PEG聚合物与疏水脂质偶联而成。聚乙二醇化脂质可阻止调理素结合，增加LNP循环时间并防止颗粒融合。通过改变PEG脂质锚定长度，可调整其从LNP表面的脱落速率，对促进细胞摄取和内体逃逸至关重要。另外LNPs中的磷脂和胆固醇有助于mRNA包封及增强稳定性。对LNPs脂质成分和/或比例进行多种修饰，实现其优先在特定器官中积累的特性，Goswami等人表明，甘露糖化胆固醇可改善抗RSV自扩增mRNA疫苗（SAM）的内化和效力，一些MR靶向siRNA的例子（配体直接连接到siRNA 或siRNA包封颗粒）也被报道。图2 LNP 结构、组成和靶向配体加入策略五、结论靶向先天免疫相关细胞上的特异性受体可以产生针对疫苗量身定制的更强大、更持久的免疫反应，不同先天免疫细胞亚群的联合靶向策略更令人期待，因为它们在免疫反应中起着独特而核心的作用。如巨噬细胞驱动炎症反应，而树突状细胞在抗原呈递给T细胞中起关键作用，若同时靶向两种细胞类型可能有助于启动改善的抗原特异性免疫反应。需要进一步的研究来识别不同细胞类型中潜在的共同关键受体，或配制具有多种靶向配体组合的LNPs。对于开发RNA递送载体，应在载体配方步骤中考虑组分的相容性，以及保持有效的内体逃逸和充分的多价配体展示的必要性。eGFP mRNA和mCherry mRNA在293T细胞中实现高表达参考文献[1] Clemente B, Denis M, Silveira CP, Schiavetti F, Brazzoli M, Stranges D. Straight to the point: targeted mRNA-delivery to immune cells for improved vaccine design. Front Immunol. 2023 Nov 27;14:1294929. doi: 10.3389/fimmu.2023.1294929.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

相信不少人已经或正在和新冠病毒进行顽强抗争。根据感染毒株、个人症状的不同，“小🐑人”们又被分为以下几大类：沸羊羊：高烧不退，反复烧，体温直逼40度；割喉羊：嗓子犹如吞刀片，且浑身疼痛，症状较重；懒羊羊：症状较轻，类似感冒，还食欲大增，贼能炫饭；清水羊：味觉、嗅觉丧失，吃啥都味同嚼蜡，没食欲；开颅羊：咳嗽不止，头痛欲裂，伴随高热；......（你是哪种羊，欢迎补充）早在今年4月，著名医学期刊《柳叶刀》便公布过感染奥密克戎的疫苗接种人群（至少接种两针）出现的症状、症状持续时间以及住院率，并和德尔塔毒株进行的对比结果。报告显示：最常报告的症状是流涕（76.5%）、头痛（74.7%）、喉咙痛（70.5%）、打喷嚏（63.0%）、持续咳嗽（49.8%）和声音嘶哑（42.6%）。这也和目前国内新冠感染现状相对一致。奥密克戎与德尔塔感染后症状对比图值得注意的是，虽然与德尔塔相比，奥密克戎感染者出现嗅觉丧失的比例大幅减少，但不是完全没有！这个比例约为17%。不知道有多少人经历过新冠感染后的嗅觉丧失？那种感觉真不好受，吃啥都不香，非常影响干饭。17%并非是个很低的比例，也就是几乎每5个“小阳人”中便会有1人出现嗅觉丧失的症状。更令人恐慌的是，即使转阴之后，嗅觉还处于“离家出走”的状态！这样的人似乎不占少数，据此前的研究数据显示，约有5%的阳性患者在感染后的6个月后，嗅觉或味觉依然迟迟没有恢复。为帮助数万名因新冠而长期嗅觉功能丧失的患者重新找回“丢失的嗅觉”，第一步就是要厘清“长新冠”背后的根本原因和具体的生物机制。在美国杜克大学团队的研究团队不懈努力下，终于揭开了“新冠感染后长期嗅觉丧失”的谜底——即使组织中的新冠病毒已经被消除，但T细胞介导的炎症依然存在于嗅觉上皮中，对嗅觉神经细胞进行持续的免疫攻击；此外，由于持续的炎症损害，“脆弱”的嗅觉感觉神经元的数量显著减少，自然会导致持续的嗅觉丧失。该研究于12月21日发表在Science子刊Science Translational Medicine上。DOI: 10.1126/scitranslmed.add0484研究者共纳入9名出现持续性嗅觉丧失的PASC（COVID-19急性后遗症）患者，收集嗅觉上皮细胞活检样本。接着，采用免疫组织化学和单细胞RNA测序（scRNA-seq），观察细胞群以及转录的改变情况，从而揭开谜底。可视化嗅觉活检scRNA-seq数据集的结果显露出了“端倪”。与正常嗅觉的对照组相比，长期嗅觉丧失组的嗅觉上皮中，出现了特异性T细胞亚群的富集，尤其是集群5的常驻CD8+T（CD8 Tres 5）细胞！从免疫学角度来看，这种细胞又称为γδ T细胞，能够表达炎症细胞因子干扰素-γ，而干扰素-γ能介导免疫调节反应和适应性免疫。有趣的事情来了，基因表达分析显示，在支持细胞和嗅觉神经元中存在CD8 Tres 5细胞表达的信号配体以及干扰素-γ的受体。直白来说，当出现干扰素-γ诱导的炎症反应时，支持细胞和嗅觉神经元会对此做出响应。如果干扰素-γ持续存在，嗅觉组织便会一直处于高炎症反应状态中。Circos图：CD8 Tres衍生配体及其受体的NicheNet分析但导致这种“持续高炎症”状态的不仅是富集的γδ T细胞，甚至嗅觉上皮中多种淋巴细胞的亚群发生了改变。在抗原呈递细胞（DC）亚群中，CD207−DC细胞减少，与之相反的是CD207+DC群的增加，而后者的富集将加剧嗅觉上皮中的免疫浸润。长期嗅觉丧失的感染者体内，另一个出现变化的是巨噬细胞群。研究者观察到，以CD163为标志的抗炎M2巨噬细胞显著减少，这也是促炎信号持续存在、嗅觉神经元修复过程被抑制的重要原因之一。髓细胞种群中T细胞变化情况更令人心惊的是，感染新冠后的长期嗅觉丧失恐归因于嗅觉感觉神经元数量的减少！scRNA-seq量化后的数据显示：与对照组相比，PASC组中嗅觉感觉神经元的数量显著降低。具体来说，可使用抗嗅觉标记蛋白（OMP）抗体标记的神经元数量下降，而成熟嗅觉感觉神经元与支持细胞的比例也显著降低。上述变化证实：免疫浸润以及干细胞/宿主细胞功能的变化，共同诱导成熟嗅觉神经元的数量发生改变，从而引发长期、持续的嗅觉丧失。这也难怪，在大量炎症反应的攻击下，嗅觉神经元自然是扛不住啊！嗅觉神经元的数量变化本研究的通讯作者Bradley Goldstein教授表示，这个发现非常惊人，相当于鼻子中存在一种类似自身免疫的过程。不过好消息是，即使在长期免疫攻击后，嗅觉神经元依然保存着一些修复能力。这也是Goldstein教授领衔实验室正在开展的工作，希望能帮助长期嗅觉丧失的患者调节异常免疫反应，恢复部分嗅觉功能。相信不少体验过“嗅觉丧失”的新冠感染者再也不想经历那样的痛苦！也祝愿每一个“🐑中”以及“杨过”早日“杨康”，而且是100%地康复！参考资料：[1]John Finlay et al, Persistent post-COVID-19 smell loss is associated with immune cell infiltration and altered gene expression in olfactory epithelium, Science Translational Medicine (2022).  DOI: 10.1126/scitranslmed.add0484.[2]https://medicalxpress.com/news/2022-12-scientists-key-loss-covid-.html撰文 | Swagpp 编辑 | Swagpp来源 | 梅斯医学精彩推荐：1、少吃！Nature Communications新研究: 这种常见的食用色素竟会引发炎症性肠病！2、相同血型更易成为夫妻！PNAS：中国科学家研究近100万已婚夫妇数据，首次发现血型存在选型交配！3、一胖毁所有？不一定!最新研究显示：女性皮下脂肪组织可保护大脑，有效预防痴呆和中风！4、早起毁一天？Nature Communications最新研究：“起床困难户”注意这四点，不喝咖啡也能元气满满！5、以毒攻毒？新冠病毒竟能治癌症！Cancers新研究表明：重组SARS-CoV-2 Spike S1蛋白有望成为治疗癌症新利器！