DNA x TIM3

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）作为一种新兴的癌症治疗策略，融合了单克隆抗体的靶向性和细胞毒性药物的杀伤能力，在精准肿瘤学领域展现出巨大潜力。本文系统梳理了 ADCs 的基本分子设计，包括抗体、连接子、载荷及偶联化学等核心组成部分，阐述了其作用机制。同时，详细介绍了双特异性 ADC、Probody 药物偶联物、免疫刺激性 ADC（ISACs）等新型设计，分析了 ADCs 在临床应用中面临的药代动力学复杂、载荷释放控制、耐药性等挑战，并展望了其未来发展方向。通过对现有研究成果的总结，为读者全面呈现 ADCs 在癌症治疗中的应用现状与前景。一、引言：ADC 药物的崛起与发展现状在癌症治疗的历史长河中，新疗法的出现往往带来革命性的突破，抗体药物偶联物（ADCs） 便是当下备受瞩目的新星。ADCs 实现了临床和商业上的双重成功，以Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki（Enhertu®） 为代表的药物，在癌症治疗领域产生了重大影响。从 2000 年到 2023 年底，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准 13 种 ADC 药物上市（见表 1），同时至少有 100 种 ADC 处于不同阶段的临床试验中（见表 2）。这一数据充分体现了 ADC 药物在癌症治疗领域的快速发展和巨大潜力。ADC 药物的结构特点是通过双功能连接子将细胞毒性小分子药物与单克隆抗体（mAb） 共价结合，从而靶向结合肿瘤细胞表面过度表达的抗原。这种设计巧妙地将生物成分和小分子药物整合为一个统一的实体，既发挥了抗体的精准靶向作用，又利用了小分子药物的强大杀伤能力。然而，这种复合结构也带来了化学合成、生产工艺和质量控制等方面的独特挑战。近年来，新型 ADC 结构不断涌现，如双特异性 ADC、Probody 药物偶联物、免疫刺激性 ADC、降解物 - 抗体偶联物（DACs）和双载荷 ADC 等，为解决上述挑战提供了新途径，进一步增强了肿瘤特异性并克服了耐药性。市场对 ADC 的需求增长迅速，据 Frost & Sullivan 的数据，全球 ADC 市场规模从 2017 年的 16 亿美元迅速增长到 2024 年的 79 亿美元，复合年增长率（CAGR）为 37.3%。预计到 2030 年，全球 ADC 市场规模将达到 647 亿美元，保持 30% 的 CAGR。表 1：截至 2023 年 FDA 批准的 ADC 药物注：Gemtuzumab Ozogamicin 最初于 2000 年获 FDA 批准，2010 年撤回，2017 年重新获批。表 2：当前临床试验中的部分 ADC 药物二、ADC 的结构解析ADC 的结构是制药行业创新管道中的核心技术专长，强大的专利组合对竞争优势至关重要。设计 ADC 需要多方面的考虑，包括抗体、连接子和小分子药物，以及它们的协同整合。确定合适的抗体是 ADC 设计的第一步，而连接子和偶联方法对药物的治疗指数起着至关重要的作用。ADC 中的小分子药物必须具有强大的杀伤癌细胞的能力。2.1 ADC 中的抗体在 ADC 中，抗体作为靶向药物递送的不可或缺的 “载体”，能特异性结合癌细胞表面的抗原，将载荷精确递送到肿瘤细胞，从而实现对癌细胞的选择性清除。抗体的结构和功能特性从根本上决定了 ADC 的药代动力学和治疗效果。在IgG 亚型中，IgG1是主要选择（占临床阶段 ADC 的 85%），因为它具有优越的Fcγ 受体（FcγR） 结合能力和较长的血清半衰期（14-21 天）。这种亚型不仅通过激活自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞等先天免疫细胞增强抗肿瘤免疫反应，还能显著降低 ADC 的免疫原性，从而减少抗药物抗体（ADAs）的形成。为了最大限度地减少脱靶毒性，理想的靶抗原应在肿瘤细胞上高度表达且具有肿瘤特异性，在健康组织细胞中几乎不表达。已上市的 ADC 药物的常见靶抗原，如 CD22、CD33、CD30 和 CD79，在癌细胞表面高度表达。此外，抗原的稳定性至关重要，稳定的抗原可降低其从靶细胞脱离并随后与抗体结合的可能性，从而避免 ADC 在循环中被无效清除。一个理想的 ADC 需要癌细胞表面有足够的抗原表达（理想情况下每细胞超过 10^5 个），实际水平通常在每细胞 5,000 到 10^6 个之间。药物的载荷对其治疗效果也同样关键。在选择抗体时，高亲和力和低免疫原性是关键考虑因素。在靶向药物开发中，优化吸收效率和循环时间对提高治疗效果至关重要。通过抗体结构优化或药物载荷改进来提高内化效率是一个重点。然而，过高的抗原 - 抗体亲和力可能会由于结合位点屏障（BSB）效应限制 ADC 渗透到深层肿瘤组织。为了应对这一挑战，可以通过调整抗体剂量、降低亲和力或使用更小的抗体（如单域抗体或 scFv）等策略来增强 ADC 的穿透性。新兴技术，包括嵌合抗体技术，通过改善抗体的稳定性和降低免疫原性等特性，为解决这些挑战提供了创新方案。例如，靶向 HER2 的 ADC 药物 DS-8201a 采用四肽连接子设计，有效掩盖了药物分子的疏水性。这种偶联技术允许递送高载荷的疏水性药物，而不影响抗体的药代动力学特性。此外，通过在抗体结构中引入特定的肽标签，可以实现位点特异性偶联，这些标签可被转谷氨酰胺酶、甲酰甘氨酸生成酶（FGE）或分选酶等酶识别和修饰。这种方法确保药物有效地附着在抗体的预定位点，同时保持其功能完整性和药代动力学特性。此外，嵌合抗体技术能够设计更小的抗体构建体，如单域抗体或 scFv，它们可以更有效地渗透肿瘤组织，从而提高药物递送效率。这些进展共同凸显了抗体工程和偶联技术在提高治疗效果和推动精准医学领域发展中的关键作用。2.2 ADC 中的载荷细胞毒性剂是 ADC 中的核心载荷，通常被称为 “payload”。这些载荷在水解后会转化为强效细胞毒性药物。在抗癌 ADC 的开发中，载荷主要分为三类：DNA 损伤剂、微管抑制剂和拓扑异构酶抑制剂（见表 4）。选择这些载荷时，除了细胞毒性外，还需要综合评估其偶联特性、溶解度和稳定性。药物的分子结构应便于与连接子偶联。此外，由于 ADC 通常通过静脉给药，其在血液中的溶解度和长期稳定性尤为关键，直接影响药物的生物利用度和治疗效果。表 4：代表性小分子细胞毒性载荷具体而言，载荷的溶解度确保 ADC 在给药和循环过程中保持溶解状态，防止聚集或沉淀导致生物利用度降低。ADC 在血液中的稳定性也至关重要，因为它可以防止载荷过早释放，否则可能导致脱靶效应并降低治疗指数。此外，静脉给药的 ADC 的生物利用度通常较高，因为这种途径绕过了口服给药可能面临的首过代谢和吸收变异等潜在障碍。然而，药物与抗体比率（DAR）、连接子化学和 ADC 的分子量等因素会影响其药代动力学，进而影响其生物利用度。例如，高 DAR 可能导致疏水性增加和潜在的聚集，这可能会影响 ADC 在血液中的稳定性和清除率。因此，优化这些因素对于最大限度地发挥 ADC 的治疗潜力至关重要。药物抗体比率（DAR） 是 ADC 的关键质量属性，表示每个抗体偶联的小分子药物的平均数量。DAR 值显著影响 ADC 的药代动力学、疗效和毒性特征。较低的 DAR 值（例如 2 至 4）有助于更稳定的药物分布和更长的治疗效果，而较高的 DAR 值可能导致健康组织中药物过度积累，引发更强的毒性反应。理想的 DAR 必须在 ADC 的抗癌效力与其安全性之间取得平衡。由于溶酶体屏障和肿瘤微环境的复杂性，能够有效到达靶位点的细胞毒性载荷数量有限。然而，具有低 IC50 值的载荷通常被认为是高效 ADC 的理想候选者。对于 DNA 损伤剂，IC50 值通常在皮摩尔范围内，而微管抑制剂往往在纳摩尔范围内表现出效力。例如，据报道，Duocarmycin 和 Pyrrolobenzodiazepines 的 IC50 值分别为 1-10 pM 和 0.1-1 pM，显示出强大的肿瘤细胞杀伤效果。此外，两种成熟的 DNA 损伤剂 Calicheamicins 和 Exatecans 的 IC50 值分别在 0.1-1 nM 和 1-10 nM 范围内，并显示出显著的治疗潜力。然而，尽管这些高效力药物在临床前具有令人印象深刻的疗效，但它们的临床开发必须谨慎进行，因为一些皮摩尔药物由于严重的不良反应在临床试验中已被终止。ADC 的开发取决于高 potency 载荷的选择、DAR 的精确控制以及位点特异性偶联技术的应用。这些关键因素共同决定了 ADC 的治疗 efficacy 和安全性。随着技术的不断进步，ADC 领域有望推出新一代高效、低毒的药物，为癌症治疗带来新的希望。2.3 ADC 中的连接子连接子在 ADC 中起着不可或缺的作用，它将细胞毒性载荷与单克隆抗体共价结合，确保药物在血液中稳定，并在到达肿瘤细胞时有效释放。连接子的设计必须在稳定性和药物释放效率之间取得平衡，以最大限度地提高治疗效果并减少副作用。连接子可分为两大类：可切割（可降解）和不可切割（稳定）连接子。可切割连接子利用肿瘤细胞的独特环境条件，如低 pH、蛋白水解活性或还原性环境，来触发药物释放。这些连接子在正常生理条件下稳定，但在肿瘤细胞特有的酸性或还原性环境中会发生切割，从而释放细胞毒性药物。可切割连接子的常见例子包括酸敏感连接子、蛋白酶敏感连接子和谷胱甘肽敏感连接子。例如，腙键、二硫键和肽连接子是典型的可切割连接子。虽然这些连接子能有效释放药物，但它们可能存在一定的不稳定性，导致药物在到达肿瘤细胞之前过早释放，增加脱靶毒性的风险。旁观者效应是指 ADC 释放的细胞毒性载荷可以影响邻近的肿瘤细胞，即使是那些不表达靶抗原的细胞，从而提高整体治疗效果，当连接子设计确保在肿瘤微环境中优化药物释放时，这种效应能更有效地发挥作用。不可切割连接子（稳定连接子）在血液中抗水解，通常需要在细胞的溶酶体内降解，因此在血液中的半衰期更长，降低了脱靶毒性的风险。常见的稳定连接子包括硫醚。为了克服这些限制，科学家们开发了各种创新方法。例如，使用完全烷基化的链间二硫键技术可以增强 ADC 的稳定性并减少不必要的药物释放。此外，THIOMAB80 技术通过工程方法在抗体中引入特定的氨基酸残基，以优化连接子偶联和稳定性。非天然反应性氨基酸偶联技术和工程化酶介导的偶联也被用于实现精确偶联，从而增强 ADC 的靶向性和 efficacy。在 ADC 的开发中，选择合适的连接子仍然是一个关键挑战。理想的连接子应在血液中保持稳定，同时在肿瘤细胞内快速有效地释放载荷。随着 ADC 技术的不断进步，连接子的设计和优化将继续推动新型 ADC 药物的开发，从而提高治疗效果并减少不良反应。三、ADC 的作用机制ADC 是肿瘤学中一种变革性的治疗方式，它整合了单克隆抗体的精确性、细胞毒性载荷的受控释放以及化疗药物的效力，以实现对肿瘤的选择性根除。单克隆抗体成分以其对肿瘤特异性抗原的纳摩尔结合亲和力为特征，促进了药物的长期全身循环和靶向肿瘤蓄积，同时最大限度地减少了对健康组织的脱靶效应。当与肿瘤特异性抗原结合后，ADC - 抗原复合物通过网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞作用被内化，形成早期内体。这些内体随后酸化并成熟为溶酶体，在那里酸性环境和蛋白水解酶触发载荷释放。释放的细胞毒性载荷通过两种主要机制发挥其抗肿瘤作用。微管破坏剂，如 auristatins，与 β- 微管蛋白结合，破坏微管动力学并阻止有丝分裂，最终导致有丝分裂灾难。相反，DNA 损伤剂，如 calicheamicin，通过内在线粒体途径诱导双链断裂或 DNA 交联，激活 p53 依赖的凋亡。ADC 的一个显著特征是旁观者效应，其中疏水性载荷扩散到邻近的抗原阴性肿瘤细胞，从而克服抗原表达的空间异质性并增强治疗效果（图 1）。图 1：ADC 的作用机制示意图这种包括抗原识别、溶酶体处理和跨细胞细胞毒性在内的协同作用机制，实现了强大的肿瘤根除效果，同时减少了全身暴露。这种生物靶向与化学精确性的结合，使 ADC 成为精准肿瘤学的关键进展，为异质性肿瘤的治疗提供了一种范式转变，同时保持了良好的治疗指数。四、ADC 面临的挑战ADC 已成为肿瘤治疗中一种变革性的方式。然而，其临床转化需要解决药代动力学、结构设计和转化过程中的多方面挑战。4.1 药代动力学复杂性ADC 的动态药代动力学（PK）行为带来了显著的临床障碍。体内转化产生异质性物质，包括完整的 ADC、裸抗体和游离的细胞毒性载荷，其相对比例随时间变化。这种复杂性阻碍了可靠的剂量 - 反应关系的建立，并使 PK 建模复杂化，最终影响治疗可预测性和药物开发效率。4.2 载荷释放控制和毒性载荷的过早解离仍然是一个关键的安全瓶颈。共价连接的不稳定性，特别是在传统的赖氨酸 / 半胱氨酸偶联系统中，会导致细胞毒性剂的全身释放。这种脱靶释放与剂量限制性血液毒性和器官损伤密切相关。最近的研究表明，约 40% 的 ADC 相关不良事件源于连接子稳定性不佳，这凸显了对时空控制释放机制的迫切需求。4.3 耐药机制ADC 耐药通过三种主要途径发展：（1）抗原介导的机制，包括靶标下调和表位掩蔽；（2）细胞内处理缺陷，如溶酶体酸化受损；（3）载荷特异性适应，如药物外排泵激活。虽然联合方案和下一代载荷在临床前显示出前景，但它们在 II 期试验中的临床验证率仍低于 30%，这凸显了对耐药生物学理解的根本差距。4.4 靶抗原异质性肿瘤抗原表达的时空异质性带来了双重治疗挑战。首先，患者间的变异性（例如，乳腺癌亚型中 HER2 表达的 2-5 个数量级差异）需要人群水平的分层。其次，肿瘤内克隆进化需要实时调整靶向策略。为了应对这种多维度的异质性，新兴方法结合了两个关键参数：定量抗原密度阈值（>5,000 个受体 / 细胞以确保有效内化）和旁观者效应优化。这种双重策略通过互补机制增强治疗效果 —— 抗原阈值保证高表达细胞中足够的药物摄取，而旁观者效应将细胞毒性扩展到邻近抗原表达较低的癌细胞。表 3：肿瘤异质性影响 ADC 疗效的机制4.5 结构优化挑战两个关键参数控制 ADC 的疗效 - 毒性平衡：DAR 和偶联均一性。虽然 DAR 值超过 4 可增强载荷递送，但它们同时通过加速巨噬细胞摄取使血浆清除率增加 60-80%。下一代构建体必须同时改进位点特异性偶联技术（例如，工程化半胱氨酸残基实现 > 95% 的均一性）和稳定的连接子化学（例如，硫酸酯酶可切割系统）。4.6 制造和临床转化障碍ADC 复杂的三部分结构对抗生素、制造和控制（CMC）提出了严格要求。主要生产挑战包括将偶联效率保持在 ±5% 的批次变异性内，以及确保冻干过程中载荷的稳定性。这些技术障碍导致每种获批 ADC 的开发成本超过 5 亿美元，67% 的临床阶段候选药物因治疗指数不足而失败。CMC 通过优化关键质量属性（包括 DAR 均一性、最大限度地减少载荷过早释放（减少脱靶毒性）和保持抗体特异性（保持靶标结合））直接解决治疗指数挑战。通过对偶联化学的严格过程控制、制剂稳定策略以及用于表征的先进分析方法，CMC 确保产品一致性，从而增强临床成功所需的安全性 - efficacy 平衡。4.7 靶标同质化和市场可行性当前 ADC 开发表现出令人担忧的靶标冗余，43% 的临床候选药物靶向 HER2 或 TROP2。这种集中导致治疗重复（例如，8 种抗 HER2 ADC 处于 III 期试验），同时忽视了 CLDN6 和 PTK7 等新兴靶标。这种市场饱和可能降低商业回报并抑制靶标发现的创新。创新的工程策略正在重塑 ADC 的发展轨迹。双特异性平台（例如，HER2×CD3 双靶向 ADC）在灵长类动物模型中显示出 3.2 倍的肿瘤选择性改善，而条件激活的前药连接子将全身毒性降低 89%。伴随诊断技术的同步进步，特别是基于循环肿瘤 DNA 的抗原监测，可能实现实时治疗适应，使 ADC 成为精准肿瘤学的基石。五、ADC 的未来发展方向5.1 改进 ADC 的各个部分5.1.1 抗体抗体的选择对 ADC 的开发和疗效至关重要。人源化和全人源单克隆抗体因其优异的特性，如低免疫原性、长半衰期和强大的免疫反应能力，已成为 ADC 开发中最常用的类型。然而，ADC 的成功还取决于对抗原的谨慎选择，这些抗原在肿瘤细胞中高表达，而在正常组织中低表达。许多成功的 ADC 靶标，如 HER2 和 TROP2，在某些正常组织中也有表达，这可能导致靶标依赖性和脱靶毒性反应，可能导致临床试验暂停或过早终止。为了减轻这些挑战，战略性的抗体工程方法，如截短（去除非必需的抗体结构域）和剪切（特定区域的受控蛋白水解加工），正越来越多地被用于改善靶标特异性。例如，Fc 结构域截短消除了 Fc 介导的与正常组织中免疫细胞的相互作用，从而减少非特异性摄取和细胞因子释放综合征的风险。相反，Fab 区域剪切可以优化抗原结合片段的几何形状，以增强对肿瘤相关抗原与其生理对应物之间表位的区分。这些结构修饰与糖基化工程和其他翻译后优化协同作用，创造出 “肿瘤选择性” 抗体结构，最大限度地减少脱靶结合，同时保持载荷向恶性细胞的精确递送。为了进一步提高抗体的治疗效果，研究人员一直在修饰抗体的 Fc 区域以增强其细胞毒性活性。这些修饰可分为两大类：Fc 区域的结构工程和聚糖重塑。结构工程包括定点突变和不对称工程。已显示 Fc 区域中的定点突变（如 S239D/I332E 突变）可显著改善与 FcγR IIIa 的结合，从而增强 ADCC。这些突变已被纳入抗 CD19/CD40 抗体中，在临床前和临床研究中显示出改善的治疗效果。Fc 区域的不对称工程以创建不同重链的异二聚体也显示出产生更稳定的抗体并改善 ADCC 功能，这种方法已用于开发用于癌症治疗的双特异性抗体。聚糖重塑涉及岩藻糖缺失和基于氧化的聚糖重塑等技术。岩藻糖缺失（从 Fc 区域去除岩藻糖）已被证明可显著增强与 FcγR IIIa 的结合，在体外和体内均导致更高水平的 ADCC。协和发酵麒麟公司授权的 POTELLIGENT® 技术使用 FUT8 敲除 CHO 细胞生成去岩藻糖抗体。去岩藻糖抗体的例子包括 mogamulizumab（抗 CCR4 抗体），其在临床试验中显示出优异的疗效，现已被批准用于治疗某些血液癌症。基于氧化的聚糖重塑，如高碘酸盐氧化，可在 Fc 区域产生醛基，实现细胞毒性载荷的位点特异性偶联。该技术已用于 ADC 的开发以增强其治疗潜力。这些修饰不仅增强了抗体的细胞毒性活性，还提高了它们在癌症治疗中的治疗潜力。5.1.2 载荷近年来，新型载荷如免疫调节剂和靶向蛋白降解剂的引入为 ADC 的开发开辟了新方向。免疫调节剂，包括某些免疫检查点抑制剂（如 PD-1 和 CTLA-4 抑制剂），已被纳入 ADC 设计中，以增强肿瘤微环境中的免疫反应。例如，免疫抑制剂 Voclosporin（Lupkynis）已获得 FDA 批准用于治疗系统性红斑狼疮。Voclosporin 通过抑制钙调磷酸酶来减少 T 细胞活化，从而调节免疫反应。靶向蛋白降解剂，包括分子胶和蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），是一类通过招募 E3 泛素连接酶系统诱导靶蛋白降解的药物。例如，靶向 BCL6 的分子胶 BI3802 通过诱导 BCL6 降解，在治疗 B 细胞相关癌症方面显示出潜力。此外，百时美施贵宝公司开发的 CelMoDs（一类 IKZF1/3 降解剂，如 CC-92480、CC-220 和 CC-99282）已进入复发或难治性多发性骨髓瘤（RRMM）的临床研究。在 ADC 的研究和应用中，毒素的疏水性是影响其疗效和副作用的关键因素，并且与 “旁观者效应” 密切相关。疏水性毒素分子，如 MMAE，可以被动扩散到邻近的肿瘤细胞中，产生旁观者效应，增强 ADC 对抗原表达异质性肿瘤的广泛细胞毒性作用。然而，当毒素分子过于疏水时，它们可能在体内聚集、被吞噬或发生非特异性结合，增加脱靶毒性。为了减轻高疏水性毒素的副作用，研究人员提出了在毒素分子上引入疏水性掩蔽基团的策略，如聚乙二醇（PEG）或聚谷氨酸。这些掩蔽基团增加了 ADC 的溶解度，减少了与正常组织的非特异性相互作用，从而减轻了由高疏水性毒素引起的副作用，如聚集形成、快速清除和潜在的免疫原性。这种策略使 ADC 即使在高 DAR 下也能保持良好的药代动力学特性和较低的脱靶毒性，从而进一步提高治疗效果。5.1.3 连接子连接子的设计和构建对于提高 ADC 的疗效和安全性至关重要。传统的随机偶联方法通常导致产品异质性，这可能影响药代动力学和疗效的一致性，并可能导致药物聚集、脱靶毒性和结构不稳定性。为了应对这些挑战，位点特异性偶联已成为生物偶联化学中的革命性方法。这种方法通过精确靶向抗体和蛋白质等生物分子上的反应位点，增强治疗一致性并优化结构 - 功能关系。用于位点特异性偶联的技术包括使用工程化半胱氨酸残基、非天然氨基酸、酶法或亲和引导肽。这些技术实现了位置控制，最大限度地减少了产品异质性并保留了关键的表位结合区域。例如，与赖氨酸偶联的对应物相比，使用工程化半胱氨酸的位点特异性 ADC 显示出优异的药代动力学特性和降低的聚集倾向。同样，非天然氨基酸的掺入使生物正交点击化学偶联成为可能，这在肿瘤靶向纳米载体中已得到验证。酶促偶联的最新创新通过序列识别基序进一步提高了特异性。例如，微生物转谷氨酰胺酶（mTG）介导的偶联能够在谷氨酰胺残基处实现位点特异性药物附着，而无需抗体序列修饰，实现 DAR 均一性并减少聚集（DAR 2-4，变异性 < 10%）。这种方法与 Diels-Alder 化学相结合，在连接子和抗体之间形成碳 - 碳键，与传统的马来酰亚胺 - 硫醇偶联相比，显著提高了体内稳定性。此外，双偶联策略（例如，将细胞毒性药物和免疫调节剂附着到单个抗体上）正成为一个前沿领域，利用正交偶联位点（例如，工程化半胱氨酸和聚糖修饰残基）来拓宽治疗应用。这种精度对于下一代 ADC 和双特异性抗体至关重要，其中载荷化学计量直接影响治疗指数和脱靶毒性。深入探索和优化连接子的设计和构建策略对于提高药物疗效和最小化毒性至关重要。研究团队开发了新型连接子技术，如树枝状二聚体连接子技术，以创建具有高 DAR 的 ADC。该技术减少了抗体和毒素之间的非特异性相互作用，增强了药物稳定性，并提高了药物递送效率，确保毒素更精确地递送到肿瘤靶标。此外，研究人员开发了溶酶体酶可降解连接子，如 ValCit-PABC 和 AlaAlaAsn-PABCMMAE。这些连接子旨在在肿瘤细胞的溶酶体内特异性释放毒素，从而降低药物毒性。然而，已经解决了诸如 Ces1C 酶降解导致在小鼠血浆中过早切割等挑战，通过在特定位置引入酸性氨基酸来增强连接子稳定性。总之，精确的连接子设计策略，包括选择合适的连接子类型、优化稳定性和适应性以及提高体内稳定性，正推动 ADC 研究朝着提高疗效、降低毒性和提高特异性的方向发展。随着肿瘤类型、靶标和药物类型的多样性不断扩大，定制连接子设计策略对于优化 ADC 的疗效和安全性变得越来越重要。研究还专注于肿瘤微环境中连接子的稳定性，特别是在酸性条件下，为癌症治疗提供了新的希望和潜在解决方案。5.2 新型 ADC5.2.1 双表位和双特异性 ADC为了克服对单靶 ADC 的耐药性，研究人员正在探索新方法。双表位抗体能够结合同一抗原上的两个不同表位，已成为克服单靶 ADC 局限性的有效策略。这种改进的稳定性和肿瘤靶向效率直接转化为增强的治疗效果。从机制上讲，位点特异性偶联物的结构完整性得以保持，最大限度地减少了循环中载荷的过早释放，从而在肿瘤部位维持细胞毒性浓度，防止导致耐药性的亚治疗暴露。新出现的临床证据进一步表明，通过位点特异性偶联实现 DAR 均一化的 ADC 与异质性对应物相比，显示出显著降低的多药耐药蛋白 1（MDR1）介导的药物外排。双表位 ADC 通过允许单个抗体与癌细胞上存在的抗原上的两个不同表位结合，在癌症治疗中提供了一种新方法。这种配置提高了结合亲和力，特别是在 HER2 水平低的癌细胞中，并提高了药物递送效率（表 5）。例如，靶向两个不同 HER2 表位的双表位 ADC 可以在细胞表面形成受体 - 抗体复合物，促进内吞作用和溶酶体运输，同时降低抗原表达。表 5：2024 年 AACR 会议上的双特异性 ADC（部分）为了评估双表位 ADC 的性能，科学家们创建了靶向 cMet/EGFR 和 cMet/HER2 的新型四价双特异性抗体（BsAbs）。这些 BsAbs 将诱导 Met 快速内化和降解的抗体与靶向 EGFR 或 HER2 的单链可变片段连接起来。此外，将 HER2 与 B7-H3 和 B7-H4 等其他靶标结合有望实现更广泛的治疗应用。例如，HER2×CD63 双特异性 ADC 在 HER2 阳性肿瘤中显示出增强的细胞毒性，突出了更精确靶向的潜力。为了应对单靶 ADC 的耐药性挑战，科学家们将双特异性抗体作为主要策略。它们靶向两种抗原的能力不仅提高了治疗效果，还降低了耐药风险。SI-B001 是一种抗 EGFR 和 HER3 的双特异性抗体，已与新型 AC 连接子和拓扑异构酶 I 抑制剂 ED04 连接形成 BsADC BL-B01D1，其 DAR 约为 8。这种偶联物提高了靶向精度和安全性。BL-B01D1 通过双靶交联和内化，特异性靶向 EGFR 依赖性肿瘤并减轻与 HER3 相关的耐药性。I 期试验，特别是在 EGFR 突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，报告了 63.2% 的客观缓解率（ORR），证明其对多药耐药性的有效性。目前，BsADC 的开发集中在 HER2、cMet 和 EGFR 等靶标上，同时对 B7-H3 和 B7-H4 等其他靶标的兴趣也在增加。此外，双特异性方法在靶向低表达或内化不良的抗原方面显示出潜力。非 IgG 样双特异性抗体的进展正在解决半衰期挑战，从而提高癌症治疗的精度。此外，三特异性和多功能抗体的创建为克服受体冗余和肿瘤异质性提供了有前景的策略，为个性化治疗铺平了道路。5.2.2 Probody 药物偶联物传统的靶向受体的 ADC 通常不仅在癌细胞上表达，还在某些非恶性组织上表达，这通常与不可避免的靶向非肿瘤毒性相关，导致剂量减少或治疗中断。为了解决这个问题，已经开发了一类新的 ADC 设计，其特征是条件活性抗体，通常称为 Probody。这一概念受到小分子前药的启发，其中毒素以 inactive 形式递送到体内，并在循环系统或特定器官中转化为活性形式，从而提高药物稳定性和特异性。Probody 通过可切割的间隔物将自掩蔽部分融合到 IgG 分子的 N 端，或者设计成在 pH 依赖性条件下表现出降低的结合亲和力。当到达肿瘤微环境时，由于蛋白酶的存在和酸性条件，Probody 的掩蔽部分被去除或发生构象变化，从而恢复抗体的亲和力并触发细胞毒性载荷的释放。Probody 技术包括一类通过蛋白水解切割激活的重组抗体基治疗剂。这些构建体由三个主要成分组成：具有抗癌活性的单克隆抗体或其可变区片段、附着在轻链 N 端的掩蔽肽（遮蔽抗体的 Fab 区域与抗原结合），以及连接肽（间隔物），其易受酶切割，将肽与抗体连接（图 2）。Probody 治疗剂可以使用常规的重组抗体制备技术生产。Probody 的作用机制依赖于正常组织和肿瘤组织之间的蛋白酶活性差异，从而将药物的活性主要限制在肿瘤微环境中，并最小化在正常组织中的活性。在正常组织中，Probody 保持其完整结构，并且由于掩蔽肽的存在，抗体无法结合抗原，从而延长了半衰期。当到达肿瘤微环境时，蛋白酶切割连接子，释放掩蔽肽并暴露抗体的 Fab 区域以进行抗原结合。图 2：Probody 药物偶联物的结构和机制。（A）Probody 药物偶联物的结构。（B）Probody 药物偶联物的作用机制。Probody 技术的一个显著优势是其理论上适用于广泛的基于抗体的药物。该技术已成功应用于各种抗体类型的治疗目的，包括免疫调节剂和免疫检查点抑制剂（如抗 PD-L1）、ADC（抗 CD71、抗 CD166、抗 EGFR）以及 T 细胞双特异性抗体（抗 EGFR-CD3）。早期研究发现了一种易被多种蛋白酶切割的肽序列（LSGRSDNH），该序列在非恶性组织中活性低，但在各种人类癌症的微环境中上调。临床前动物研究表明，引入掩蔽基团后治疗指数大约增加了十倍。基于这一创新，研究人员开发了几种开创性的 Probody 药物偶联物，目前处于临床前阶段，包括 CX-2051、praluzatamab ravtansine（以前称为 CX2009）、NCT03149549、NCT04596150 和 CX-2029。此外，肿瘤微环境（TME）通常表现出酸性（pH 6.0-6.8），与正常组织的中性 pH（7.3-7.4）形成对比，为 ADC 的条件激活提供了基础。因此，在抗体结合区域引入弱碱性组氨酸已成为实现 pH 依赖性激活的常用策略。已经开发了多种 pH 依赖性 ADC，靶向 EGFR、HER2、AXL175 和 ROR2 等。例如，基于微管抑制剂 MMAE 的靶向 EGFR 的 Probody 药物偶联物 HTI1511 已显示出有前景的临床前数据。这种偶联物在 pH 6.0-6.5 时与 EGFR 的结合亲和力是 pH 7.4 时的十倍以上，并且在表达 EGFR 的 A431 异种移植物中保持与西妥昔单抗相当的结合能力。此外，在西妥昔单抗耐药的 PDX 模型和携带 KRAS 或 BRAF 突变的小鼠模型中，HTI-1511 显著抑制甚至逆转肿瘤生长。在食蟹猴研究中，HTI1511 在高达 8 mg/kg 的剂量下表现出良好的耐受性，表明具有良好的临床安全性。然而，自 2018 年以来，HTI-1511 的临床开发似乎停滞不前，可能是由于 EGFR ADC 领域的潜在竞争、生产规模扩大的技术挑战以及公司战略重点的转变。作为响应 TME 的新型 Probody 药物偶联物的一个例子，研究人员基于称为蛋白质相关化学开关（PAC）的机制开发了一种 pH 依赖性 Probody 药物偶联物。这些 Probody 药物偶联物的互补决定区设计为与丰富的离子相互作用，包括氯化钠、碳酸氢盐和硫化氢。在约 7.4 的 pH 下，这些分子的带负电荷形式以足够的浓度存在，通过与带正电荷的互补决定区相互作用来抑制抗原结合。然而，在更酸性的 TME 中，这些离子的浓度降低，使靶标结合能够依赖离子浓度激活。5.2.3 免疫受体激动剂在过去十年中，癌症免疫疗法取得了重大进展，引发了人们对该领域的新兴趣。肿瘤细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs）可以触发先天免疫激活。在这种情况下，通过与模式识别受体（PRRs）相互作用的免疫佐剂分子已成为癌症药物开发的焦点。ADC 与 PRR 激动剂的组合被认为是局部激活先天免疫系统的有前景的策略。与传统 ADC 相比，免疫刺激性 ADC 具有几个潜在优势。首先，它们可以靶向多种肿瘤相关 DAMP，从而促进抗肿瘤免疫反应。其次，免疫刺激性 ADC 不仅可以激活抗原呈递细胞（APC），还可能刺激其他肿瘤浸润免疫细胞，如 T 细胞。此外，它们可以引发免疫记忆效应，提供持久的抗肿瘤作用并降低复发风险。免疫刺激性 ADC 的设计理念是通过抗体将免疫激动剂（如 Toll 样受体 7/8（TLR7/8）激动剂或干扰素基因刺激剂（STING）激动剂）递送到肿瘤微环境，从而避免传统免疫激动剂全身给药可能产生的毒性问题（图 3）。图 3：干扰素基因刺激剂的作用机制。在免疫刺激性 ADC 中，TLR7/8 和 STING 激动剂增强先天免疫反应，从而促进适应性免疫反应。TLR7 和 TLR8 作为保守的先天免疫分子，在肿瘤微环境中发挥重要作用。它们通过 MyD88 依赖性信号通路激活 NF-kB，并促进各种细胞因子和趋化因子的分泌，如白细胞介素 - 6（IL-6）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白细胞介素 - 12（IL-12）以及 CXC 基序配体 9 和 10（CXCL9、CXCL10），这些因子增强抗肿瘤淋巴细胞的浸润和激活。同时，STING 激动剂启动 I 型干扰素信号通路，进一步增强 T 细胞适应性免疫反应，增强免疫系统识别和攻击肿瘤的能力。免疫刺激性 ADC 通常结合 TLR7/8 和 STING 激动剂以协同增强免疫效果。例如，基于这两种激动剂的纳米疫苗已显示出引发更广泛的细胞因子反应，如干扰素 -γ（IFN-γ）、IL-2 和白细胞介素 - 12，这进一步增强了抗癌效果。这种组合策略不仅重塑肿瘤微环境，还提高了癌症治疗的反应率，有助于解决传统 ADC 药物面临的一些挑战。免疫刺激性 ADC 可以通过激活先天免疫系统来增强适应性免疫反应，将 “冷肿瘤” 转化为对免疫疗法敏感的 “热肿瘤”，从而提高抗肿瘤效果。最新的临床前研究表明，免疫刺激性 ADC 可以有效促进各种肿瘤模型中的免疫细胞浸润，并增加肿瘤对免疫检查点抑制剂的反应。然而，这些药物也面临挑战，例如由于全身性非特异性免疫反应可能导致严重的副作用。因此，优化免疫刺激性 ADC 的设计和连接子的选择已成为当前研究的重要方向之一。此外，正在积极探索免疫刺激性 ADC 与其他免疫疗法的组合。例如，免疫刺激性 ADC 与免疫检查点抑制剂（ICIs）的组合可能进一步增强抗肿瘤活性，特别是在实体瘤中。最近的研究集中在识别新的检查点靶标，如 TIGIT、TIM3 和 LAG-3，以克服当前疗法面临的耐药机制。研究人员希望通过开发针对这些新靶标的单克隆抗体来改善治疗结果，为癌症患者提供新的治疗选择。ICIs 与化疗、靶向治疗和抗血管生成药物的组合在各种实体瘤中显示出显著的疗效。例如，在临床试验中，PD-1 抑制剂与抗血管生成剂、放疗或化疗的组合改善了治疗结果。这种联合治疗不仅提高了总生存期和客观缓解率，还在某些肿瘤类型中显示出潜在的协同效应。尽管免疫刺激性 ADC 仍处于开发的早期阶段，尚未获得 FDA 批准，但它们在临床前研究中取得了积极进展，多家公司正在将相关药物推进到临床试验中。随着对免疫刺激性 ADC 机制的深入了解和技术的进步，这些药物有望在癌症治疗中发挥重要作用。5.2.4 降解物 - 抗体偶联物降解物 - 抗体偶联物（DACs）是一种新兴的药物递送策略，它结合了 ADC 和蛋白降解剂的优点，旨在靶向和降解特定的疾病相关蛋白（图 4）。DACs 在癌症治疗中具有重要的应用潜力。图 4：降解物 - 抗体偶联物的结构和机制。（A）降解物 - 抗体偶联物的结构。（B）降解物 - 抗体偶联物的作用机制。（C）蛋白水解靶向嵌合体的结构。DACs 的基本原理是单克隆抗体首先识别并结合肿瘤相关抗原，随后将降解剂分子递送到靶细胞中。在细胞内，连接子在特定条件下被切割，释放降解剂分子，如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）或分子胶。这些降解剂通过 E3 泛素连接酶系统诱导靶蛋白的泛素化，导致蛋白酶体降解。与传统 ADC 不同，DACs 使用蛋白降解剂作为载荷而不是细胞毒性药物。因此，DACs 可以更精确地靶向特定蛋白，减少对正常细胞的毒性作用。此外，蛋白降解剂通常对生物利用度的要求较低，这使得 DACs 能够在体内递送这些分子而不依赖于高生物利用度。近年来，研究人员开发了各种靶向细胞内蛋白降解剂，包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、蛋白水解靶向抗体（PROTABs）和溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）。这些技术为细胞表面和膜蛋白的降解提供了新策略，扩展了传统小分子抑制剂和单克隆抗体之外的治疗潜力。虽然 DACs 主要侧重于向癌细胞递送细胞毒性载荷，但这些蛋白降解技术通过提供消除靶蛋白的替代机制补充了 DACs，特别是那些难以成药或对传统疗法耐药的靶蛋白。例如，PROTACs 和 PROTABs 利用泛素 - 蛋白酶体系统降解细胞内蛋白，而 LYTACs 利用内体 - 溶酶体途径降解细胞外和膜蛋白。这种互补方法拓宽了癌症治疗的治疗策略范围，解决了 DACs 单独可能无法有效靶向的靶标。总之，抗体导向的蛋白降解剂代表了一项突破性技术，有望为癌症患者提供独特的治疗选择。然而，这些药物中的大多数仍处于早期临床前开发阶段，需要进一步的药物化学研究和临床前评估以确保其安全性和有效性。5.2.5 双载荷 ADC大多数实体瘤由异质性癌细胞亚群组成，每个亚群具有不同的基因表达谱和对不同作用机制药物的敏感性。因此，临床实践中经常使用涉及多种具有不同作用模式的药物的联合疗法。双载荷 ADC 有望作为单一药物发挥作用，能够引发相加或协同效应，并克服治疗难治性肿瘤患者的药物耐药性，同时提供简单的给药方案。2017 年，报道了一种使用含有两个正交掩蔽半胱氨酸残基的分支化学连接子生产双载荷 ADC 的方法。这种创新方法能够将 MMAE 和单甲基奥瑞他汀 F（MMAF）均一地偶联到抗 CD30 抗体上，DAR 为 16。双载荷 ADC 在表达 CD30+MDRn 的间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）小鼠异种移植模型中显示出强大的活性。这种双载荷策略有可能作为单一药物发挥作用，触发相加或协同效应，并克服治疗难治性肿瘤患者的药物耐药性，同时保持简单的给药方案。双载荷 ADC 的临床潜力得到了进一步探索，因为它们结合了两种不同的载荷类别，超越了装载 MMAE 和 MMAF 等细胞毒性剂的 ADC。例如，将 asterlin 与 TLR 激动剂偶联到抗 FolRa 抗体上，在小鼠模型中显示出协同抗肿瘤活性和免疫记忆。然而，并非所有测试双载荷 ADC 的研究都显示出有意义的协同效应，特别是那些涉及不同载荷类别的研究。例如，研究人员开发了一种抗 HER2 ADC，配备 MMAE 和 SG3457（一种能够通过交联损伤 DNA 的超强效 PBD 二聚体）。同样，开发了一种靶向 HER2 的 ADC，配备 MMAF 和高效拓扑异构酶 II 抑制剂 PNU-15968。尽管这两种 ADC 都能够发挥双重作用机制，但与相应的单药 ADC 相比，这两种药物在体外效力方面均未显示出改善。这些发现强调了选择具有适当作用机制的载荷、确保所选两种载荷之间的效力平衡以及优化 DAR 以实现最佳治疗结果的重要性。充分理解和最大限度发挥双载荷 ADC 潜力的努力仍处于探索的早期阶段。六、结论ADC 已成为肿瘤学中一种变革性的治疗方式，它结合了单克隆抗体的精确性和载荷的效力，提供靶向治疗。在过去十年中，ADC 设计、偶联技术和载荷选择方面的显著进步推动了其临床成功和商业化。ADC 的结构优化，包括抗体工程、连接子化学和载荷设计的进步，在提高其治疗指数方面发挥了关键作用。位点特异性偶联技术提高了均一性和稳定性，而免疫调节剂和蛋白降解剂等创新载荷扩展了 ADC 的治疗潜力。新型 ADC 设计，包括双特异性 ADC、免疫刺激性 ADC、DACs 和双载荷 ADC，正在解决肿瘤异质性、耐药性和脱靶毒性等挑战。这些下一代 ADC 有望克服传统疗法的局限性，并改善难治性癌症的治疗结果。尽管取得了这些进展，ADC 在临床转化中仍然面临重大挑战。复杂的药代动力学、载荷释放控制和耐药机制的出现需要进一步创新。开发时空控制释放机制、改进连接子稳定性以及减轻抗原异质性的策略是关键研究领域。此外，ADC 生产的高制造成本和技术障碍需要优化，以确保更广泛的可及性和可负担性。展望未来，ADC 与新兴治疗方式（如免疫检查点抑制剂和靶向蛋白降解剂）的整合有望提高其疗效并克服耐药性。ADC 技术的不断发展，加上伴随诊断和精准医学的进步，使 ADC 成为下一代癌症治疗的基石。随着该领域的进展，ADC 有望在异质性和难治性癌症的治疗中发挥越来越重要的作用，为治疗选择有限的患者带来新的希望。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

ADC在癌症治疗领域取得了突破性的进展，涌现出了许多新技术、新疗法，与此同时也面临许多挑战。今天为大家解读一篇关于ADC在癌症治疗领域的最新进展的综述文章，一起学习起来。抗体偶联药物（ADC）是一种有前景的靶向癌症治疗方法，通过将抗体的精准靶向性与细胞毒性药物相结合，选择性杀伤肿瘤细胞，同时减少脱靶效应。本综述全面分析了ADC的结构组成、作用机制及临床应用，并探讨了抗体工程和连接子设计方面的技术进步，以提高疗效和安全性。文章概述了当前临床现状，重点介绍了已获批的ADC及临床试验中的候选药物，同时讨论了稳定性、半衰期和全身毒性等关键挑战。1. 前言癌症是全球第二大死因，每年导致1000万人死亡。尽管现在有多种癌症治疗方法，如化疗、免疫治疗、放疗、细胞治疗和手术，但传统化疗仍是主要治疗手段。然而，化疗的选择性差、全身毒性和耐药性等局限性不容忽视，这些限制了药物的治疗窗口和疗效。因此，研究人员持续探索减少或消除化疗脱靶副作用的方法，以显著改善患者的健康相关生活质量。ADC的概念最早由德国诺贝尔奖得主、化疗创始人Paul Ehrlich于100年前提出。他将ADC描述为“魔法子弹”，因其能特异性靶向病变细胞而不伤害健康细胞。Ehrlich设想将抗体与毒素结合以实现选择性杀伤。这一设想在多年后得以实现，即当时甲氨蝶呤被连接到针对白血病细胞的抗体上。随后，基于嵌合和人源化单克隆抗体的发展，1997年FDA批准了首个抗癌抗体利妥昔单抗，抗体的发展为ADC的发展提供了先决条件。ADC是一类靶向癌症治疗方法，通过将细胞毒性药物与抗体结合，解决了传统化疗药物缺乏特异性的问题。尽管ADC的开发不断面临新挑战，如抗体与细胞毒性药物的组合选择、临床相关靶点的确定以及连接子的类型、位置和数量等，全球研究人员也在不断努力去解决这些问题。截至2024年11月，FDA已批准15种ADCs。ADC类似于“制导导弹”，由三个关键部分组成：（1）与癌细胞表面肿瘤特异性或肿瘤相关抗原结合的单克隆抗体；（2）细胞毒性药物；（3）将抗体和药物连接的可切割或不可切割的连接子。连接子的设计需高度稳定，以确保ADC分子在通过受体介导的内吞作用进入癌细胞前不发生非预期切割。与传统化疗药物不同，ADC通过选择性释放细胞毒性药物杀伤表达靶抗原的癌细胞，同时减少对健康细胞的暴露，从而降低全身给药的脱靶效应。本文旨在强调ADC在癌症治疗领域的变革潜力，强调持续创新的必要性，并探讨ADC开发中的挑战，以充分实现其治疗前景。2. ADC技术的进展近年来，由于单克隆抗体（mAbs）的特异性以及新发现的癌症特异性或相关抗原数量的增加，mAbs在癌症治疗领域的开发日益受到重视。1997年，首个用于治疗B细胞淋巴瘤的利妥昔单抗（Rituximab）获批，标志着mAbs在癌症治疗中的扩展。随后，更多新一代抗癌mAbs如Avastin®、Cetuximab®、Rituximab®、Trastuzumab®等相继问世。mAbs结合特异性的调控尤为重要，这使其相较于其他癌症治疗方法具有显著优势。此类修饰可在抗体分子的可变域内进行，该区域包含互补决定区（CDRs），决定了抗体与相应抗原的相互作用。为了改造可变域和CDRs，需要通过靶向或随机突变生成大量变异体并进行筛选。基于抗体-抗原复合物结构知识的靶向或结构引导突变是一种更有效的方法，因为需要测试的变异体较少。通常，通过X射线晶体学获得的表位-互补位结构数据可与计算机工具结合预测合适的变异体。此外，也可采用从头计算的分子结构设计和抗体-抗原复合物对接方法替代X射线晶体学。筛选出的潜在抗体变异体随后可通过突变实验验证其效力。mAbs的人源化是抗体工程中的关键步骤，尤其在治疗靶点涉及人体时。这一过程可减少因暴露于非人源材料（如源自非人源的抗体）而可能引发的交叉反应。由于大多数抗体源自非人源，人体免疫系统可能将这些mAbs视为威胁并产生不必要的免疫反应，从而影响治疗效果。如图1所示，一种人源化抗体的方法是CDR移植技术，即将合成的非人源mAbs的CDRs移植到人源Ig分子中。这使得分子对免疫系统的“异源性”降低，同时不损害其特异性。通过应用特异性决定残基（SDR）移植，可进一步降低免疫原性。SDRs的添加保留了CDR的环结构，并可轻易从抗体-抗原复合物的3D结构中识别。图1：抗体人源化中的CDR移植和SDR移植方法通过CDR移植技术对非人源mAbs进行人源化。将非人源抗体（红色矩形所示）的CDRs移植到人源IgG框架（浅蓝色所示）中，并与人源恒定区（紫色）连接，生成免疫原性较低的完全人源化mAb。SDR移植是将非人源mAbs的SDR（黄色矩形）移植到人源IgG框架（浅蓝色所示）中，并与人源恒定区（紫色）连接。噬菌体展示技术同样可用于全人源化抗体的合成。该方法需将多个基因整合至噬菌体内构建完整文库，随后噬菌体会将基因表达为表面蛋白，这些蛋白可通过生物淘选进行筛选，并利用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测。另一项从鼠源可变区序列生成人源单抗的技术，可通过整合人类种系基因库信息，采用计算生物学方法对互补决定区（CDR）及VH/VL界面附近残基进行理性设计，从而推导出鼠源可变区序列。该技术通过参照最接近的人类种系序列进行迭代替换，使抗体逐步获得人类特征，最终在保持功能活性的同时实现完全或可接受的人源化。运用此技术已成功制备出三种靶向CD25、血管内皮生长因子和TNF-⍺的全人源化单抗，分别进行了59、46和45处氨基酸替换。尽管单抗具有高度特异性和卓越靶向能力，但多数单抗本身细胞毒性不足以杀死癌细胞，但ADC可以解决这个问题，因为其细胞毒性主要来源于所载药物。目前仅有约2%的ADC分子能抵达并穿透实体瘤细胞，因此必须选择具有强效细胞毒性且能在体内保持稳定性的药物作为载荷。当前FDA批准的ADC药物载荷可分为微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂两类。微管蛋白作为微管的核心组分在细胞有丝分裂中起关键作用，抑制该蛋白可有效阻断肿瘤细胞分裂与转移；而DNA损伤剂则通过抑制DNA复制机制、诱导DNA烷基化或双链断裂等方式发挥细胞毒性。当需要不依赖细胞周期的杀伤机制时，DNA损伤剂比主要作用于分裂期细胞的微管蛋白抑制剂更具优势。另外，ADC技术中部分实验性载荷为海洋源免疫毒素，如源自软体动物耳廓截尾海兔的单甲基奥瑞他汀E，以及来自水螅的HALT-1毒素。刺胞动物门来源的actinoporin类毒素因其稳定性与小分子量（18.5-20kDa）展现出作为免疫毒素载荷的巨大潜力，可实现更高组织穿透性与更低免疫原性。这类毒素通过特异性识别鞘磷脂后在细胞膜上形成孔洞，破坏离子梯度导致渗透失衡和细胞裂解。新一代ADC还采用免疫调节剂作为载荷以激活免疫系统而非直接杀伤肿瘤，包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激蛋白（STING）激动剂等，这类免疫调节型ADC被称为免疫刺激抗体偶联物（ISAC），其作为癌症免疫治疗剂可产生持久免疫记忆，展现出广阔前景。连接子是ADC技术中持续革新的关键组分，其既控制抗体与药物载荷的释放，又决定ADC整体稳定性。连接子可分为可裂解型与不可裂解型，二者各具用途：可裂解型含有化学触发结构能在特定条件下诱导释放；不可裂解型则与药物载荷结合，因此需根据靶点特性与定位选择合适的连接子。传统连接子在减少非特异性释放、优化连接子-载荷偶联、以及避免降低ADC效价（如马来酰亚胺类连接子的逆迈克尔消除反应）等方面仍需改进。最新开发的连接子包括新型酶敏感连接子、光敏感连接子和生物正交可裂解连接子，具体内容将在后文详述。3.下一代连接子化学连接子在ADC设计中起着关键作用，它稳定地将细胞毒性药物与mAb连接。约80%已获批的ADCs使用可切割连接子，以便将治疗药物递送至肿瘤部位。这些连接子设计为在细胞外和细胞内环境（如氧化还原电位、pH、谷胱甘肽浓度和特定溶酶体酶的存在）差异时被切割，从而使细胞毒性载荷在靶肿瘤细胞内或附近特异性释放。肽基序是可切割连接子的主要形式，已在临床阶段的ADCs中广泛应用。然而，这些可切割连接子的一个固有缺点是容易被细胞外酶（如丝氨酸弹性蛋白酶）切割，导致细胞毒性载荷的系统性释放，从而引发脱靶毒性。因此，理想的连接子需具备足够的稳定性，以防止细胞毒性药物在非靶组织中过早释放或引发全身毒性。同时，连接子需在结合抗体时保持偶联物的无活性、无毒性状态。研究人员一直致力于开发在循环系统中更稳定的可切割连接子。这些方法包括使用对特定蛋白酶更具选择性的肽序列，以及探索其他酶类作为释放机制。传统的可切割连接子释放方法包括质子解离、二硫键还原和蛋白水解降解（如缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）-PABC连接子技术）。理想的ADC连接子需具备双重特性：一方面通过稳定的抗体偶联结构阻止药物在血液循环中提前释放，另一方面能在靶位点实现特异性触发释放。尽管多数可裂解连接子能满足第一项要求，但新型豆荚蛋白（legumain）连接子技术首次同时实现了双重要求。该专利技术由Vincerx Pharma公司开发，其创新机制在于利用豆荚蛋白——一种在预后不良的肿瘤细胞中过表达的溶酶体蛋白酶。作为高特异性的天冬酰胺内肽酶，豆荚蛋白能精准切割靶蛋白中的特定天冬酰胺残基，从而显著增强对肿瘤细胞的选择性。这种特性可大幅降低细胞毒性药物在体循环和健康细胞中的非特异性释放。为进一步扩大ADC治疗窗，该技术采用前药原理：在细胞毒性药物上连接可被豆荚蛋白切割的亲水性肽帽（又称细胞捕获剂）。当前药被肿瘤细胞内化后，肽帽被豆荚蛋白酶切除，此时药物才被激活。细胞捕获剂能有效抑制细胞膜通透性，促使药物在肿瘤细胞内滞留蓄积，从而同步提升疗效与安全性。连接子技术的另一突破是串联裂解连接子系统，其要求连续发生两次酶切反应才能释放载荷药物。这种级联反应机制确保第二次酶切必须发生在首次切割之后，从而有效降低循环过程中的药物提前释放风险和脱靶毒性。该技术灵感来源于两类前药策略：一是利用亲水性葡萄糖醛酸苷基团的前药设计，二是可被肿瘤细胞中高表达的溶酶体酶β-葡萄糖醛酸苷酶识别的连接子技术33。通过引入β-葡萄糖醛酸苷基团作为保护层，可防止二肽在循环过程中被非特异性切割。只有当ADC被内化并经历溶酶体降解后，单糖基团才会被移除，进而暴露出二肽结构供后续降解并释放细胞内载荷。大鼠实验证实，串联裂解连接子在保持血浆稳定性和耐受性方面表现优异，可显著提高ADC的治疗指数。传统ADC药物存在三大局限：抗体选择受限（必须依赖溶酶体摄取机制）、易产生耐药性（药物释放依赖肿瘤细胞内吞和溶酶体裂解等多重过程）、分子量过大影响肿瘤穿透效率。新型肿瘤微环境激活连接子（TMALIN）技术平台通过独特的酶消化特性直接解决了这些难题。该技术能在微环境中实现肿瘤细胞外裂解，使ADC的抗肿瘤活性完全不受抗体内吞能力影响，从而极大拓展了抗体选择范围。TMALIN-ADC的特殊结构可促进药物在肿瘤微环境富集，使肿瘤组织与血液中的药物浓度比显著提高，进而提升治疗指数。其独特的酶消化特性与肿瘤富集能力协同作用，可实现载荷药物在肿瘤组织的大量蓄积，产生强效旁观者效应——即使对低表达或不表达靶抗原的肿瘤也展现显著抗肿瘤效果。此外，TMALIN技术开发的ADC具有卓越的体循环稳定性，能最大限度减少非靶组织中的药物脱落，大幅降低脱靶毒性。最后，该平台构建的ADC表现出优异的溶解性和化学稳定性，彻底解决了传统ADC中马来酰亚胺连接方式导致的逆向加成反应问题，可制备高均一性（DAR=8.0）且定量精确偶联的ADC产品。除上述技术外，其他新型酶敏感连接子还采用肿瘤过表达的特异性酶（如β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、焦磷酸酶可裂解连接子）。光敏感连接子则通过外部可控激活机制降低脱靶风险：近红外光（NIR）响应型连接子基于七甲川花青荧光团设计，可在特定波长照射时释放药物；紫外光（λ=365 nm）触发型采用邻硝基苄基作为裂解基团，其半衰期与天然抗体相当；最新研发的双条件激活ADC需同时满足光照（λ=365 nm）和内源性N端胺反应才会裂解。此外，生物正交可裂解连接子能响应活体内进行的非干扰性化学反应。基于此开发的"无痕连接子"ADC采用双取代丙炔氧羰基（dsProc）和双取代丙炔基（dsPra）作为触发单元，在与Cu(I)-BTTAA相互作用时发生生物正交反应，实现肿瘤部位细胞外药物释放。4. 位点特异性偶联技术传统的偶联方法（第一代）利用抗体中丰富的赖氨酸或半胱氨酸残基进行偶联。而位点特异性偶联（下一代）技术则通过抗体工程实现更精确的定点偶联，从而克服异质性、高DAR（药物-抗体比率）物种清除率加快、治疗窗口变窄和稳定性差等问题。目前主要有四种位点特异性偶联方法（表1）：1. 特定氨基酸偶联：利用天然或工程化的半胱氨酸、谷氨酰胺等氨基酸残基（示例：DM1通过工程化半胱氨酸与Thio-trastuzumab在Ala114位点偶联）。2. 非天然氨基酸偶联：含生物正交反应基团的非天然氨基酸（示例：对乙酰苯丙氨酸偶联的auristatin类化合物）。3. 短肽标签偶联：通过4-6个氨基酸残基组成的短肽实现特异性偶联（示例：LPETG五肽标签介导的转肽反应）。4. 糖基化偶联：靶向CH2结构域糖链的定点偶联（示例：唾液酸糖链的点击化学偶联）。表1详细比较了这些方法的特性、适用药物、抗体类型和参考文献。位点特异性技术可显著提高ADC产品的均一性，DAR值波动范围从传统方法的0-8降低至精确控制的2-4。5. 前药载荷设计理想的前药载荷需具备七大特性：1. 足够的细胞毒性效力（IC50通常在pM-nM级）2. 低免疫原性3. 高血浆稳定性4. 可修饰功能基团而不影响活性5. 旁观者杀伤效应6. 适宜的水溶性7. 与靶点亚细胞定位匹配的释放特性第一代ADC药物（如甲氨蝶呤、长春碱）存在效力不足、肿瘤蓄积差等问题。表2列举了新一代候选前药：• BCL-XL抑制剂：通过稳定促凋亡蛋白BIM增强MEK抑制效果（NCT03595059）• NAMPT抑制剂：破坏NAD+代谢通路（MDA-MB-453模型中T/C比达0.13）• 海兔毒素衍生物：强效微管抑制剂（IC50 0.2-224 nM）• PROTAC分子：诱导靶蛋白降解（如HER2+细胞中BRD4降解）• 光敏偶联物：近红外光控释放（3T3/HER2细胞IC50~2.5 nM）特别值得关注的是免疫刺激型ADC（ISACs），其载荷为TLR/STING激动剂等免疫调节剂，可通过激活免疫记忆产生持久抗肿瘤效应。6. 双载荷ADC与双特异性ADC肿瘤异质性是治疗耐药和复发的主要原因。单药ADC对含不同药物敏感性细胞的异质性肿瘤效果有限。为解决这一问题，研究者开发了双药共递送策略：Yamazaki团队构建了同时携带MMAE和MMAF的ADC（图2）：• MMAE：膜渗透性微管抑制剂（杀伤靶细胞及邻近细胞）• MMAF：膜不渗透性药物（抑制外排泵克服耐药）在HER2+乳腺癌异种移植模型（混合HER2+/HER2-细胞）中，双药ADC显示完全缓解且无复发，显著优于单药ADC。除MMAF外，Mckertish与Kayser还开发了另一种双载荷ADC：通过Val-Cit连接子将曲妥珠单抗与MMAE偶联后，再经不可裂解连接子琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC）与美坦新（DM1）二次偶联形成双偶联物。该双载荷ADC在HER2高表达的SK-BR-3乳腺癌细胞和HER2低表达的DLD-1结直肠癌细胞中均展现出细胞毒效应。这些证据支持双偶联策略能对异质性肿瘤产生强细胞毒性及抗肿瘤效果，有效应对治疗抵抗和肿瘤复发问题。图2 双药ADC的制备利用mtgase介导的双功能支链连接物，制备由MMAE和MMAF组成的双药物ADC，然后与MMAE（品红圈）和MMAF（黄色三角形）进行正交点击反应。使用的连接子是谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(GluValCit)-PABC连接子，该连接子在内化后提供体内稳定性和快速释放。近年来，双特异性抗体因其优于单克隆抗体的特性，在肿瘤免疫治疗及其他疾病治疗领域展现出广阔应用前景，引发了科研界的极大关注。这类抗体的核心特征在于具有两个结合位点，可分别靶向两种不同抗原或同一抗原上的不同表位。研究显示，双特异性抗体通过多种机制在癌症治疗中表现出显著疗效，包括激活免疫细胞、阻断免疫检查点、抑制炎症因子以及双重信号通路调控等作用方式。表3已对这些作用机制及相应的双特异性抗体案例进行了系统总结。表3总结了双抗ADC的四大作用机制：1. 免疫细胞激活（如PD-1/TIM-3双抗）2. 免疫检查点阻断（如PD-1/VEGF双抗）3. 炎症因子抑制（如TNF/IL-17A双抗）4. 双信号通路阻断（如EGFR/cMET双抗）显然，双特异性抗体能有效对抗癌症，并可作为潜在抗体偶联药物（ADC）进行开发，以提升单抗ADC的特异性、亲和力及内化效率。目前已有多种双特异性ADC处于研究阶段。Zong及其团队通过蛋白质反式剪接技术（BAPTS）构建了同时靶向催乳素受体（PRLR）与HER2的双特异性抗体，采用马来酰亚胺己酰基连接子搭载MMAE载荷（图3）。与HER2-ADC相比，PRLR×HER2双特异性ADC在体外实验中显示出更高的内化效率及更显著的人乳腺癌抗肿瘤活性。此外，双特异性ADC（BIO-201）通过可裂解连接子将靶向HER2与Trop-2的双特异性抗体与强效DNA拓扑异构酶I抑制剂偶联。实验证实，该ADC对共表达HER2与Trop-2的癌细胞具有增强的细胞结合力、内化效率及强效细胞毒性。在HER2或Trop-2阳性肿瘤的异种移植模型中亦观察到肿瘤消退效应，表明其相较于单抗ADC具有更广谱的肿瘤类型覆盖能力。图3 靶向人表皮生长因子受体2和PRLR的双特异性ADC的生成以MMAE为载体，通过马来酰亚胺己丙基连接体，通过片段表达、分裂内含子反式剪接和接合过程制备靶向HER2和PRLR的双特异性ADC。除乳腺癌抗原外，间质-上皮转化因子（MET）选择性酪氨酸激酶抑制剂（TKI）对携带MET基因突变的肺癌也具有疗效。针对MET的抗体偶联药物（ADC）在治疗非小细胞肺癌MET外显子14跳跃突变或MET过表达等变异类型中也显示出良好疗效。但MET基因改变仅存在于少数非小细胞肺癌患者中，加之肿瘤耐药性问题，MET靶向ADC的疗效可能受到极大限制，这促使联合治疗方案的开发成为迫切需求。研究人员将靶向MET双表位的双特异性抗体与美登素类载荷偶联，构建了双特异性METxMET ADC。该双表位ADC被证实能在中高表达MET的异种移植瘤中诱导肿瘤消退，包括对MET抑制剂存在先天或获得性耐药的模型。目前REGN5093-M114（METxMET ADC）的I/II期临床试验已在MET过表达的晚期癌症患者中启动（NCT04982224）。除靶向肿瘤治疗外，双表位METxMET ADC还可用于研究跨内体运输机制。近期研究将生物传感器与双表位METxMET抗体偶联构建可裂解型双特异性ADC，并在体外和体内实验中均观察到其内化现象。研究表明METxMET双表位抗体可内化进入分选内体，随后快速运输至循环内体，并缓慢成熟为晚期内体——这正是MET、EGFR和PRLR等ADC的作用位点。这些发现不仅为循环内体的催化活性、跨内体运输与ADC加工之间的关系提供了新见解，同时提示循环受体可作为ADC的潜在靶点，因其能高效递送ADC载荷至肿瘤细胞内。7.靶向肿瘤微环境的ADC与"旁观者效应"如前所述，传统ADC的抗体选择受限于细胞表面暴露的靶抗原——这类抗原通常在癌细胞中高表达，而在健康细胞中低表达。简言之，"旁观者效应"是指ADC释放的细胞毒性有效载荷可扩散至邻近细胞并将其杀死，即使这些细胞不表达抗体识别的靶抗原。目前处于临床前和临床开发阶段的ADC主要靶向肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）。TAA是在肿瘤中高表达但健康组织中极少存在的蛋白质，而TSA仅存在于特定癌细胞类型中。与血液系统恶性肿瘤不同，实体瘤在被称为肿瘤微环境（TME）的复杂动态生态系统中生长，其组成在不同肿瘤类型间存在显著异质性。TME作为多维度动态生态系统，在肿瘤发生发展及治疗响应中起关键作用，其核心组分包括：（1）提供结构支撑的丰富细胞外基质；（2）促进肿瘤生长侵袭的间质细胞（如癌症相关成纤维细胞CAFs）；（3）支持肿瘤血管新生的异常新生血管网络；（4）具有促瘤/抑瘤双重功能的免疫细胞。鉴于肿瘤细胞与TME的密切关联，在TME非恶性细胞上异常表达的TME相关抗原（TMA）成为实体瘤治疗的新兴靶点，与传统肿瘤抗原策略形成差异化路径。重要TMA靶点包括趋化因子/细胞因子、转录因子、代谢酶和检查点分子。这类靶标的突出优势在于其在内皮细胞/间质细胞/免疫细胞的高表达，而在健康组织中罕见或低表达。此外，TMA靶点（尤其新生血管或间质细胞表达的抗原）在全身给药时更易被ADC接触。目前多个靶向TMA的ADC已进入临床试验：针对晚期B细胞恶性肿瘤CD74的STRO-001（NCT03424603）、靶向CCR7治疗非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的JBH492（NCT04240704）。此外，Camidanlumab tesirine（ADCT-301）正处于治疗经典霍奇金淋巴瘤（cHL）和非HL的I/II期阶段（NCT02432235）。另有靶向CD276的DS-7300、MGC018和Mirzotamab clezutoclax主要用于晚期实体瘤治疗（NCT04145622、NCT03729596和NCT03595059）。下表4汇总了当前处于临床试验阶段的TME靶向ADC概况。8. ADC的衰老调控作用癌细胞中的细胞衰老具有两大特征：一是细胞进入永久性生长停滞状态，二是分泌衰老相关分泌表型（SASP）。SASP包含细胞因子、趋化因子和生长因子等物质，可形成促炎症和促肿瘤的微环境。矛盾的是，这种SASP能通过支持周围恶性细胞、促进转移并可能降低某些疗法的疗效，从而刺激肿瘤进展。与传统化疗相比（后者可能诱导非靶向细胞衰老并促进SASP形成，ADC能将细胞毒性药物精准递送至表达特定抗原的癌细胞，而不损伤健康细胞。这种特异性不仅能降低整体毒性，还可能避免衰老细胞通过SASP引发慢性组织损伤和继发恶性肿瘤。通过将衰老限制在靶向细胞内或直接诱导细胞毒作用，ADC可减少促肿瘤微环境的形成，展现出显著治疗优势。鉴于衰老细胞会促进促肿瘤环境，ADC减少正常细胞意外衰老的能力可降低肿瘤复发风险。通过维持健康组织完整性并避免SASP相关炎症，ADCs对患者长期预后具有积极意义，可能降低癌症复发和治疗耐药风险。虽然ADC传统设计以杀死靶细胞为目标，但学界正兴起通过ADC选择性诱导癌细胞衰老的研究。该策略通过迫使肿瘤细胞进入受控衰老状态以阻断其增殖。若这些衰老癌细胞表达"衰老相关免疫配体"刺激免疫细胞识别，还可能被免疫系统清除。诱导衰老型ADC或可增强免疫监视，帮助免疫细胞识别清除这些非分裂的受损细胞。这种"诱导衰老+直接杀伤"的双重机制可实现肿瘤抑制最大化。例如，靶向细胞衰老机制相关蛋白的ADC可与免疫检查点抑制剂或SASP调节剂联用，建立"治疗性衰老"状态以提升整体疗效。ADC设计应优化以避免非预期衰老。有效载荷的合理选择、连接子稳定性和抗原靶点特异性对减少健康细胞意外衰老至关重要。通过改进ADC使其对肿瘤细胞（尤其是具有独特抗原者）具有高度特异性，可降低脱靶诱导衰老的风险。出人意料的是，衰老现象不仅影响肿瘤发展，更与抗癌治疗响应密切相关。研究表明，抗癌治疗会导致恶性和非恶性组织中衰老细胞累积，这主要源于其DNA损伤机制及全身给药方式——多数抗癌药物可引发多组织多部位的衰老反应。多种靶向治疗药物能诱导恶性和非恶性细胞早熟衰老：CDK4/6抑制剂（如帕博西尼、瑞博西尼、阿贝西尼）通过模拟p16INK4a活性引发p53依赖性细胞周期稳定停滞；泛HDAC抑制剂伏立诺他和DNA甲基转移抑制剂地西他滨则分别通过CpG甲基化调控和SA-β-gal活性等机制诱导衰老；VEGF抑制剂等抗血管生成药物在临床前模型中可诱发衰老并提升细胞因子水平，提示存在类SASP效应；甚至利妥昔单抗等非细胞毒性治疗性抗体也能促进淋巴瘤细胞衰老。因此，在设计避免慢性SASP产生的ADC时，宜选用不易诱发细胞衰老停滞的作用机制：如微管靶向剂（奥瑞他汀类、美登素类）通过破坏微管诱导凋亡而不直接造成DNA损伤，相比烷化剂或拓扑异构酶抑制剂等DNA损伤类药物更不易引发衰老；Bcl-2抑制剂等激活内源性凋亡通路的非DNA损伤类凋亡诱导剂也可在不启动衰老程序的情况下促进细胞死亡。其他避免SASP的工程技术包括：采用定点偶联策略增强靶向递送效率，通过Fc工程调控免疫系统相互作用，以及选择性使用仅在肿瘤微环境中激活的可裂解连接子。9.ADC与其他疗法的协同作用由于抗体偶联药物（ADC）具有选择性靶向癌细胞的独特特性，其可与其他癌症疗法联用以实现协同效应，这对患有复杂多病症的患者尤为显著。临床前及临床研究证实，ADC能与免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1疗法）、激酶抑制剂甚至低剂量化疗药物协同作用，显著增强肿瘤细胞杀伤效果。以免疫检查点抑制剂为例，当其与ADC联用时，既能通过ADC精准靶向癌细胞，又能刺激患者产生抗肿瘤免疫应答，从而帮助克服肿瘤免疫逃逸机制。最具前景的联合疗法当属ADC与免疫检查点抑制剂（PD-1或PD-L1抑制剂）的配伍应用。这类药物通过激活免疫系统识别攻击癌细胞，在缩小实体瘤体积和提高总体缓解率方面展现出显著潜力。当ADC杀死癌细胞时，肿瘤抗原释放至微环境可激活免疫系统，使肿瘤更易被免疫细胞识别，从而产生协同抗肿瘤效应。这种策略为单药治疗响应不佳的患者提供了新的希望。临床前研究显示，ADC与纳武利尤单抗联用能显著改善难治性癌症患者的预后。与传统化疗药物联用时，ADC可降低化疗剂量，从而减轻患者不良反应。部分ADC搭载的超强效细胞毒载荷使其在较低全身剂量下即可起效。此外，连接子化学和抗体工程学的创新进一步提升了ADC在循环系统中的稳定性和选择性，确保药物主要在肿瘤微环境中释放，有效降低了全身毒性。鉴于ADC能精准靶向肿瘤细胞并减少脱靶效应，其非常适合与那些存在毒性风险的其他疗法联合使用。未来，ADC与靶向治疗或免疫治疗的策略性组合，有望为传统放化疗提供一种高效低毒的替代方案，特别适合合并症患者或无法耐受传统治疗强烈毒副作用的脆弱人群。10. FDA批准的ADC药物截至2024年11月，FDA已批准了15种ADC，如表5所示，而超过164项不同阶段的ADC临床试验目前正在进行中。表6为目前正在临床阶段的部分ADC备注：根据2024年11月18日Clinicaltrials.gov数据库中的目标进行分类。不同靶点临床活跃情况如图4所示。图4 不同靶点临床活跃情况11. ADC开发中的挑战及其给药后的系统稳定性  尽管抗体药物偶联物（ADC）在靶向癌症治疗中展现出巨大潜力，但其开发与应用仍面临诸多挑战。首先，选择合适的连接子以偶联有效载荷和抗体是ADC开发的关键。可裂解型与不可裂解型连接子各有优缺点，因此连接子的选择需基于抗体与有效载荷的具体化学特性。理想的连接子应仅在ADC被肿瘤细胞内化后裂解释放药物。若连接子不稳定导致药物过早释放，可能引发脱靶毒性——这是ADC技术亟需克服的主要缺陷之一。  根据抗体分子偶联药物分子的最佳数量，ADC可通过药物抗体比（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）进行分类。DAR是影响ADC效能、稳定性和药代动力学的重要参数。理论上，高DAR的ADC因携带更多细胞毒性药物而应具有更强的效力。然而研究表明，DAR过高的ADC可能因结构庞大阻碍肾脏清除，转而通过肝脏加速清除，从而降低疗效。不同ADC的最佳DAR需根据抗体类型、有效载荷及靶向肿瘤类型综合评估，这对优化设计和提升疗效至关重要。  ADC治疗的另一个挑战是耐药性问题，其机制包括：肿瘤内异质性导致抗原表达下调、治疗诱导的靶抗原减少或丢失；靶抗原与其他细胞表面受体二聚化阻断ADC结合。针对耐药性，研究者提出双特异性ADC、联合疗法增强抗原表达、结构修饰提升肿瘤穿透性等策略，但仍需进一步探索耐药机制以开发更有效解决方案。  由于ADC的分子复杂性，其在释放有效载荷前需要穿越一系列细胞内通路，因此更容易受到细胞中多种不同耐药机制的影响，其中部分机制的特征尚未完全阐明。ADC经历复杂的细胞内运输过程，包括内吞作用、内体分选、溶酶体加工和有效载荷释放。这些复杂步骤具有高度动态性，且通常存在细胞类型特异性。尽管相关研究较少，但临床前研究往往难以捕捉细胞内加工的复杂性，导致难以准确定位ADC耐药的确切驱动因素。目前已有少量假说针对细胞内摄取和加工过程的改变进行探讨。研究表明，细胞屏障增强引发的渗透性降低和异常内体运输，以及摄取途径改变可能阻碍ADC进入细胞。研究者发现ADC通过小窝蛋白-1（CAV1）包被的囊泡进行递送，这种有别于常规网格蛋白介导途径的摄取机制可能导致摄取效率低下。此外，溶酶体pH值变化也被证实会抑制溶酶体加工并干扰有效载荷释放。除了上述关于ADC各组成要素的挑战外，大规模商业化生产ADC也是一项艰巨而复杂的任务。这种复杂性主要源于药物有效载荷的合成：这类分子来源于天然产物，具有复杂的分子结构，且由于高毒性特性必须在高度密闭的设施中进行生产。复杂的工艺自然对应着更高的生产成本。另一个障碍是传统的偶联工艺——通过抗体表面暴露的氨基酸残基（通常为赖氨酸和半胱氨酸）实现抗体组分与药物的连接。但该方法的缺陷在于药物可能随机偶联到多个潜在位点，导致偶联特异性不足并产生批次间差异。此外，有效载荷的随机偶联会导致药物-抗体比率（DAR）波动，降低产品的一致性和均一性。因此，开发应对这些挑战的创新策略已成为全球药物化学家面临的重要课题。ADC给药后的系统稳定性对治疗效果至关重要。为应对代谢稳定性（即完整性）相关的挑战，目前正在开发多种策略以增强ADC稳定性并延长其系统半衰期。系统清除机制（包括肾小球过滤和网状内皮系统摄取）会缩短ADC在血液中的有效作用时间。理想ADC应在特异性、疗效和安全性之间取得平衡，这在很大程度上取决于抗体与细胞毒性药物之间连接子的设计、化学性质和结构。连接子的选择具有关键作用。理想连接子应在循环中保持稳定，仅在到达肿瘤部位后释放药物。虽然可裂解连接子的设计目的是在肿瘤微环境中释放有效载荷，但其可能在循环中过早断裂，导致系统毒性。相比之下，非可裂解连接子由于需要在ADC内化后通过溶酶体降解抗体和连接子才能释放细胞毒性有效载荷，因此通常表现出更高的血浆稳定性。这一特性不仅能降低系统毒性，还能提供更宽的治疗窗口。抗体组分对ADC稳定性和特异性也起着关键作用。抗原特异性低的抗体可能与健康细胞发生交叉反应，导致脱靶毒性和过早清除。在免疫球蛋白类别中，IgG（尤其是IgG1）因其相较于抗体片段更长的半衰期而成为ADC设计的首选。虽然抗体片段更有利于肿瘤渗透，但由于半衰期较短，通常需要进行聚乙二醇化修饰以延长循环时间。双特异性抗体的使用也为克服肿瘤特异性、抗体吸收和加工等挑战提供了潜在解决方案。通过优化ADC设计实现延长循环时间、靶向药物释放和最小化脱靶效应，可显著提升癌症治疗效果。与此同时，药物抗体比率（DAR）是影响ADC性能的关键参数，包括其效力、稳定性和药代动力学特性。虽然较高的DAR通常意味着更强的细胞毒性药物载荷从而提升药效，但已有研究表明，与低DAR的ADC相比，DAR过高的ADC可能表现出更快的肝脏清除率、更低的耐受性和更狭窄的治疗窗口，最终可能降低治疗效果。这是由于高DAR的ADC分子结构庞大，阻碍了肾脏清除途径，转而通过肝脏代谢消除。更高的DAR还会增加ADC的疏水性，并加剧链间半胱氨酸聚集倾向。此外，高DAR会显著增加全身毒性风险，因为分布于全身的过量细胞毒性药物在杀伤靶向肿瘤细胞的同时可能损伤健康组织。本质上，DAR的升高通常与脱靶效应和毒性风险的增加相关。通过选择最佳偶联位点和在不稳定连接区域引入空间位阻等修饰手段，已被证实能有效增强ADC的稳定性。选择具有空间位阻的偶联位点可使抗体产生空间屏蔽效应，减少药物的提前释放。Fc工程改造和定点偶联技术等策略在优化ADC药代动力学方面展现出良好前景：Fc工程通过延长循环时间改善药物半衰期，而定点偶联则通过精确控制药物结合位点提升稳定性。最后，选择合适的肿瘤特异性抗原对ADC疗效至关重要。实体瘤中常用靶点包括HER2、Nectin-4和TROP2等。针对突变抗原（如特定EGFR突变）设计的ADC具有更高特异性，因为这些突变蛋白因泛素化降解机制而稳定性较低。通过工程化改造获得靶向致癌驱动突变蛋白的抗体构建ADC，可显著提高肿瘤靶向性和治疗效果，其特异性可与酪氨酸激酶抑制剂等选择性小分子药物相媲美。12. ADC的临床成功及其对现有癌症治疗的影响ADC在制药行业取得了显著的临床成功，尤其在血液系统恶性肿瘤和特定实体瘤治疗领域。相较于传统化疗，ADC能够选择性靶向并清除癌细胞，同时具有更低的全身毒性。随着FDA批准的曲妥珠单抗-美坦新偶联物（T-DM1）和维妥珠单抗（brentuximab vedotin）等ADC药物显著延长患者生存期，这类药物正日益被视为肿瘤治疗领域的变革性疗法。ADC相比传统疗法具有多重优势：其高特异性可最大程度减少脱靶效应，保护健康细胞并降低骨髓抑制和全身炎症等化疗常见副作用；模块化设计为优化抗体、连接子和细胞毒性载荷各组分提供了灵活性，支持高度靶向性和可定制化治疗；通过ADC技术平台，成功解决了奥瑞他汀类和美登素类等强效细胞毒素因毒性问题无法用于全身化疗的困境。这种创新策略不仅为耐药性癌症治疗带来新希望，更为满足未竟临床需求的疾病管理开辟了新途径。尽管优势显著，ADC要完全释放治疗潜力仍面临挑战：肿瘤细胞抗原表达异质性、药物耐药性问题以及循环系统内稳定性与疗效维持难题，导致部分ADC候选药物临床进展受阻。虽然更稳定的连接子设计和抗体优化技术已部分缓解这些问题，但要确保在广泛患者群体和癌症类型中维持稳定疗效，仍是亟待突破的关键瓶颈。ADC革新癌症治疗的潜力主要体现在其与其他疗法（如免疫检查点抑制剂）的协同作用，以及增强免疫介导的肿瘤细胞杀伤能力。例如，临床前模型显示ADCs与PD-1/PD-L1抑制剂的联用具有协同效应，这种联合疗法通过结合靶向细胞杀伤与免疫激活的双重优势，为治疗策略开辟了新路径。此外，针对肿瘤细胞表面两个或多个不同抗原的双特异性或多特异性ADCs的研发进展，有望进一步提升治疗特异性并降低耐药风险。随着ADC技术的持续突破，新一代ADCs将可能实现更高的精准度、更低的脱靶毒性，并在更多癌症类型中展现广泛适用性。我们认为，ADC正在成为靶向肿瘤治疗的基石，或将逐步替代传统化疗或与之形成互补。随着ADCs技术的迭代升级，将其整合至多模式癌症治疗方案中，有望显著改善患者预后，在疗效与耐受性之间实现现有疗法难以企及的平衡。总体而言，尽管ADC仍存在局限性，但其独特的作用机制与不断优化的技术设计预示着该领域将在现代肿瘤学中占据愈发重要的地位，未来数十年或将重塑癌症治疗格局。这一前景突显了持续开展ADC领域基础研究与临床开发的重要性，唯有如此方能充分释放其治疗潜力。13.结论ADC是创新性癌症治疗方式，通过将抗体部分与药物有效载荷相结合，展现出成为下一代抗癌药物的巨大潜力。与传统抗癌药物相比，其最显著优势在于具有更高的靶向特异性。目前越来越多新型双特异性和多价ADC正被快速开发，极大扩展了ADC的应用范围。尽管已有很多ADC成功上市且更多候选药物处于临床试验管线中，但该技术仍有诸多改进空间以提升疗效，例如开发创新型连接子技术、设计新型抗体结构域，以及拓展ADC的靶向能力至肿瘤微环境等领域。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，多年来已经开发了各种针对癌症的疫苗，包括基于细胞的、基于核酸的和基于病毒的癌症疫苗。尽管许多疫苗在体内和临床研究中都显示出有效性，并且一些已经获得FDA批准，但仍需克服重大限制：（1）开发一种针对特定癌症的通用疫苗是困难的，因为不同个体的肿瘤具有不同的抗原，（2）肿瘤抗原可能与身体自身的抗原相似，（3）存在癌症复发的可能性。因此，开发能够区分肿瘤和身体抗原的个性化癌症疫苗是不可或缺的。本文全面回顾了不同类型的癌症疫苗，并强调了开发高效癌症疫苗所需的重要因素。此外，还讨论了其他技术在癌症治疗中的应用。最后，提出了一些见解和结论，例如使用冷等离子体和癌症干细胞在开发未来的癌症疫苗中的可能，以解决癌症疫苗开发过程中的主要限制。 1.引言 疫苗自18世纪末首次发现以来，一直被用来保护人类健康免受传染病的侵害。最近针对冠状病毒疾病的疫苗的成功，鼓励研究人员将这些基本概念扩展到治疗癌症。主动免疫疗法或疫苗接种是有效肿瘤根除的重要方面，治疗性癌症疫苗可以通过两种主要方式刺激和增强：(1)使用非特异性促炎分子和佐剂来改善体内已有的抗肿瘤免疫反应，或(2)在宿主中诱发针对特定肿瘤抗原的新免疫反应。理想的肿瘤抗原和佐剂通常一起递送，以刺激适应性免疫系统，目的是实现树突状细胞(DCs)的最佳激活和效应T细胞的持久反应。天然免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞和吞噬细胞，在肿瘤识别和抑制中也扮演着重要角色。然而，免疫抑制性肿瘤微环境(TME)是肿瘤浸润免疫细胞和免疫疗法的关键障碍之一。治疗性癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的结合已成为提高患者反应率和生存率的新兴方法。癌症疫苗的有效性仍在众多临床试验中受到审查。在这篇综述中，我们探讨了TME中癌症免疫周期的机制，并分析了主要癌症疫苗平台的有效性和局限性。此外，我们为即将到来的癌症疫苗提供了新的见解，以提高其效率。 2.肿瘤微环境和癌症疫苗机制 TME包含大量免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NKs)、树突状细胞(DCs)、淋巴细胞B细胞和淋巴细胞T细胞(CD4+和CD8+)，它们在抗原呈递过程和可能导致肿瘤进展的癌症免疫周期中发挥关键作用；因此，针对TME及其组成部分被认为是有效癌症疫苗的主要机制。TME中的巨噬细胞、B细胞和DCs是被称为抗原呈递细胞(APCs)的一些例子。这些细胞通过摄取来自疫苗注射的各种途径(皮下、皮内或肌肉内)或来自死亡癌细胞的抗原，促进抗原特异性免疫细胞的相互作用和激活（称为启动过程）。然后，APCs使抗原在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类上呈现（在人类中，人类白细胞抗原(HLA)是MHC系统）。这之后是APCs从TME迁移到淋巴结以激活效应T细胞(CD4+或CD8+)。淋巴结是次级淋巴器官(SLOs)之一，为免疫细胞提供三维结构，增强抗原负载APCs与效应T细胞之间的相互作用，以激活T细胞并产生有效的免疫反应。在淋巴结内，成熟的APCs可以通过向效应T细胞呈现MHC-抗原复合物来激活效应T细胞。这之后是激活的效应T细胞渗透到TME中，在那里T细胞可以识别目标癌细胞并将它们杀死。SLOs中的初级(静止)B细胞滤泡(称为滤泡B细胞)在抗原结合到初级滤泡上后被激活；激活后，初级滤泡B细胞变成次级滤泡，包含充满B细胞芽的中央生发中心(GC)，并随着抗体成熟，这些B细胞芽经历几个阶段和过程，与抗体成熟相关。这些步骤导致淋巴细胞分化为效应T(Teff)细胞和B记忆细胞，以这种方式，它们迁移到TME，导致肿瘤细胞的根除。然而，根据对TME的研究，抗肿瘤防御的产生不仅在SLOs中发生，而且还直接在称为三级淋巴结构(TLS)的SLO样聚集体中，这些结构通过细胞因子的积累，包括CXCL13、RANKL和白细胞介素(IL)-7，在TME中发展。这些结构与淋巴组织诱导细胞(LTi)以及其他细胞，特别是DCs、NKs或CD8+ T细胞相互作用，导致分泌对高内皮静脉(HEV)形成(介导淋巴细胞向淋巴结的迁移)、免疫细胞招募和细胞保留至关重要的因素。这些前述因素共同招募和激活LTi细胞。所有这些阶段，从抗原吸收到癌细胞死亡，都被认为是癌症免疫周期的一部分，将在下一节中详细讨论。 在TME中存在的各种APCs中，与B细胞和巨噬细胞相比，DCs是最有效的APC。这些细胞通过两种通用机制介导与抗原启动相关的过程：规范(交叉抗原呈递)和非规范(交叉抗原修饰)途径。规范途径更为常见，基于抗原蛋白的类型(外源性/内源性)。APCs(如DCs)可以通过两条主要途径驱动规范抗原呈递机制：(1)细胞质或蛋白酶降解途径(专指内源性蛋白呈递)，在这一过程中，内源性抗原蛋白，无论是来自蛋白酶体还是吞噬体，都被DCs的细胞质蛋白酶切割成肽片段，然后由MHC-I分子呈递并激活效应T细胞，特别是针对肿瘤细胞的抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)，或(2)空泡或内吞途径(专指外源性抗原蛋白呈递)，在这一过程中，DCs通过内吞作用摄取外源性抗原蛋白，形成称为内吞体的特殊囊泡结构，然后将与溶酶体融合，在溶酶体的低pH值下降解这些抗原为肽片段，然后呈递在MHC-II分子上，并激活CD4+ T细胞，导致CTL激活、功能和存活。除了上述规范途径外，几篇论文还证明了非规范/交叉修饰途径的存在，通过这些途径，APCs如DCs并不自己呈递抗原。相反，来自其他相邻DCs或肿瘤细胞(供体细胞)的抗原-MHC复合物被转移到APCs，如DCs(受体细胞)，尽管有各种机制，包括咀嚼细胞吞噬、外泌体摄取和隧道纳米管，并在没有进一步的抗原处理阶段的情况下激活相关的效应T细胞。这些过程在图1中显示。 图1. 抗原呈递细胞（APC）呈递机制。肿瘤微环境及其组分：肿瘤微环境（TME）包含多种抗原交叉呈递过程，这些过程可以由树突状细胞通过规范/交叉呈递途径（A）或非规范/交叉修饰途径（B）介导。交叉呈递机制有两种方式：细胞质或蛋白酶体降解（A-1）和通过空泡途径（A-2）。在细胞质途径中，来自内吞体或吞噬体结构的抗原向细胞质移动，形成酸性细胞质蛋白酶体，将抗原切割成更短的肽段。这些肽段有两个命运：(1) 被运送到内质网（ER）进行进一步的修饰。修饰后的抗原肽随后装载到MHC类I分子上，并移动到细胞表面。(2) 切割后的肽段在返回吞噬体/内吞体之前装载到MHC I上，然后移动到细胞表面。在空泡途径中，与抗原装载到MHC类I有关的前述事件在吞噬体或内吞体中发生，随后装载抗原的APCs（DCs）向次级淋巴器官（SLO）移动，以激活T细胞。在非规范/交叉修饰途径中，抗原-MHC复合物在另一细胞上形成，然后转移到APCs，如DCs，DCs最终能够通过不同途径激活相关的效应T细胞：咀嚼细胞吞噬（B-1）、外泌体摄取（B-2）和隧道纳米管（B-3）。在咀嚼细胞吞噬中，包括来自一个细胞（供体）的质膜和细胞质的膜片被转移到另一个细胞（咀嚼细胞）；APCs通过外泌体摄取依赖于外泌体（在内吞过程中形成的小膜基小泡）转移特定物质的能力（这些物质不仅可以被APCs进一步降解和处理以在MHC分子上呈递，而且也可以被视为功能性的MHC-肽复合物）；隧道纳米管是来自细胞膜的长突起，它们不仅促进细胞表面分子和细胞质内容物的交换，而且可以通过在远距离细胞间转移MHC分子来介导远程DCs之间的交叉修饰。 3.癌症免疫周期  癌症免疫周期包括一系列重复和放大的阶段，每个阶段都由特定的细胞因子和趋化因子介导，这些因子将导致有效的抗癌免疫反应和癌细胞死亡。这些阶段如下：(1) 在第一步中，肿瘤形成过程中产生的新抗原从死亡的肿瘤细胞中释放出来，然后由树突状细胞(DCs)携带到邻近的引流淋巴结(DLN)。(2) 第二阶段开始时，DCs通过MHC-I和MHC-II分子将获得的抗原呈递给T细胞，形成MHC-I和MHC-II-抗原复合物，这是通过前面讨论的交叉呈递途径实现的。(3) 效应T细胞随后能够识别抗原并被激活。(4) 存在于DLN中的识别抗原的肿瘤特异性T细胞，表达特定的趋化因子受体以及细胞粘附分子，这些分子对于T细胞的迁移和渗透到肿瘤组织是必需的。借助这些表达的分子，T细胞离开DLN并通过血液流向肿瘤组织移动。(5) 接着是T细胞渗透到肿瘤组织，(6) 通过T细胞受体(TCR)识别和结合MHC-I-抗原复合物，这刺激DCs分泌各种细胞因子，最终激活T细胞。(7) 这些过程共同作用，最终通过各种机制杀死癌细胞，包括直接肿瘤溶解和脱颗粒、抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性；然而，最近报告了一条新的T细胞杀死癌细胞的途径，这条途径独立于MHC-I的抗原呈递及其被T细胞识别。考虑到癌细胞死亡时会释放额外的新抗原，引发免疫反应，并从第一阶段重新开始，新抗原由细胞因子上调，这种机制被称为癌症免疫周期，其步骤在图2中有更详细的展示。癌症患者的癌症免疫周期出现故障，因为至少其中一个步骤是有缺陷的。考虑到这一点，治疗癌症的有效方法之一将是开发能够针对癌症免疫周期中的细胞因子的治疗性疫苗。（图2） 图2. 癌症免疫周期阶段及其调节。癌症免疫周期阶段由广泛的细胞因子和趋化因子调节，其中一些刺激癌症免疫周期以杀死癌细胞，而一些细胞因子则作为抑制剂并降低这些过程。刺激性细胞因子协同作用以介导T细胞激活。激活的T细胞进入肿瘤微环境(TME)并诱导肿瘤杀伤。每个阶段都受到各种细胞因子和其他分子因素的调节，如图中绿色表示诱导剂，红色表示抑制剂。 4.逃避癌症免疫周期 宿主免疫系统由监视部分和保护部分组成；免疫监视系统不断地检查身体，并增强抗肿瘤免疫反应，以识别和摧毁任何存在的肿瘤细胞，最终防止癌症进展。一般来说，癌细胞经历各种遗传和表观遗传修饰，导致特定抗原的产生；这些抗原随后刺激T细胞识别和杀死癌细胞；然而，随着肿瘤细胞的生长，它们开始发展出称为“癌症免疫编辑”的机制来逃避宿主免疫监视系统；因此，免疫系统无法消除这些癌细胞。另一方面，从正常免疫系统的保护部分来看，它由称为“免疫检查点”的特定蛋白质分子组成，这些分子存在于免疫细胞（包括T细胞）的表面，以及它们相应的配体受体，这些受体存在于癌细胞上。这些免疫检查点通过使用基于单酪氨酸的信号基序（特别是免疫受体酪氨酸基序抑制和开关基序）来诱导抑制信号，防止产生任何强烈的免疫反应信号，这些信号会破坏体内的健康细胞。通过这种方式，免疫检查点倾向于保护正常细胞。PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA和TIGIT是一些常见的免疫检查点，它们介导T细胞对肿瘤细胞的识别；当T细胞表面存在的免疫检查点蛋白识别并结合到癌细胞的受体时，它们向T细胞发送一个“关闭”信号，从而防止免疫系统根除癌细胞。考虑到这一点，一些癌细胞倾向于通过上调细胞表面免疫检查点分子的负信号来促进癌症生长和转移，并抑制T细胞激活，而其他一些肿瘤细胞可能激活免疫抑制性白细胞（如嗜酸性粒细胞）来创造一个TME，该TME无法很好地响应抗肿瘤免疫分子。此外，一些肿瘤内在基因，包括YTHDF1，降解MHC-I复合物分子，导致免疫逃逸。根据前面讨论的癌症疫苗的作用机制以及癌症免疫周期，成功癌症疫苗设计的一些关键因素是选择适当的肿瘤抗原以刺激有效的T细胞，实现在APCs中足够的抗原浓度以激活它们，以及通过激活效应T细胞（即CD4+和CD8+）来诱导持久的免疫原性反应。在这方面，选择正确的抗原及其递送方法将非常重要，这将在以下小节中详细讨论。 5.肿瘤抗原分类 肿瘤抗原是在肿瘤细胞中产生的任何抗原物质，它们触发免疫反应，并作为肿瘤识别的生物标志物，可用于开发新的治疗性癌症疫苗。肿瘤抗原可能出现在与蛋白质合成和降解相关的阶段。根据HLAs的表达模式，肿瘤抗原可以分为两个一般组：肿瘤相关抗原（TAAs），其中抗原由主要在肿瘤细胞上表达的HLAs呈递（主要是HLA类I），以及肿瘤特异性抗原（TSAs，或新抗原），其中抗原由不仅在癌细胞上表达，也在正常细胞上表达的HLAs呈递。根据抗原的分子结构和来源，TAAs可以归入以下类别之一：分化（组织谱系）、肿瘤胎儿、癌症-睾丸、异常糖基化和表达、过表达，以及肿瘤病毒抗原。另一方面，TSAs根据观察频率被分类为共享（公共）和个性化（私人）新抗原；共享（公共）新抗原来自特定于肿瘤的变异，这些变异在其他患者/不同恶性肿瘤中观察到，而它们的个性化（私人）对应物是来自不太可能在其他人群/恶性肿瘤中发生的肿瘤特异性变异；因此，个性化新抗原是患者特定的。迄今为止，已经识别出一些公共新抗原，而私人新抗原通常来自非复发的驱动/乘客突变，并构成大多数已知的新抗原。此外，根据抗原来源，抗原可以是规范的（来自蛋白质编码基因），或非规范的（来自非蛋白质编码基因）；在规范抗原中，抗原在蛋白质编码基因的开放阅读框（ORFs）内表达，如许多与癌症相关的基因的过表达，包括p53、癌症/睾丸抗原（CTAs）和人类端粒酶逆转录酶。非规范抗原在ORFs之外表达，可能来自抗原在各个水平上的变异，如基因组、表观基因组、蛋白质组、转录组、翻译和抗原处理水平（内含子保留、选择性剪接、密码子读穿和非规范/非AUG翻译启动水平）。肿瘤抗原分类及其属性在图3中总结。 图3. 肿瘤抗原分类。总体而言，肿瘤抗原被分类为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，每一类又细分为几个类别。每个类别根据以下几个方面进行比较：(1) 肿瘤特异性（指特定的免疫反应针对并特异地与肿瘤细胞或其抗原发生作用，同时不伤害正常细胞的程度；因此，高肿瘤特异性是所期望的），(2) 中枢耐受（免疫系统识别肿瘤抗原与自身抗原，在其体内发育过程中消除癌细胞而不对自身抗原产生免疫反应的机制。因此，高中枢耐受是所期望的，这意味着免疫系统对自身抗原表现出强大的耐受水平，包括那些出现在正常细胞和组织上的抗原，并能更好地识别它们），(3) 免疫原性（指癌细胞激发宿主免疫系统免疫反应的能力。这种免疫反应可以涉及免疫细胞的激活，以及对肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的抗体产生；因此，高免疫原性是一个期望的因素），以及 (4) 普遍性（这显示了肿瘤抗原在患者中出现的普遍程度或罕见程度）。 除了抗原类型外，确定一种有效的肿瘤抗原递送方法给APCs不仅可以使抗原介导的APC靶向更加选择性，并诱导T细胞激活，还可以减少系统毒性。由于不同类型的抗原具有不同的物理属性，诱导最佳免疫反应主要取决于选择合适的递送系统[23]。一些主要的递送方法包括使用细胞、抗原、肽、核酸和基于病毒的方法，每种方法将在以下各节中详细讨论。 6.不同的癌症疫苗平台 6.1. 基于肽的疫苗 在基于肽的癌症疫苗中，通常使用20-30个氨基酸来制造广泛的肽，以激活患者的免疫系统，使他们能够通过增强特定肿瘤的T细胞介导的免疫反应来识别和杀死肿瘤细胞，即通过MHC类I和II分子分别激活CD8+和CD4+ T细胞。这些肽通常属于TAAs或TSAs（包括癌症/睾丸抗原和新抗原），用于设计个性化疫苗。基于肽的癌症疫苗不仅可以激活B细胞和T细胞介导的免疫反应，还可以诱导持久的杀瘤效果；然而，为了引发有效的抗肿瘤T细胞反应，癌症疫苗通常递送包括TAAs和TSAs在内的混合肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽的鉴定和发现已在其他评论中讨论。与短肽相比，合成长肽（SLPs）在激活T细胞反应方面更强，因为SLPs需要被APCs处理，并且可以激活细胞毒性CD8+ T细胞和CD4+ T辅助细胞反应。由于免疫原性低，基于肽的疫苗通常与免疫佐剂配制而成。FDA和EMA已批准用于人类的佐剂，包括铝盐、MF59、佐剂系统和CpG 1018。其他正在研究的佐剂包括聚肌苷酸-聚胞苷酸与聚赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的（poly-ICLC）、葡萄糖基化脂质A、咪唑喹啉、CpG寡脱氧核苷酸、环二核苷酸等。为了进一步提高肽抗原的免疫原性，杂合肽，即经过修改的肽的版本，通过替换具有类似生化属性、整体结构和功能与原始氨基酸序列相比的表位序列中的氨基酸残基；这称为保守氨基酸替代，以增强它们与MHC分子的结合亲和力；通过这种方式，它们可以诱导针对特定抗原的增强免疫反应，使杂合肽成为疫苗开发和免疫疗法的潜在工具，用于癌症等疾病。考虑到游离肽在体内的半衰期短和稳定性差，肿瘤抗原肽通常被纳入其他递送系统中。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米颗粒和脂质体是抗原肽和佐剂的两个代表性递送系统，因为它们已被证明是安全的。Varypataki、Jiskoot等人的比较研究表明，装载SLP的PLGA纳米颗粒和阳离子脂质体比角鲨烯或Montanide基乳液更能在体内刺激T细胞反应。两种载体都可以保护肽免受降解，并促进树突状细胞摄取和淋巴结转运。 在过去十年中，在临床试验中评估的脂质体疫苗包括Tecemotide、DepoVax、ISCOMATRIX、Lipo-MERIT等；然而，它们都没有改善患者的存活率。除了合成纳米颗粒外，树突状细胞衍生的外泌体（DEXs）可以通过向其他免疫细胞转移MHC/肽复合物并直接或间接刺激T和NK细胞，在肿瘤免疫学中发挥重要作用。装载抗原肽的DEXs已作为癌症疫苗在临床试验中进行了评估，但未能在晚期癌症患者中产生足够的适应性免疫。尽管如此，DEXs仍然是组合疗法的一部分的希望。 6.2. 重组（病原体）疫苗：病毒和细菌基础疫苗 重组病毒/细菌疫苗主要分为三大类：(1) 灭活疫苗（使用在实验室培养后被杀死的病毒/细菌），(2) 减毒活疫苗（病毒/细菌被削弱但未完全杀死），以及 (3) 亚单位疫苗（使用类似病毒/细菌蛋白的部分）。所有重组疫苗都基于通过重组/选择方法将重组基因（如编码TAAs、细胞因子或共刺激分子的基因，这些基因被插入到病毒/细菌基因组中）输送到APCs中，以刺激适当的抗肿瘤免疫反应，并通过激活先天和适应性免疫系统来实现。病毒/细菌基础疫苗可以提供有效且持久的免疫反应。这些疫苗通过两种主要机制靶向APCs并启动免疫反应：(1) APCs的间接感染，通过病毒感染介导的细胞损伤发送危险信号以及共刺激分子来激活骨髓中的APCs，以及 (2) APCs的直接感染，基于MHC途径中的抗原处理。后一种机制有助于重组病毒疫苗的修改，以增强抗原呈递。其中一些修改基于表达编码MHC类I限制性肽的最小水平的基因，向编码抗原的基因中插入内体/溶酶体分选信号，以及使用痘病毒激活T细胞，或用作携带特定共刺激分子或细胞因子的载体。最近有效的细菌基础癌症疫苗之一由Wu等人开发；这些研究人员使用了减毒鞭毛细菌（鼠伤寒沙门氏菌株），涂覆有能够结合负电荷抗原的带正电荷的树状大分子纳米颗粒，并且细菌通过基因突变变得不那么免疫原性。 6.3. 基于细胞的疫苗：树突状细胞（DCs）、干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法 治疗性基于细胞的疫苗基于体外通过病毒肽、基因或使用基因修饰的肿瘤细胞（杀死的肿瘤细胞）激活APCs（如NK细胞或DCs）。在这方面，基于细胞的疫苗可以被分类为肿瘤细胞疫苗和免疫细胞疫苗。在肿瘤细胞疫苗中，整个肿瘤细胞被用作疫苗的来源，其中包含整个TAAs，包括CD4+和Cd8+ T细胞的表位。全细胞癌症疫苗目前正在进行临床试验。使用全肿瘤细胞作为疫苗，其中包含所有可能的抗原，而不是蛋白质/肽肿瘤抗原，不仅消除了识别理想靶标抗原的需要；此外，可以同时针对几种肿瘤抗原，这将诱导对更多肿瘤细胞的进一步免疫反应。然而，仍然需要一种刺激/刺激因子来促进APCs对抗原的吸收过程，以从先天和适应性免疫系统中招募细胞。考虑到这一点，基于细胞的疫苗已经通过基因或通过辐射进行了修改，以便能够在宿主中分泌细胞因子，而不需要进一步增殖。大多数最近开发的癌症疫苗都是基于使用全细胞如DCs，这影响免疫系统中细胞的功能。DCs在抗原吸收和呈递过程中的重要性，以及通过DCs表面存在的广泛受体介导的T细胞激活，包括那些用于抗原吸收、抗原呈递、共刺激分子、细胞因子受体、环境传感器受体、细胞因子产生相关受体以及趋化因子受体，已经使DCs成为开发基于免疫细胞的癌症疫苗中最常用的免疫细胞。为了提高DCs在抗原吸收和T细胞激活中的效率，研究人员已经开始使用干细胞来开发更好的基于细胞的癌症疫苗。干细胞在癌症疫苗领域的应用始于胚胎干细胞（ESCs）；考虑到ESCs通常来自无关供体，它们表达不匹配的MHC和次要组织相容性（miH）抗原（这些是由正常自身蛋白衍生的肽，人类中由HLA呈递），如果移植到宿主中，它们将引起异免疫反应。尽管ESCs表达少量的HLA-I 和几乎没有HLA-II和共刺激分子，但这种数量足以刺激人类ESCs的细胞毒性T细胞介导的异种排斥反应。在对人类ESC系进行表征之后，并考虑到全细胞疫苗能够同时传递多种肿瘤胎儿抗原，以及它们对所有患者普遍适用，无论他们的HLA类型如何，研究人员已经开始将这些ESCs应用于全细胞癌症疫苗，以制造基于ECS的癌症疫苗。使用异种人类ESCs作为可能的癌症疫苗在小鼠和大鼠模型上进行测试，研究发现人类ESCs产生了适度的杀瘤效果，而在使用同种异体或自体ESCs的情况下，他们观察到更强的肿瘤抑制效果。然而，考虑到人类ESCs被注入到小鼠体内，前述免疫反应可能是由于人类ESCs和小鼠细胞之间的MHC抗原不兼容，而不是ESC系；此外，ESCs诱导的肿瘤形成阻碍了它们作为有效的癌症疫苗用于临床应用。这些问题促使研究人员转向使用诱导多能干细胞（iPSCs），因为它们在基因表达和表观遗传特征方面与ESCs非常相似。然而，iPSCs也有一定的肿瘤形成性。已经有多种方法被报道用于克服它们在开发基于干细胞的疫苗时的肿瘤形成性：完全分化或从培养中完全消除残留iPSCs；干扰肿瘤进展基因以防止残留细胞形成肿瘤；以及在患者体内最初形成肿瘤后的肿瘤检测和消除。鉴于此，大多数最近的iPSCs工作都使用辐射来消除培养中残留的iPSCs，并强烈防止畸胎瘤形成和进一步iPSC介导的肿瘤形成。早期研究对iPSCs转染到小鼠结肠癌表明，尽管iPSCs能够诱导对癌细胞的细胞因子，但没有观察到肿瘤排斥，表明iPSCs需要修改才能诱导对肿瘤细胞的强烈免疫反应；例如，考虑到自体iPSCs与其异种对应物相比具有更准确的肿瘤抗原，它们可以是开发抗癌疫苗的更好选择，因为它们可以最小化异免疫；此外，为了增强它们对癌症的免疫反应，可以与它们一起使用免疫刺激佐剂（如TLR9）。Kooreman等人使用相同的策略来产生针对胰腺导管腺癌的iPSC疫苗，其中自体iPSCs受到刺激，随后添加CPG（一种TLR 9佐剂）以改善免疫反应。另一项研究开发了来自T细胞急性淋巴细胞性白血病患者的自体iPSCs，并在DCs中装载；这在抑制急性淋巴细胞性白血病癌症方面显示出效果。在最近的一项研究中，iPSC衍生的外泌体与DCs（树突状细胞）一起孵化，他们在小鼠黑色素瘤模型中探索了它们的抗肿瘤效果；根据他们的结果，DC+外泌体疫苗显著抑制了体内模型的肺转移，诱导了长期T细胞反应，并没有改变正常细胞和小鼠器官的活性。同样，另一组通过将iPSCs和DC外泌体结合，制备了一种包含抗癌药物多柔比星的纳米结构；这提高了化疗药物的体内效果以及抗肿瘤免疫。除了iPSCs，研究人员还使用灭活的癌症干细胞（CSCs）来开发癌症疫苗。嵌合抗原受体（CARs）是重组蛋白受体，已被设计成使T细胞能够针对特定抗原以产生抗肿瘤免疫反应并杀死特定的肿瘤细胞。这些受体的一般结构由三个主要域组成：(1) 一个细胞外域，用于选择性结合特定的肿瘤抗原，(2) 一个跨膜域，以及 (3) 一个细胞内域；这三个域共同促进T细胞介导的肿瘤死亡，为T细胞的激活和攻击肿瘤细胞提供必要的T细胞信号。CAR-T细胞疗法的一个例子是基于使用表达CD-19的基因修饰自体T细胞。该疗法通过编码CAR的转基因重新编程患者的T细胞，能够识别和摧毁任何表达CD-19的细胞（正常和恶性），在与表达CD19的细胞结合后，CAR发出一个信号，增强T细胞的扩增、激活和目标细胞的消除，以及药物的持久性。前述机制可以在两种基于CAR-T细胞疗法的当前FDA批准的药物中看到，即Tisagenlecleucel（用于治疗急性淋巴细胞性白血病）和Axicabtagene ciloleucel（用于治疗大B细胞淋巴瘤）。然而，仍有一些限制需要克服：存在抗原丢失的可能性，因此用CAR-T细胞治疗的患者可能部分表达抗原或根本不表达；另一个问题是肿瘤抗原可能由正常细胞表达。尽管检查点抑制剂和CAR-T细胞疗法的结合是一种新的治疗选择，但这种治疗可能仍然无法诱导有效的T细胞浸润，并可能导致在几种CAR-T细胞疗法中报告的细胞因子介导的毒性。这就需要寻找一种新的方法来优化基于CAR-T细胞疗法的癌症疫苗。 6.4. DC亚群及其在启动和激活T细胞中的作用 DC起源于骨髓中的巨噬细胞-DC前体（MDP），并产生共同的DC前体（CDP），然后分化成DC，它们包括各种类型的免疫细胞，根据它们的表现型、发育特征、组织分布以及转录相关特征，被分为三个主要组：经典/常规DC（cDCs）（包括cDC1和cDC2）、浆细胞样DC（pDCs）以及来源于单核细胞的DC（moDCs）。这些DC组各自分泌特定类型的细胞因子，专门用于启动和激活各种效应T细胞，并调节癌症免疫周期的特定阶段；因此，它们可以以不同的方式影响免疫反应的结果；例如，cDC1专门用于抗原启动以及它们对CD8+ T细胞的交叉呈递，随后通过MHC I信号识别。另一方面，cDC2主要参与将抗原交叉呈递给CD4+ T细胞，并通过对MHCII的识别，促进Th1、Th2和Th17的极化。根据单细胞分析，通过识别各种类型的cDC2亚群，DCs的复杂性进一步增加。pDC产生I型干扰素（IFNs），参与抗病毒和抗肿瘤免疫反应。最后，由炎症刺激的moDCs，分化并被招募到身体的炎症部位，如TME。在遇到抗原之前，DC不成熟，其特征是细胞内高表达MHC-II，低表达共刺激分子和趋化因子、细胞因子受体。然而，这些未成熟的DC通过交叉呈递或交叉修饰过程摄取抗原，并通过对各种途径，特别是受体介导的内吞作用，成熟为成熟的DC。由于它们表面存在各种类型的受体（图4），DC的成熟可以被不同的因素刺激，从单克隆抗体（mAb）到DC修饰，以及DC在成熟过程中发生的生理变化，使DC能够分泌广泛的刺激性细胞因子和其他化学分子，以阻断抑制信号，并增加共刺激分子、细胞因子产生和抗原呈递。然后，DC处理并呈递来自疫苗细胞的肿瘤抗原，通过在DC上形成抗原-MHC复合物，呈递给效应T细胞（CD4和CD8），T细胞用它们的T细胞受体（TCRs）与这个复合物结合。在成熟过程中，DC发生生理变化，导致表面MHC I和MHC II分子的表达增加，共刺激分子（如B7-1/CD80, ICAM-1/CD54, LFA-3/CD58和Tropomodulin1），趋化因子受体和细胞因子分泌，共同调节T细胞反应。此外，DC成熟导致内吞泡的pH值降低，导致蛋白质水解，肽-MHC分子向细胞表面的运输，以及抗原捕获能力的降低。在各种刺激性分子/受体的表达上调后，DCs向引流淋巴结迁移，与T细胞相互作用，诱导免疫反应，最终通过形成抗原-MHC复合物，将来自疫苗细胞的肿瘤抗原呈递给效应T细胞（CD4和CD8），使T细胞能够与DC表面呈现的这些复合物结合，并通过它们的受体（TCRs）激活；这个过程导致肿瘤被杀死。如果CD8 T细胞被有效激活，加上其他传统癌症治疗方法，如单克隆抗体、化疗和放疗，它们都可以协同作用，提高T细胞介导的肿瘤杀伤效果的效率。从这个角度来看，T细胞激活调节是在开发癌症疫苗时需要考虑的关键因素之一。T细胞激活由激活的DCs产生的广泛其他因素和信号调节，激动剂抗体，共刺激分子受体和共抑制剂（免疫检查点抑制剂）。然而，为了维持免疫稳态和自我耐受，以及减少/预防炎症和自身免疫疾病，必要时需要抑制刺激性信号的效果。在这方面，特定的分子，包括（1）表达Foxp3的异质性CD4+ T细胞亚群，称为调节性T细胞（Tregs），具有免疫抑制特性，以及（2）其他抑制性免疫细胞，如髓系来源的抑制细胞（MDSC），通过分泌各种抑制性细胞因子和分子（如TGF-β, IL-10和IL-35）发挥作用并抑制。化疗和放疗，如果以免疫调节剂量使用，可能会抑制T细胞激活。 图4. 癌症疫苗平台及其作用机制。所有讨论的疫苗平台都倾向于被抗原呈递细胞摄取，最终诱导并增强杀死癌细胞的T细胞介导途径。 6.5. 基于核酸的疫苗：DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗基于使用DNA或mRNA将基因传递给宿主APCs，以编码肿瘤抗原并产生抗原蛋白，从而使表达的肿瘤抗原诱导适当的免疫反应以杀死/抑制癌细胞。 6.5.1. 基于DNA的癌症疫苗 使用DNA癌症疫苗的历史可以追溯到1990年，当时Wolff等人研究了直接注射裸DNA到小鼠肌肉中的效果，结果在表达相应的蛋白质。在1998年，首次报告了DNA疫苗的人体试验，证明了DNA疫苗在治疗免疫缺陷病毒1型（HIV）中的效率。癌症DNA疫苗基于使用编码肿瘤抗原的细菌质粒来激活先天和适应性免疫反应。为了使DNA疫苗发挥作用，它们需要进入细胞核被转录成mRNA；然后，它们被运输到细胞质中被翻译成编码的抗原，然后通过抗原处理和呈递给CD8+ T（通过MHC I）和CD4+ T（通过MHC II）细胞来激活特定的免疫反应。DNA疫苗的作用机制是激活适应性和先天免疫系统。关于适应性免疫激活的机制，有三个主要途径：(1) DNA直接插入到体细胞，如肌肉细胞，然后翻译成抗原，并通过MHC-1分子直接呈递给细胞毒性CD8+T细胞；(2) DNA编码的抗原通过分泌或通过凋亡小体在体细胞中释放，然后通过吞噬作用和APCs处理释放的肽，并通过MHC II分子交叉呈递给CD4+ T细胞；以及(3) DNA直接转染到APCs中产生抗原（这将是内源性抗原）。这些内源性抗原然后被处理并通过MHC I和MHC II分子分别呈递给CD8+ T和CD4+ T细胞，以诱导适应性细胞免疫（通过激活CD8+ T细胞然后分化为CTLs）以及体液免疫（通过激活CD4+ T细胞）；这种DNA直接转染到APCs中，主要以皮内递送的形式进行，是DNA癌症疫苗的重要途径。转向由DNA疫苗介导的先天免疫激活途径，有许多因素调节上述途径，例如CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）二核苷酸，它们是细菌产生的质粒DNA中的免疫刺激性基序。这些基序通过与关键的先天免疫刺激因子之一，即Toll样受体9（TLR9）相互作用，参与刺激先天免疫激活。接着，TLR9识别细菌DNA中未甲基化的CpG基序，触发巨噬细胞、树突状细胞和B细胞的TLR介导的信号通路，涉及激活NF-κB、IRAK和MyD88信号通路，产生促炎细胞因子、趋化因子和免疫球蛋白。此外，DNA本身激活STING信号通路，这是控制DNA信号级联的主要途径，该途径在细胞质中独立于TLR发生。体内研究已证实，在缺乏STING途径的情况下，DNA疫苗无法诱导强大的适应性免疫反应。DNA疫苗提供了多种优势，包括高度特异性和安全性、编码广泛的抗原、生产成本低，以及易于运输和储存；此外，DNA疫苗具有较低的插入突变风险，DNA很少与宿主染色体结合。经过优化的DNA疫苗在临床前研究中表现出高效。然而，由于其免疫原性差，DNA疫苗在临床试验中的进展甚微。有几种优化策略来解决免疫原性差的问题，包括优化质粒元素（如Kozak序列、内含子和物种特异性密码子），使用强大的启动子序列进行高效转录（如改良的巨细胞病毒启动子），使用特定的佐剂（如胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CPG）基序、聚合物、纳米颗粒、脂质体和小分子激动剂），以及最后，修改肿瘤抗原的设计。 6.5.2. 基于mRNA的疫苗 体外转录的mRNA疫苗是在1984年使用含有质粒DNA模板、RNA聚合酶以及其他主要成分的体外转录系统中开发的mRNA疫苗的早期版本。尽管最初mRNA疫苗并非用于治疗目的，但早期研究，包括20世纪90年代关于基于mRNA的癌症疫苗的首次体外（使用脉冲RNA的DCs）和体内（在小鼠中）研究，为使用mRNA疫苗治疗疾病，包括癌症铺平了道路。随后的研究集中在使用脂质体将mRNA输送到细胞中，进一步证实了基于mRNA的疫苗的治疗效率，因为mRNA疫苗带来了广泛的好处，如耐受性（副作用可控且暂时）和无需基因组整合的需求（因为与DNA不同，mRNA无需进入细胞核）；因此，消除了插入突变的风险。开发基于mRNA的疫苗不需要使用任何病原体/病毒剂；因此，它是非感染性的。此外，mRNA疫苗易于降解（降低毒性风险），提供体液和细胞免疫，这对于抗肿瘤反应至关重要。此外，mRNA疫苗生产快速且成本低廉。有四种主要类型的转录mRNA：常规mRNA、自增强mRNA（samRNA）、转录增强RNA（tamRNA）和圆形mRNA（circmRNA）。这些体外转录的常规mRNA的一般结构与真核细胞中的天然mRNA相似，即由5'帽、5'和3'非翻译区（UTRs）、开放阅读框（ORF）和聚（A）尾组成。尽管这类mRNA疫苗具有优势，但一些缺点，包括mRNA的固有不稳定性、缺乏良好的生产规范、低蛋白表达效率、高免疫原性，以及与体内mRNA输送到细胞和重复注射剂量维持蛋白表达相关的困难，以及非靶向副作用，阻碍了其作为有效治疗疫苗的发展。考虑到这一点，近几十年来，人们为优化基于mRNA的疫苗做出了巨大努力，通过化学修饰、产品纯化和序列优化提高mRNA稳定性，降低其体外和体内免疫原性，例如5'端（自体）或5'帽（类似物）修饰，通过密码子优化、鸟嘌呤加胞嘧啶（GC）含量富集、保持3'聚（A）尾的长度在120-150个核苷酸内，并添加化学修饰的腺苷。另一种提高稳定性和蛋白产量的方法是开发基于RNA而非mRNA的其他类型的疫苗。例如，自增强RNA（saRNA）、转录增强RNA（taRNA）和圆形RNA（circRNA）在癌症疫苗领域带来了治疗益处。然而，为了使mRNA疫苗在临床应用中使用，它们应该受到酶降解的保护，成功地输送到目标细胞，随后通过内吞作用，并从内体逃逸以防止过早降解。mRNA复合物的物理化学性质应被考虑在内，因为它们影响目标细胞对mRNA的摄取机制。从这个角度来看，有效地将mRNA输送到目标细胞/组织是必要的。为了达到这个目标，已经开发了两种主要方法：(1) 通过电穿孔的体外DC转染，然后重新输注转染细胞，以及(2) 直接注射mRNA，有或没有载体。在第一种方法中，通过电穿孔将mRNA加载到DCs中（在不使用任何载体的情况下实现优化的体外转染）。在生成转染DCs后，它们将被重新输注到患者体内，作为自体疫苗的一部分并诱导免疫反应。由于能够启动适应性免疫反应以及抗体反应（通过向B细胞呈现完整抗原），DCs已经被大量关注，作为体外和体内mRNA疫苗输送的载体。 同样，皮内和淋巴结内注射在提供体内免疫方面是有效的。另一方面，物理方法（使用电穿孔或基因枪）增加了DCs对mRNA的摄取效率，但面临主要限制，这些限制阻碍了它们的进一步发展，例如增加细胞死亡，限制了对目标细胞的可及性；此外，使用基因枪，例如，只在小鼠模型中显示效率，而不是在人类模型或更大的研究规模中；电穿孔增加了免疫原性（只有在自增强RNA疫苗的情况下）。使用病毒载体进行mRNA输送有几种缺点，使它们成为不适当的载体；其中一些缺点包括差的体内效力，刺激由载体介导的免疫反应的可能性，对病毒载体的已有免疫力，以及生物安全问题。这些缺点导致科学家寻找其他mRNA载体，结果利用纳米颗粒，特别是脂质和聚合物基纳米颗粒，为mRNA输送开发了多样化、有效和安全的载体。其中一些基于脂质/聚合物的方法基于使用鱼精蛋白（阳离子肽），阳离子脂质，以及聚合物，包括树状大分子和壳聚糖，以及脂质纳米颗粒，这些颗粒与聚乙二醇（PEG）等其他聚合物结合以增加稳定性。在脂质载体的情况下，已经应用了胆固醇和膜中存在的其他天然脂质来提高疗效。基于脂质的输送载体不仅提高了mRNA输送的效率，并有助于选择性地靶向器官和/或细胞（通过调整脂质纳米颗粒中各种元素的比例），而且这样的脂质载体诱导了佐剂效应，正如一些最近的研究报告所示，脂质纳米颗粒诱导了强大的体内免疫反应，比AddaVax（一种常见的疫苗佐剂）具有更强的佐剂效力；此外，脂质纳米颗粒可以通过激活Toll样受体4（TLR4）信号通路增强mRNA癌症疫苗的抗肿瘤效力。mRNA疫苗可以通过多种途径给药，如皮下、皮内、鼻内、肌肉内、淋巴结内、瘤内和静脉注射等。利用mRNA对自体DCs进行体外工程被认为是肿瘤抗原传递的首选方法，但大多数用于开发mRNA疫苗的方法倾向于使用脂质纳米颗粒载体直接给药mRNA。基于mRNA的疫苗开发旨在诱导或增强有效的抗肿瘤免疫反应。给药后，mRNA通过APCs的细胞摄取进入细胞质，并经历抗原启动和MHC-抗原呈递级联反应，导致通过MHC-I和MHC-II介导的抗原呈递以及CD8+和CD4+ T细胞的激活。除此之外，CD4+ T细胞本身可以通过协同激活抗原特异性B细胞来诱导体液免疫反应，而这些B细胞可以作为APCs在通过MHC类II向B细胞呈递抗原后反过来激活CD4+ T细胞。 6.6.个性化癌症疫苗 个性化癌症疫苗是另一种旨在针对患者特定癌细胞的免疫疗法，基于他们独特的遗传档案来刺激患者的免疫系统更选择性地识别和攻击癌细胞。基于前面讨论的不同癌症疫苗平台，已经开发和使用了几种类型的个性化癌症疫苗，并在临床前和临床研究中使用，如基于肽、全细胞、核酸（DNA和mRNA）和新抗原的个性化癌症疫苗。开发个性化癌症疫苗有几个步骤：(1) 对患者的肿瘤进行基因组分析（以识别肿瘤特异性特征，如突变、新抗原和其他可以被免疫系统针对的特征）；(2) 抗原选择（基于基因组分析，选择肿瘤特异性抗原以包含在疫苗中）；以及(3) 疫苗配方（使用不同的方法制定疫苗，如来自肿瘤抗原的肽、装载肿瘤抗原的DCs、编码肿瘤抗原的DNA或RNA、新抗原或整个肿瘤细胞裂解物）。在个性化癌症疫苗给药后，疫苗中的抗原通过APCs呈递给免疫细胞，并刺激对携带目标抗原的癌细胞的免疫反应。传统癌症疫苗和个性化癌症疫苗都有助于癌症免疫疗法的不断发展，个性化疫苗在改善具有特定肿瘤特征的患者的治疗结果方面显示出前景，因为这种类型的疫苗提供了一种高度针对性和个体化的癌症免疫疗法方法，与其可能针对广泛患者群体中的常见抗原或与癌症相关的抗原的传统对应物相比。个性化疫苗旨在针对患者的特定癌细胞，基于肿瘤的遗传和抗原谱，并刺激免疫系统识别和攻击这些特定的癌细胞，而传统癌症疫苗可能针对几个癌症患者共享的常见抗原或与某些类型的癌症相关的抗原，但不是针对个体的肿瘤。此外，个性化癌症疫苗的抗原是基于患者肿瘤的基因组分析和新抗原选择的，而传统癌症疫苗中的目标抗原在特定类型的癌细胞中更广泛地表达，或者可能与癌症相关但不是针对个体的肿瘤。考虑到生产过程，个性化癌症疫苗有一个定制的生产过程，（测序患者的肿瘤DNA/RNA，识别特定突变，合成或选择基于这些突变的肽或抗原，并制定疫苗）；然而，传统类型是使用标准化的抗原或不针对患者肿瘤的抗原来源生产的。个性化癌症疫苗激活针对患者特定癌细胞的选择性免疫反应；然而，传统疫苗诱导对常见癌症抗原或与特定类型的癌症相关的抗原的一般免疫反应。个性化癌症疫苗通常用于精准医疗，其中治疗根据患者的独特特征量身定制。虽然个性化癌症疫苗在癌症治疗中提供了有希望的潜力，但也有一些需要解决的挑战；例如，它们需要复杂的过程（如肿瘤基因组测序，特定抗原的识别），以及为每个患者定制生产疫苗。考虑到这些过程耗时、资源密集且成本高昂，这些疫苗在患者群体中的可及性有限；这种耗时问题可能导致其他问题，这些疫苗不适合需要立即治疗的患者（那些癌症迅速发展的患者），因为基因组分析、抗原选择和疫苗生产所需的时间可能会延迟治疗开始。肿瘤异质性是另一个挑战；考虑到肿瘤的遗传异质性，它们包含不同遗传突变和抗原谱的不同细胞群体的混合，因此，个性化疫苗可能不会针对肿瘤中存在的所有相关抗原，导致疫苗未针对的癌细胞可能的逃逸机制。此外，个性化癌症疫苗可能面临克服癌细胞免疫逃逸机制的挑战，在某些情况下导致效力有限；其他障碍可以归因于有限的临床证据以及其他后勤挑战（包括存储、运输和给药个性化癌症疫苗）。尽管存在这些挑战，癌症免疫疗法的持续研究和进步继续改善个性化癌症疫苗的开发和利用，旨在解决这些限制并提高其治疗癌症的效力。最有效的方法是开发基于新抗原的个性化癌症疫苗。总的来说，所有当前的癌症疫苗平台都有优点，如诱导体液和适应性免疫系统、长期稳定性、灵活性、高免疫原性、临床安全性等，以及缺点，如抗原丢失、低MHC表达、不适当的APC摄取和抗原呈递等，在表1中详细总结。 7.结合人工智能和冷等离子体技术作为开发癌症疫苗的新型模式工具 目前，有几家大公司是生产治疗性癌症疫苗的领导者，包括Imatics、BioNTech、AstraZeneca、纪念斯隆凯特琳癌症中心、默克、马萨诸塞州总医院、F. Hoffmann-La Roche、Bristol-Myers Squibb、Regeneron Pharmaceuticals和诺华。尽管上述公司拥有众多专利并开发了各种癌症疫苗，但开发有效和通用癌症疫苗存在几个主要挑战，例如不同人群中肿瘤的变异性、肿瘤抗原与身体自身抗原的相似性，以及癌症复发的可能性（由免疫抑制性肿瘤微环境或肿瘤异质性引起）。考虑到这一点，优化当前的癌症疫苗以覆盖广泛的肿瘤抗原、区分肿瘤抗原与身体的对应物，并预防癌症复发是不可或缺的。 如表1所示，所有疫苗平台都有自己的特定优缺点，这导致科学家通过结合这些不同平台来优化癌症疫苗，目的是加强优势和减少劣势，并提出更好的治疗性癌症疫苗。这种组合疗法的例子包括使用基于脂质的递送（脂质体、脂质纳米颗粒、猫离子脂质），特别是PEG等各种聚合物，以增强mRNA稳定性，将聚合物注入目标细胞，肿瘤特异性，放大肿瘤抗原反应，并减少可能的毒性。此外，为了克服免疫抑制性肿瘤微环境（这可能阻止功能和激活对摧毁癌细胞必需的免疫细胞），研究人员已经将mRNA疫苗的使用与免疫检查点抑制剂结合起来。肿瘤异质性指的是存在基因多样性的亚群，具有不同的表型特征，导致遗传突变的多样性。肿瘤的同质性可以在肿瘤之间或同一肿瘤内部看到；肿瘤的同质性使得在亚群中发生的突变难以检测，并阻碍了适当治疗策略的设计。在肿瘤异质性方面，有空间（肿瘤进展过程中的动态基因组演变）和时间（肿瘤由具有不同基因组的亚克隆组成，这使得患有相同癌症和肿瘤亚型的人对治疗的反应不同）异质性，两者都需要克服。一些策略基于通过组织多点采样在肿瘤区域看到的变异设计个性化mRNA癌症疫苗；这些策略能够同时针对在各个肿瘤区域表达的多种抗原（以针对空间异质性），并监测疾病的进展，然后可以根据监测结果调整治疗计划（以解决时间异质性）。然而，这些策略和组合疗法使疫苗设计和给药途径更加复杂，并增加了患者的治疗成本和持续时间。随着人工智能（AI）应用在包括医学在内的各个领域的扩展，科学家已经利用AI算法（如MHC结合预测工具、突变转录物表达量的量化、突变的克隆性、确定肿瘤特异性T细胞表位）来预测基于肿瘤基因组数据的肿瘤抗原及其属性。基于诱发T细胞反应的可能性，科学家可以选择一些特定突变作为疫苗候选物。AI工具可能提高疫苗设计的准确性，并克服与肿瘤异质性相关的挑战。 使用AI算法似乎是一个有前景的工具，可以帮助解决癌症疫苗开发的主要挑战。另一种可能与AI相关工具一起使用的技术是冷等离子体相关系统。冷等离子体（CAP），也称为非热或冷物理等离子体，是一种由部分电离气体组成的介质，它引发各种活性氧和氮物种的生成。CAP已在包括医学在内的广泛行业中应用，特别是在癌症治疗中；CAP在摧毁癌细胞以及固体肿瘤方面显示出有希望的结果，同时影响各种相关机制，如诱导凋亡，特别是在肿瘤细胞而非正常对应物中，减少细胞迁移，阻止细胞周期在S阶段，损伤DNA，以及增加肿瘤微环境中的ROS浓度，减少肿瘤免疫抑制，并提高抗原性。CAP已获得FDA批准用于癌症治疗。然而，这项技术尚未用于癌症疫苗开发。根据CAP在癌症治疗中的应用方式，我们建议CAP技术可以直接或间接应用于癌症疫苗开发。直接方法可以包括直接暴露癌细胞以及疫苗给药（例如，同时给药脂质纳米颗粒mRNA癌症疫苗和冷等离子体暴露癌细胞），间接方法可以包括先将细胞培养基中的细胞（如CAR-T细胞中的患者T细胞，或iPSCs）或仅培养基暴露于CAP，然后让细胞在介质中生长。这可能有助于通过阻止肿瘤进展中的基因突变来减少肿瘤异质性，提高治疗在杀死癌细胞而不影响正常细胞时的选择性，并防止正常细胞表达肿瘤抗原。其他方法可能包括尝试开发其他新的CAR-T细胞，而不是CD19和BCMA，这些细胞能够识别不同的肿瘤抗原，并应用冷等离子体。考虑到CAP可以增强肿瘤抗原性（癌细胞与正常细胞被免疫细胞识别的差异程度）并上调MHC-I和II等免疫原性细胞表面分子，将CAP引入这一领域可能会导致有趣的结果。其他方法可能包括将非活化的全肿瘤干细胞与含有抗癌剂的脂质纳米颗粒一起装载，或将肿瘤干细胞与含有iPSCs的脂质体一起装载，然后注射；这可以提高DCs的效率，从而提高免疫原性反应。此外，这种方法可能同时针对几个因素；例如，非活化的肿瘤干细胞和iPSCs本身都涵盖了广泛的肿瘤抗原，这些抗原免疫原性较差（不会逃避癌症免疫周期），如果它们在系统中一起使用，这种覆盖范围可能会增加，并有助于解决肿瘤异质性问题。此外，这种组合系统可以进一步提高免疫原性反应，以防止癌症复发。最后，如果将冷等离子体与这样的组合系统集成，该组合系统甚至可以进一步改进，因为CAP本身选择性地破坏肿瘤细胞。同时，含有iPSCs的脂质体穿透DCs并增强肿瘤抗原呈递的变异性，然后被T细胞检测并产生免疫反应。这些是需要未来研究的一些方法，可能会开辟治疗性癌症疫苗开发的新颖有效途径。 8.总结和结论 总之，我们强调了四大疫苗平台的最新研究进展及其局限性。我们认为，全面了解免疫抑制性肿瘤微环境对于开发有效的癌症疫苗至关重要。此外，基于颗粒的递送系统在过去几十年中已用于癌症疫苗的深入研究，这些系统对于提高疫苗的免疫原性和促进淋巴结运输具有巨大的前景。已有共识认为，如果癌症疫苗与其他免疫调节或标准化疗法结合使用，可能会实现更大的治疗效果。然而，仍需要持续努力以鉴定肿瘤特异性新抗原、有效的佐剂和优化递送平台。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。