XLRS1

基因疗法、眼科基因治疗、基因编辑、AAV工艺质控，点击图片查询议程，合作热线：王晨 180 1628 87692月4日，国家药监局药品审评中心（CDE）突破性治疗申请公示信息显示，强生的AAV5-hRKp.RPGR眼内注射溶液拟纳入突破性疗法，该药是基于腺相关病毒载体（AVV）的基因治疗药物，适用于治疗确诊为RPGR致病性变异相关X连锁型视网膜色素变性的患者。在眼科AVV基因疗法的黄金赛道上，国内已有超20家企业在布局，其中不少在研新药已经进入临床试验阶段，将为遗传性眼病的治疗带来新希望。眼科基因疗法临床需求较大AAV5-hRKp.RPGR眼内注射溶液旨在将RPGR基因的功能拷贝递送至视网膜下空间，改善和维持视觉功能。2020年，AAV5-hRKp.RPGR眼内注射溶液Ⅰ/Ⅱ期试验6个月数据公布：中期数据显示，低剂量和中等剂量的耐受性良好，并表明视力有显著改善。资料显示，2019年，强生与MeiraGTx签署合作开发遗传性眼病基因疗法，包括AAV5-hRKp.RPGR眼内注射溶液及另两款治疗全色盲的基因治疗药物。2023年底，MeiraGTx宣布，强生以高达4.15亿美元收购了该药的研发权益。MeiraGTx将获得1.3亿美元的预付款和近期里程碑付款、该药在美国和欧盟首次商业销售，以及制造技术转让后获得的高达2.85亿美元额外资金。2017年12月，全球首个眼科基因疗法Luxturna在美国获批上市，掀起了眼科基因疗法的热潮。相对其他器官而言，眼睛体积较小，只需要低剂量的药物就可以达到治疗效果，而且具有免疫豁免、系统风险低等优势，成为各方药企率先布局的一大领域。目前眼科基因治疗的适应症主要是与单个基因突变相关的遗传性视网膜疾病，包括视网膜色素变性、无脉络膜症、Leber遗传性视神经病变（LHON）、Leber先天性黑蒙（LCA）、Stargardt病、色盲症（ACHM）、X连锁视网膜劈裂症（XLRS）和年龄相关性黄斑变性（AMD）等。因这些疾病严重影响患者的独立生活和日常活动能力，临床医疗需求大。遗传性眼病的很多基因突变已经被精准识别，为基因疗法的开发提供了众多靶点选择，针对眼部的基因治疗研究一直处于前沿。眼科AVV基因治疗是AAV基因治疗的黄金赛道，占据AAV基因治疗临床试验四分之一。腺相关病毒由于其较低的免疫原性和位点特异性整合能力，被认为具有较好的安全性，是最有潜力的基因传递系统之一，这也使得AVV基因治疗领域的发展势头日益强劲。国内众多创新药企杀入赛道在眼科AVV基因治疗上，国内已有纽福斯生物、朗信生物、嘉因生物、天泽云泰、康弘药业、中因科技、辉大基因、安龙生物、金唯科、本导基因、九天生物、方拓生物、鼎新基因、凌意生物、极目生物、星眸生物、目镜生物、纽伦捷生物、领诺医药、埃微路新、南京贝思奥、瑞风生物、因诺惟康等众多创新药企积极布局，其中不少在研药物已经进入临床试验。纽福斯生物是中国首家专注于眼科疾病的基因治疗公司。2021年3月，纽福斯生物研发的中国首个临床阶段的眼科体内AAV基因治疗药物NR082（研发代码NFS-01）获国家药监局批准开展药物注册临床试验，用于ND4线粒体基因突变引起的Leber遗传性视神经病变。NR082是国内首个获得临床试验许可的眼科体内AAV基因治疗药物，并已于2020年9月获得美国FDA孤儿药认定，并于2022年获批在美国开展临床试验。2022年7月，该药又被国家药监局纳入突破性治疗品种，上市进入“快车道”。2023年2月22日，纽福斯生物宣布，NR082用于治疗ND4突变引起的Leber遗传性视神经病变Ⅲ期临床试验在中国完成全部患者入组给药。除了该药外，纽福斯生物还有针对视神经损伤、血管性视网膜病变等多种眼科疾病的十余个在研项目。2022年1月，朗信生物旗下公司朗昇生物提交的LX101注射液临床试验获国家药监局受理，用于治疗先天性黑蒙症，是国内首个递交该适应症临床试验的基因疗法，并于2022年4月19日获批临床试验。LX101是朗信生物自主研发的一款以rAAV为载体的基因疗法，在此前的研究者发起的临床研究中，LX101表现出良好的安全性，且已在多位患者中见到视力提高的疗效。2022年4月19日，朗昇生物又宣布，LX101的临床试验申请获CDE批准，用于治疗RPE65双等位基因突变相关的遗传性视网膜变性患者。2023年1月19日，嘉因生物宣布，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准其新型基因疗法EXG102-031注射液的新药临床试验申请，用于治疗湿性年龄相关的黄斑变性。同年3月，该药的上述适应症在国内的临床试验申请获国家药监局受理。EXG102-031注射液只需要一针注射，就可在体内长期表达并有效治疗视网膜中异常血管形成和血液渗漏。中因科技的ZVS101e注射液是其与北京大学第三医院合作研发的基因替代治疗药物，也是国内外首个进入临床阶段的BCD（特殊类型的视网膜色素变性）基因治疗药物。该药物将适用于所有携带CYP4V2基因突变的BCD患者。2021年5月，该药针对BCD疾病适应症的临床试验启动，是全球首个针对BCD疾病展开临床试验的基因治疗。ZVS101e治疗BCD的Ⅰ/Ⅱ期注册性多中心临床研究，已经于2023年2月20日完成了首例患者入组。九天生物的眼科AAV基因治疗药物SKG0106眼内注射溶液的临床试验申请也于2023年10月获国家药监局批准，用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性。SKG0106已于2023年6月获FDA批准开展治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性全球Ⅰ/Ⅱa期临床试验，项目的全球临床试验已经启动。除了上述企业外，其他企业新药的研发也在不断推进，近年来越来越多的眼科基因疗法获批临床试验。于患者而言，基因治疗将为眼科疾病的治疗带来新希望。朗信生物朗信生物成立于2020年，是一家致力于基因治疗创新药研发制造及商业化的初创企业。公司核心团队有来自全球知名大学及实验室的科学家、专业人士、及全球顶尖生物医药公司高级管理人员。与国内知名医院的临床医学科学家密切合作，公司目前关注遗传性疾病的基因治疗领域，已有多个管线产品研发及工业化技术开发基础。2021年起，公司已有超过5000平米场地投入运营，在上海浦东张江设立了研发和临床研究中心；位于苏州生物医药产业园的中试和生产基地已建成国际领先的无血清悬浮培养工艺生产平台。朗信生物以眼部疾病产品作为基因治疗突破点，构建安全、精准的基因替代和基因编辑技术，实现基因治疗的临床应用，已建立多系统疾病基因治疗的研发团队和平台生产技术。并与国内外知名医院的临床医学科学家密切合作，提升创新能级，以更高效率开发基因治疗产品，最终应用于临床。目前用于遗传性视网膜变性及年龄相关性黄斑变性的产品已经进入到了临床阶段。此外公司涉及的基因治疗的眼科候选产品有：VEGF、PROM1、CRX、RS1、GNAT1、GsdmdC细胞焦亡等。LX101注射液是朗信生物自主研发的一款以rAAV为载体的基因疗法。产品通过对RPE65基因编码序列优化设计，高效表达人源RPE65蛋白，补偿因该基因突变导致的蛋白功能缺失，眼内给药后可有效治疗RPE65双等位基因突变相关的遗传性视网膜变性（IRD）患者。在此前进行的研究者发起的临床研究中，LX101表现出良好的安全性，且已在多位患者中见到视力提高的疗效。LX101为国内第一个获得临床试验批件的遗传性视网膜变性基因治疗产品。中因科技北京中因科技有限公司是一家专业从事遗传性眼病临床基因诊断和基因治疗药物研发的国家高新技术企业，是国内率先进行眼科基因治疗药物研发的企业。公司建立的遗传性眼病临床基因诊断平台以及基因治疗药物研发平台，致力于为遗传性眼病患者提供精准基因检测和基因治疗的全程“一站式”服务，并且通过持之以恒的努力，致力于成为国际眼科基因治疗药物的领先企业。公司创始团队从事遗传性眼病基因研究20余年，建立从靶标筛选、基础研究、动物实验、干细胞验证和AAV病毒生产完整的基因治疗药物开发体系。公司同时具有基因替代治疗和基因编辑治疗两个平台，基于中国遗传性视网膜变性的常见致病基因和突变热点，结合基因的发病机制，分别开发基因替代治疗或基因编辑治疗药物，目前正在开展的基因替代治疗项目2项，基因编辑治疗项目4项，其中两项动物实验已经完成，开展小样本临床试验。中因科技研发管线ZVS101e 注射液是中因科技自主研发的CYP4V2基因替代治疗药物，含表达人CYP4V2蛋白的重组AAV血清型8（rAAV8）载体（rAAV8-hCYP4V2）。ZVS101e所含治疗载体对视网膜细胞有特殊嗜性，注射入患者视网膜下腔后，可高效感染视网膜的RPE细胞，并在RPE细胞中特异性表达CYP4V2蛋白，弥补由于基因突变导致的蛋白功能缺失，从而对BCD患者的视网膜功能恢复起到有效治疗作用。该替代治疗药物将适用于所有携带CYP4V2基因突变的BCD患者。结晶样视网膜变性（BCD）是一种遗传性视网膜退行性疾病，典型改变为黄白色闪光结晶样物质沉积于视网膜，伴有视网膜色素上皮细胞和脉络膜毛细血管层萎缩，CYP4V2已被鉴定为BCD的致病基因。绝大多数BCD患者20～40岁发病，双眼受累，早期可能无症状，随着疾病进展，出现视力下降、视野缩小、夜盲症和色觉障碍等症状，患者通常在50～60岁时由于严重的视力下降和视野缩小成为法定盲人。基于临床特征和基因检测鉴定CYP4V2中的双等位基因致病变异，BCD可被确诊，然而仍缺乏有效的临床治疗手段。（基因替代治疗）ZVS203e注射液是由北京中因科技有限公司自主研发的，用于治疗视网膜色素变性（RP）的基因编辑治疗产品。设计基因编辑治疗药物ZVS203e主要是将RHO基因中的突变位点修复，使其恢复表达正常的RHO基因产物，进而恢复视网膜细胞正常功能，最终达到恢复患者视力的目的。目前此项目正处于临床前研发阶段，结果显示良好的安全性及显著有效性。纽福斯纽福斯成立于2016年，是李斌教授团队于华中科技大学同济医学院附属同济医院自2008年起十几年来对眼科基因治疗技术探索和积累的成果。作为一名眼科医生和视网膜疾病专家，李教授带领团队成功完成了从实验室到临床应用的转化研究，通过一系列国内和国际多中心临床试验证实了腺相关病毒 （AAV） 载体技术在眼科基因治疗的应用价值。公司首个候选药物NFS-01旨在治疗莱伯氏遗传性视神经病变 (LHON) 。该疾病是一种可导致严重视力损伤的退行性疾病，迄今为止尚无有效的治疗方法。2011年，团队应用该候选药物开始了全球首个LHON基因治疗探索性临床研究，参与临床试验的9例患者已持续随访8年，至今无严重不良反应且其中5例患者视力显著提高。此结果为全球基因治疗最长随访记录，发表于 《自然》 子刊、 《柳叶刀》 子刊及眼科领域顶级杂志 《眼科学》 , 充分证明了基因治疗技术临床应用的长期安全性与有效性。在首项研究取得可喜成果后，李教授团队于2017-2018年间进行了一项更为全面的临床研究，研究入组受试者达159例 （其中包括来自阿根廷的10例），这也是目前全球整个基因治疗领域样本量最大的临床试验。同样，十二个月随访结果显示NFS-01疗效显著，且未发现严重不良反应。NR082于2020年9月获得美国FDA孤儿药资格认定，于2021年3月成为国内首个获得1/2/3期无缝临床试验许可的眼科体内基因治疗药物，已在今年6月完成首例患者入组给药。NFS-01的作用原理2011年，团队应用候选药物NFS-01开始了全球首个LHON基因治疗探索性临床研究，参与临床试验的9例患者已持续随访8年，至今无严重不良反应且其中5例患者视力显著提高。NFS-01以重组腺相关病毒(rAAV)作为载体，将正常的ND4基因递送至患者受损的视神经节细胞，修复线粒体生物呼吸链，使视神经节细胞恢复活力与视功能，从而治疗G11778A (ND4) 位点突变所引起的LHON疾病。纽福斯研发管线Leber遗传性视神经病变（LHON）：该疾病是一种母系遗传的线粒体疾病，多发于14-21岁的青年男性，患者表现为双目视力受损至失明。这一疾病由德国眼科医生 Theodor Leber于1871年首先发现，目前全球患者约60万人，其中中国10万人。LHON是线粒体DNA突变所导致的疾病，位于线粒体基因组上的第11778、第14484和第3460位点为该病的3个原发位点，90％以上的LHON病人中能够发现G11778A (ND4基因）、G3460A（ND1基因)、T14484C（ND6基因） 三个位点突变中的一个，尤以G11778A最多，占50％～80％。由于该突变使线粒体生物呼吸链受损，造成ATP缺乏，使患者视神经节细胞产生氧化应激，导致细胞凋亡。目前临床上尚无针对Leber遗传性视神经病变的有效疗法或治愈手段。纽福斯目前正在开发两款针对LHON的候选药物 - NFS-01（NR082, rAAV-ND4) 和 NFS-02（rAAV-ND1), 分别治疗G11778A (ND4) 位点突变和G3460A(ND1) 位点突变所引起的LHON疾病。作用机制为采用基因治疗策略，以重组腺相关病毒作为载体，将正确的基因通过玻璃体腔注射递送至患者受损的视神经节细胞，修复线粒体生物呼吸链，使视神经节细胞恢复活力与视功能。公司核心产品NR082眼用注射液，以病毒作为载体，将正确的基因递送至受损的视神经节细胞，提高甚至恢复患者的视力。目前，该药物已被美国FDA和欧洲药品管理局授予“孤儿药”（用于预防、治疗、诊断罕见病的药品）称号，是首个获得中美两国许可的中国基因治疗新药。目前在中国已经完成一期、二期临床试验，正在开展三期。在美国，正在进行一期、二期临床试验的准备工作。康弘药业康弘药业在ASGCT2022年会上公布了公司研发的眼科基因治疗产品AAV-KH902的临床前数据。AAV-KH902在临床前研究中显示出较好的数据。角膜新生血管(CoNV)已被确定为角膜移植排斥反应的主要危险因素之一，康弘药业的AAV-anti-VEGF(AAV-KH902)目的在于提高高风险角膜移植大鼠模型的角膜移植存活率。数据显示：与对照组(N=6)相比，AAV-KH902治疗组(N=6)的角膜新生血管（CoNV）、角膜移植物混浊、移植物厚度显著降低。治疗后2个月，AAV-KH902治疗组移植存活率较PBS注射组显著提高33.3%。此外，两组眼压（IOP）均在正常范围内。在基质内注射2周后，角膜内发现微量CD11b+细胞，表明AAV-KH902的治疗没有引起IOP异常和炎症。2022年5月6日，国家药品监督管理局药品审评中心受理康弘药业提交的KH631临床试验申请。KH631眼用注射液是通过腺相关病毒（AAV）递送目标基因用于治疗新生血管性（湿性）年龄相关性黄斑变性（nAMD）的，是具有自主知识产权的1类生物新药。目前康弘药业拥有眼科基因工程药物KH902和KH906，康柏西普（项目名：KH902，商品名：朗沐）2013 年 12 月获得CFDA批准上市，2014年4月上市销售，至2016年已销售破8亿。安龙生物北京安龙生物医药有限公司，简称安龙生物，专注于生命科学领域对新药研发的突破性进展，包括基因治疗，基因编辑，DNA及RNA等其它遗传物质做为新药研发的方向，获得泰格医药等投资机构6000万资金支持。安龙生物产品在病毒、DNA基因治疗的稳定性和携带性上均表现出较强优势，基于AAV对组织的特异性侵染、AAV载体对眼科疾病的基因治疗等代表性研究成果已发表在Nature Microbiology, Plos ONE等国际期刊，在研项目包括老年黄斑变性(AMD)基因药物和针对血友病A型的基因治疗项目。老年相关湿性黄斑病变（wet-AMD）已成为继青光眼、白内障之后全球第三大致盲因素，全球患病人数不断攀升，而目前针对wet-AMD的治疗，主要是抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）疗法。虽然已经有成熟的疗法上市，但是抗VEGF疗法仍有自身局限，长期频繁的玻璃体内注射，让患者体验不佳，严重降低了患者依从性，也增加疾病进展的风险。安龙生物的AnLong001是一种AAV基因治疗模式，采用了目前最先进的脉络膜上腔注射方式。AAV载体使得AnLong001以视网膜为生物反应器，持续稳定表达抗VEGF分子，在患者中最大限度地减少症状的发生，而脉络膜上腔注射也能够显著降低炎症等副作用发生率。目前，AnLong001已进入毒理实验阶段。从当前进展来看，该款产品能够抑制视网膜变性、损害以及新生血管形成，同时，在动物实验中未见明显的病理改变。九天生物九天生物是一家创新基因及细胞治疗公司，致力于研究、开发和生产具有突破性的基因和细胞疗法。九天生物成立于2019年，自主研发建立了完整的腺相关病毒(AAV)基因治疗技术平台，拥有先进的衣壳发现和病毒载体构建技术、分析和工艺开发实力、以及全球领先的临床级AAV载体大规模GMP生产能力。九天生物（Skyline Therapeutics）近日宣布其在研的AAV眼科基因治疗药物SKG0106眼内注射溶液的临床试验申请（IND）获国家药监局批准，开展治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）的新药临床试验。SKG0106已于今年6月获美国FDA批准开展治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）全球I/IIa期临床试验，项目的全球临床试验已经启动。SKG0106眼内注射溶液是一款创新眼科基因治疗药物，由新型重组腺相关病毒（rAAV）衣壳携带编码独特设计的抗血管內皮生长因子（VEGF）蛋白的转基因序列，通过单次玻璃体腔注射，在眼内高效转导视网膜细胞后持续表达具有抗新生血管生长功能的蛋白，从而抑制眼内新生血管增生、阻断血管渗漏和视网膜水肿，有效治疗nAMD，实现长久获益。目镜生物上海目镜生物医药科技有限公司是一家专注于基因工程化定向进化技术开发新型AAV外壳用于眼科疾病基因治疗技术和产品研发的创新公司。目镜公司致力于探索、研发基因治疗新技术、新疗法。通过Shuffling-insertion Mediated AI Retargeting Technology（SMART）AAV衣壳筛选平台，为寻找更优的用于治疗包括视网膜、耳、血液、肺、肝脏、胰脏、肌肉以及大脑等脏器的遗传性或慢性疾病AAV基因治疗载体奠定了基础。依托该平台，团队陆续发现了一批器官特异靶向、渗透性好、免疫原性低的候选AAV衣壳，未来将会有更多的新衣壳实现成果转化。星眸生物合肥星眸生物科技有限公司成立于2019年8月，位于安徽省合肥市高新区，是中国科大先研院孵化的创新企业，是一家基于前沿基因编辑技术开发、专注基因疗法领域的生物技术公司。星眸生物深耕眼科基因治疗多年，科研成果卓著。创始人团队为生命科学相关领域的资深研究员、教授、博士，拥有多年深耕眼科、基因编辑、基因治疗的研发和管理经验，相关研究工作荣登 Nature、Cell、Science Advances、Nature Communications 等顶级学术期刊。星眸生物聚焦基于AAV载体的眼科基因治疗药物研发，同时精进TRED (Targeted-RecA Enhanced homologyDirected repair，基于CRISCR/Cas9/MS2-RecA 的创新型基因编辑方法）和BE（Base Editing,碱基编辑）基因编辑技术用以布局公司中长期发展规划。 核心技术平台包括：AAV 双/多抗平台、AAV 病毒衣壳筛选技术平台、基因编辑技术平台--TRED技术和 BE技术。星眸生物基因治疗I类创新药“XMVA09注射液”是首个兼具实现双特异性靶点与玻璃体腔内注射衣壳的基因治疗药物，适应症为湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），已实现体内体外药效显著优于美国头部产品RGX-314。目前XMVA09的新药临床试验(IND)申请已获得国家药品监督管理局(NMPA)批准，下阶段将正式开展I/II期临床研究。辉大基因辉大生物科技有限公司成立于2018年，致力于通过创新的CRISPR基因编辑技术研发单基因罕见疾病和威胁人类健康的慢性病的基因替代和基因编辑等基因治疗药物。目前辉大基因拥有三大研发平台：基因编辑平台、递送载体平台、动物模型平台。辉大基因研发管线HG-004通过递送正确的RPE65基因，治疗由于RPE65基因突变导致的先天性黑蒙2型疾病（LCA2）。HG004是由辉大团队自主研发的基因治疗药物，使用重组腺相关病毒AAV9型载体递送正常RPE65基因到视网膜，从而恢复、治疗及预防成人及儿童的RPE65突变相关Leber先天性黑矇。HG004是国内自主研发的首个同时获得美国FDA授予的孤儿药及儿科罕见病药物双认证的AAV眼科基因疗法药物，该药物的使用同一临床主方案的国际多中心临床研究申请已获中国及美国IND批准。鼎新基因鼎新生物从AAV病毒设计的底层进行了最精细化的改造，打造rAAV文库高通量筛选迭代技术平台，提高组织嗜性、转染效率、表达持续性和安全性。该AAV病毒载体平台能够持续输送工程化改造的血清型，满足不同候选分子精准递送要求，并能免疫逃逸实现再次给药要求。鼎新基因一直将治疗场景设立于耳科和眼科领域，聚焦的眼科耳科适应症是治疗靶点成熟的眼科慢性病和先天性耳聋。公司AAV基因治疗以眼科及耳科作为切入口，建立了成型的AAV基因治疗研发和技术体系，已基本完成了第一个眼科慢性病、第一个先天性耳聋研发管线的临床前候选分子确认，进入了国内相关产品研发的头部阵列，正在扩展新型AAV的临床转化并扩大治疗领域。2023年11月18日(美国东部时间)，上海鼎新基因科技有限公司(下称“鼎新基因”)与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来、李华伟课题组合作研发的RRG-OTOF双载体AAV被美国食品和药品监督管理局（FDA）授予治疗OTOF介导的听力损失（OTOF-mediated hearing loss）的罕见儿科疾病认定（RPDD）。RRG-OTOF是一种基于腺相关病毒 (AAV) 双载体的基因疗法，通过将编码otoferlin的基因传递到耳蜗的内毛细胞来治疗OTOF介导听力损失患者。耳蜗内一次性给药 RRG-OTOF，AAV双载体进入到相同的细胞可长期持续表达完整的功能性otoferlin蛋白，以使听觉功能恢复。凌意生物凌意生物成立于2021年2月，是全球领先的单基因遗传病创新药物开发公司。公司拥有国际一流的基因疗法发现、研究开发及产业化团队，致力于FIC基因治疗管线的研发和产业化。公司致力于源头创新，聚焦代谢、中枢神经系统、眼科等临床急需的疾病领域，从遗传病动物模型等关键技术入手，以最高的质量标准为患者提供一次性解决方案。凌意生物LY-M001注射液是中国首个自主研发，针对I型或III型戈谢病的AAV基因治疗药物。该产品使用重组腺相关病毒rAAV为载体，通过单次静脉输注给药后即可表达患者所需的葡萄糖脑苷脂酶。凌意生物开发了拥有完全自主知识产权的改良型葡萄糖脑苷脂酶基因治疗载体，可在体内长期稳定表达并降解有害糖脂代谢物，从而达到长期治疗戈谢病的目标。由浙江大学医学院附属第一医院黄河院长牵头发起的IIT临床研究项目也已正式启动，目前已完成两例受试者给药。初步的IIT数据显示：LY-M001在有效性和安全性方面均有良好表现，无任何不良事件发生。瑞风生物瑞风生物是中国头部的基因编辑药物创新企业，以基因编辑技术为核心驱动，致力于革新性药物的诞生。瑞风生物是国际上早期应用基因编辑探索遗传疾病治疗的高水平团队，并持续在血液科、眼科等疾病方向积累了开创性成果，在包括基因编辑工具创新、成药策略发现、新型动物模型构建、多层次药效和安全性评估等层面具备了高水平的技术积累，拥有体内和体外两大创新药物方向。瑞风生物的使命是基于革新性的基因技术，为严重疾病患者提供可及性和治愈性药物。目前在遗传病、复杂疾病和肿瘤领域等皆有管线布局，其中β-地中海贫血基因编辑疗法已经取得全球先进水平的临床进展。RM-001是瑞风生物自主研发的β-地中海贫血基因编辑药物。利用CRISPR基因编辑技术改造患者自体造血干细胞，激活人体内天然胎儿血红蛋白（HbF）合成，使红细胞恢复正常生理功能并摆脱输血，达到单次给药根治β-地贫的目的。RM-001采取直接靶向γ-珠蛋白基因（HBG1/2）启动子的编辑策略，不会影响造血干细胞及其分化功能细胞其它功能基因的表达，更加安全。RM-001是瑞风生物的先导管线产品，基于靶向HBG基因的更具安全性的编辑策略开发而成。该款产品于2022年11月获得国家药品监督管理局（NMPA）批准在中国开展注册临床研究。这是国内首款获得临床试验许可治疗地贫的新靶点基因编辑药物。RM-001细胞注射液I期临床研究是一项多中心、开放标签临床研究，旨在评估一次给药、单剂量的RM-001在β-地贫患者中的安全性和有效性，入组了12例年龄6岁-35岁受试者，涵盖了儿童、青少年和成人患者。金唯科金唯科是一家致力于眼科疾病、神经肌肉疾病、遗传代谢疾病等的AAV基因治疗新药研发公司。金唯科研发管线2020年4月金唯科开始运营3000平米的AAV新药研发平台，包括GMP级AAV制备车间、质粒制备车间、质量研究平台和成药研发平台，实现了从AAV药物设计、成药性研究、中试生产到质量研究的完善AAV基因治疗技术链。公司自主研发了可放大的、成本可控的AAV规模化制备及层析纯化工艺，在研的多条关于眼科和全身给药的产品管线均得到了良好的推进。其中，治疗湿性老年性黄斑变性(wAMD)的JWK001和治疗X连锁青少年视网膜劈裂症(XLRS)的JWK002作为龙头管线，进展最快，将先后申报IND。nAMD是一种严重影响视力甚至会导致失明的不可逆眼科疾病，是世界范围内不可逆失明和视力损害的主要原因之一。目前nAMD已成为继青光眼、白内障之后全球第三大致盲因素，全球患病人数不断攀升，我国也有数百万的患者等待治疗。该病的发病机理为患者视网膜黄斑区形成异常新生血管，同时可能引起视网膜水肿、出血、渗出和瘢痕形成等不良症状，进而严重影响患者视力。目前nAMD治疗的一线药物是抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）的生物制剂，但现有的抗VEGF疗法需要长期且频繁地进行眼内玻璃体腔注射，多次注射不仅耗时耗力还会增加眼内炎症等不良反应的风险。JWK001注射液是金唯科自研的首个采用“两质粒包装系统”的AAV基因治疗新药，通过其自主研发的特色技术大幅提升AAV包装效率并降低生产成本。该产品通过视网膜下给药将抗VEGF蛋白表达框的AAV递送至眼部细胞中，持续高效表达抗VEGF蛋白的同时避免反复玻璃体腔注射对眼组织的伤害、患者依从性差等治疗风险，同时其特色的多靶点基因表达框也提升了药物疗效。这些优势共同使得该产品可实现一次治疗，终身有效的目的。因诺惟康北京因诺惟康医药科技有限公司（Innovec Biotherapeutics）是一家从事基因治疗技术和产品研发的公司。因诺惟康目前有诸多基因治疗的产品管线储备，大部分集中于眼科和神经科领域，公司生物医药技术包括新型病毒载体的设计和开发、基因编辑药物开发，临床级病毒载体的生产和应用，研究遗传疾病的自然发生过程、特征及突变基因，建立遗传疾病相关的动物模型。公司主要项目处于临床前的研究阶段。南京贝思奥南京贝思奥生物科技有限公司成立于2020年，公司致力于研发基于重组病毒载体和非病毒载体的基因治疗药物。主要通过基因重组治疗眼科疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、罕见病等疾病。埃微路新成都埃微路新生物技术有限公司成立于2020年5月，主要的目的是采用定向进化技术来改造AAV以提高其在临床试验中对不同组织器官的转导效率，并能够避免在运送基因的过程中被人体中和抗体中和。因此这将是一个具有巨大商业潜力的基因治疗载体平台，依据主要采用的技术命名为AAVolution（AAV+evolution），即AAV载体的定向进化。与此同时，结合研发团队自身的背景和现在AAV的市场应用，将主要关注的基因治疗靶向的疾病前期设定为心脏和视网膜相关疾病。领诺医药领诺医药位于上海张江药谷，IN-2004（AAV基因治疗，眼科）/LIN-2004（AAV基因治疗，半乳糖脑苷脂酶 Galactocerebrosidase /GALC)）为领诺医药的两款正在开发中的候选产品。IN-2004（AAV基因治疗）/LIN-2004（AAV基因治疗）为两款正在开发中的候选产品。领诺医药眼病基因治疗产品纽伦捷生物纽伦捷生物于2021年12月在园区成立，是一家旨在利用其具有自主知识产权的细胞转分化技术、遗传替代技术开发新型基因治疗药物的生物科技公司。纽伦捷生物由多位神经生物学家、眼科专家、基因治疗专家和生物制药行业的资深人士共同创立，致力于将新兴的细胞转分化技术转化为针对未被满足临床需求的解决方案。目前，围绕细胞转分化技术，纽伦捷生物已搭建了包括转分化因子筛选、病毒及非病毒载体设计、体内外药效学方法开发等关键技术的新型基因治疗药物研发平台，并已经申请了多项关键专利。纽伦捷生物产品管线聚焦于神经系统疾病，重点面向致盲性眼病以及难以治疗的神经系统肿瘤开发具有自主知识产权的原创基因治疗药物。天泽云泰上海天泽云泰生物医药有限公司，2020年3月注册成立于中国上海，致力于将前沿的基因及细胞治疗技术，转化为临床可及的治疗方法，以期望造福更多患者。公司拥有一支由业内顶尖的学术专家和经验丰富的研发人员组成的团队，覆盖了药物开发从概念到上市的每一环节；拥有具有自主知识产权的一系列核心技术平台，包括ViVec® AAV载体筛选平台、ViLNP® 脂质纳米粒技术平台、ViCas® CRISPR基因编辑技术平台和ViHiYi® AAV高产技术平台，专注于开发创新的细胞和基因疗法，为中国乃至全世界患有遗传性疾病、神经退行性疾病、肿瘤的病人提供解决方案。天泽云泰致力于将前沿的基因及细胞治疗技术，转化为治疗代谢及血液病、中枢神经系统疾病、眼科及视网膜疾病、肿瘤等的创新疗法。（管线截图来自于官网）目前进入临床的是针对血友病B和结晶样视网膜色素病变治疗的两款创新产品：VGB-R04注射液通过静脉注射实现肝脏特异性FIX基因替代和酶分泌，纠正血液FIX活性达到生理水平，治疗血友病B。VGB-R04在静脉注射后，通过AAV衣壳蛋白介导的肝脏细胞转导，将表达盒递送至细胞核。VGB-R04表达盒以游离DNA的形式存在，在肝脏细胞中表达凝血因子Ⅸ高活性天然变体（hFIX Padua）蛋白。肝脏表达并分泌入血的hFIX Padua蛋白替代缺失的先天性凝血因子IX发挥作用，从而纠正血友病B患者的凝血障碍，以期采用基因替代疗法从根本治愈该单基因遗传病，达到一次给药、长期有效的目的。FIX-Padua 是一种天然存在的具有高度活性的 FIX 变体 (R338L)，其活性约为普通野生型FIX 的8 倍，意味着可以在更低的表达水平完成正常凝血功能，这样就降低了病毒载体的给药剂量，提高了病毒载体给药的安全性和药效。血友病B为凝血因子IX基因缺陷导致的X连锁隐形遗传性出血性疾病，以身体负重关节、软组织及粘膜等身体部位损伤后过量出血或自发性出血为其典型临床特征。绝大部分患者为男性，男性发病率为1/25,000。目前主要的治疗方法为注射血浆或凝血因子等替代疗法，无法根治。（VGB-R04作用机制图示）VGR-R01眼用注射液是针对CYP4V2基因突变导致的BCD患者的基因治疗产品。CYP4V2蛋白为P450酶家族成员，在视网膜色素上皮细胞（RPE）中高度表达，具有脂肪酸羟化酶活性，与脂肪代谢相关。VGR-R01的作用原理是一种基因替代疗法。VGR-R01通过视网膜下腔注射给药后，AAV衣壳蛋白介导RPE细胞的转导，将VGR-R01基因表达盒递送至细胞核。VGR-R01表达盒以游离DNA的形式存在，在RPE细胞表达CYP4V2蛋白，以重建细胞的脂肪酸羟化酶活性。VGR-R01通过纠正患者视网膜内的脂肪酸代谢障碍，以期达到预防或改善RPE细胞、感光细胞及脉络膜的结构和/或功能损伤，并实现纠正视力损伤、保护残存视功能、或延缓视力恶化的临床效果。结晶样视网膜变性 (BCD)又称Bietti结晶样视网膜病变，是一种常染色体隐性遗传的进展性视网膜变性疾病。BCD致病基因是位于4q35的CYP4V2，编码一种与脂肪代谢相关的蛋白酶。在世界范围内BCD均有分布，但在中国、日本和韩国人群中更为普遍。大多数BCD患者于20-40岁发病，出现夜盲和视力下降等症状，在50-60岁发展为法定盲人。基于临床特征和基因检测鉴定CYP4V2中的双等位基因致病变异，BCD可被确诊，然而仍缺乏有效的临床治疗手段。（VGR-R01作用机制图示）极目生物极目生物是一家总部位于中国、专注于眼科创新疗法的生物技术公司，拥有覆盖从早期发现阶段到商业化阶段的一系列突破性眼科治疗技术产品组合。公司的愿景是，通过在中国、亚洲乃至全球提供创新疗法，解决眼科疾病领域未满足的临床需求，惠及广大眼科患者群体。极目生物在生命科学领域专业投资方的支持下创立，并由一支拥有丰富的全球眼科产品研发和商业化经验的行业精英团队管理。极目生物用于治疗青光眼的基因疗法ARVN601正在临床前开发中，ARVN601是基于microRNA (微小核糖核酸)的神经保护基因治疗。自2010年世界青光眼协会共识会议召开以来，视神经保护作为一种预防和推迟青光眼视神经退化性改变的非降眼压相关的疗法，已被认为是青光眼治疗的重要潜在策略。然而，目前尚无任何视神经保护疗法获批专门用于青光眼的临床治疗。2021年，极目生物与香港大学签署合作备忘录，与香港大学眼科学系系主任及临床教授梁啟信教授（Prof. Christopher Leung）展开研究合作，共同发现和开发针对青光眼的新型神经保护疗法（ARVN601）。此次项目有三个主要研究目标 ：①调节线粒体活性作为应对青光眼的神经保护策略；②开发基于microRNA (微小核糖核酸)的基因疗法以促进视神经再生；③研究细胞代谢重程序设计对于视网膜神经节细胞（RGC, Retinal Ganglion Cell）的保护和再生的作用。这一开创性合作，标志着全球青光眼新型疗法的研发进入了新的篇章。青光眼，是由于视神经病变导致的一种不可逆的神经退行性疾病，其典型的病理表现为视网膜神经节细胞进行性丢失，在全球不可逆性致盲性眼病中发病率占首位。据估计，2020年全球约有7600万青光眼患者，预计2040年将超过1亿，中国是青光眼患者最多的国家，2020年我国青光眼患病人数达到2100万，致盲人数可达567万。而随着老龄化进程的加快，我国青光眼的患病率逐年增加。极目生物早期科学研究助理副总裁丁锦东博士（Dr. Jindong Ding）表示：“青光眼的治疗目前依旧存在巨大的未被满足的需求，这背后反应的是我们对于疾病机理依旧缺乏了解，治疗手段依旧需要完善。新型神经保护疗法是对该领域治疗方案的全新的探索，意义深远。同时，这一过程也将面临非常大的挑战，这表明极目生物在科学创新方面勇于接受挑战，承担风险的勇气和决心。希望在不久的将来我们就能够把这一疗法推进到临床阶段。”新型神经保护疗法ARVN601不仅聚焦了目前青光眼治疗领域，仅通过降低眼压无法满足部分病人得到有效治疗的这一未被满足的临床需求，更是启动了无论在技术平台、靶点、机理等方面都具有独创性的研究探索。一直以来极目生物致力于填补眼科疾病疗法空白，助力患者和大众更有效地应对眼健康挑战。来源：新京报、佰傲谷BioValley、药融圈、医享客基因疗法、眼科基因治疗、基因编辑、AAV工艺质控，点击图片查询议程，合作热线：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额!

徐寒梅中国药科大学二级教授（博导），海洋药学专业负责人，江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心主任，国家药典委员会委员，国家级高层次人才项目入选者。主编出版 3 部论著（《新药非临床研究与开发》《抗肿瘤药物药理学实验指南》《酶类药物学》），发表学术论文 213 篇（SCI 收录 81 篇）， 申请国内专利 32 项（获授权 24 项），培养研究生 160 名（博士 29 名）。主办“第十四届中国国际多肽学术会议暨第五届亚太国际多肽学术会议”，多次受邀参加国内外学术会议报告。研究领域涉及多肽药物研发、全新微肽发现及机制研究、长链非编码 RNA 与疾病关系的分子机制。主持课题包括国家自然科学基金、国家 “863”计划、国家重大专项和重大横向课题等项目 30 余项。先后获中国药科大学“十三五”科技突出贡献奖，联合国教科文组织和平中心“2020 跨文化科技大使”，教育部技术发明奖一等奖，中国产学研合作创新成果 奖二等奖，江苏医药科技进步奖一等奖、二等奖各 1 次，中国发明创业成果奖一等奖，江苏省科学技术奖一等奖，江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人，内蒙古组织部 “草原英才”等奖励和荣誉。优化规律间隔成簇短回文重复序列相关核酸酶 9 敲入效率的研究进展 PPS 洪秀，李臣诚，徐寒梅 *（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）[ 摘要 ] 基因编辑技术可以通过在基因组 DNA 中精确插入、缺失或替换而人为地修饰靶位点的遗传物质。近年来，随着规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9, CRISPR/Cas9）系统的发展，研究人员对各种细胞基因组进行编辑的能力大大提高，但由于同源定向修复（homologous directed repair, HDR）效率低下，许多通过抑制非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）或增强 HDR 的方法，如化学调节、同步表达和同源臂优化等被开发出来用以提高基于 CRISPR/Cas9 系统的精确基因敲入效率，重点介绍这些方法如何优化 Cas9 敲入效率的最新进展。 基因编辑是针对靶基因进行插入、敲除和定点突变以完成精确修饰的基因工程技术 [1]，目前包括锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）技术、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）技术[2]。天然的CRISPR/Cas9 系统由Cas9，CRISPR 衍生 RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）3 部分组成，crRNA 和 tracrRNA 通过局部碱基配对形成引导RNA（guide RNA，gRNA），与 Cas9 蛋白结合并引导其识别和切割目标 DNA 序列 [3]。CRISPR 介导的基因编辑使研究人员能够使用 Cas9 和适当的 gRNA 在基因组特定位置有效地引入双链断裂，并且通过非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（homologous directed repair，HDR）2 种修复途径，实现突变或外源基因插入 [4]。NHEJ 修复方式通过在双链断裂处引入小的插入或缺失，造成基因移码突变；当外源模板存在时，可通过 HDR 实现基因的精准修复或片段插入 [5]。尽管 CRISPR/Cas9 可通过 HDR 介导基因敲入，但 HDR 仅在 G2 和 S 期细胞中活性较高，因此，对于神经元细胞等分裂缓慢或处于有丝分裂后期的细胞并不适用；此外，NHEJ途径是细胞中 DNA 修复的主要方式 [6]。因此，上述2 种因素导致 HDR 介导的基因修复效率较低，仅为0.1%~6.5%[7]。CRISPR 系统递送是实际应用的关键，目前它能通过 3 种形式被递送到细胞中，包括 DNA（质粒DNA）、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），不同的递送形式在病毒载体或非病毒载体的协助下进入细胞，从而完成靶标基因的编辑。第 1 种 DNA 递送需将 Cas9 蛋白、单向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）的 DNA 序列构建于质粒载体中，再对质粒进行病毒包装（如慢病毒、腺相关病毒等），最终 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列在病毒介导下进入细胞从而起始基因编辑。它操作简单且成本低，适用于基因功能的研究，但存在如下缺点：1）质粒载体过大，从而导致病毒包装效率和递送效率降低；2）DNA 序列需经转录、翻译形成 Cas9 蛋白、sgRNA 再起始编辑功能，降低了编辑效率；3）转染后的 Cas9 基因序列不易去除，导致 Cas9 蛋白长期存在细胞中，易引发更大的毒性和副作用 [8]。第2 种 mRNA 递送是将 Cas9 的 mRNA、sgRNA 序列在非病毒载体的介导下递送至靶细胞，起始基因编辑。这种递送形式的优点是由于 mRNA 无需转录，经翻译后即可启动基因编辑，使得编辑效率高于DNA 递送形式，且因 mRNA 不会长久维持在细胞中，从而降低了 CRISPR 系统的脱靶率。不过，由于 mRNA 的稳定性较差，对递送载体有较高要求。第 3 种 RNP 递送是将 Cas9 蛋 白、sgRNA 组装成RNP，然后通过非病毒载体直接递送于细胞中起始基因编辑，为目前最高效的 CRISPR/Cas9 基因编辑策略。该递送形式优势明显，递送至细胞后无需转录、翻译过程，直接起始基因编辑，从而能显著提高编辑效率，且 RNP 一般在细胞内 48 h 即可降解，不会在细胞中长期存在，从而降低了对细胞的毒性和不良影响，极大降低脱靶率，此外 RNP 递送不受细胞类型限制，使编辑更加精准、高效。但是 RNP转染的缺点是编辑时间较短，需在一段时间内提供足够的编辑工具，以便进行足够的编辑；并且，由于需要大量合成 Cas9 蛋白和 sgRNA，导致 RNP 转染的成本相对较高；在实验中选择RNP 转染还需要考虑 sgRNA 和 Cas9 蛋白的适配性。总之，CRISPR技术的快速发展提高了研究人员对细胞进行精确基因编辑的能力，但 CRISPR/Cas9 技术目前仍面临递送效率低、HDR 效率低、脱靶性，以及毒性和副作用等多种问题 [9]。鉴于 Cas9 诱导断裂的 HDR 效率相对较低，本文主要通过对供体模板及递送方式的优化，外源加入调控 NHEJ 或 HDR 相关信号通路、染色质开放或关闭状态、细胞周期的小分子化合物，构建敲除或过表达细胞系或利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）调控细胞信号通路关键蛋白的表达，以及对 Cas9 系统的优化等方法来优化Cas9 敲入效率，从而提高编辑的特异性和减少脱靶效应，提升基因编辑的传递效率和导入能力，并实现更大片段的精准编辑，加速了基因编辑技术向临床转化，对于解决基因编辑面临的主要难点具有重要意义。1供体模板的优化策略常见供体模板有质粒、双链 DNA（double strand DNA，dsDNA）和单链 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）3 种。质粒作为基因敲入模板，不仅制备周期长，且高浓度导入会造成较强的细胞毒性 [10]。因此，研究者常使用 dsDNA 或 ssDNA 作为供体模板。对于小片段的插入，通常选用 ssDNA 供体；对于荧光蛋白或基因表达盒等大片段插入，则一般选择dsDNA 和质粒供体。值得注意的是，左右同源臂一般以待敲入的目的细胞基因组为模板扩增，以避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源而降低 HDR 效率。由于通过同源重组修复途径敲入大于 2 000 bp 的长基因片段很难成功实现，因此，供体模板的设计是基因敲入实验所面临的主要挑战之一。下面将对模板选取及设计过程中可能遇到的问题进行归类分析，如根据敲入目标片段的长度和靶标的类型选择合适的模板的类型及设计最佳的同源臂大小来提高敲入效率（见表 1）。1.1供体模板的设计在基因编辑实验中，当插入目标片段长度小于 2 000 bp 时，ssDNA 在包含较短同源臂的情况下可以产生比 dsDNA 更高的 HDR 效率；无论使用 ssDNA 或 dsDNA 供体，使用非前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）链供体的HDR效率略高于PAM链供体，Liang等[11]研究表明，最优ssDNA的总长度约为200个碱基，30个碱基的3'端短同源臂和 40 个碱基的 5' 端长同源臂组成的不对称同源臂供体 DNA 在诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）中可实现 45% 的敲入效率。此外，当 sgRNA 的切割位点位于敲入位点上游 5 bp 或下游 3 bp 时，基因的敲入效率最佳。值得注意的是，为了避免二次切割，可将对应 sgRNA 的PAM 或邻近 PAM 的序列进行同义突变。当目标片段长度大于 2 000 bp 时，选择同源臂长度为 600 ~ 2 000 bp 的质粒或 dsDNA 更加合适。然而哺乳动物细胞中对于长片段 DNA 的精准插入效率非常低，Gao 等 [12] 开发了简单的基因组编辑方法，称为转录偶联 Cas9 介导的编辑（transcription-coupled Cas9-mediated editing，TEd）， 当 插 入 大DNA 片段时它可以实现比传统 Cas9 介导的编辑更高的效率。首先研究者发现处于转录耦合状态的供体 DNA 能够显著提高绿色荧光蛋白（gene fluorescent protein，GFP）的精准插入效率，随后基于上述发现设计开发了一系列优化的 TEd 基因编辑系统，通过在同源供体 DNA 上引入启动子以形成 TC-donor（transcription-coupled HR-donor）， 并在其转录产物 TC-RNA 的 3' 端添加多个 MS2 茎环结构（MS2 binding loops）以及在 Cas9 上融合 MS2适配体的结合结构域，该团队发现优化后的 TEd 系统对于 GFP 的精准插入效率可以达到传统方法的 10倍左右，并在高达 10 000 bp 的 DNA 片段敲入方面也获得了很好的效果。总之，在 Cas9 实验中，当插入片段长度小于2 000 bp 时，ssDNA 供体可提供更短的同源臂，获得比 dsDNA 形式的模板更高的插入效率；当目标片段长度大于 2 000 bp 时，应选择同源臂长度为 600 ~2 000 bp 的质粒或 dsDNA。与相同长度的 ssDNA 供体相比，长 dsDNA 供体更有可能产生细胞毒性：供体越长，细胞毒性就越明显，且增加较长 dsDNA 供体的浓度也会导致毒性的产生。dsDNA 供体的另一问题是它们更倾向于插入整个供体序列，包括同源组。此外，在设计 HDR 供体 DNA 的时候，还应该注意以下 2 点：1）如果在 HDR 实验中使用 Cas9 核酸酶，最好使用与目标 DNA 的 2 条链匹配的同源序列检测 ssDNA 供体；2）当使用 Cas9 系统时，要避免在 HDR 修复后重新产生 PAM 位点。设计 ssDNA供体序列，应在 PAM 位点引入同义突变，这样 RNP就不能识别修复后的序列。否则，Cas 核酸酶可能会重新切割修复后的 DNA，除了所需的 HDR 突变外，还会形成 NHEJ 介导的插入缺失。因此，设计 HDR供体模板时，要注意区分短型插入和长型插入。对于较短或中等长度插入，建议使用 ssDNA 作为 HDR 供体模板。根据敲入目标片段的大小选择合适的供体类型及最佳长度的左右同源臂，并对 PAM 位点引入同义突变，同时，也要考虑敲入不同靶标的难易程度，从而不断提高 HDR 介导的敲入效率。1.2 供体模板的修饰对供体模板进行化学修饰或组蛋白修饰将提高其稳定性及基因编辑效率。考虑到 dsDNA 在细胞内极易被降解、敲入效率低，Akhmetzyanova 等 [13] 研究发现，双链模板的末端修饰能提高供体的稳定性，他们采用体外合成 Cas9-RNP 和 5' 端修饰的短同源臂dsDNA 供体进行结合，选择了 13 种化学基团对双链模板进行修饰，并选用 HCT116 细胞进行筛选和效率测试，结果发现所有修饰均能在不同程度上提高编辑效率，其中利用化学基团 C6-聚乙二醇 5' 端修饰的dsDNA 模板能够将敲入效率提高为未修饰模板的 5~6 倍，并且在 293T 细胞中将长度为 700 bp DNA 片段的敲入效率提高到 65%。此外，在短的 ssDNA 模板的5'端或3'端添加硫代磷酸二酯键能提高其稳定性，减少核酸外切酶的影响，从而提高在 iPSC 和 Jurkat细胞等核酸酶水平高的细胞中的编辑效率。另外，在基于 HDR 的基因编辑中，通常以纯化或“裸露”的 DNA 为供体模板。但细胞中的DNA 是被组蛋白包裹成染色质的天然形式存在的，而组蛋白 H3K36 三甲基化（H3K36me3）是人类细胞HDR 至关重要的修饰，Cruz-Becerra 等 [14] 发现，与裸 DNA 供体模板相比，组蛋白修饰的染色质供体模板能够更有效地发生同源链配对，其基因编辑效率是裸 DNA 供体模板的 2.3~7.4 倍。综上，利用 5' 端化学修饰的 dsDNA 作为模板，结合高稳定和低脱靶性的 Cas9-RNP 递送，能够实现比未修饰情况下高出 5 倍的敲入效率，并且在人类胚胎肾脏细胞中对长度为 700 bp 的 DNA 片段实现了效率达 65% 的敲入。通过用更稳定的硫代磷酸二酯键替代磷酸键，对 ssDNA 供体进行末端修饰，可以增强其稳定性。该策略不仅大幅度地提高了敲入效率，也极大地缩短了制备周期，给未来的基因编辑实验和基因治疗手段提供了更大的可能性。另一方面，H3K36me3 和 H3K4me3 甲基化修饰介导人类细胞中的同源重组与 Cas9 融合，使得 HDR 效率提高了 3 倍，且减少了脱靶效应，证明了组蛋白修饰提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。1.3 供体模板与 Cas9 的递送形式目前有以下几种方法可将 CRISPR/Cas9 及其组分递送到目标细胞，包括 Cas9-RNP，Cas9-mRNA和 Cas9 质粒形式以及病毒、非病毒等载体。1.3.1 Cas9-RNP Cas9-RNP 复合物由 Cas9 蛋白和sgRNA 组成，该形式递送 Cas9 蛋白和 sgRNA 是最直接简便的方法，无需转录和翻译过程，能直接快速启动基因编辑过程，脱靶率低且毒性小。但由于Cas9-RNP 复合物尺寸较大不易包封，该形式递送存在一定的难点 [15]。Chandrasekaran等[15]通过电转将 Cas9/sgRNA导入原代 T 细胞，成功实现了近 40% 的基因编辑效率；进一步引入 HDR 模板，产生了 20% 的基因敲入效率。Kim等[16] 通过电转的方式将 Cas9/sgRNA 递呈至人红白血病细胞系（K562），通过改变 sgRNA靶向不同的位点，分别获得 16%~72% 的编辑效率，平均效率为 44%。在其他方式难以转染的人成纤维细胞和多能干细胞中，通过电转也能分别得到 19%和 23% 的基因编辑效率。1.3.2 Cas9-mRNA RNA 水平递送编码 Cas9 蛋白的mRNA 和 sgRNA，mRNA 能较快启动基因编辑，但该递送方法的局限性在于 mRNA 本身稳定性差且在体内外都容易受到 RNA 酶的降解，限制了基因编辑的持续时间，降低了基因编辑效果 [17]。Liu 等 [18] 发现结合了二硫键的脂质纳米颗粒BAMEA-O16B可以高效地将 Cas9 mRNA 和 sgRNA传递到细胞中。研究表明，使用BAMEA-O16B同时递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA 可以抑制 293T 细胞的 GFP 表达，基因编辑效率高达 90%。 1.3.3 Cas9 质粒 由于稳定性高、操作简单、成本低等优点，从 DNA 水平递送编码 Cas9 蛋白和sgRNA 的质粒成为常用的递送形式。然而递送质粒会降低基因编辑效率，延长 Cas9 切割时间从而增加脱靶率 [18-19]。Liu 等 [18] 设计了基于聚合物/无机杂化纳米粒子的双重靶向递送系统，将 CRISPR/Cas9 质粒递送至人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞核中，基因编辑效率高达90%。Zhang 等 [19] 研发了基于聚乙二醇-b-聚乳酸-羟基乙酸二嵌段共聚物 [poly (ethylene glycol)-b-poly (lactic-co-glycolic acid)，PEG-b-PLGA] 纳米颗粒的递送系统，其能够将 CRISPR/Cas9 质粒 DNA 递送至多个器官的血管系统中，并实现了 80% 的基因编辑效率。1.3.4 病毒和非病毒载体 病毒载体是 CRISPR/Cas9系统最常用的递送载体，但病毒载体可能会导致宿主产生有害的免疫原性和突变，限制了其应用；非病毒载体具有免疫原性低、无内源病毒重组的优点，因而纳米粒子制剂载体受到广泛的关注 [20]。基于阳离子脂质体的纳米颗粒常用于递送CRISPR/Cas9 系统，Zhang 等 [21] 合成了新型聚乙二醇磷脂修饰的阳离子脂质纳米粒子递送系统，从而使体外 A375 细胞的转染效率达 47.7%，且含有酯基的可生物降解的脂质样化合物在体内外均表现出有效的 Cas9 mRNA 递送。壳聚糖也是良好的聚合物载体，Qiao 等 [22] 将红色荧光蛋白包封在壳聚糖中形成带正电荷的纳米颗粒，将 Cas9-RNP 和 ssDNA 供体同时递送到细胞质中，具有很高的基因组编辑效率且无细胞毒性。目前，基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的与递送载体相关的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对 Cas9 或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。与长期表达的递送方式相比，瞬时递送的优势就在于能够降低脱靶的概率，这在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期表达时也可能导致癌变。Cas9-mRNA 为快速、稳定性差且在体内外都易受到降解的递送形式，适用于周期短的实验研究；Cas9 质粒稳定性高、操作简单、成本低，是常用的体外递送形式，但由于各类转染试剂存在细胞毒性，并且切割时间长，容易引起脱靶效应；与以 DNA/RNA 为基础的递送技术相比，RNP 体系直接在体外将 Cas9 蛋白和 gRNA 组装形成 RNP 复合物，通过电转法等方式导入靶细胞，实现 Cas9 的瞬时表达。该递送形式使细胞毒性更低，半衰期更短，同时采用其进行基因编辑可带来更低的脱靶效应。由于 RNP 在血液中易被蛋白酶降解，RNP 介导的CRISPR 基因编辑更多用于体外实验 [23]。目前病毒载体仍然是临床试验的常用载体。病毒载体可实现高转染效率，但是存在包装外源片段长度有限、免疫原性强和具有潜在脱靶效应等局限性。其中，慢病毒宿主范围广，基因容量大，感染效率高，能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，具有多种血清型，体内扩散能力强，常用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。非病毒载体的原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移，包括脂质纳米颗粒、电穿孔、细胞穿透肽等作为递送方式。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，但实验耗材成本高，存在细胞毒性，部分细胞类型递送效率低 [24-25]。因此，研究人员可根据实验需求选取合适的递送方式，例如 Cas9-RNP，Cas9-mRNA，Cas9 质粒以及通过病毒和非病毒载体包装的递送系统，包括阳离子脂质体的纳米颗粒、壳聚糖等，从而能在体内外有效提高基因编辑效率。2 调控 DNA 双链断裂修复的小分子化合物 如前所述，自然界中 HDR 的频率非常低，哺乳动物细胞通过多种机制优先使用 NHEJ 进行 DNA 双链断裂（double-strand break，DSB）修复，除了有丝分裂外，NHEJ 在整个细胞周期中都是活跃的，而 HDR 仅限于 S 期和 G2 期活跃。研究表明，NHEJ小分子抑制剂、HDR 激活剂和细胞周期抑制剂可影响 DSB 修复的不同方面，使 DSB 修复平衡转向HDR，有利于提高 CRISPR/Cas9 系统的基因敲入效率（见图 1），如细胞周期抑制剂可通过延长细胞周期的 S 期和 G2 期的长度以提高 HDR 的效率 [26]。目前开发的小分子化合物已被用于提高 HEK 293细胞、人类 iPSCs、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和小鼠胚胎中的 HDR 效率（见表 2）。2.1 调控 HDR 与 NHEJ 相关信号通路的小分子 参与双链断裂 DNA 修复途径的某些小分子通过作用于 DNA 修复过程中的关键蛋白以有效提高敲入效率（见图 1）。DNA 修复途径包括 HDR和 NHEJ。HDR 激活剂或 NHEJ 抑制剂可有效提高 HDR 敲 入 效 率。 其 中 HDR 激活剂有 RS-1 和brefeldinA；NHEJ 抑制剂包括 SCR7，L755507，NU7026，白藜芦醇，NU7441 和 KU-0060648。RAD51 是有丝分裂细胞中催化 DNA 同源重组修复过程中同源配对的唯一蛋白，其通过介导 DNA链配对和交换而参与 DNA 同源重组修复。Song 等[27]研究表明，RS-1 可激活 RAD51 蛋白，使 RAD51 蛋白与 DNA 的结合更稳定，从而将 HDR 修复效率提高 3 倍，值得注意的是，高浓度 RS-1 具有较强的细胞毒性。胞内蛋白运输抑制剂能抑制物质从内质网向高尔基体的运输，Hong 等 [28] 研究发现，使用胞内蛋白运输抑制剂 brefeldinA，可将 HDR 效率提高 2 倍。DNA 连接酶Ⅳ（DNA ligase IV，LIG4）是 NHEJ途径的关键酶，Ray 等[29] 发现 SCR7 是 LIG4 的抑制剂，能抑制 NHEJ 活性，在 A549 细胞中，相较于未处理的对照组，SCR7 使靶位点的插入效率提高约 3 倍。β3-肾上腺素能受体是一类 G 蛋白偶联受体，Murakami等 [30] 研究发现 L755507 和 NU7026 是β3-肾上腺素能受体激动剂，可增强 CRISPR 介导的HDR 效率，最佳使用剂量为 5 μmol·L-1，并且在 24 h以内效果最佳，可将敲入效率提高 3 倍。为了研究DNA 依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）对 DSB的 NHEJ 修复途径的影响，Sak 等 [31] 评估了 DNAPKcs 特异性抑制剂 NU7441 对不同状态的非小细胞肺癌细胞株 DSB 修复的细胞周期特异性作用，结果显示 NU7441 以细胞周期依赖性的方式抑制 NHEJ的效率。Robert 等 [32] 研究显示，DNA 蛋白激酶抑制剂 NU7441 和 KU-0060648 能抑制 NEHJ 活性，将 HDR 效率提高 3 倍。Li 等 [33] 研究发现，白藜芦醇可抑制 LIG4 的表达，使猪胎儿成纤维细胞的 HDR 效率提高 2~3 倍。此外，他们还发现白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制 S 期猪胎儿成纤维细胞，而 HDR 相关基因如RAD51 和 RAD52 的表达与白藜芦醇呈剂量依赖性增加。因此，白藜芦醇通过与多个 DNA 损伤相关蛋白相互作用，增加了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率。综上，为了提高 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率，研究人员可选择性使用小分子化合物，如 HDR 激活剂 RS-1 和 brefeldinA 分别作用于靶标 RAD51 和高尔基体，将敲入效率提高 2~ 3 倍；NHEJ 抑制剂包括SCR7，L755507，NU7026，NU7441，KU-0060648和白藜芦醇等，通过作用于不同的靶标，主要有LIG4，DNA 蛋白激酶和 β3-肾上腺素能受体，抑制NHEJ 修复途径，从而使 HDR 修复效率提高 2~5 倍。2.2 调控染色质开放或关闭状态的小分子靶向 DSB 的可及性主要取决于染色质状态，并且 DNA 有效修复的第一步是允许修复途径相关的蛋白质结合，HDR 与 NHEJ 的修复平衡与染色质结构的状态相关。染色质结构的开放或关闭状态主要由组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡控制，而组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）严格调控。乙酰化导致开放活跃的染色质状态，HDAC 使组蛋白去乙酰化，实现染色质致密卷曲。HDAC 抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化水平，促进开放染色质位点，从而调控CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 [34]。HDAC 抑制剂能抑制 NHEJ 关键因子的去乙酰化，显著增加 G2/M 期的细胞百分比，并相应减少了 G1/S 期的细胞数量，从而促进HDR 修复途径。Li 等 [35] 通过评估组蛋白修饰剂如 HDAC 抑制剂和HAT（靶点包括 p300/CBP，Tip60 和 MOZ）抑制剂对 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑效率的影响，证明了抑制 HDAC1 和 HDAC2 的活性，能够增强 HDR介导的基因敲入效率；相反，抑制 HDAC3 会降低基因编辑效率。因此，HDAC 抑制剂作为内源性途径调控因子，能抑制 NHEJ 修复途径，提高 HDR 修复效率，为细胞自身修复途径的基因编辑提供有力条件。2.3 调控细胞周期的小分子由于 HDR 发生在细胞周期的 S 期和 G2 期，所以一些研究将细胞周期抑制剂与基因编辑相配对，使细胞周期同步化并将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或G2 期从而提高 HDR 效率（见图 2）。细胞周期抑制剂通过抑制微管聚合来使细胞停滞在 G2/M 期。Lin 等 [36] 对 6 种可逆化学细胞周期抑制剂进行了评估，包括 4 种 G1/S 阻滞剂（阿菲迪霉素、羟基脲、含羞草素和胸腺嘧啶），1 种 G2/M阻滞剂（诺考达唑）和 1 种 M/G1 阻滞剂（洛伐他汀），该研究发现诺考达唑和另一 G2/M 阻滞剂（ABT-751）可通过作用于 β 微管蛋白来增强 CRISPR/Cas9 活性，将 HDR 修复效率提高 3~6 倍。周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是调节细胞周期进程的异二聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在 S 期阶段该酶的活性增加激活了 HDR修复通路的关键标志，如激活 DNA 末端切除过程。Smirnikhina 等 [37] 利用 CDK 抑制剂靛红素，通过在S 期或 G2 期阻滞靶细胞，提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。细胞分裂周期7 相关蛋白激酶（cell division cycle seven associated protein kinase，CDC7）属于丝氨酸-苏氨酸激酶，可被 Dbf4 依赖性激酶（Dbf4-dependent kinase，DDK）激活，是细胞进入 S 期的必要因子，抑制 CDC7 蛋白可导致细胞周期停滞在 G1/S 期。CDC7/DDK 复合体使微小染色体维持蛋白（minichromosome mantenance protein，MCM） 维 持 磷 酸 化， 从 而 启动 G1/S 期的过渡。Wienert 等 [38] 研究发现 XL413 为CDC7 抑制剂，能够可逆地阻断 MCM 的磷酸化，并在 S 期早期阻滞细胞。在 K562 细胞中，XL413将增强型蓝色荧光蛋白（enhanced blue fluorescence protein，EBFP）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的基因编辑效率分别提高了1.4 和 1.8 倍。此外，敲低蛋白 CDC7 能在可逆的 S 期减缓过程中激活 HDR 途径，使许多情况下（包括原代 T 细胞）的 HDR 修复效率提高 3.5 倍。综上，使用不同细胞周期蛋白抑制剂将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或 G2 期可针对性地提高 HDR 修复效率。不过，细胞周期抑制剂可能引起部分细胞凋亡，研究者需要进行预实验探索最适浓度。3调控 DNA 双链断裂修复的关键蛋白表达 除了 NHEJ 抑制剂或 HDR 激活剂，还可通过构建敲除细胞系或利用 siRNA/ 短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低或过表达修复通路关键蛋白来提高 CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 效率，如敲低 Ku70，Ku80，DNA-PKcs，p53 结合蛋白 1（p53-binding protein 1，53BP1），以及过表达 RAD51 和RAD52（见表 3[39-48]），具体作用机制如图 3 所示。Chu 等 [39] 发现，在 HEK293/TLR 细胞中，Ad4蛋白处理能降低 LIG4 的表达，显著抑制了 NHEJ的效率。该研究还发现利用 siRNA 降低 LIG4 的表达可使 HDR 效率提高 2.8 倍。Li 等 [40] 利用 siRNA减少 NHEJ 通路中关键因子 Ku70 和 Ku80 的表达，增加了多个 HDR 效率，包括同源重组、单链退火和单链寡核苷酸介导的 DNA 修复。DNA-PKcs 是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶（phosphoinositide 3-kinase-related kinase，PIKK）家族的成员，该家族包括具有高度同源的催化结构域的蛋白质，如 PI3K，毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated protein，ATM），ATR（ATM and Rad3 related）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[41]。DNA-PKcs 的激酶活性在 NHEJ 启动步骤中起着重要作用，Liu 等 [41] 研究表明 DNA-PKcs表达下调可使 HDR 效率增加 2.8 倍。53BP1 是真核细胞中 DSB 修复途径选择的关键调控因子，通过抑制末端切除导致 NHEJ 优先于HDR，使得 HDR 启动受限。Canny 等 [42] 通过阻断53BP1 在 DNA 损伤位点的积累，发现53BP1 抑制剂可以提高人类和小鼠细胞中 HDR 依赖基因组编辑的效率，最高可提高 5.6 倍，并提高了基因靶向性和与 dsDNA 或 ssDNA 供体的染色体基因转换。RAD51 和 RAD52 是 HDR 过程中的关键蛋白，Kurihara 等 [43] 研究发现在神经元细胞中共转染过表达 RAD51，敲入效率提高了 2.5 倍。Shao 等 [44] 研究显示，RAD52 在 293T 细胞中的过表达，使 HDR修复效率增加 3 倍。该课题组还发现 RAD52 和SCR7 的联合使用将 HDR 效率提高约 40%。CtBP相互作用蛋白（CtBP-interacting protein，CtIP） 是 同 源 重 组 早 期 步 骤 的 关 键 蛋 白， 主 要作为辅因子诱导减数分裂重组蛋白 11（meiotic recombination 11，MRE11）核酸内切酶对 DNA 末端切割，激活 HDR 途径 [45]。Charpentier 等 [46] 研究发现，CtIP 最小的 N 端片段可激活 HDR 修复，从而提高了靶位点的基因编辑效率。Engeland 等 [47] 研究显示，P21 蛋白与许多转录因子相互作用，P21 蛋白能抑制 CDK4 的活性，使周期抑制蛋白 Rb 不能发生磷酸化，细胞周期相关转录因子 E2F 不能释放，进而使细胞周期停滞在 S/G1 期，从而增加 HDR 效率。Gutshner 等 [48] 试图通过直接同步 Cas9 的表达与细胞周期进展来激活 HDR 修复活性，结果发现将人 Geminin 蛋白的 N 端区域与 Cas9 融合，诱导Cas9 在 G1 期降解，使目标 DNA 切割限制在 S/G2 期，HDR 效率增加至 87%。综上，干扰或过表达 DSB 修复途径关键蛋白的策略有利于生成精确基因修饰的细胞系和生物体，研究者可通过 siRNA 减 少 Ku70，Ku80，LIG4，DNA-PKcs，53BP1，CDK，CtIP 等表达或对蛋白RAD51 和 RAD52 过表达从而提高 HDR 修复效率，抑制 NHEJ 修复活性。除了通过调控 DSB 修复的关键蛋白表达的策略之外，Ye 等[49] 开发了新的方法，用 CRISPR 激活（CRISPRa） 或 CRISPR 沉 默（CRISPRi）来调节NHEJ 和 HDR 通 路，CRISPRi 或 CRISPRa 复合物能抑制 NHEJ 修复途径并激活 HDR 修复，显著提高CRISPR 介导的基因编辑的 HDR 效率。4优化 Cas9 系统从 Cas9 蛋白的性质出发，如表面电荷、末端残基及拓扑结构，可以对其进行修饰或改造，使其更适配于不同载体系统的体内递送，促进 Cas9-RNP的基因编辑。具体包括如下方法：1）Cas9 核酸酶的末端修饰，如添加标签蛋白或融合蛋白结构域；2）基于 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理对其进行工程化改造，从而筛选出优异的 Cas9 突变体；3）对 Cas9 拓扑结构进行调整，如与特定蛋白功能域融合，或同时表达多个 sgRNAs 或 Cas9 实现 CRISPR/Cas9 系统的多重编辑及调控 [50]。4.1 Cas9 的修饰 CRISPR/Cas9 介导的同源重组修复是由 Cas9在 gRNA 介导的双链断裂后，在切割位点利用供体DNA 进行的修复途径。供体 DNA 在切割位点的富集程度将决定同源重组能否发生，供体 DNA 在切割区域的低浓度是同源重组的限速步骤。基于此问题，Ling 等 [51] 采用非天然氨基酸偶联技术实现 Cas9 蛋白与供体 DNA 的直接或间接偶联，将其共递送进入体内，实现切割区域供体 DNA 的有效富集，在细胞水平实现同源重组水平大幅提升10~20 倍。此外，使用含叠氮基的氨基酸对 Cas9 蛋白进行化学修饰，通过加成反应缀合供体 ssDNA 或DNA 衔接子，从而将修饰的或未修饰的供体 DNA模板募集到 RNP 复合物中，结果显示用 G1367-AeF（苯丙氨酸突变位点 G1367）RNP 和二苄基环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）修饰的 ssDNA 共转染细胞的 HDR 效率增加了1.6 倍。Huang 等[52] 开发了 Cas9 ProSNA-sgRNA 核糖核蛋白递送系统，通过在 Cas9 蛋白 N 端修饰 3 个连续的 GALA 肽促进核递送效率。结果显示 Cas9 ProSNA RNP 在 4 种不同的细胞中的基因编辑效率为 32%~47%。4.2 Cas9 突变体 CRISPR/Cas9 推动了基因编辑技术的发展，但PAM 要求限制了精确基因编辑方法的适用性，使目标编辑发生在 PAM 的特定距离或特定范围内 [53]。不过，随着人们对 Cas9 蛋白三维结构和作用机制的深入认识，通过对 Cas9 蛋白进行工程化改造就逐渐成为优化提升 CRISPR/Cas9 系统的有力手段。该方法以 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理为指引，对Cas9 蛋白相应的结构域进行设计改造，来筛选性能更为优异的 Cas9 突变体。Huang 等 [54] 研究发现通过定向进化生成的 4 种Cas9 突变体能够共同靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。结果显示 Nme2Cas9 突变体成功突破了传统 PAM 的限制，并实现高效的基因编辑。Wang 等 [55] 研究发现将微生物单链退火蛋白（single chain annealing protein，SSAP）与催化失活的 dCas9结合形成无切割的基因编辑器 dCas9-SSAP 具有较低的目标误差和最小的脱靶效应，可有效插入千碱基的序列，效率约达 20%。4.3 Cas9 蛋白与特定功能蛋白融合目前通过将特定蛋白或功能域与 Cas9 融合，可以有效提高 HDR 敲入效率。单碱基编辑和引导编辑器（prime editor，PE）编辑可实现精准的碱基替换和片段的插入而无需 DSB过程。该系统通过对靶位点的“搜索”和“替换”，可实现 4 种碱基之间的任意替换及小片段的精准插入和删除，克服了 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率低和碱基编辑系统不能实现碱基颠换的困难 [56]。 Peterka 等[57]将逆转录酶和野生型 SpCas9 进行融合构建了 PEn 蛋白，利用常规的先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA，pegRNA），PEn可通过同源依赖性 DSB 修复机制实现小 DNA 插入，效率达 50%。Jiang 等 [58] 将具有双链切割活性的 Cas9 与逆转录酶融合，并结合 2 条靶向互补 DNA链 pegRNA，开发出了 PEDAR 系统，它可以高效地诱导 20 ~ 700 bp 片段的缺失和 30 bp 片段的插入。Adikusuma 等 [59] 同样利用野生型 SpCas9 构建了新的PE 系统，并且将蛋白、pegRNA 和 nicking sgRNA 整合在同一质粒中进行表达，该系统在 293T 细胞中平均编辑效率可达 67%。此外，将该系统注射小鼠胚胎，在新生小鼠中最高可以实现 100% 的编辑效率。Aird等[60]将HUH核酸内切酶与Cas9融合表达，实现了稳定的共价 RNP-ssDNA 复合体，结果显示通过 HUH-Cas9 融合蛋白与 ssDNA 共价结合可使HDR 效率增强 30 倍。Ma 等 [61] 将最小基元 Brex27与 spCas9 融合构建成 miCas9，研究发现以 Cas9-mRNA 形式递送时，miCas9 的编辑效率提高了 2.5倍；此外，Ma 等 [62] 将 Cas9 与全长睡美人（sleeping beauty，SB）转座子（Cas9- SB）、SB 的 RED 结构域（Cas9-N123） 和 SB 的 PAI 结 构 域（Cas9-N57）融合，经流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析显示，Cas9-N57 融合蛋白将 HDR 编辑效率提高了 1.5 倍。由于 HDR 增强子（HDR-enhancer，HE）是同源重组早期阶段的关键蛋白 CtIP 发挥活性所必需的最小 N 末端多聚化结构域，因此 HE 可通过增强HDR 提高Cas9 基因敲入效率。Charpentier 等 [63] 将HE 与 Cas9 融合，结果显示 Cas9-HE 融合物在包括人类细胞系、iPSCs 和大鼠受精卵中获得的基因编辑效率为仅用 Cas9 的 2 倍或更高。如前所述，Cas9-HE 融合物允许在若干实验系统中获得更高的转基因整合效率。此外，使用 Cas9-HE 非常简单且不需要使用基因修饰的细胞或药理学试剂，极大地提高了基因编辑应用的靶向范围，从而有利于提高 HDR 效率。HDR 和 NHEJ 之间的平衡与位点特异性的染色质状态相关。研究发现 CRISPR/Cas9 诱导 DSB的 NHEJ 修复效率在常染色区域较高，而微同源末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）和 HDR 偏向异染色质 [64]。因此可通过染色质重塑因子来调控染色质状态，使平衡偏向 HDR。Chen 等 [65] 将染色质重塑因子 PRDM9 与 Cas9 融合，将 HDR 效率提高了 3 倍，且未增加脱靶效应。 综上所述，将 Cas9 蛋白与特定功能蛋白，包括逆转录酶、内切酶、同源重组关键蛋白以及染色质重塑因子，融合表达的策略具有较高的基因组特异性，是未来基因组工程应用的有效工具。4.4 gRNA 优化和表达策略多重编辑CRISPR/Cas9系统与 TALEN 和 ZFN等核酸酶相比具有很大优势，其意味着多个 sgRNAs或 Cas9 能够同时表达从而极大地提高了 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑或转录调控的效率和靶向范围，多重编辑性使该系统在生物工程领域得到极大应用和发展。Hsieh-Feng 等 [66] 研究表明，高效表达多个 sgRNAs 在实现优化或多重基因组编辑中起着关键作用，研究发现各种 CRISPR/Cas9 的表达盒配置、转录本处理过程和传递策略都优化 sgRNA 的表达。此外，通过修饰或改变 sgRNA 识别区长度，可实现 CRISPR 系统的多重编辑或调控。CRISPR/Cas9 系统的特异性主要体现在 sgRNA对 Cas9 切割位点的特异性识别与结合，增强细胞内sgRNAs 的稳定性和特异性有助于提高基因组编辑效率，减少脱靶效应。基于 sgRNA 的骨架结构，可在特定位点进行修饰或改造，例如截短或延长 sgRNA 的 5'端或 3' 端来增减其长度；引入 2' 核糖化学修饰 sgRNA的骨架。此外，sgRNA 含有保守的核酸序列，可合理设计与之碱基互补配对的序列，复合成双链连接到载体上，从而提高递送效率 [67]。Wang 等 [68] 针对 sgRNA种子区核糖 2'-OH 与 Cas9 蛋白之间的相互作用位点，发现可利用特定位点的化学修饰来调节Cas9蛋白活性，通过在这些特定的位点引入 1 个发光性基团，实现了Cas9 活性的光学控制，从而间接调控基因编辑效率。综 上， 研 究 人 员 通 过 工 程 化 Cas9 蛋白或sgRNA 等方式，使 CRISPR/Cas9 系统的靶向范围、靶向特异性和保真性均得到了拓展和提高。当然，无论是通过针对 Cas 蛋白自身结构的优化改造，还是采用优化设计 sgRNA 等方式，均能在一定程度上提升 CRISPR/Cas9 系统的应用性能。5总结与展望CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 是精确可控的基因组 DNA 编辑工具 [69]。然而，由于哺乳动物细胞对NHEJ 的偏好性大于 HDR，基于 HDR 的精准基因敲入效率很低，因此，综合考虑细胞周期和 DSB 修复的关系对于提高基因敲入效率至关重要。目前，可采用在 ssDNA 或 dsDNA 供体末端引入化学修饰以增强供体稳定性，供体共价连接到CRISPR/Cas9 系统上提高切割位点局部浓度的方法提高基因敲入效率。但这些方法存在操作困难、成本高等问题。因此，需要进一步优化供体模板，以促进 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入在临床治疗中的应用。此外，该系统还受限于 PAM 序列的依赖性和脱靶效应，应用在人类疾病基因治疗时需要提高其保真性、安全性等因素。例如通过优化 Cas9 蛋白或gRNA 从而拓宽 PAM 序列识别范围并提高靶向特异性，通过融合效应结构域或进行转录调控。CRISPR/Cas9 系统在临床试验中的递送主要依赖于物理途径和病毒载体，这受到细胞损伤和安全性问题的严重阻碍。非病毒纳米载体的开发将有助于拓展 CRISPR/Cas9 系统的医学应用。有效和安全的递送策略仍然是 CRISPR/Cas9 系统临床应用的主要挑战。研究人员需根据每种 CRISPR/Cas9 模式的作用机制和理化性质，合理设计载体，使基因组编辑效率最大化，脱靶风险最小化。尽管研究人员已对 CRISPR/Cas9 技术进行了广泛的探索，但该技术的特异性还有待进一步提高，以减少脱靶风险，确保安全性。此外，CRISPR/Cas9系统具有多重编辑的优势，可应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行筛选，极大促进了基因编辑技术在生物工程领域的发展和应用。然而，对于 sgRNA 在细胞内的机制及其对Cas9 竞争作用的了解仍有待加强。参考文献 ：[1] Cong L, Zhang F. 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Subretinal injection of ATSN-201 was well tolerated in all patients in first cohort with no serious adverse events reported Enrollment is ongoing in first clinical trial utilizing AAV.SPR, the company’s novel spreading capsid March 13, 2024 -- Atsena Therapeutics, a clinical-stage gene therapy company focused on bringing the life-changing power of genetic medicine to reverse or prevent blindness, today announced dosing has been initiated in the second cohort of the LIGHTHOUSE study, a Phase I/II clinical trial evaluating subretinal injection of ATSN-201 for the treatment of X-linked retinoschisis (XLRS). ATSN-201, a best-in-class gene therapy product candidate, leverages AAV.SPR, the company’s novel spreading capsid, to achieve therapeutic levels of gene expression in photoreceptors of the central retina while avoiding the surgical risks of foveal detachment. ATSN-201 was well tolerated in all three XLRS patients in the first cohort and no serious adverse events were reported. The Data and Safety Monitoring Board recommended proceeding with the second cohort, in which patients will receive the next dose level of ATSN-201. "We are encouraged by the excellent safety observed with the low dose of ATSN-201 in the LIGHTHOUSE study, which represents the first clinical utilization of AAV.SPR. Additionally, initial indications of structural and functional improvement observed within and beyond the injection areas suggest successful lateral spread of the vector,” said Kenji Fujita, MD, Chief Medical Officer of Atsena Therapeutics. “Advancing into the second cohort brings us one step closer to potentially bringing a much-needed one-time treatment to patients with XLRS, an inherited retinal disease that causes progressive vision loss and can lead to blindness.” The LIGHTHOUSE study is a Phase I/II, open-label, dose-escalation and dose-expansion clinical trial evaluating the safety and tolerability of ATSN-201 in male patients ages 6 and older with a clinical diagnosis of XLRS caused by pathogenic or likely pathogenic mutations in RS1. Enrollment in the LIGHTHOUSE study is ongoing. For more information, visit ClinicalTrials.gov (Identifier: NCT05878860). XLRS is a monogenic X-linked disease caused by mutations in the RS1 gene which encodes retinoschisin, a protein secreted primarily by photoreceptors. RS1 is localized to the extracellular surface of rods, cones, and bipolar cells. XLRS is characterized by schisis, or abnormal splitting of retinal layers, which causes impaired visual acuity that is not correctable with glasses and leads to progressive vision loss and ultimately blindness. XLRS primarily affects males and is typically diagnosed in early childhood. Approximately 30,000 males in the U.S. and EU have XLRS, for which there are currently no approved treatments. AAV.SPR, one of Atsena’s novel capsids, spreads laterally beyond the subretinal injection site to enable safe and efficient transduction of the central retina (where schisis cavities predominate in XLRS patient retinas) when injected into areas outside the macula. A preclinical study in non-human primates demonstrated that AAV.SPR promotes transgene expression well beyond subretinal injection bleb margins. This is in stark contrast to benchmark AAV vectors, which remain confined to the original bleb margins. At clinically relevant doses, AAV.SPR efficiently transduces foveal cones without the need for surgical detachment and does not cause inflammation. For more information about the preclinical study and how AAV.SPR works, visit https://atsenatx.com/our-approach/laterally-spreading-aav/. Atsena Therapeutics is a clinical-stage gene therapy company developing best-in-class treatments for the reversal or prevention of blindness from inherited retinal diseases. The company’s lead program is evaluating ATSN-201 in an ongoing Phase I/II clinical trial for X-linked retinoschisis (XLRS), a progressive genetic condition affecting boys and men that is typically diagnosed in childhood. Another ongoing Phase I/II clinical trial is evaluating ATSN-101 for Leber congenital amaurosis type 1 (LCA1), one of the most common causes of blindness in children. Atsena’s pipeline is powered by novel adeno-associated virus (AAV) technology tailored to overcome the hurdles presented by inherited retinal diseases. Founded by pioneers in ocular gene therapy, Atsena is led by an experienced team dedicated to addressing the needs of patients with vision loss. The content above comes from the network. if any infringement, please contact us to modify.