前言:
从1978年第一款核酸药物诞生至今,寡核酸药物研发历程坎坷。近年来,得益于新型化学修饰技术对稳定性的改善,以及新型递送系统的应用解决肝细胞摄取效率低等问题,寡核酸药物发展势头迅猛。然而,免疫原性、脱靶等问题仍然给寡核酸药物研发带来了较大阻碍。
免疫原性数据是监管部门批准药物疗法的必备条件之一,用于评估某一疗法的安全性和有效性。目前,关于治疗性单克隆抗体和其他生物制剂的免疫原性评估的相关监管指南和行业白皮书已经发布,但寡核酸药物在动物或患者体内免疫原性的报道较少,监管部门也未发布明确的针对寡核酸药物开发的免疫原性研究的系统性指南。业界对寡核酸药物免疫原性理解的局限,大大限制了这类药物的研发进程。
相较于单克隆抗体等大分子生物制剂,寡核酸药物的结构更简单,分子量更小,具有更少的潜在表位,因此,它们通常被认为具有较低的免疫原性。然而,寡核酸分子由于其结构的特殊性,与免疫系统的相互作用复杂,可能诱导非特异性的先天免疫反应的产生。为了提高寡核酸药物的稳定性、安全性、细胞吸收及疗效,新一代寡核酸药物的研发过程中通常会对其进行各种化学修饰,目前已报道的各类修饰有一百多种,而这些修饰有的可能降低其免疫原性,有的可能增加其免疫反应。因此,对寡核酸药物进行临床前免疫原性分析是十分必要的。
· 寡核酸药物免疫原性的来源:
免疫系统通过不同的胞外和胞内模式识别受体识别小RNA,这是机体的一种病毒防御机制。胞外识别由内体中的TLR3/7/8介导,胞内识别由细胞质中的受体介导。识别治疗性RNA的主要途径是TLR信号通路,它通过髓样分化因子88(MyD88)介导并激活各种途径,导致核因子-κB(NF-κB)激活和I型干扰素反应和/或促炎细胞因子(IL-6、IL-8、IL-12和TNF)释放,最终导致多种下游免疫应答的激活。小RNA对TLR7和TLR8的刺激依赖于富含GU的序列(例如5'-UGUGU-3'或5'-GUCCUUCAA-3')的存在,引起IFNα介导的炎症反应,激活树突状细胞和巨噬细胞中NF-κB,最终介导炎性细胞因子的生成。
· 寡核酸药物免疫原性的解决办法:
单体和骨架修饰
现在RNA药物普遍使用了化学修饰,如引入某些2'-核糖和末端骨架修饰,包括2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-氟(2'-F)和磷酸硫酯(PS)等,这些修饰一方面可以显著提高寡核酸药物的体内稳定性,也可以在一定程度上降低其免疫原性。
递送系统
现在RNA药物普遍使用了化学修饰,如引入某些2'-核糖和末端骨架修饰,包括2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-氟(2'-F)和磷酸硫酯(PS)等,这些修饰一方面可以显著提高寡核酸药物的体内稳定性,也可以在一定程度上降低其免疫原性。
其他
此外,不同的给药剂型配方、给药途径、给药剂量频率的优化均可能达到降低药物免疫原性的效果。而且,末端修饰等方法可以改善药物在体内的代谢稳定性、RNA干扰复合物(RISC)稳定性、组织分布等,通过降低药物体内给药剂量,也可以在一定程度上间接降低药物的免疫原性作用。
· 寡核酸药物的临床前免疫原性检测方法:
目前人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)常被用于寡核酸药物细胞免疫原性评估。PBMC通过血液循环分布到全身各组织器官中,参与免疫应答和免疫调节,可用于模拟体内环境,为药物研发提供有效的体外模型,可以用于初步评估药物的免疫安全性,故而被广泛应用于RNA药物或其它可能具有免疫刺激性药物(如大分子药物、小分子免疫激动剂等)的临床前免疫原性评估中。
具体检测方法:以siRNA为例,通过特定的转染试剂转染一定剂量的siRNA进PBMC细胞,进而检测I型干扰素相关免疫因子响应水平。如下图,在体外人PBMC细胞中,评估一组阳性刺激物(包含TLR小分子激动剂和siRNA)对IFN-α(左图)和IL-6(右图)的激活水平,各阳性刺激物均呈现不同程度的免疫响应。
PBMC的寡核酸药物免疫激活实验失败率较高,采集外周血后到分离PBMC的时长、提取方式、冻存方式、运输条件、解冻和复苏步骤等每一个环节均可能会影响到PBMC的活性和功能,进而影响后续试验的成败。因此,细胞免疫原性检测前需要规范化PBMC的处理方式,在保留较大提取收率的同时,也要有效维持PBMC的活性和功能。
成都先导现已建立稳定的使用PBMC细胞进行寡核酸药物免疫原性评价的体系,确保PBMC供体的活性和激活结果,并已成功用于客户项目的评价支持。
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