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中文摘要 蛋白质纳米颗粒作为抗原展示载体，与天然病原体大小相似，能够有效帮助抗原提高其稳定性和免疫原性。临床试验研究表明，蛋白质纳米颗粒可被应用于新型疫苗的开发。此文对蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学特性，以及蛋白质颗粒在疫苗研发中的应用进行综述，旨在为蛋白质纳米颗粒的进一步研究提供参考。 正文 接种疫苗是预防疾病感染最有效的方法之一，常见疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，但部分研发策略还存在问题，如重组亚单位疫苗虽然成分明确、安全性高，但往往因缺乏病原体相关分子模式而无法高效诱导APC成熟，需要佐剂提高免疫原性，激活机体适应性免疫应答。 随着纳米技术的发展，脂质体、微粒、无机和聚合物、蛋白质等均能够被制成纳米颗粒，高效递送药物或诊断试剂到靶点。纳米颗粒大小适宜、表面可修饰，可以增强疫苗抗原在机体内的渗透性和半衰期，提高递送率。目前基于纳米颗粒的靶向治疗与诊断被广泛应用，其中蛋白质纳米颗粒已能获取清晰的原子级晶体结构，且能够在结构和基因上被操纵。基于此，研究者提出了将亚单位疫苗的抗原分子结合在蛋白质纳米颗粒表面形成与病原体相似的多价分子模式，以实现对免疫系统的有效刺激，这成为新的疫苗研发策略。 1 蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学 1.1 免疫刺激 纳米颗粒疫苗能够增强淋巴运输、增加APC在淋巴结中的捕获以及通过多价受体交联增加抗原特异性B细胞的活化。蛋白质纳米颗粒疫苗中抗原能够自组装成寡聚的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），具有良好的免疫原性，对于一些抗原无法自组装成纳米颗粒的亚单位疫苗，可通过将这些抗原附着到寡聚的蛋白纳米颗粒上来完成自组装。 纳米颗粒疫苗主要在次级淋巴器官中诱导适应性免疫应答，皮下或肌内注射后，通过淋巴引流或免疫细胞来介导疫苗抗原从注射部位到淋巴结（lymph node，LN）的运输。对于直接淋巴引流，疫苗颗粒的相对分子质量和尺寸至关重要。直径在10~200 nm范围内的纳米颗粒可通过淋巴管内皮细胞连接处直接扩散进入淋巴管向LN输送，最佳尺寸约为40 nm。小于10 nm的分子会扩散到血液中进行全身循环，较大的颗粒倾向于在注射部位附近积存，需要特化细胞如树突状细胞携带进入淋巴系统，大约24 h才能到达LN。因此，直径10~200 nm的蛋白质纳米颗粒能够快速进入淋巴结，刺激免疫系统。 1.2 免疫加强 在纳米颗粒表面密集展示抗原通常可以有效增加免疫原性，如肽抗原在体内因缺乏重复表位会被快速清除，导致体液应答较差，而在颗粒支架上多聚化时会产生强烈的抗原特异性抗体应答。蛋白质纳米颗粒还可以增加抗原的稳定性并保持所需的表位构象，如HIV包膜蛋白Env三聚体与自组装蛋白支架的融合已被成功应用于确保抗原折叠成正确的构象。纳米颗粒还可以作为多价抗原展示平台，以高度有序的方式在表面呈现抗原的多个拷贝，可以同时结合多个B细胞抗原受体，增加亲和力，从而诱导更强的B细胞活化。 预防性疫苗的有效性取决于能否产生持久的T细胞依赖的IgG抗体应答。APC对抗原的呈递取决于抗原相关的特异性，包括大小、形状、表面电荷、亲水性以及受体之间的相互作用。其中抗原的大小是影响APC有效吸收的重要因素，纳米颗粒具有带电荷、疏水或受体相互作用特性的大表面，这导致APC与抗原颗粒的相互作用比与可溶性蛋白质的相互作用更好。通过将抗原附着在纳米颗粒上，使疫苗增加到最佳尺寸范围，提高了APC的有效摄取，更多地呈递抗原以激活Th。 1.3 免疫靶向 蛋白质纳米颗粒还可以被应用于开发免疫逃逸病原体的疫苗，例如HIV、流感和疟疾等疫苗。部分病毒特异性抗体（一般多为非中和抗体）与病毒结合后，可通过其Fc段与某些表面表达FcR的细胞结合从而介导病毒进入这些细胞，从而增强了病毒感染性的过程，其中HIV和登革热病毒特异性抗体存在抗体依赖性增强作用。为了避免这一不良反应，研究者从抗原中分离出中和表位并将其构建于蛋白质纳米颗粒表面，可以增加抗原的呈递作用，从而产生强烈的中和性体液免疫应答。除了中和表位之外，在蛋白质纳米颗粒上引入T细胞表位还可激活细胞介导的免疫应答，通用CD4+ T细胞表位可以通过募集Th帮助建立针对抗原的体液应答，而CD8+ T细胞表位可以产生针对特定病原体的杀伤性T细胞。 2 蛋白质纳米颗粒疫苗的应用 蛋白质纳米颗粒在人体中有很好的安全性和有效性。病毒衣壳是目前研究最多的天然蛋白颗粒，例如HPV和HBV的VLP。研究表明，接种二价HPV疫苗1次即能提供有效、持久的免疫效果。目前已发现来自不同生物的天然蛋白质，例如铁蛋白、二氧四氢喋啶合酶（lumazine synthase，LS）等能够自组装成纳米颗粒。这些自组装的蛋白质纳米颗粒展示抗原分子的平台技术也逐渐成熟，在临床前研究中，蛋白质纳米颗粒可显著提高抗体对多种抗原，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）融合前F蛋白、HIV-1的包膜蛋白、流感病毒血凝素（hemagglutinin， HA）和新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的刺突蛋白（spike protein，S）的中和效力或广度。目前展示病毒糖蛋白抗原的蛋白质纳米颗粒疫苗正在进行临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147）评估。此外，通过计算机设计的蛋白质纳米颗粒，具有强大的自组装优势和低免疫原性，也可以作为通用的多价抗原呈递平台。 2.1 VLP VLP是1种自组装系统，可在1种或多种病毒蛋白表达后自发形成病毒状颗粒，具有对称的二十面体或棒状结构，由于缺乏复制酶和编码病毒蛋白的核酸而无法复制。HPV疫苗如二价Cervarix、四价Gardasil-4和九价Gardasil-9，含有由主要衣壳蛋白L1自组装而成的L1-VLP，具有免疫原性并能够诱导高滴度的保护性中和抗体。中和抗体由VLP上的重复表位触发，这些表位可通过B细胞受体或Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）交联激活B细胞。此外，L1蛋白也富含Th表位。 从慢性HBV感染者的血浆中纯化获得的乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）， 可自组装成24~31 nm的纳米颗粒。重组乙型肝炎疫苗通过培养携带HBsAg基因的酵母细胞表达平台获得的HBsAg可自组装形成纳米颗粒。戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）也可以通过形成重组VLP提高免疫效果。由杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达HEV的衣壳蛋白，获得的HEV-VLP能够预防感染。此外研究者发现HE-VLP外表面的环结构域允许外源表位的插入，而不影响VLP的形成，被认为有可能作为抗原载体。 对下一代流感疫苗的需求一直是对新型VLP疫苗进行研究的最大驱动力之一。流感病毒的VLP是由基质蛋白M1支持的脂质双分子层上的HA和神经氨酸酶抗原自组装产生直径100~150 nm的非传染性颗粒，与天然的流感病毒类似。目前多项流感VLP疫苗的安全性与免疫原性临床研究（NCT01014806、NCT01072799、NCT00903552等）已完成。 2.2 铁蛋白 铁蛋白是1种铁储存蛋白，普遍存在于几乎所有的生物体，包括细菌、真菌、植物和动物。铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由4个螺旋束组成。它们自组装成1个八面体对称的球形结构蛋白质纳米笼，外径约为12 nm，内径约为8 nm，内部空腔提供了封闭环境隔绝铁和外部环境。铁蛋白自组装具有强大的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒，能够在85 ℃以下保持稳定，并能在中性pH条件下耐受相当高水平的变性剂，非常适合携带和暴露免疫原。此外，由于铁蛋白由8个单位组成，每个单位均为三轴对称，因此它可以呈现三聚体抗原的支架。许多病毒的主要抗原以三聚体形式发挥作用，例如流感病毒的HA、SARS-CoV-2的S和呼吸道合胞病毒的F蛋白等。将这些抗原分子融合到铁蛋白上能够形成与天然结构相似的三聚体。Kanekiyo等将流感病毒HA与铁蛋白基因融合，获得了HA-铁蛋白纳米颗粒。在抗原性方面，使用这种流感纳米颗粒疫苗进行免疫接种引起的血凝抑制抗体滴度大约是灭活疫苗的11倍。此外，它引发了2个高度保守结构域的中和抗体应答，提高了流感病毒免疫的效力和广度。 铁蛋白纳米颗粒也被用于SARS-CoV-2疫苗的研究，研究者利用铁蛋白纳米颗粒展示多价SARS-CoV-2 S，与单独的S相比在免疫小鼠后会引发更强烈的中和抗体应答。研究者利用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的受体结合域（receptor binding domain，RBD）和七肽重复单位共价结合在铁蛋白纳米颗粒表面。与单体SARS-CoV-2疫苗相比，纳米颗粒疫苗能引起更强大的中和抗体和细胞免疫应答，能显著降低攻毒小鼠的病毒载量，在恒河猴中诱导了持续的中和抗体和细胞免疫应答。 研究团队采用SARS-CoV-2 S RBD与H7N9 HA的保守茎部区域HA2进行融合，并引入人铁蛋白，构建了可以同时抗SARS-CoV-2及流感病毒的疫苗。在小鼠体内验证该疫苗的免疫原性，发现其能够诱导针对多种SARS-CoV-2变异株的中和抗体。针对流感病毒的数据显示，该疫苗能诱导高水平的针对H7的抗体应答及较强的针对H3的抗体应答。在随后的攻毒实验中，发现疫苗对H7N9的致死性攻击有完全的保护，对H3N2的致病性攻击同样保护效果良好。 铁蛋白纳米颗粒引起免疫应答的潜力已被证明是针对多种病原体的，并且可以快速、低成本地生产。目前基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗已经进入了临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147等）。 2.3 LS LS存在于细菌、真菌和植物中，是参与核黄素生物合成的酶。LS因物种而异，由大小和亚基数不同的同源寡聚体组成，包括五聚体、十聚体和二十面体的六十聚体。所有LS单体的N端和C端都暴露在其表面并面向外，允许在2个不同的位置插入外源抗原序列，不会影响二十面体结构的形成。二十面体的LS也显示出强大的构象稳定性。以上特征使二十面体LS成为展示抗原的有吸引力的支架。Berguer等证实LS可在体外刺激小鼠的骨髓树突状细胞，上调共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ类抗原的水平，同时还证明LS能提高TLR4通路的mRNA、趋化因子和细胞因子的水平。 Jardine等采用嗜热菌Aquifex aeolicus的六十聚体LS作为抗原展示的纳米颗粒平台，构建了靶向HIV的gp120胞外结构域的免疫原eOD-GT6，能够强效刺激产生VRC01类中和抗体。相比之下，单体并不具有激活B细胞的活性，三聚体激活B细胞的效率和速度远不如形成六十聚体的纳米颗粒。Zhang等使用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的S三聚体在LS纳米颗粒上展示。他们对LS纳米颗粒进行了N-糖基化修饰，从而提高了蛋白质溶解度和表达。SARS-CoV-2 S的LS比单独的S能够引发更高的中和抗体应答，用0.08 µg的SARS-CoV-2 S-LS纳米颗粒进行小鼠疫苗接种可诱导与2.0 µg单独的S相似的中和抗体水平。 2.4 I53-50蛋白 研究者们基于天然蛋白质纳米颗粒的自组装能力，设计出许多具有自组装功能的蛋白质复合物。Bale等精确设计的自组装蛋白纳米颗粒I53-50由2种寡聚蛋白组成，包括三聚体I53-50 A和五聚体I53-50 B。分别表达和纯化这2个组分，并将其混合后可高效地组装成高度有序、均匀的二十面体颗粒，直径在24~40 nm。组装发生速度与病毒衣壳的组装速度相近，并且能够通过电荷互补性控制分子货物的包装。I53-50A能够保持抗原分子天然稳定的构象，这一特点使它在HIV、RSV、SARS-CoV-2的疫苗研究中得到了广泛的应用。 研究者利用I53-50成功展示了20个不同毒株稳定的SOSIP三聚体，SOSIP位点是通过引入连接gp120和gp41亚基的人工二硫键（SOS），以及gp41胞外域（IP）的异亮氨酸-脯氨酸突变（I559P）形成。免疫研究表明，与传统的单组分纳米颗粒系统相比，该三聚体可以提高抗体应答的质量，并且在具有顶点-近端中和表位的SOSIP三聚体时最有效。此外有研究在I53-50纳米颗粒外部呈现了RSV-F糖蛋白三聚体重复结构的免疫原DS-Cav1（融合前稳定的F抗原），在小鼠和非人灵长类动物实验中，20个DS-Cav1三聚体的全价纳米颗粒免疫原诱导的中和抗体应答是三聚体DS-Cav1的10倍。 Walls等在I53-50纳米颗粒中展示了60个SARS-CoV-2 S的RBD，在低剂量的情况下诱导的中和抗体滴度约是预融合稳定S的10倍。SARS-CoV-2 RBD纳米颗粒诱导的抗体靶向多个不同的表位，这表明它们可能不容易逃避突变，并表现出比人恢复期血清更低的结合中和率，这可能会降低发生疫苗相关的呼吸道疾病的风险。目前研究者已启动了GMP生产工作，以推进SARS-CoV-2-RBD纳米颗粒疫苗进入临床。这些结果推动了I53-50纳米颗粒作为疫苗载体的持续开发。 3 蛋白质纳米颗粒疫苗的构建策略 蛋白质纳米颗粒可以通过其组成蛋白的异体以重组形式获得，这种能力有助于通过合理的设计，赋予蛋白质纳米颗粒有用的、非天然的功能。基于分子组装机制允许纳米颗粒蛋白和抗原分别在各自最佳的表达系统中产生，以保持其天然的构象。为了有效地呈递和与细胞受体的相互作用，抗原保持其结构稳定性和构象是至关重要的。同时抗原可能会干扰纳米颗粒亚基间相互作用，阻碍其组装成纳米颗粒。目前有3种方法可以用来整合病毒抗原与纳米颗粒蛋白：基因融合、化学偶联以及SpyTag/SpyCatcher系统。 基因融合可以使抗原与纳米颗粒蛋白整合，表达后纳米颗粒蛋白的自组装导致抗原多价展示。但基因融合可能造成纳米颗粒蛋白亚基和/或抗原的不当折叠，导致支架组装抑制或抗原活性丧失。需要合适的设计以维持抗原与纳米颗粒的构象稳定，例如在抗原与纳米颗粒分子之间插入柔性的Linker，以保证2个组分的正确折叠。 SpyCatcher/SpyTag系统是一种快速稳定的不可逆肽-蛋白质连接方法，由化脓性链球菌纤连蛋白结合蛋白的胶原蛋白黏附素结构域改造而来，含有13个氨基酸的SpyTag和含有138个氨基酸的SpyCatcher。SpyTag中的天冬氨酸能和SpyCatcher上的赖氨酸在相邻的谷氨酸催化下自发反应生成异肽共价键。将SpyTag和SpyCatcher分别偶联纳米颗粒蛋白和抗原分子，表达纯化后，在体外混合得到展示多价抗原的纳米颗粒。 化学偶联使用交联剂与蛋白质氨基酸残基的侧链相互作用，实现抗原分子与纳米颗粒蛋白亚基的连接。最常见的反应是通过交联剂的 N-羟基琥珀酰亚胺臂对蛋白质纳米颗粒上的赖氨酸或N末端的氨基进行酰化，然后通过交联剂的马来酰亚胺臂烷基化抗原上的半胱氨酸。由于半胱氨酸在蛋白质表面很少见，因此通常可以通过点诱变引入单个暴露的半胱氨酸。化学偶联的VLP包括噬菌体Qβ和烟草花叶病毒，已进入多项临床试验，包括用于2型糖尿病患者的IL-1β疫苗和用于戒烟的尼古丁疫苗。蛋白质纳米颗粒表面存在多个赖氨酸，导致偶联产物的异质性。同时引入反应性半胱氨酸可能干扰抗原中预先存在的二硫键的形成。 4 总结与展望 在过去10年中，蛋白质纳米颗粒作为抗原展示的载体被广泛应用于疫苗的研发，特别是对SARS-CoV-2疫苗的研究，引起了研究者对蛋白质纳米颗粒平台的极大兴趣。蛋白质纳米颗粒作为抗原的展示平台在疫苗研发中拥有巨大的潜力，它们可应用于多种病原体，能够显著提高抗原的免疫原性和稳定性，引发持久的保护作用。同时拥有重组蛋白的优势，能够快速、低成本生产。 使用蛋白质纳米颗粒作为抗原的载体，也存在潜在的针对载体的抗体应答风险，同时引入的SpyCatcher/SpyTag蛋白也是外源性蛋白，在体内可能产生免疫原性。已知的自组装蛋白质纳米颗粒的数量是有限的，可通过计算设计具有原子级精度和可控组装的蛋白质纳米颗粒。此外，蛋白质纳米颗粒疫苗的临床研究数据不足，限制了其在人体的应用。总之，开发基于蛋白质纳米颗粒的疫苗具有广阔的前景，但也必将面临相关的挑战，需要更多的临床数据进一步证明蛋白质纳米颗粒在新型疫苗开发中的实用意义。 作者 张欣明综述  李媛媛审校 国药中生生物技术研究院有限公司疫苗研发课题组(一)， 北京  101111 通信作者：李媛媛， Email：lily13102@163.com 引用本文：张欣明, 李媛媛. 蛋白质纳米颗粒在疫苗研发中的应用 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 238-244.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230705-00058 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：流感病毒是最重要的人畜共患病原体之一，能够引起严重症状，有潜力造成大量死亡和巨大的经济损失。疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳选择。已经开发了不同类型的流感疫苗，包括减毒活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗、病毒体疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。然而，它们存在一些限制，如相对较高的制造成本和长时间的生产周期，某些疫苗在特定人群中的中等效力，以及缺乏交叉反应性。这些问题是需要解决的。在这里，我们总结了不同类型流感疫苗开发和应用的最新进展，包括病毒载体流感疫苗的最新发展。我们还描述了基于重组流感病毒作为病毒载体的其他疫苗的构建。本综述文章提供的信息可能会促进安全高效新型流感疫苗的开发。 1.引言 流感病毒是一种包膜RNA病毒，其病毒基因组由8个节段的负义单链RNA组成，编码10种核心蛋白，包括聚合酶基础2（PB2）、聚合酶基础1（PB1）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2），以及其他一些功能性辅助蛋白，如聚合酶基础1-F2（PB1-F2）、聚合酶基础1 N40（PB1N40）、聚合酶酸性-X（PA-X）等。由PB1、PB2和PA组成的聚合酶三聚体复合体与病毒RNA和NP蛋白形成RNA核蛋白（RNP），负责病毒RNA的转录和复制。HA、NA和M2蛋白嵌入病毒颗粒的外层包膜中，其中HA和NA易于暴露，因此是两种主要的免疫原性蛋白。在感染过程中，HA在病毒进入步骤中发挥重要作用，如附着和穿透。HA也是流感病毒表面的主要抗原糖蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体反应。NA负责切割细胞表面存在的末端唾液酸残基，从而促进子代病毒从感染细胞中释放，并在流感病毒的传播中发挥重要作用。根据HA和NA的抗原多样性，流感病毒被分类为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型（N1-N11）。 根据世界卫生组织的估计，全球约有300万至500万人感染流感，导致大约29万至65万例因严重呼吸系统疾病相关并发症而死亡。然而，流感病毒感染通常会导致一种常见的季节性疾病，其特征是较轻的临床表现，如发热、喉咙痛、肌肉无力和一系列相对轻微的呼吸道症状（包括咳嗽和流鼻涕）。大多数患者在一周内从这些症状中恢复；然而，在某些人群亚组中，如老年人、儿童、孕妇和免疫抑制疾病患者，流感病毒感染可能非常严重，可能导致死亡。在20世纪，已经记录了4次流感病毒感染的大流行，包括1918年H1N1大流行（也称为西班牙流感）、1957-1958年H2N2大流行（亚洲流感）、1968-1969年H3N2大流行（香港流感）和2009年的另一次H1N1大流行（墨西哥或猪流感）。据估计，1918年西班牙流感在全球造成了约20亿感染和2100万死亡。在1957-1958年，H2N2亚型流感病毒的爆发起源于亚洲，然后传播到全球，造成约100万至400万人死亡。十年后，由H3N2亚型流感病毒引起的另一次流感大流行起源于香港，导致全球100万至300万人死亡。最新的2009年墨西哥或猪流感大流行是由H1N1亚型流感病毒引起的，影响了214个国家，造成约20万人死亡。除了主要包括H1N1和H3N2的人类流感病毒外，一些流感病毒还可以感染其他动物物种，包括猪流感H1N1、H3N2和H1N2，以及H5、H7和H9亚型的禽流感病毒。值得注意的是，在上述流感大流行中，有几次是由禽源性流感病毒的跨物种传播引起的，如西班牙流感H1N1、亚洲流感H2N2和香港流感H3N2病毒。 目前，有几种治疗流感病毒感染的治疗方法。三类抗流感病毒药物可以分类为病毒M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。首批获准用于治疗流感病毒感染的抗病毒药物是金刚烷胺和金刚乙胺，这两种小分子药物来自金刚烷药物类别。这两种药物通过作为病毒M2离子通道的抑制剂，通过施加静电阻碍，阻止H+流通过M2通道进入病毒颗粒，从而抑制病毒复制。由于M2离子通道被阻断，病毒核糖核蛋白的传递被阻止。尽管金刚烷胺和金刚乙胺是最早的两种获准抗流感药物，流感病毒迅速进化为具有药物耐药表型的病毒变体，通过在M2的跨膜域的氨基酸位置27、30、31和34处获得突变。在药物治疗后2-3天，30%-50%的患者中可以观察到病毒耐药株。自从金刚烷耐药病毒出现以来，针对流感病毒神经氨酸酶的抑制剂已经被开发出来。扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦是N-乙酰神经氨酸（2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸）的衍生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NAIs。这些NAIs结合到NA的活性位点，竞争性地抑制NA与其底物N-乙酰神经氨酸的结合。由于这种抑制，NA不能再从宿主蛋白中切割N-乙酰神经氨酸，从而阻止病毒从细胞表面膜释放。正如预期的那样，在接受这些NAIs治疗的患者中，流感病毒的NA中发生了自然突变。已经描述了两种对NA抑制剂的耐药机制。第一种涉及NA酶催化位点内的突变，破坏了它与药物的直接相互作用。第二种涉及HA的突变，减少了对其受体的亲和力，从而补偿了药物对NA活性的影响。最常见的观察到的突变，如流感A病毒N1 NA亚型的H275Y和N295S（N1编号）；流感A病毒N2 NA亚型的R292K和E119V（N2编号）和流感B病毒的R152和D198N，是赋予NA抑制剂耐药性的NA突变，以减少唾液酸酶活性和/或稳定性。除了上述两种主要的抗流感治疗药物外，还发现了一些新的抗病毒抑制剂，如聚合酶抑制剂（例如法匹拉韦和利巴韦林）、HA抑制剂（例如RO5464466、阿比多尔、MBX2329和MBX2546）、NP抑制剂（例如萘普生和姜黄素）和宿主靶向剂（例如DAS18），它们也可以作为对抗流感病毒感染的额外治疗选择。 尽管有几种治疗药物可用于抗流感治疗，但接种流感病毒疫苗仍然是预防和控制流感病毒传播的最有效方法之一，可以显著降低流感病毒感染的发病率和相关医疗并发症。常用的流感疫苗包括灭活流感疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位流感疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组病毒载体流感疫苗。在这篇综述中，我们讨论了不同流感疫苗的优缺点，病毒载体流感疫苗的开发，以及其他使用流感病毒作为载体的病毒疫苗的构建，以提供开发有效和安全新型流感疫苗的重要见解。 2.不同类型的流感疫苗及其优缺点 流感疫苗是预防和控制流感病毒感染的重要措施。目前，商业化和实验性的流感疫苗主要包括灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗。 2.1.减毒活流感疫苗（LAIV） 减毒活流感疫苗是通过流感病毒基因组中自然发生的突变产生的毒力较低的流感病毒株，或者是通过在病毒易感细胞、胚胎鸡蛋中多次传代所谓的亲本流感病毒，或其他使病毒毒力降低的过程，即不太可能在实验感染动物中引起重大疾病的病毒。选择毒力较低的流感病毒株作为候选疫苗，进一步在人类志愿者中进行测试，然后才能被FDA考虑批准作为人类流感疫苗使用。这种类型的流感疫苗株具有低毒力和致病性，但仍允许病毒在接种后相对较短的时间内感染和增殖。LAIV主要包括流感A(H1N1)、A(H3N2)亚型和流感B病毒的维多利亚系。根据迄今为止公布的数据，LAIV的鼻内接种可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。特别是，LAIV诱导的细胞免疫反应，如高交叉反应性CD8+ T细胞反应和IFN-g+ T细胞反应，在学龄儿童和婴儿中比成人更好。随着反向遗传技术的进步，即在实验室环境中使用称为质粒的圆形DNA片段来工程化病毒的分子方法，许多研究中使用手动删除或替换病毒的毒力基因，以减弱病毒的毒力或工程化病毒携带一个或多个所需的外源基因。使用这些现代技术，可以产生三价和四价LAIV，分别表达三种或四种流感病毒HA基因。四价LAIV已被证明对美国2-17岁儿童提供有效的保护效果。在中国，首个三价LAIV（长春百克生物科技有限公司，中国）于2020年获得市场批准。然而，考虑到LAIV仍然可以在接种者中复制，因此可能通过称为遗传逆转的过程将其基因组演变为亲本样病毒，这可能允许它在人类群体中传播，LAIV可能对公共卫生构成潜在风险。因此，需要更多的研究来调查这些LAIV的安全性，然后才能广泛使用。 2.2.灭活全病毒疫苗 在20世纪40年代，由Thomas Francis Jr., MD和Jonas Salk, MD领导的密歇根大学研究小组开发了第一种基于灭活流感A病毒的流感疫苗，并在1945年获得军用许可。他们的疫苗使用受精鸡蛋的方法至今仍用于生产大多数流感疫苗。这种方法涉及在鸡胚（或真核细胞）中培养病毒以允许病毒增殖，然后通过加热或用化学试剂（主要是甲醛）处理来灭活病毒，以减弱病毒的感染细胞和增殖能力。然后添加佐剂以增强最终疫苗配方的免疫原性。灭活全病毒疫苗配方中包含的灭活流感病毒被剥夺了毒力和传播能力，同时保留了病毒表面蛋白抗原（如HA和NA）提供的完整抗原性。因此，灭活全流感病毒疫苗具有高安全性、保持完整病毒抗原组分、高免疫原性、提供长期免疫保护以及无毒力逆转风险的优点。如前所述，反向遗传方法的进步已经彻底改变了制备灭活全流感病毒疫苗的过程，该疫苗由已知毒力基因被删除或以某种方式操纵以灭活病毒的重组流感病毒组成。除了人类使用，灭活全流感病毒疫苗也是预防家禽行业禽流感病毒（AIV）感染的重要工具。 中国预防禽流感的流感疫苗主要是灭活全病毒疫苗。2018年，中华人民共和国农业农村部批准的六种灭活禽流感疫苗产品主要针对AIV的H5和H7亚型。这六种疫苗包括重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗和灭活疫苗（H5N2株rSD57+株rFJ56, H7N9株rGD76）。这些疫苗株使用H5N2亚型流感病毒株（D7）作为病毒基因组骨架（提供六个内部病毒基因）和来自H5N1、N5N6和H7N9突变病毒株的HA和NA基因。这些重组疫苗株是通过使用反向遗传技术产生的，针对在中国家禽养殖场主要传播的几种病毒，包括携带2.3.2.1d和2.3.4.4d亚型HA基因的H5亚型病毒，以及在家禽中产生高免疫效应的H7N9病毒。同样，由哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院新批准的重组疫苗，由灭活的重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗（H5N1株Re-11+株Re-12和H7N9株H7-Re3）组成，也是通过反向遗传技术产生的。值得注意的是，这些AIV灭活疫苗不仅可以预防家禽中的AIV感染，而且对人类公共卫生也大有裨益。自2013年开始，H7N9亚型AIV造成了数百例人类病例死亡，因此被认为是中国的一个主要公共卫生威胁。然而，在2017年9月将H5/H7二价灭活流感疫苗引入家禽业以控制H7N9流感病毒感染后，家禽中H7N9病毒的流行率大幅降低，并且使用这种疫苗对鸡进行免疫接种在预防人类感染H7N9病毒方面也非常有效，事实上，在H5/H7二价疫苗广泛使用后的两年内，仅有4例人类H7N9病例报告，与2016年10月1日至2017年9月30日记录的人类H7N9病例数量相比减少了99.5%。 灭活全流感病毒疫苗可以在体内诱导体液免疫，并产生高滴度的特异性IgG抗体。然而，这种疫苗对不同基因型或亚型的病毒交叉免疫保护效果并不理想。此外，还有其他一些缺点，包括相对较低的抗体产生率、相对较低的细胞免疫应答诱导效果，以及更多免疫剂量可能给接种动物带来过大的压力。还有报道指出，灭活全人类流感病毒疫苗可能会引起儿童高热，因此不推荐12岁以下儿童使用。随着疫苗生产工艺的进步，全人类流感病毒疫苗的生产已逐渐被淘汰。相比之下，裂解病毒疫苗和亚单位疫苗的开发和应用取得了进展，这些疫苗可以提供相当和有益的免疫效果，并具有更高的安全性。 图1、五种常用流感疫苗的组成：(A) 减毒活流感疫苗，(B) 全病毒灭活疫苗，(C) 裂解病毒流感疫苗，(D) 亚单位流感疫苗，以及 (E) 病毒体流感疫苗。这五种不同的流感疫苗在活性、抗原成分和结构组织上有所差异，这些差异影响了疫苗的免疫原性和保护效力。该图是用 Biorender.com 创建的。 2.3.裂解病毒流感疫苗 裂解病毒流感疫苗是基于灭活全流感病毒疫苗制备的。选择合适的裂解剂和条件破坏病毒包膜并裂开病毒颗粒。裂解剂以及病毒的核酸和大分子量蛋白被丢弃，而活性抗原组分（HA和NA）和部分M和NP蛋白（增强免疫反应）得以保留。这种疫苗配方可以集中并增加一定体积疫苗中活性抗原蛋白的水平，这可以在最大程度上刺激抗体产生效果，同时大大减少由病毒颗粒其他组分可能引起的不必要副作用。因此，裂解流感疫苗比灭活全流感疫苗更安全。目前，中国市场上已经批准的这类疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）和四价灭活流感疫苗（IIV4）。裂解流感疫苗是IIV3的主要组成部分，而所有的IIV4都是裂解流感疫苗。先前的研究表明，对于6个月以上儿童接种裂解病毒免疫接种，具有令人满意的保护效果，2011-2012年接种数据显示，36-59个月和6-35个月儿童接种IIV3的保护效果分别为58.2%和49.6%。此外，其他研究也表明，IIV4对流感B病毒的免疫原性高于IIV3。IIV4主要包括流感A(H3N2)、A(H1N1)亚型，以及流感B病毒的维多利亚和山形株。血凝抑制（HI）阳性转化率作为衡量接种个体血清中能中和流感病毒的抗体存在的标志，HI的几何平均滴度（GMT）平均增长率，以及疫苗免疫后血清抗体保护率均达到预期，表明疫苗具有高免疫原性。 2.4.亚单位流感疫苗 传统的亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗制备的，其中HA和NA抗原蛋白进一步提取、纯化和浓缩。然后，添加相应的佐剂以制备最终的亚单位疫苗配方。或者，随着基因工程技术的进步，分子克隆技术已被应用于构建亚单位流感疫苗。简言之，通过限制性内切酶消化和连接过程，将流感病毒的主要抗原蛋白基因（如HA和NA）克隆到蛋白表达质粒中。将工程质粒转移到原核或真核细胞中，以产生HA或NA蛋白抗原，然后进行浓缩和纯化，添加相应的佐剂以获得最终的亚单位疫苗（严格意思上的亚单位疫苗）。常用的IIV3疫苗包括一些通过这种方法制备的疫苗。例如，Influvac®（Solvay Pharmaceuticals BV, Weesp, The Netherlands）和Agrippal®（Chiron SRL, 现为Novartis Vaccines, Viaflorentina, Italy）疫苗在健康儿童、成人和老年人中显示出良好的免疫原性、安全性和耐受性。由于孕妇极易感染流感病毒，特别为孕妇设计了三价流感亚单位疫苗Agrippal S1和Grippol Plus，这些疫苗符合药品委员会（CPMP）标准，并已显示出为孕妇提供高滴度抗体以及长达6个月的婴儿免疫保护效果。除了人类使用，也广泛研究了猪和家禽的亚单位流感疫苗。Hernandez等同事使用杆状病毒载体系统表达猪流感病毒（SIV）HA蛋白与猪IgG2a Fc结合，可以为猪提供有效的抗H1N1 SIV效果和高滴度血清抗体，并减少肺损伤。此外，Song等同事评估了重组HA1-2亚单位疫苗对禽源H7N9流感的免疫原性，并发现含佐剂的灭活疫苗候选物可以在小鼠中诱导有效的HA1-2特异性体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。值得注意的是，它们有一些缺点，包括相对较低的免疫原性、所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。 2.5.病毒体流感疫苗 病毒体是重组流感病毒包膜，由HA、NA和病毒磷脂组成。它们的颗粒结构使病毒体保持病毒膜融合和细胞结合能力，这可以增加与亚单位和裂解病毒疫苗相比的免疫原性。病毒体可以将封装的货物送入抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并随后诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，由于缺乏佐剂，病毒体在激活APCs和触发交叉呈递方面的效率不高，这限制了CTL免疫的诱导。因此，添加合适的佐剂可以克服这一缺点。Dong等同事开发了一种新型流感疫苗配方，该配方由含有Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂质A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni的病毒体组成。体外研究表明，含MPLA的病毒体比未加佐剂的病毒体更能强烈激活APCs，并且用含MPLA的病毒体免疫小鼠，病毒NP附着可以促进NP特异性CTLs的启动。病毒体也被用作短肽抗原的传递系统。Soema等同事构建了含有保守的人类HLA-A2.1流感T细胞表位M158-66的病毒体。在HLA-A2转基因小鼠中评估了这些肽装载病毒体的免疫原性和保护效果。在小鼠和树突状细胞培养中研究了病毒体的传递特性。用含肽病毒体和佐剂CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1转基因C57BL/6小鼠，增加了肽特异性CTLs的数量。用含佐剂的肽装载病毒体免疫接种减少了小鼠在异源流感病毒挑战后的体重损失。 自20世纪70年代首次提出病毒体流感疫苗以来，经过20多年的发展，流感病毒体疫苗已积累了足够的临床实验数据，并由此产生了两种产品Epaxal®和Inflexal®，它们分别由瑞士伯尔尼瑞士血清和疫苗研究所在1994年和1997年生产。其中，Inflexal®是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，它在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。它能够诱导B细胞反应并产生病毒抗原特异性抗体。然而，一项临床研究未能证明其能够诱导针对嵌入病毒体的两个肽段（CTL靶标抗原）的CD8+ T细胞。这一缺陷表明的是病毒体技术的局限性，还是仅仅反映了目标抗原选择的非最优性，目前尚不清楚。与灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗和病毒体疫苗类似，主要诱导B细胞介导的体液免疫。未来的研究需要开发能够同时诱导细胞免疫和体液免疫的流感疫苗，如前述的减毒活流感疫苗和下文描述的活病毒载体疫苗。 活病毒载体流感疫苗利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到不同类型的病毒基因组中，使得这种重组病毒能够在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 3.病毒载体流感疫苗 病毒载体流感疫苗是指利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到另一种病毒的基因组中，这使得这种重组病毒能在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 图2、复制缺陷型腺病毒载体流感疫苗的工作原理。携带流感病毒HA基因的复制缺陷型腺病毒载体能够诱导产生高滴度的血凝抑制(HI)抗体。该图是用 Biorender.com 创建的。 3.1.腺病毒载体流感疫苗 腺病毒载体疫苗使用腺病毒作为载体，通过将其与腺病毒基因组结合，表达感兴趣的病原体的保护性抗原蛋白的转基因。腺病毒载体疫苗具有几个优点，包括高水平的抗原蛋白转基因表达，以及同时诱导体液和细胞免疫应答的能力。它们也是安全的，易于制备，不需要佐剂。目前，它们被广泛开发作为预防性疫苗。 腺病毒载体疫苗策略已被用于尝试开发通用流感疫苗。由于流感病毒包括许多基因型（或亚型），并且可以通过自然遗传突变和/或基因组重排（称为抗原漂移和抗原移位）相对快速地进化，因此同时为个体提供针对不同流感病毒的保护的疫苗生产面临真正的挑战。开发通用流感疫苗是解决这一重要问题的重要方法。为此，已构建腺病毒载体流感疫苗以表达流感病毒蛋白的保守抗原区域，如HA2的茎区、嵌合HA、M2e、NP及其T/B细胞表位，因为这些主要蛋白抗原对各种亚型的流感病毒显示出高度的免疫原性和免疫保护效果。例如，Tutykhina等同事构建了一种携带流感病毒保守M2和NP抗原表位的重组腺病毒载体（Ad5-tet-M2NP），该载体能够诱导高水平的CD8+和CD4+ T细胞产生，表明接种这种重组病毒载体疫苗可以诱导针对流感病毒的强效T细胞介导的免疫应答。接种这种活腺病毒载体疫苗的小鼠在8个月后能够产生高水平的效应记忆CD44+CD62- T细胞，并对五种流感病毒（H9N2、H1N1、H5N2、H2N3和H3N2）显示出有效的长期保护效果。Hassan等同事构建了一种不同的活腺病毒载体疫苗，包含H5N1流感病毒的保守抗原表位，包括由M2外域（M2e）、血凝素（HA）融合域（HFD）、核蛋白的T细胞表位（TNP）和HA a-螺旋域（HaD）组成的多表位（ME）。这种腺病毒载体ME疫苗诱导了体液和细胞免疫应答，减少了接种小鼠肺部的流感病毒滴度，并显示出相对良好的免疫保护效果，能够抵抗H5、H7和H9流感病毒的挑战。然而，用Ad-ME载体疫苗免疫的小鼠在挑战后的肺部流感病毒滴度仍然显著高于匹配的HA对照疫苗接种动物，这表明最佳的抗体介导保护可能需要结构完整的HA免疫原。因此，还可以基于所谓的计算优化广谱反应原（COBRA）概念，计算设计表达结构完整、全长HA作为免疫原的其他类型的基于Ad的疫苗。 目前，5型腺病毒（Ad5）是最常用的人腺病毒（AdV）载体。Wu等同事构建了一种复制缺陷的重组AdV（rAd5-avH1HA），在单轮细胞感染后能够表达H1N1流感病毒（A/swine/Zhejiang/199/2013株）的HA蛋白。作者表明，这种疫苗能够诱导产生高滴度的中和抗体，并显著减少接种的BALB/c小鼠鼻腔和肺部的挑战流感病毒的复制。由于大多数人对Ad5具有自然免疫力，非人源重组腺病毒载体，如牛腺病毒（BAdV），也越来越多地受到研究人员的关注。例如，Ekramy等同事使用BAdV-3构建了一种重组腺病毒载体流感疫苗BAd-H5HA，表达H5N1亚型禽流感病毒的HA基因，并在小鼠中比较了与HAdV类型C5（HAdV-C5）载体H5N1疫苗（HAd-H5HA）的免疫效果。他们首次发现，低剂量（1×106 PFU）肌肉注射BAd-H5HA可以在小鼠中诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并提供针对异源H5N1病毒的有效免疫保护。相比之下，HAd-H5HA需要较高剂量（1×108 PFU）才能达到相当的免疫效果。 3.2.沙粒病毒载体流感疫苗 沙粒病毒是一类具有双节段RNA基因组的包膜RNA病毒。沙粒病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）、马丘波病毒（MACV）、皮钦德病毒（PICV）等。这些沙粒病毒（也称为哺乳动物沙粒病毒）可以通过感染啮齿动物的粪便、尿液、血液或唾液传播给人类，它们是沙粒病毒的自然宿主。由LASV、JUNV和MACV等致病性人类病毒引起的严重出血热是主要的感染相关症状。相反，许多其他沙粒病毒，如PICV，在感染后不引起人类和哺乳动物的任何临床表现，因此被认为是非致病性的（即无害的）偶然宿主。同样，LCMV通常不会对普通人群构成严重健康威胁，因为大多数LCMV感染的病例都是无症状或轻微的。 先前的研究表明，沙粒病毒在感染的早期主要感染重要的免疫细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，这使它们成为疫苗开发的理想病毒载体，因为它们靶向这些能够自然增强对抗原蛋白免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）。已有几项研究利用反向遗传技术生成携带感兴趣抗原蛋白的重组LCMV。Emonet等同事开发了一种三质粒反向遗传系统来生成三节段LCMV。通过该系统恢复的重组LCMV能够同时携带多达两个感兴趣的抗原蛋白的转基因。2018年6月，专注于肿瘤学和传染病创新活性免疫疗法的临床阶段生物技术公司Hookipa Biotech AG（“Hookipa”）和研究型生物制药公司Gilead Sciences, Inc.（“Gilead”）宣布了一项研究合作和许可协议，授予Gilead对Hookipa的TheraT®和Vaxwave®沙粒病毒载体技术的独家权利，用于乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）两种主要慢性传染病的指示。值得注意的是，基于LCMV载体并表达人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E7和E6开放阅读框（ORFs）的非致癌性融合蛋白作为模型肿瘤相关抗原的TheraT®载体，以及基于PICV的类似病毒结构，目前正在作为HPV16阳性头颈癌的重复原始增强免疫策略进入临床1期测试。这是首次在人类（FIH）第1期（剂量递增）/第2期（剂量扩展）多国、多中心、开放标签研究中包括140名HPV16+确诊癌症参与者。虽然这在使用LCMV等沙粒病毒载体作为治疗性肿瘤疫苗方面迈出了重要一步，但值得注意的是，约5%的人类人群显示出先前接触LCMV的证据，因此存在预先存在的（LCMV）载体免疫问题。此外，尽管大多数获得性LCMV感染是无症状或轻微的，但先天性LCMV感染可能非常严重，可能导致自然流产和胎儿死亡，或引起脑功能障碍。最近的报告还表明，LCMV感染免疫受损个体也可能导致一些严重的医疗并发症。在极少数情况下，LCMV感染可能导致某些形式的神经系统疾病，如无菌性脑炎、脑炎、脑膜炎或甚至在健康个体中引起小头畸形，因此必须谨慎使用。 PICV与LCMV具有相似的病毒基因组结构，但与全球发现的LCMV不同，其宿主是普通家鼠属Mus musculus。PICV仅在南美洲哥伦比亚的皮钦德谷特有的稻大鼠属oryzomys albigularis中发现。与LCMV不同的是，PICV在人类中不会引起疾病。Dhanwani等同事构建了一个PICV的三质粒反向遗传系统，并用它来开发PICV载体流感疫苗。当将A型流感病毒（HA和/或NP）的抗原蛋白转基因插入重组PICV载体疫苗（rP18tri）时，这些PICV载体流感疫苗可以有效地在接种的小鼠中诱导针对HA和NP的特异性体液和适应性免疫应答，并能提供持久的、有效的保护效果，使接种的动物能够抵御致命的小鼠适应株流感病毒（PR8）。此外，对PICV的中和抗体（nAb）反应水平非常低。这种免疫逃避现象部分可以用Pichinde病毒粒子表面膜上的糖蛋白（GPC）高度糖基化来解释，这使得病毒无法被nAbs识别。因此，PICV载体疫苗比LCMV载体疫苗具有一个主要优势，即PICV基疫苗可以克服初次加强免疫期间抗载体免疫的问题。尽管仍处于开发的早期阶段，但PICV载体已被证明相对安全，可以避免由于PICV仅在哥伦比亚自然发现而预先存在的免疫力，并且已显示出作为开发新型流感和其他病原体疫苗的病毒载体的巨大潜力。 最近的一项研究表明，基于PICV和LCMV的病毒载体可以被设计来传递肿瘤相关抗原，如HPV16 E6和E7基因的非致癌性融合蛋白，在异源原始增强方案中可以有效诱导肿瘤特异性CTL（CD8+ T细胞）反应，消除已建立的实体肿瘤并保护接种的小鼠免受肿瘤再挑战。沙粒病毒家族成员可以诱导强烈的CTL反应和低水平的中和抗体，这有助于克服其他病毒载体中常见的抗载体免疫问题，例如痘病毒和腺病毒载体。基于这些激动人心的新发现，已经建立了一种新的基于沙粒病毒的免疫治疗策略。 图3、不同类型病毒载体及其疫苗的优势、劣势以及应用。该图是用 Biorender（Biorender.com）创建的。 3.3.新城疫病毒载体流感疫苗 新城疫病毒（NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏液病毒科，其基因组从3'端至5'端依次编码六个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）。NDV基因组能够被改造以稳定表达大片段的感兴趣转基因（4.5 kb或更大），并且能够表达超过3种不同的非NDV蛋白。理论上，任何插入NDV两个蛋白编码序列之间的外源基因都可以被表达。先前研究表明，当外源基因插入NDV P和M基因之间时，表达水平最高。 NDV能够感染不同哺乳动物的呼吸道上皮细胞，如家禽、人类、猪、小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。NDV能够激活宿主的局部粘膜免疫，诱导产生高效的体液和细胞免疫应答。此外，NDV的整个复制周期都在细胞质中进行，从而最小化了病毒基因组与宿主基因组之间重组的风险。NDV载体疫苗的应用可以通过喷雾和/或将疫苗加入饮水等大规模免疫方法进行。另一个优点是NDV在鸡胚中高效增殖，有利于重组NDV载体疫苗的大规模生产。因此，NDV载体已成为人类和动物疫苗开发的重要对象。 人类不是NDV的自然宿主，因此NDV对人类不太致病。此外，已经证明NDV与已知的多种人类副黏液病毒（如呼吸道合胞病毒RSV和人类副流感病毒hPIV）的氨基酸同源性和相似性较低，因此人类对这些其他呼吸道病毒的免疫对NDV的影响有限。Bukreyev等同事构建了一种表达人类副流感病毒3型（HPIV3）HN蛋白的重组NDV，随后将其作为活病毒载体疫苗（106.5 PFU）用于非洲绿猴和恒河猴的鼻内和气管内接种。活重组NDV载体HPIV3疫苗仅在接种动物的呼吸道复制。28天后进行第二次免疫。结果显示，接受活重组NDV载体HPIV3疫苗免疫的动物的中和抗体血清滴度显著高于接受野生型HPIV3免疫的动物。为了评估NDV载体疫苗对人类流感病毒的有效性，Nakaya等同事使用NDV Hitchner B1株作为病毒载体，将人类流感A/WSN/33病毒的HA基因插入NDV P和M基因之间，构建了rNDV/B1-HA疫苗。结果表明，重组NDV载体流感疫苗能够在接种的小鼠中诱导产生强大的体液免疫应答，通过高水平的针对流感病毒HA蛋白的抗体滴度提供对A/WSN/33病毒的保护效果。DiNapoli等同事研究了NDV载体疫苗对非洲绿猴高致病性禽流感病毒（HPAIV）的免疫效果，他们用活重组NDV载体疫苗（10 PFU）表达H5N1 HPAIV HA蛋白（NDV-HA）对动物进行免疫。两次疫苗接种后，诱导产生了高滴度的中和抗体，并在呼吸道诱导产生了高水平的粘膜免疫球蛋白IgA反应。这些发现表明，NDV载体流感疫苗可能对人类使用具有潜力。 新城疫和禽流感都是严重威胁家禽业的重要传染病。因此，通过疫苗接种预防这两种疾病具有特别的意义。构建高效的新城疫和禽流感二价疫苗可以减少疫苗生产成本和通过多种疫苗给动物带来的不利压力。NDV载体AIV疫苗是解决这一问题的策略之一。Ma等同事构建了一种表达A/chicken/Iowa/04-20/2015 (H5N2)病毒HA蛋白的重组NDV病毒，用作流感疫苗候选物。作者发现，无论是活NDV载体流感疫苗还是灭活NDV载体流感疫苗都能在接种后两周诱导产生针对H5N2 HA蛋白和NDVLaSota株的中和抗体。然而，活NDV载体流感疫苗的免疫原性低于灭活NDV载体流感疫苗。此外，这些疫苗对高致病性H5N2 A/turkey/Minnesota/9845-4/2015病毒的复制显示出效果，这通过接种动物的有限病毒脱落证明。免疫鸡的血清还能在病毒挑战后中和高致病性H5N1和H5N8病毒。在另一项研究中，Xu等同事将H9亚型AIV HA蛋白的外域与NDV F蛋白的跨膜域和细胞质尾区融合，构建了重组NDV载体流感rmNA-H9F疫苗候选物。接种后，这种疫苗能够保护鸡免受致死剂量的NDV和AIV H9N2的挑战，并诱导产生高水平的NDV-HI、H9-HI和分泌型IgA。 尽管NDV载体AIV疫苗已经在实验室实验中显示出显著的积极免疫效果，但存在针对NDV的母源抗体可能会减少NDV载体疫苗的有益免疫效果。为了解决这个问题，一些研究小组建议使用嵌合NDV载体。通过用具有不同血清学特性的禽副黏液病毒2型（APMV-2）的对应物替换NDV F和HN蛋白的外域构建了嵌合NDV载体（NDV株BeaudetteC）。这绕过了针对NDV的预先存在的母源抗体，并为HPAI病毒提供了有效的保护。Chowdhury等同事也使用这种方法构建了表达H7 HA蛋白保守序列的重组嵌合NDV载体。他们的发现显示，由于母源抗体的影响，4周龄鸡在异源初次加强免疫策略后没有诱导出高滴度的NDV LaSota特异性抗体。然而，通过NDV/HA异源初次免疫后，H7中和抗体的滴度已经超过了16 HI，这可以保护肉鸡和火鸡免受H7N8 HAPI的侵害，同时也减少了病毒脱落。 3.4.杆状病毒载体流感疫苗 杆状病毒是一种感染昆虫细胞的病毒，因此，只有无脊椎动物能被这种病毒感染。Autographa californica多重囊核多角体病毒（AcMNPV）是研究实验室中最常用的杆状病毒。AcMNPV是一种大型双链DNA病毒，基因组为133.9 kb，包含156个开放阅读框（ORFs）。AcMVPV的基因组较大，因此有足够的位置插入感兴趣的外源基因以在病毒感染的细胞中表达。在过去的三十年中，为了这个目的，杆状病毒表达载体系统（BEVS）不断优化。在过去的十年中，基于BEVS的疫苗研究逐渐增加，有7种商业化产品已获批准用于人类，其中包括人类乳头瘤病毒疫苗、流感疫苗、前列腺癌疫苗和脂蛋白脂酶缺陷疫苗。 随着BEVS的不断进步，这些技术也被应用于构建杆状病毒载体流感疫苗。Influenza-Flublok Quadrivalent，一种四价重组杆状病毒载体流感疫苗，配方每0.5 mL剂量含有180 mg，每种流感病毒株的HA含量为45 mg：A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/Minnesota/41/2019（类似A/Hong Kong/45/2019的病毒）(H3N2)、B/Washington/02/2019和B/Phuket/3073/2013，可用于2020-2021年流感季节的人类疫苗接种。Flublok Quadrivalent是一种用于主动免疫以预防由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的疫苗。它已于2017年获批用于18岁及以上人群。Influenza-Flublok的三价版本于2013年获得许可，但后来被四价版本取代。与灭活流感疫苗相比，Flublok配方中相对较高的流感抗原水平可以增强疫苗的免疫原性并减少局部反应原性。此外，Liu等同事评估了另一种基于BEVS的H5亚单位疫苗（A/goose/Guangdong/1/96），发现这种疫苗可以保护BALB/c小鼠以及无特定病原体（SPF）和商业肉鸡，因此可以作为人类和动物候选H5流感疫苗株。此外，Yu等同事使用BEVS构建了一种重组杆状病毒载体BmNPV-CMV/THB-P10/CTLT疫苗，该疫苗包含H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的T淋巴细胞表位（CTLT）的融合密码子优化序列，以及H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的Th和B细胞表位（THB）的融合密码子优化序列，然后用于小鼠和鸡的免疫。他们的发现表明，疫苗可以在两种动物中激活流感病毒特异性的体液和细胞反应，表明疫苗可以作为针对不同亚型AIV的通用疫苗。尽管BEVS具有作为疫苗开发有吸引力的载体平台的独特特性，但考虑到与BEVS相关的因素，如蛋白质复杂性、翻译后修饰、规模和成本，它并不适用于所有疫苗产品开发。应用杆状病毒载体疫苗作为常用疫苗载体平台的主要限制是缺乏人类免疫的安全指南。需要进一步研究以成功将技术整合到现实生活情况中。还需要在哺乳动物系统中建立完整的杆状病毒基因表达，以进一步增强基于杆状病毒的疫苗的安全性。杆状病毒可能是具有作为潜在疫苗的一些有吸引力属性的下一代流感疫苗。 3.5.疱疹病毒载体流感疫苗 疱疹病毒是一种具有大型双链DNA基因组的病毒，大小范围约为125到240 kbp。这些疱疹病毒在宿主范围上受到限制，例如，禽类疱疹病毒只能感染禽类。有几种疱疹病毒载体可用，包括火鸡疱疹病毒（HVT）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。MDV疫苗已经在养禽业中使用了40多年，因为它可以诱导对抗马立克氏病的终身免疫。HVT已被用作病毒载体来表达各种抗原蛋白，如AIV的HA蛋白和NDV的F蛋白。已有几种基于HVT载体的商业疫苗表达H5亚型AIV的HA蛋白，如Vectormune® AI [CEVA Animal Health, Lenexa, KS, USA (www.vectormune-ai.com)]。这种疫苗为火鸡和家鸭提供了针对H5亚型HPAI的有效免疫保护。Kapczynski等同事构建了一种表达2.2 H5N1 AIV HA蛋白的重组HVT载体AIV疫苗，该疫苗在鸡接种后对H5N1和H5N2 HPAIV挑战产生了显著的保护效果，使动物的存活率达到80%-95%。此外，接种HVT载体AI疫苗的鸡的脾T淋巴细胞能够识别MHC匹配的目标细胞感染H5、H6、H7或H9 AI病毒。Li等同事使用细菌人工染色体（BAC）克隆技术构建了另一种表达H7N1 HPAIV HA基因（rHVT-H7HA）的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H7HA可以诱导产生H7特异性免疫反应，帮助鸡抵御高致病性H7N1病毒的感染，并显著减少病毒脱落。Liu等同事还使用BAC克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种表达H9 HA蛋白的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H9可以在接种后35天诱导鸡产生体液和细胞免疫反应，这通过针对H9的高滴度中和抗体HI和激活IFN-g+ CD4+和IFN-g+ CD8+ T细胞证明。当接种的动物在接种后35天受到H9N2 AIV挑战时，在鸡的气管和肛门拭子中在挑战后3天和5天没有观察到病毒脱落。此外，在接种鸡的器官（气管、肺、脾和肾）中没有检测到H9N2病毒。这些发现表明，HVT作为禽流感疫苗开发的病毒载体具有前景。然而，疱疹病毒载体的一些缺点，如高水平的预先存在的抗载体免疫、通过卵内途径提供完全保护所需的相对较长时间以及宿主细胞终身感染可能造成的风险，可能会阻碍这种病毒载体在疫苗开发中的考虑。 流感疫苗的开发包括季节性流感疫苗和通用流感疫苗两个主要方向。季节性流感疫苗针对每年流行的流感病毒株进行设计，而通用流感疫苗则旨在提供针对多种流感病毒株的广泛保护。 4.季节性流感疫苗和通用流感疫苗的开发 许多前述的病毒载体疫苗已被证明是安全且具有免疫原性的，它们能够激活针对感兴趣抗原蛋白的体液和细胞免疫反应，无论是在局部粘膜部位还是系统性地。因此，病毒载体疫苗可以克服传统灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗的一些固有缺点。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需要进一步研究。流感疫苗开发中真正的挑战是如何应对流感病毒频繁的抗原漂移和抗原转变，以及流感病毒的快速突变率。为了克服这个问题，最近的努力集中在改进流感病毒的流行预测，以开发能够与预测的季节性病毒紧密匹配的疫苗候选物，以及开发能够对多种流感病毒株提供广泛保护效果的通用流感疫苗。 4.1.季节性流感疫苗的开发 流感监测是一项全球性的公共卫生活动，每年在全球范围内进行。世界卫生组织（WHO）自1952年起组织了这一协调的全球性努力，以追踪流感病毒感染，最初称为全球流感监测网络（GISN），2011年更名为全球流感监测与响应系统（GISRS），并扩展到包括113个成员国的143个机构。根据这一流感病毒监测系统的主要两种方法，通过综合征监测系统从门诊或医院收集信息，以监测当地社区流感疾病的新出现，而循环流感病毒株的病毒学特征则由实验室监测系统收集。每年两次，全球季节性流感病毒循环的所有收集到的信息都会被GISRS整合、分析，并提供给适当的当局，用于季节性流感疫苗株的选择和通用流感疫苗的开发。自20世纪50年代以来的几十年里，流感病毒疫苗株的选择依赖于年度血清学检测的数据，这些数据提供了免疫系统对当前循环流感病毒的反应的表型测量。然而，血清学检测有一定的缺点，包括劳动强度大、实验室间数据不一致，以及数据不公开和/或难以解释或扩大规模。因此，这些方法只能应用于分析一小部分流感病毒。因此，迫切需要开发基于监测数据的流感病毒持续进化分析工具，并为选择具有更广泛保护潜力的流感疫苗株提供建议。系统发育树或进化树是用于可视化循环流感病毒遗传进化的工具之一。多年来，研究人员开发了多个类似的工具来生成系统发育树并分析循环流感病毒的遗传进化。其中一种方法称为Nextflu（https://bedford.io/projects/nextflu/），这是一个由Neher和Bedford设计的在线可视化工具。Nextflu可以实时跟踪循环流感病毒的进化，特别是人类季节性流感病毒的进化。用户可以通过可视化循环流感病毒株的遗传和流行病学特征来分析季节性流感循环模式，这可以为即将到来的流感季节提供预测。同样，人群水平流感病毒序列的AD图结合了系统发育推断和祖先特征状态重建的信息，这是一种依赖于使用最大简约法将生物体的特征状态映射到系统发育树上的方法，以识别可能处于定向选择下的等位基因和相关遗传变化。除了系统发育树，抗原图或抗原图也是重要的分析工具。抗原图已经使用A型（H3N2）人类流感病毒的数据开发，并常规用于分析WHO流感监测网络的全球数据，作为流感疫苗株选择过程的一部分。抗原图基于反映病原体抗原特性的血清学数据。流感病毒的抗原特性通常基于对病毒分离物进行的血凝抑制（HI）数据，这些数据针对特定株的感染后雪貂抗血清进行测试。通过使用上述工具可视化流感病毒的自然进化，研究人员可以构建统计学习模型来解释抗原差异并预测流感病毒的下一步进化。例如，Steinbrück及其同事结合AD图和抗原树分析了2002年至2007年收集的流感A型（H3N2）的HA基因的进化，并成功预测了H3N2病毒在回顾性测试场景中的抗原进化。 尽管能够预测下一个季节性流感病毒株，但通常需要大约一年的时间来完成流感疫苗株的选择，并通过疫苗生产、发布和分发过程。然而，在这段时间里，循环的流感病毒可能会进一步变异，使其与选定的疫苗株不相似，正如最近的例子所示，预测的H3N2病毒流感疫苗，这种病毒与其他季节性流感病毒相比，进化得特别快且不可预测，并在2004年至2019年过去十五个流感季节中的六个季节中，使季节性流感疫苗与自然循环的H3N2株不匹配。此外，季节性流感疫苗刺激的抗体水平可能只能在相对较短的时间内维持，然后在流感季节结束前降至亚保护水平。这些问题可能会使预测和生产最佳季节性流感疫苗的能力复杂化，因此可能需要其他方法（例如，通用流感疫苗的开发）来生产覆盖不同流感病毒株的更广泛流感疫苗。 4.2.通用流感疫苗的开发 通用流感疫苗旨在提供针对甲型和乙型流感病毒的保护，而不受它们已知的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）或其他病毒基因或基因片段的抗原漂移和移位的影响。目前，通用流感疫苗开发的几种常见靶点包括HA蛋白的保守茎部结构域、M2离子通道（M2e）的外域以及内部蛋白核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。 由于流感病毒的茎部区域位于病毒粒子表面的一个不易被中和抗体接近的区域，因此它受到宿主免疫系统的选择压力较小，因此在不同流感病毒之间高度保守。因此，针对HA蛋白的这个保守茎部区域，可以合理地假设能够诱导出针对流感病毒内部亚型、不同亚型之间以及不同群组之间的广泛反应性抗体。 已经探索了包括生成具有HA头部高度糖基化、"无头"HA、仅表达茎部的长α螺旋（LAH）结构域以及开发嵌合和马赛克HA以诱导针对茎部的抗体等不同策略的候选通用流感疫苗。通过这些策略开发的一些通用流感疫苗已进入人体临床试验，并显示出一些令人鼓舞的结果。例如，一项包括65名参与者的I期临床试验结果表明，他们接受了两次不同组合的嵌合HA活流感病毒、灭活流感病毒或灭活流感病毒加佐剂的免疫接种，显示出诱导抗茎部H1抗体的证据。更令人鼓舞的是，结果显示，在接受了两次嵌合HA灭活和佐剂流感病毒疫苗的参与者中，诱导的抗茎部抗体在1.5年内比基线高出4倍以上。 其他尝试生产通用流感疫苗的方法涉及以流感病毒M2e蛋白为靶点。虽然由流感病毒M2e蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与感染病毒的宿主细胞上的M2e结合，但一些研究表明，接种个体中M2e特异性血清抗体滴度迅速下降。这种弱抗原免疫原性的例子，再加上大多数诱导的抗体是非中和抗体，突出了通用流感疫苗开发过程中的一些挑战。因此，建议通过研究更保守的流感病毒抗原（或某些病毒抗原的保守区域）与使用适当的佐剂和其他增强抗原免疫原性的方法相结合，以及/或研究将通用流感疫苗与其他已知疫苗联合使用，这些方法可能有助于增强产生针对不同流感病毒株的更持久和广泛保护性的HA/NA中和抗体的潜力。 通用流感疫苗的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑病毒的保守抗原、疫苗设计策略、佐剂的选择以及免疫程序的优化等多个方面。随着对流感病毒以及宿主免疫应答机制的深入了解，未来有望开发出能够提供广泛保护的通用流感疫苗。 5.重组流感病毒作为疫苗载体的开发 反向遗传系统可用于实验室中生成重组流感病毒，这是将其作为疫苗载体的基础。流感病毒(IAV)感染可以诱导CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，这些细胞因子进而促使CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞。Th1细胞参与CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫应答，识别并破坏病毒感染细胞，抑制病毒复制和增殖。另一方面，Th2细胞可以激活B细胞，促进中和抗体的产生，从而参与宿主的体液免疫。减毒活流感疫苗(LAIV)在感染早期也能诱导粘膜免疫。 近年来，重组流感病毒已被用作病毒载体。将外源基因以不同的克隆策略插入流感病毒基因组，可能会产生不同的免疫应答。例如，一些研究表明，当外源基因插入流感病毒HA或NA的基因片段时，重组流感病毒载体疫苗能够介导针对外来蛋白的强烈中和抗体应答。相反，将外源基因插入流感病毒内部蛋白（例如NP和M1）或编码核糖核蛋白（例如PB2、PB1和PA）的基因片段，可以诱导针对外来蛋白的CD8+ T细胞应答。 图4、研发针对流感病毒血凝素（HA）茎部的通用流感疫苗的策略：超糖基化HA、无头HA、长α螺旋（LAF）片段、嵌合HA和马赛克HA。该图是用 Biorender.com 创建的。 基于这些发现，Isakova-Sivak等同事构建了两种重组活流感病毒载体腺病毒疫苗(LAIV-AdV)，通过将AdV的T细胞表位插入授权的冷适应H7N9 LAIV病毒的全长NA基因和截短的NS1基因的ORF中。使用这种LAIV-AdV疫苗免疫，可在C57BL/6J小鼠中诱导相对较强的流感病毒特异性抗体和细胞介导的免疫，足以保护接种动物免受致病性H7N9流感病毒和人AdV5感染。此外，Matyushenko等同事构建了两种重组LAIV载体疫苗，通过将编码RSV M2蛋白T细胞表位的基因插入H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)或非结构蛋白(NS1)中。这两种重组LAIV载体疫苗都能同时保护小鼠免受流感病毒和RSV感染，并在接种和挑战动物的肺部及肺组织驻留记忆T细胞(TRM)亚群中激活流感和RSV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。 尽管取得了这些积极的结果，重组流感病毒载体疫苗的安全性和有效性仍需进一步研究和改进。作为减毒活流感病毒，当用作病毒载体时，它仍能复制，因此存在与流通的野生型流感病毒发生基因重组和重配的可能性。此外，当病毒载体疫苗在实验室或接种个体中连续传代时，可能会丢失外源基因。 6.结语 许多病毒载体流感疫苗已被证明是安全和具有免疫原性的，能够激活针对局部粘膜位点或系统性抗原蛋白的体液和细胞免疫应答。这些病毒载体流感疫苗因此可以克服传统流感亚单位疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗的一些固有缺点。到目前为止，已经研究了许多病毒载体流感疫苗，其中一些显示出可接受的有效性水平。这些新型病毒平台和技术为人类、家畜以及伴侣和外来动物的许多疾病提供了快速、高效和成本效益的疫苗生产方式。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需进一步研究。流感疫苗开发中的一个真正挑战是如何应对频繁的抗原漂移和移位，以及这些病毒的快速变异率。解决这一棘手但重要问题的潜在解决方案是通过优化预测下一种主要流感病毒株的方法，以便开发出具有最大保护价值的更好的季节性疫苗，和/或通过开发仍在深入研究和开发阶段的通用流感疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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关注并星标CPHI制药在线 呼吸道病毒是以呼吸道为侵入门户，在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的一类病毒，主要包括正黏病毒科（流感病毒）、副黏病毒科（副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、人偏肺病毒）、冠状病毒科（SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV冠状病毒）、披膜病毒科（风疹病毒）、小RNA病毒科（鼻病毒）等不同病毒科的多种病毒。呼吸道病毒感染是全球范围内人类发病和死亡的主要原因之一，多数急性呼吸道感染是由病毒引起的。天然药物主要通过直接和间接途径发挥抗呼吸道病毒感染类疾病，直接作用是指抑制病毒的吸附和阻止病毒释放，从而保护机体细胞不受损害，间接作用则是通过免疫调节作用起到抗病毒效果。 1、抑制病毒的吸附和阻止病毒释放 血管紧张素转化酶2 (angio‐tensin-converting enzyme 2，ACE2) 是存在于宿主细胞上的一种受体，新型冠状病毒表面的刺突蛋白可以协助病毒找到宿主细胞上的 ACE2 受体并诱导病毒与受体细胞相结合，吸附宿主细胞，在酶的反应下病毒的包膜与宿主细胞融合进而入侵宿主细胞。研究发现青蒿素及其衍生物可以缠绕新冠病毒刺突蛋白的Lys353和Lys31 结合位点，从而影响其与人体ACE2受体蛋白的融合，从而阻止病毒吸附宿主细胞。高分辨质谱和ACE2生物色谱法筛选确定连花清瘟中的大黄酸、连翘苷A、连翘苷I、新绿原酸及其异构体对ACE2具有高度抑制作用。姜黄素、醉茄素A、胡椒碱、芒果苷、蒂 巴 因、小檗碱、穿心莲内酯和印楝素对SARS-CoV-2 的刺突蛋白和ACE2 受体均具有显著的结合亲和力，可以阻断刺突蛋白与ACE2 受体的结合从而抑制病毒吸附宿主细胞。中药丹参水溶性单体成分丹酚酸可通过阻止刺突蛋白六螺旋束结构形成，有效抑制新型冠状病毒的吸附。 血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒包膜上的2种糖蛋白，在流感病毒入侵宿主细胞及传播的过程中扮演着重要的角色。HA可识别并结合宿主细胞表面的唾液酸受体，使病毒粘附于宿主细胞表面、介导病毒包膜与胞内体膜融合；NA能够水解宿主细胞表面的唾液酸释放新病毒。研究发现，槲皮素可通过与流感病毒血凝素蛋白结合，竞争性抑制流感病毒血凝素与宿主细胞的唾液酸结合，抑制病毒包膜与宿主细胞膜融合，抑制病毒以胞吞形式入侵宿主细胞。发酵人参提取物可通过抑制HA、NA活性对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9病毒起到治疗作用。穿心莲内酯磺化物可通过抑制HA活性实现抗H1N1、H3N2、乙型流感病毒（IBV）的作用。大蒜素可以用作H1N1的NA、HA、M2蛋白通道的有效多靶点抑制剂，黄芩苷可通过抑制病毒的血凝素HA2亚基活性而抑制H5N1禽流感病毒的进入。安石榴苷能抑制流感病毒的神经氨酸酶，阻止唾液酸的分解，阻断病毒释放。诃子酸和诃子林鞣酸可以抑制病毒NA蛋白的活性，破坏病毒与宿主细胞上唾液酸的结合，在感染的细胞中阻止病毒释放。 人呼吸道合胞病毒 (human respiratory syncytial virus，HRSV) 含有三种膜结合蛋白：附着蛋白(G)、融合蛋白(F)、病毒孔蛋白 (SH)。蛋白G可与宿主细胞结合，蛋白F可以融合病毒和细胞膜，使病毒核糖核蛋白能够到达细胞质。三种糖蛋白相互作用使病毒入侵宿主细胞。甘草可通过抑制病毒附着、内化减少HRSV感染，18β-甘草次酸是影响甘草抗HRSV 活性的活性成分之一。穿心莲内酯衍生物可有效抑制HRSV包膜表面糖基蛋白荧光肽的裂解，阻止病毒入侵细胞。车前草醇提液可通过与HRSV竞争结合Hep-2细胞表面的特异性受体抑制HRSV的吸附过程，同时可直接杀死病毒，发挥抗RSV作用。  2、抑制病毒的增殖 病毒感染特定的活细胞后，可以在病毒核酸的控制下，利用宿主细胞的能量系统、核糖体等合成病毒核酸和蛋白质，最后组装成结构完整、具有感染力的成熟病毒颗粒。冠状病毒3C 样蛋白酶(3C-like protease，3CLpro) 与木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease，PLpro) 在病毒增殖过程能够将多肽链切割分解成病毒复制需要的片段。通过研究发现，木犀草素、β-谷甾醇、芒柄花黄素、紫檀素、蒙花苷、金丝桃苷等通过与3CLpro特异性结合，阻止3CLpro发挥作用。萝卜硫素 (SFN) 是一种缓慢结合的抑制剂，SFN与3CLpro能够发生共价反应， 形成了SFN-3CLpro复合物，从而阻断3CLpro的作用。杨梅素可以与3CLpro共价结合，阻止3CLpro发挥作用，从而抑制病毒的增殖。冬凌草甲素不仅能够抑制3CLpro 的活性，而且在高浓度下可以阻止PLpro主导的反应活动，从而阻止病毒的增殖。新橙皮苷、蛇床子素等与PLpro结合，阻止PLpro发挥作用，从而抑制病毒增殖。西北甘草异黄酮和甘草异黄酮 A可以与RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase，RdRp) 结合形成复合物，阻止RdRp发挥作用，从而抑制病毒的增殖。 核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB) 信号通路可以调节流感病毒RNA合成，在病毒的复制过程中发挥重要作用。葡萄红素B能够抑制H1N1病毒在MDCK和A549细胞中的复制，并通过IκB激酶 (IκB kinase，IKK) 去磷 酸化抑制NF-κB 转入细胞核，从而降低了病毒诱导的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的生成。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21可以直接与病毒聚合酶酸性蛋白结合，并通过破坏核糖核蛋白复合物的形成来限制IAV聚合酶活性，从而阻止病毒增殖。 免疫调节        病毒感染机体时，巨噬细胞是防御系统的第一道屏障，产生各种抗病毒因子如白细胞介素IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子TNF⁃α等，介导机体发挥抗病毒免疫应答，进而抑制和清除体内病毒细胞。人参多糖治疗H9N2感染的鸡发现，其胚胎成纤维细胞CEF中MHC Ⅱ基因表达及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10水平升高，表明人参多糖可通过增强体液免疫应答促进机体抗病毒活性。儿茶提取物可增强流感病毒感染小鼠的细胞免疫，还能促进特异性中和抗体产生。干扰素是细胞相互交流以预防和根除病毒感染的一种手段，分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。先天性免疫细胞分泌的以IFN⁃α 与IFN⁃β 为主的Ⅰ型干扰素（IFN）介导的天然免疫机制是宿主细胞抵抗冠状病毒最重要的方式之一。研究报道，黄檗水提物通过诱导Ⅰ型干扰素（IFN⁃β）或促炎性细胞因子（IL-6、TNF⁃α）和随后刺激在宿主细胞中的抗病毒状态， 从而抑制病毒复制， 提高小鼠对甲型流感病毒H1N1、H5N2、H7N3、H9N2的感染存活率。IFN⁃γ 属于Ⅲ型干扰素，主要由Ⅰ型辅助性T细胞（Th1细胞）及自然杀伤细胞产生。研究表明，红参水提物可通过抑制HRSV诱导的小鼠树突状和巨噬细胞样细胞中炎性因子TNF⁃α、IL-6、IL-8表达和人肺上皮细培养液中活性氧的形成，降低肺病毒载量，增强干扰素IFN⁃γ分泌以及增加小鼠 HRSV感染后CD8+T细胞和CD11c+树突状细胞的数量等多种机制发挥抗HRSV作用。此外，红参水提取物可诱导甲型流感病毒H5N1感染的小鼠肺组织IFN⁃α、IFN⁃γ 产生，增强免疫从而减轻H5N1流感病毒的感染。 视黄酸诱导基因1样受体（RLRs）信号通路在抗病毒免疫的过程中发挥着重要作用。当16HBE细胞被H1N1 病毒感染后，炎症因子IL-4、IFN⁃γ、RLRs通路相关因子RIG-Ⅰ、IFN⁃β 启动子刺激物⁃1（IPS-1）、IRF-7、IRF-3、NF⁃κB水平均升高，穿心莲内酯干预后上述因子水平均降低，提示穿心莲内酯可通过降低其信号因子来影响RLRs信号通路。研究发现，连翘酯苷A可通过降低小鼠肺部免疫细胞的RLRs信号通路相关蛋白RIG-Ⅰ、MAVS、NF?κBp65表达，降低Th 1/Th 2和Th 17/Treg比例，从而减轻甲型流感病毒FM1株在小鼠肺部引起的炎症反应。 Toll样受体（TLRs）信号通路也是和呼吸道病毒相关的天然免疫主要信号通路之一， TLRs可以激活 NF⁃κB等转录因子，促进多种与免疫有关的细胞因子及趋化因子的分泌从而引起炎症反应。玉叶金花水提物能抑制感染流感病毒A/FM1/47（H1N1）小鼠血清TNF⁃α、IL⁃6、 IL-1β过表达及肺组织中TLR7、MyD88、NF⁃Κb mRNA及蛋白表达，提示玉叶金花可通过降低TLR7介导的MyD88依赖的信号转导通路活化抑制 NF⁃κB活性，从而减轻炎症风暴， 发挥抗流感病毒作用。研究发现，栀子苷通过影响TLR3/TRIF信号通路，降低炎性细胞因子IL-6、TNF⁃α 表达，促进抗病毒因子IFN⁃β 合成，保护A/FM/1/4（H1N1）建立的流感病毒性肺炎小鼠引起的病毒性肺损伤。黄芩苷可通过抑制TLR4/NF⁃κB信号转导途径，降低下游细胞因子IL-6 水平来发挥抑制 HRSV 感染的作用。 参考文献：       [1]王剑,张萍萍,于健,等.天然药物抗呼吸道病毒活性成分及其作用机制研究进展[J].药学学报,2024,59(04):853-865. [2]杜正彩,郝二伟,韦棪婷,等.中国-东盟传统药用植物抗呼吸道常见病毒研究进展[J].中成药,2022,44(11):3579-3587. 作者简介： 小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。 END 【智药研习社直播预告】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~