mTORC1 x AMPK

即使在氧充分的条件下（有氧糖酵解/Warburg效应），癌细胞上调葡萄糖的糖酵解途径形成乳酸，这个过程被认为是恶性肿瘤的标志。代谢活跃的癌细胞导致营养消耗、缺氧、酸性、有毒的代谢物富集的肿瘤微环境，抑制免疫系统。 肿瘤细胞代谢与肿瘤微环境 （Nat Rev Cancer . 2020 Sep;20(9):516-531） 本文简介肿瘤细胞代谢调节的5条信号通路。 其他代谢相关文章，请点击下面链接阅读 23种代谢产物与肿瘤免疫 T细胞代谢与功能的关系 1. Hippo Pathway Hippo通路控制细胞增殖、器官大小和组织稳态。它由MAPK家族、MST1/2、LATS1/2以及转录共激活因子YAP和TAZ组成。 当该通路被激活时，上游信号磷酸化并激活MST1/2和LATS1/2，从而磷酸化YAP/TAZ。因此，YAP/TAZ通过14-3-3蛋白被隔离在细胞质中，并被E3连接酶β-TRCP降解。 Annu Rev Pathol. 2021 January 24; 16: 299–322 然而，当Hippo信号通路关闭时，YAP/TAZ易位到细胞核，与转录增强相关域(TEAD)转录因子结合，诱导致癌靶基因的表达。 Hippo通路受到广泛的上游调控因子的调控，包括细胞-细胞接触、来自周围环境刺激、Wnt信号传导、GPCR-配体相互作用和各种细胞应激条件。 YAP/TAZ促进糖酵解和谷氨酸代谢 YAP/TAZ活性在许多类型的癌症中都是过度活跃。hHippo通路作为细胞生长的主调节因子，参与了多种代谢过程。YAP/TAZ活性通过直接和间接提高糖酵解酶活性来促进糖酵解。特别是，YAP/TAZ的活性增加了TEAD对GLUT3的表达，并通过FOXC2诱导了HK2的表达。YAP/TAZ还通过Hedgehog信号通路促进LncRNABCAR4的表达，上调HK2和PFKFB3。YAP/TAZ增强谷氨酰胺代谢，增加乳腺癌细胞中谷氨酰胺转运体SLC1A5和SLC7A5的表达。YAP/TAZ和TEAD通过表达氨基酸转运体上调谷氨酰胺和氨基酸代谢。YAP/TAZ诱导谷氨酰胺酶和转氨酶的表达，包括GOT1和PSAT1，它们产生NEAAs和TCA循环中间体。YAP/TAZ积累脂质，直接调节胆汁酸成分，从而增强癌细胞的转移潜能。 葡萄糖增强YAP/TAZ的活性 细胞周期进程和细胞增殖由营养物质浓度决定。葡萄糖代谢对YAP/TAZ活性有显著影响。高糖水平增加了HSP的葡萄糖通量，产生用于糖基化的UDP-GlcNAc。因此，丰富的葡萄糖诱导YAP O-GlcNAcylation，干扰LATS和βTrCP的相互作用，进而增强YAP/TAZ的活性。在胰腺癌和肝癌中，YAP被O-GlcNAcylation过度激活。 LATS2的糖基化通过干扰乳腺癌中LATS2和MOB1的相互作用来抑制其活性。相反，葡萄糖剥夺诱导的能量应激通过hippo依赖和非依赖的机制抑制YAP/TAZ活性。能量传感器AMPK随着ATP的减少而被激活。AMPK直接磷酸化YAP的丝氨酸61和丝氨酸94，从而阻断YAP-TEAD的相互作用。AMPK通过AMOTL1磷酸化和激活间接抑制YAP。 外部激素水平可以调节Hippo通路。脂质激素，如溶血磷脂酸和鞘氨醇-1-磷酸，通过GPCRs抑制该通路，肽激素胰高血糖素增加血糖水平，通过cAMP和PKA激活Hippo通路。 脂肪增强YAP/TAZ的活性 亚细胞脂质成分也可以调节Hippo通路激酶。SREBP是Hippo通路的上游调控因子。当SREBP被激活时，甲羟戊酸途径增强了RhoAGTPase的香叶酰化。RhoA是一个f-actin的细胞骨架调节因子，而f-actin是一个成熟的LATS激酶的上游因子。因此，癌细胞中脂肪酸代谢的增加会异常激活RhoA，并通过抑制LATS来增强YAP/TAZ的活性。 有趣的是，YAP/TAZ在血液系统恶性肿瘤中几乎不表达，而YAP的强制表达已被证明可以介导肿瘤抑制功能。 2. PI3K-AKT/mTOR Pathway 在正常细胞中，细胞的增殖和合成代谢受到外部生长因子（如胰岛素和激素）的微妙调节，PI3K-AKT-mTOR通路是其中一条重要通路。 PI3K/AKT信号通路调节代谢酶。在被胰岛素激活后，AKT通过磷酸化GSK3来抑制糖原合成途径。PI3K/AKT通过代谢酶的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）直接或间接上调糖酵解。例如，AKT磷酸化并激活AS160蛋白，从而增强了GLUT的膜运输。AKT通过抑制磷酸化直接抑制TXNIP，通过抑制内吞作用增加GLUT1/4的膜表达。 AKT还提高了糖酵解酶的效率。AKT通过增加HK2的线粒体整合来磷酸化并激活HK2。AKT使PFKFB磷酸化；这种变化催化果糖-6-磷酸到F-2,6-BP，从而提高糖酵解。AKT信号通路也通过HIF-1α转录因子促进糖酵解。HIF-1激活一些糖酵解组分，包括GLUT。HIF-1诱导LDH促进乳酸分泌和有氧糖酵解。 PI3K/AKT信号通路上调谷氨酰胺和脂肪酸代谢。AKT通过mTORC1增加Myc的翻译，并通过GSK3和FOXO3A抑制Myc的降解。由于MYC调节谷氨酰胺代谢，MYC的激活增加了细胞氮的供应。因此，AKT促进了核苷酸的合成。癌细胞需要从头脂质合成来维持和供应持续的无限细胞分裂所需的膜成分。AKT通过直接磷酸化脂质合成的第一个酶ACLY，影响脂质的新生生物合成过程，从而提高酶的效率。AKT通过ACLY调控增加各种癌症类型中的组蛋白乙酰化 AKT诱导的mTORC1激活增强了SREBP家族的翻译和切割加工。AKT介导的GSK3抑制进一步阻止了SREBP1的降解。因此，了解通过PI3K/AKT信号通路的代谢重编程将阐明PI3K抑制剂对癌症治疗的有效治疗替代方案。 3. Myc Pathway 转录因子c-Myc通过MAX调控基因表达，是癌细胞中最过度活跃的基因之一，位于生长相关信号通路(如EGFR、AKT和GPCRs)的交叉点。 Myc调节与葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸代谢相关的基因的表达。Myc通过上调糖酵解和谷氨酰胺水解来增强癌细胞的代谢重。Myc诱导许多糖酵解酶(如GLUT、HK2和PFK)，它们催化糖酵解过程相应步骤。 MYC癌基因的激活驱动谷氨酰胺的优先代谢向TCA循环添补反应（Anaplerosis）和随后的氧化磷酸化。MYC癌基因表达的缺失增加了线粒体代谢对葡萄糖的依赖。 4. p53 Pathway P53是最著名的肿瘤抑制基因之一，它影响细胞过程，包括凋亡、细胞周期进程和代谢。p53在细胞应激条件下被激活，如DNA损伤和营养剥夺。根据应激源的类型和强度，它决定了是发生适应还是细胞死亡。p53在转录、翻译和翻译后水平上被调节。p53的稳定性受E3连接酶MDM2的调控。 AMPK磷酸化，乙酰化，从而在能量应激条件下稳定p53。通过上调MDM2来促进p53的降解，p53诱导一个负反馈回路来维持稳态。 p53调节代谢（Cancers 2021, 13, 133） P53减少有氧糖酵解，上调线粒体分解代谢过程，包括脂肪酸氧化(FAO)和OXPHOS；p53转录抑制GLUT1和GLUT4的表达，抑制葡萄糖摄取；抑制TCA循环；增加脂肪酸氧化；增加氧化磷酸化（OXPHOS），积累NADH和FADH2。 5. LKB1/AMPK Pathway AMPK是一种保守性良好的能量传感激酶。AMPK抑制合成代谢途径（脂肪酸合成、mTOR途径），促进分解代谢（糖酵解、Krebs循环、磷酸戊糖途径、脂肪酸氧化和自噬）的细胞过程。因此，AMPK的激活允许细胞承受细胞能量应激条件。 与其他代谢蛋白不同，AMPK的调控依赖于AMP和ADP的细胞浓度，但独立于其他代谢中间体。AMP/ATP比值的增加导致AMP相互作用，随后是AMPK的构象变化。在癌症的背景下，应激环境下的AMPK激活，包括缺氧和能量或营养剥夺，赋予了各种癌症的应激抵抗特性。  *红色箭头（激活上调）（Oxid Med Cell Longev . 2019 Oct 31;2019:8730816.） AMPK是一种致癌蛋白还是肿瘤抑制蛋白仍有待确定。在临床环境中，AMPK激活剂，包括2型糖尿病药物二甲双胍和AICAR，被用于抑制癌细胞增殖；然而，AMPK也通过促进原蛋白抗性、迁移和转移作为致癌蛋白。 ACC是AMPK的一个成熟的靶点。ACC在脂肪酸从头合成过程中，ACC介导乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。AMPK通过抑制ACC磷酸化来减少ATP的消耗。AMPK降低的脂肪酸合成通量降低了NADPH的消耗。为了满足细胞对脂质代谢物的需求，AMPK通过CD36和其他脂质转运体上调脂肪酸的摄取来维持脂质稳态。 蛋白质翻译是高度耗能的，并使用多种合成代谢途径，包括PPP和谷氨酰胺水解。AMPK通过抑制mTORC1和翻译机制，允许癌细胞适应恶劣的营养条件，如葡萄糖剥夺。 主要参考文献 Jordan H. Driskill et al，The Hippo Pathway in Liver Homeostasis and Pathophysiology. Annu Rev Pathol. 2021 January 24; 16: 299–322 Robert D. Leone and Jonathan D. Powell, Metabolism of immune cells in cancer, Nat Rev Cancer . 2020 Sep;20(9):516-531 Tambay, V.; Raymond, V.-A.; Bilodeau, M. MYC Rules: Leading Glutamine Metabolism toward a Distinct Cancer Cell Phenotype. Cancers 2021, 13, 4484 : Lahalle, A.; Lacroix, M.; De Blasio, C.; Cissé, M.Y.; Linares, L.K.; Le Cam, L. The p53 Pathway and Metabolism: The Tree That Hides the Forest. Cancers 2021, 13, 133 Francesco Ciccarese et al. LKB1/AMPK Pathway and Drug Response in Cancer: A Therapeutic Perspective,Oxid Med Cell Longev . 2019 Oct 31;2019:8730816.

葡萄糖、脂肪酸和氨基酸是生物体的三大碳源物质，是我们人体最重要也是最基本的物质与能量的来源，并调节了诸多生物学功能。然而，在日常生活中，三大碳源并非一直都很丰富，在许多条件下，例如在餐后数小时后或进餐之前，血糖以及组织中的葡萄糖水平都会显著地下降——这是十分常见的生理现象。尽管有糖原分解、糖异生等方式来补充葡萄糖，但这些过程至多保证机体血糖不会过低，从而防止出现低血糖等危及生命的状态，却不能完全阻止体内糖的短缺。因此，在面对血糖水平下降时，机体从主要利用葡萄糖到利用其它营养物的转变过程，就显得十分关键了。 从上世纪50年代起，以George F Cahill Jr等为代表的先驱们，逐步揭示了饥饿条件下，机体能够动员所储存的脂肪（如脂肪组织里的甘油三酯）和蛋白质（如肌肉里的肌纤维），并利用被动员的脂肪酸、氨基酸进入线粒体中的三羧酸循环而被氧化，来弥补葡萄糖短缺的现象，从而初步揭示了三大碳源物质之间，尤其是脂肪酸和氨基酸作为葡萄糖的替代碳源的利用与转化的规律。 后续的研究进一步从分子水平揭示了以AMPK为代表的代谢稳态维持的核心蛋白，能够在葡萄糖水平下降的情况下，通过磷酸化脂肪酸合成的关键酶ACC（acetyl-CoA carboxylase），来抑制脂肪酸的合成，并促进更多的脂肪酸被氧化。而在氨基酸方面，AMPK能够抑制机体里另一个合成代谢的“主管”——mTORC1，阻止mTORC1所介导的蛋白质的合成，从而为机体保留更多的游离氨基酸以维持它们的氧化。 除mTORC1以外，AMPK也能通过自噬作用以促进蛋白质的水解，从而产生更多的游离氨基酸。在游离氨基酸中，又以谷氨酰胺和丙氨酸最为关键，尤其是前者，不但是血液循环中最为丰富的氨基酸（在饥饿时占到了体内游离氨基酸的50%以上），同时也是机体动员、释放的氨基酸最终进入血液循环并被如肝脏等器官氧化利用之前所必需被转化成的氨基酸种类（例如，肌肉动员的支链氨基酸大部分通过转氨等途径转化为谷氨酰胺，再进入血液被利用），可谓是牵一发而动全身（图1）。然而，谷氨酰胺的氧化利用本身是如何被促进的，却一直不清楚。 图1 饥饿条件下，谷氨酰胺作为替代碳源参与代谢 （TCA：三羧酸循环；BCAA：支链氨基酸；GNG：糖异生；OAA：草酰乙酸；Pyr：丙酮酸） 6月19日，林圣彩课题组在Cell Research发表了题为“AMPK targets PDZD8 to trigger carbon source shift from glucose to glutamine”的文章，阐述了促进谷氨酰胺代谢的机制。他们发现，在低葡萄糖条件下，AMPK能够通过磷酸化一个新底物——PDZD8（PDZ domain-containing protein 8），促进机体对谷氨酰胺这一关键氨基酸的氧化利用。从而“补全”了AMPK促进氨基酸作为葡萄糖的一类替代碳源的机制的拼图。 林圣彩课题组长期以来致力于营养物质的感知与AMPK的激活机制的研究，他们先前发现了细胞感知葡萄糖水平下降，并激活AMPK的溶酶体通路，也发现了该通路如何与其它通路协作，介导在低葡萄糖条件下mTORC1的抑制的机制。 在此基础上，他们开始在体内、在动物水平上，分析机体对氨基酸和脂肪酸的利用。他们选择了通过稳定同位素标记的谷氨酰胺和棕榈酸（是用于检测脂肪酸氧化的代表之一）来进行实验，借此仔细地跟踪了不同的饥饿时长下，谷氨酰胺和棕榈酸的利用。他们惊奇地发现，小鼠饥饿时，机体对谷氨酰胺的利用显著早于棕榈酸，表现在饥饿8小时亦即血糖刚下降不久时，标记的谷氨酰胺进入线粒体和三羧酸循环并被氧化的量就明显增多，而棕榈酸氧化的增多则需要在饥饿12小时以上才能被观察到。这一现象也存在于体外培养的细胞中。重要的是，不仅仅是棕榈酸的氧化的增加需要通过AMPK来介导，谷氨酰胺氧化增加的本身也是完全依赖于AMPK的，这说明，AMPK能够通过一种未知的机制，促进谷氨酰胺的氧化。 作者们于是尝试解析这一机制。他们回忆起了2019年发表在Cell Research（https://doi.org/10.1038/s41422-019-0163-6）的文章，在这篇文章中他们报道了一个现象：葡萄糖水平下降以后的细胞中的线粒体更倾向于结合在内质网上，形成更多的MAM（mitochondria-associated membranes）结构，这表现在直接通过亚细胞分离（subcellular fractionation）的方法对细胞的膜结构进行纯化，所得到MAM组分，或者说MAM的“产量”明显增加，而不和内质网相互作用的、纯的线粒体的产量则显著降低。 鉴于MAM对于线粒体的活力十分重要，作者们进一步对该现象进行了分析，发现低糖条件下，MAM组分的增加是依赖于AMPK的，并通过进一步用特异性地识别AMPK的磷酸化底物的抗体进行分析，确定了MAM组分中含有AMPK的底物。 在此基础上，通过用此抗体对AMPK的底物进行富集，并辅助以蛋白质谱进行鉴定，他们发现了12个定位在MAM的，在低糖时被磷酸化的蛋白质。其中有3个——PDZD8、RMDN3和PDHA1，被进一步验证为AMPK的底物（其中PDHA1已被报道为AMPK的底物）。通过分别敲除这三个基因，他们发现仅有PDZD8的敲除，能够阻止低糖所促进的谷氨酰胺氧化。 进一步的探究发现了PDZD8被AMPK磷酸化的位点是其第527位的苏氨酸（T527），且在PDZD8敲除的细胞或者小鼠的肌肉中回补PDZD8-T527A突变体、阻断了AMPK对PDZD8的磷酸化以后，能够起到类似于PDZD8敲除以后的、阻止低糖所促进的谷氨酰胺氧化的作用。作者们还发现，PDZD8-T527A既不会反过来影响AMPK的激活，也不会影响AMPK对脂肪酸氧化的促进，这说明PDZD8是一个类比于ACC的、专门负责谷氨酰胺氧化这一功能的、AMPK的底物。 作者还探究了PDZD8被AMPK磷酸化后，促进谷氨酰胺利用的机制。他们发现，在葡萄糖饥饿的细胞中，谷氨酰胺氧化的限速酶GLS1（glutaminase 1）的活力明显提高，并且高度依赖于AMPK对PDZD8的磷酸化。进一步的研究表明，AMPK对PDZD8的磷酸化能够促进后者的变构，使之加强与GLS1的相互作用，而这一相互作用显著地促进了GLS1的活力。在体外，把已经被AMPK磷酸化过的PDZD8蛋白与GLS1蛋白直接混合，就能够提升GLS1的活力。而突变了能够介导PDZD8与GLS1相互作用的氨基酸，就如同PDZD8-T527A一样，失去了激活GLS1乃至于饥饿时所加强的谷氨酰胺利用的作用。由此，作者们解析出了一条AMPK-PDZD8-GLS1的通路，通过该通路，机体能够在缺乏葡萄糖的条件下，动用谷氨酰胺以弥补葡萄糖缺乏所造成的影响（图2）。 图2 AMPK通过PDZD8，促进GLS1和谷氨酰胺的代谢 作者们还将AMPK-PDZD8-GLS1促进谷氨酰胺代谢的通路与AMPK-ACC促进脂肪氧化的通路进行了比较，对后者动用脂肪酸的速度比前者动用谷氨酰胺的速度更加迟缓的现象做出了初步的解释。与AMPK-PDZD8-GLS1直接作用于线粒体的谷氨酰胺氧化不同，AMPK-ACC对脂肪酸氧化的促进是间接的：需要AMPK磷酸化并抑制ACC足够长的时间才能使得ACC的产物malonyl-CoA的水平下降到一定的水平，才能解除malonyl-CoA对线粒体脂肪酸氧化的抑制作用，才能够提升脂肪酸氧化的水平。 而这一点在低糖条件下，溶酶体通路所介导的AMPK激活中更甚：此时AMPK的激活具有很强的区域性（集中在溶酶体上），且只能磷酸化并抑制定位在细胞质里的ACC1亚型，通过细胞质内整体的malonyl-CoA水平的缓慢下降，传导到线粒体附近，最终促进脂肪酸的氧化。相比之下，如果通过使用激动剂无差别地激活胞内所有的AMPK，并在ACC1的基础上，同时引起定位在线粒体表面的ACC2的磷酸化，就能够通过局部地降低线粒体附近的malonyl-CoA，大大加快脂肪酸氧化的速度，使之被提升的时间点提前到和谷氨酰胺差不多的程度。当然，优先利用谷氨酰胺本身可能还有其它的生理意义，如分解损坏和剩余的蛋白质可能是组织更新的重要一环，而脂肪则是为长期饥饿而储备的。 最后，作者还探究了AMPK-PDZD8-GLS1通路的生物学功能。有意思的是，该通路的缺乏并不影响低糖时细胞ATP的水平，这说明缺糖早期，细胞能够通过AMPK抑制蛋白合成等耗能的代谢途径，即使在没有谷氨酰胺氧化加强的条件下，有效地维持ATP的水平，直到缺糖后期脂肪酸氧化供能的加强。这也进一步暗示了谷氨酰胺氧化的加强可能有独特的生物学意义。作者们于是选择了LPS（lipopolysaccharides）所模拟的细菌急性感染的条件——该条件能够显著地降低血糖，且GLS1和谷氨酰胺的利用已被证明对于机体响应LPS，启动免疫反应至关重要。 在致死剂量LPS处理的条件下，他们确实观察AMPK-PDZD8-GLS1 信号传递轴可以维持巨噬细胞对促炎因子的分泌，促进炎症反应的发生，并引起小鼠更严重的死亡。而在巨噬细胞中导入不能磷酸化的PDZD8-T527A突变体，则显著降低了机体针对LPS的炎症反应。尽管由于LPS的特殊性和急性炎症的特点，加强谷氨酰胺的利用反而加大了LPS的致死性——这和诸多感染条件下所发生的炎症反应所起到的保护作用相悖，但上述表型至少说明了AMPK-PDZD8-GLS1通路在低糖条件下的重要生理功能，对不同的临床患者是否添补谷氨酰胺的水平将会起到指导作用。该表型也进一步激发起我们在未来，对更长的时间尺度下的低糖和AMPK激活条件，如卡路里限制等条件下，谷氨酰胺代谢的重要功能的猜想与兴趣。 总之，林圣彩课题组的发现解决了碳源代谢与调控方面的又一生物学重大机制，这一发现对我们认识机体维持代谢稳态与能量平衡，乃至未来对代谢紊乱的控制与“纠偏”，具有重要的启发意义。 该研究获得了科技部、基金委、福建省卫健委和厦门大学的多个基金项目的支持。河南大学基础医学院的王永亮老师为同位素标记与代谢流示踪提供了重要的技术支持，厦门大学生命科学学院李勤喜和江彬老师为GLS1活力的测量提供了重要的指导，韩家淮和吴剑锋老师指导并进行了炎症相关实验的分析，生物医学仪器共享平台的祝明霞、章赐雄、谢昌传、吴雅颖、徐哲妮、姚路明等多位老师为本项目所运用的代谢、蛋白质谱等实验手段贡献了重要的力量。 论文链接： https://doi.org/10.1038/s41422-024-00985-6 原文链接： https://life.xmu.edu.cn/info/1045/21021.htm 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

引言 葡萄糖、脂肪酸和氨基酸是生物体的三大碳源物质，是我们人体最重要也是最基本的物质与能量的来源，并调节了诸多生物学功能。然而，在日常生活中，三大碳源并非一直都很丰富，在许多条件下，例如在餐后数小时后或进餐之前，血糖以及组织中的葡萄糖水平都会显著地下降——这是十分常见的生理现象。尽管有糖原分解、糖异生等方式来补充葡萄糖，但这些过程至多保证机体血糖不会过低，从而防止出现低血糖等危及生命的状态，却不能完全阻止体内糖的短缺。因此，在面对血糖水平下降时，机体从主要利用葡萄糖到利用其它营养物的转变过程，就显得十分关键了。 从上世纪50年代起，以George F Cahill Jr等为代表的先驱们，逐步揭示了饥饿条件下，机体能够动员所储存的脂肪（如脂肪组织里的甘油三酯）和蛋白质（如肌肉里的肌纤维），并利用被动员的脂肪酸、氨基酸进入线粒体中的三羧酸循环而被氧化，来弥补葡萄糖的短缺的现象，从而初步揭示了三大碳源物质之间，尤其是脂肪酸和氨基酸作为葡萄糖的替代碳源的利用与转化的规律【1】。后续的研究进一步从分子水平揭示了以AMPK为代表的代谢稳态维持的核心蛋白，能够在葡萄糖水平下降的情况下，通过磷酸化脂肪酸合成的关键酶ACC（acetyl-CoA carboxylase），来抑制脂肪酸的合成，并促进更多的脂肪酸被氧化【2】。而在氨基酸方面，AMPK能够抑制机体里另一个合成代谢的“主管”——mTORC1【3】，阻止mTORC1所介导的蛋白质的合成，从而为机体保留更多的游离氨基酸以维持它们的氧化【4】。除mTORC1以外，AMPK也能通过自噬作用以促进蛋白质的水解，从而产生更多的游离氨基酸【5】。在游离氨基酸中，又以谷氨酰胺和丙氨酸最为关键，尤其是前者，不但是血液循环中最为丰富的氨基酸（在饥饿时占到了体内游离氨基酸的50%以上），同时也是机体动员、释放的氨基酸最终进入血液循环并被如肝脏等器官氧化利用之前所必需被转化成的氨基酸种类（例如，肌肉动员的支链氨基酸大部分通过通过转氨等途径转化为谷氨酰胺，再进入血液被利用），可谓是牵一发而动全身。然而，谷氨酰胺的氧化利用本身是如何被促进的，却一直不清楚。 2024年6月19日，厦门大学的林圣彩课题组在Cell Research杂志发表了题为AMPK targets PDZD8 to trigger carbon source shift from glucose to glutamine的文章，阐述了促进谷氨酰胺代谢的机制。他们发现，在低葡萄糖条件下，AMPK能够通过磷酸化一个新底物——PDZD8（PDZ domain-containing protein 8），促进机体对谷氨酰胺这一关键氨基酸的氧化利用。从而“补全”了AMPK促进氨基酸作为葡萄糖的一类替代碳源的机制的拼图。 林圣彩课题组长期以来致力于营养物质的感知与AMPK的激活机制的研究，他们先前发现了细胞感知葡萄糖水平下降，并激活AMPK的溶酶体通路（林圣彩组Nature破解葡萄糖感受的新机制【6, 7】，也发现了该通路如何与其它通路协作，介导在低葡萄糖条件下mTORC1的抑制的机制（Cell Research丨林圣彩团队发现感知葡萄糖调控mTORC1的感受器和机制）【8, 9】。在此基础上，他们开始在体内、在动物水平上，分析机体对氨基酸和脂肪酸的利用。他们选择了通过稳定同位素标记的谷氨酰胺和棕榈酸（是用于检测脂肪酸氧化的代表之一）来进行实验，借此仔细地跟踪了不同的饥饿时长下，谷氨酰胺和棕榈酸的利用。他们惊奇地发现，小鼠饥饿时，机体对谷氨酰胺的利用显著早于棕榈酸，表现在饥饿8小时，亦即血糖刚下降不久时，标记的谷氨酰胺进入线粒体和三羧酸循环并被氧化的量就明显增多，而棕榈酸氧化的增多则需要在饥饿12小时以上才能被观察到。这一现象也存在于体外培养的细胞中。重要的是，不仅仅是棕榈酸的氧化的增加需要通过AMPK来介导，谷氨酰胺氧化增加的本身也是完全依赖于AMPK的，这说明，AMPK能够通过一种未知的机制，促进谷氨酰胺的氧化。 作者们于是尝试解析这一机制。他们回忆起了19年，也是在Cell Research上，他们发表的一篇文章（Cell Res封面丨 林圣彩团队全景式展示AMPK时空调控图谱）【10】。在这篇文章中他们无意中报道了一个现象：葡萄糖水平下降以后的细胞中的线粒体更倾向于结合在内质网上，形成更多的MAM（mitochondria-associated membranes，线粒体相关内质网膜）结构，这表现在直接通过亚细胞分离（subcellular fractionation）的方法对细胞的膜结构进行纯化，所得到MAM组分，或者说MAM的“产量”明显增加，而不和内质网相互作用的、纯的线粒体的产量则显著降低。鉴于MAM对于线粒体的活力十分重要，作者们进一步对该现象进行了分析，发现低糖条件下，MAM组分的增加是依赖于AMPK的，并通过进一步用特异性地识别AMPK的磷酸化底物的抗体进行分析，确定了MAM组分中含有AMPK的底物。在此基础上，通过用此抗体对AMPK的底物进行富集，并辅助以蛋白质谱进行鉴定，他们发现了12个定位在MAM的，在低糖时被磷酸化的蛋白质。其中有3个——PDZD8、RMDN3和PDHA1，被进一步验证为AMPK的底物（其中PDHA1已被报道为AMPK的底物【11】）。通过分别敲除这三个基因，他们发现仅有PDZD8的敲除，能够阻止低糖所促进的谷氨酰胺氧化。进一步的探究发现了PDZD8被AMPK磷酸化的位点是其第527位的苏氨酸（T527），且在PDZD8敲除的细胞或者小鼠的肌肉中回补PDZD8-T527A突变体、阻断了AMPK对PDZD8的磷酸化以后，能够起到类似于PDZD8敲除以后的、阻止低糖所促进的谷氨酰胺氧化的作用。作者们还发现，PDZD8-T527A既不会反过来影响AMPK的激活，也不会影响AMPK对脂肪酸氧化的促进，这说明PDZD8是一个类比于ACC的、专门负责谷氨酰胺氧化这一功能的、AMPK的底物。 作者还探究了PDZD8被AMPK磷酸化后，促进谷氨酰胺利用的机制。他们发现，在葡萄糖饥饿的细胞中，谷氨酰胺氧化的限速酶GLS1（glutaminase 1）的活力明显提高，并且高度依赖于AMPK对PDZD8的磷酸化。进一步的研究表明，AMPK对PDZD8的磷酸化能够促进后者的变构，使之加强与GLS1的相互作用，而这一相互作用显著地促进了GLS1的活力。在体外，把已经被AMPK磷酸化过的PDZD8蛋白与GLS1蛋白直接混合，就能够提升GLS1的活力。而突变了能够介导PDZD8与GLS1相互作用的氨基酸，就如同PDZD8-T527A一样，失去了激活GLS1乃至于饥饿时所加强的谷氨酰胺利用的作用。由此，作者们解析出了一条AMPK-PDZD8-GLS1的通路，通过该通路，机体能够在缺乏葡萄糖的条件下，动用谷氨酰胺以弥补葡萄糖缺乏所造成的影响。 AMPK通过PDZD8，促进GLS1和谷氨酰胺的代谢（Credit: Cell Research） 作者们还将AMPK-PDZD8-GLS1促进谷氨酰胺代谢的通路与AMPK-ACC促进脂肪氧化的通路进行了比较，对后者动用脂肪酸的速度比前者动用谷氨酰胺的速度更加迟缓的现象做出了初步的解释。与AMPK-PDZD8-GLS1直接作用于线粒体的谷氨酰胺氧化不同，AMPK-ACC对脂肪酸氧化的促进是间接的：需要AMPK磷酸化并抑制ACC足够长的时间才能使得ACC的产物malonyl-CoA的水平下降到一定的水平，才能解除malonyl-CoA对线粒体脂肪酸氧化的抑制作用，才能够提升脂肪酸氧化的水平。而这一点在低糖条件下，溶酶体通路所介导的AMPK激活中更甚：此时AMPK的激活具有很强的区域性（集中在溶酶体上），且只能磷酸化并抑制定位在细胞质里的ACC1亚型【10】，通过细胞质内整体的malonyl-CoA水平的缓慢下降，传导到线粒体附近，最终促进脂肪酸的氧化。相比之下，如果通过使用激动剂无差别地激活胞内所有的AMPK，并在ACC1的基础上，同时引起定位在线粒体表面的ACC2的磷酸化，就能够通过局部地降低线粒体附近的malonyl-CoA，大大加快脂肪酸氧化的速度，使之被提升的时间点提前到和谷氨酰胺差不多的程度。当然，优先利用谷氨酰胺本身可能还有其它的生理意义，如分解损坏和剩余的蛋白质可能是组织更新的重要一环，而脂肪则是为长期饥饿而储备的。 最后，作者还探究了AMPK-PDZD8-GLS1通路的生物学功能。有意思的是，该通路的缺乏并不影响低糖时细胞ATP的水平，这说明缺糖早期，细胞能够通过AMPK抑制蛋白合成等耗能的代谢途径，即使在没有谷氨酰胺氧化加强的条件下，有效地维持ATP的水平，直到缺糖后期脂肪酸氧化供能的加强。这也进一步暗示了谷氨酰胺氧化的加强可能有独特的生物学意义。作者们于是选择了LPS（lipopolysaccharides）所模拟的细菌急性感染的条件——该条件能够显著地降低血糖【12】，且GLS1和谷氨酰胺的利用已被证明对于机体响应LPS，启动免疫反应至关重要【13】。在致死剂量LPS处理的条件下，他们确实观察AMPK-PDZD8-GLS1 信号传递轴可以维持巨噬细胞对促炎因子的分泌，促进炎症反应的发生，并引起小鼠更严重的死亡。而在巨噬细胞中导入不能磷酸化的PDZD8-T527A突变体，则显著降低了机体针对LPS的炎症反应。尽管由于LPS的特殊性和急性炎症的特点，加强谷氨酰胺的利用反而加大了LPS的致死性——这和诸多感染条件下所发生的炎症反应所起到的保护作用相悖，但上述表型至少说明了AMPK-PDZD8-GLS1通路在低糖条件下的重要生理功能，对不同的临床患者是否添补谷氨酰胺的水平将会起到指导作用。该表型也进一步激发起我们在未来，对更长的时间尺度下的低糖和AMPK激活条件，如卡路里限制等条件下，谷氨酰胺代谢的重要功能的猜想与兴趣。 总之，林圣彩课题组的发现解决了碳源代谢与调控方面的又一生物学重大机制，这一发现对我们认识机体维持代谢稳态与能量平衡，乃至未来对代谢紊乱的控制与“纠偏”，具有重要的启发意义。 参考文献 1 Cahill GF, Jr. Fuel metabolism in starvation. Annu Rev Nutr 2006;26:1-22. 2 Davies SP, Sim AT, Hardie DG. Location and function of three sites phosphorylated on rat acetyl-CoA carboxylase by the AMP-activated protein kinase [Comparative Study Research Support, Non-U.S. Gov't] [in eng]. Eur J Biochem 1990;187:183-190. 3 Inoki K, Zhu T, Guan KL. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell 2003;115:577-590. 4 Krause U, Bertrand L, Hue L. Control of p70 ribosomal protein S6 kinase and acetyl-CoA carboxylase by AMP-activated protein kinase and protein phosphatases in isolated hepatocytes. Eur J Biochem 2002;269:3751-3759. 5 Meley D, Bauvy C, Houben-Weerts JH et al. AMP-activated protein kinase and the regulation of autophagic proteolysis. The Journal of biological chemistry 2006;281:34870-34879. 6 Zhang CS, Hawley SA, Zong Y et al. Fructose-1,6-bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK. Nature 2017;548:112-116. 7 Li M, Zhang CS, Zong Y et al. 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Hepatology 2009;50:592-600. 13 Zhang YY, Ning BT. Signaling pathways and intervention therapies in sepsis. Signal Transduct Target Ther 2021;6:407. https://doi.org/10.1038/s41422-024-00985-6 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述