CD43

摘要：在过去的22年中，针对越来越多的肺炎链球菌类型（7价、10价、13价、15价、20价）的多价疫苗已经获得许可。尽管非疫苗血清型的出现，使用多糖-蛋白结合疫苗在减少侵袭性肺炎球菌病的发病率方面发挥了关键作用。尽管取得了成功，但仍需要对肺炎球菌疫苗进行持续改进。例如，尽管某些血清型已被纳入肺炎球菌结合疫苗，但仍存在一些挑战。特别是，肺炎链球菌3型在几个国家仍然是侵袭性肺炎球菌病的主要原因。本文报告了对已许可的肺炎球菌结合疫苗和其他目前处于临床开发阶段的疫苗候选物的优势和劣势的深入修订。 引言 肺炎链球菌（Spn）是一种重要的人类病原体，被广泛认为是社区获得性肺炎（CAP）、中耳炎、败血症和脑膜炎（统称为侵袭性肺炎球菌病[IPD]）的病原体。Spn 仍然是全球重要的疾病和死亡原因，5岁以下儿童中有5%的死亡是由肺炎球菌感染引起的。肺炎球菌是呼吸道的常见寄居者，可在5-90%的健康人（20-60%的学龄儿童和5-10%的成人）的鼻咽部定植。 Spn 产生多种参与疾病过程的毒力因子。其中，多糖荚膜是最重要的毒力因子，需要侵入宿主并引起疾病。荚膜对于肺炎球菌的生存至关重要，它通过保护细菌免受补体的攻击和随后的吞噬细胞杀死，从而保护细菌。Spn 合成了100多种荚膜多糖（CPSs），根据构成每种血清型的独特的糖苷成分和连接进行分类。其中，有23种血清型负责全球80-90%的侵袭性肺炎球菌感染。 过去几年中，已经开发出针对多种Spn血清型的肺炎球菌多糖疫苗（PPVs）和肺炎球菌结合疫苗（PCVs），并广泛用于预防肺炎球菌病。自20世纪70年代以来，已经开发出几种PPVs，包含6至23种血清型的荚膜多糖。目前，许多国家只许可使用23价PPV，推荐给65岁及以上的个体以及2至64岁有合并症的个体，如慢性心血管疾病和糖尿病。PPV23对免疫正常成人的IPD有效性通常在56-81%之间，但在免疫受损个体中较低。疫苗能够减轻CAP的严重程度，但不能预防它，并且不减少非侵袭性肺炎的发病率。此外，PPV23对2岁以下儿童无效，不产生免疫记忆，也不减少携带。为了提高疫苗在儿童中的有效性，开发了PCVs，其中荚膜多糖与载体蛋白结合，克服了PPVs的大多数限制。 截至目前，市场上已有PCV10、PCV13、PCV15和PCV20（表1）。 表1 针对多种Spn血清型的许可肺炎球菌多糖疫苗（PPVs）和肺炎球菌结合疫苗（PCVs） 根据世界卫生组织（WHO）的报告，Spn是抗菌药物耐药性（AMR）的四个优先病原体之一，已有许可的疫苗存在，建议增加许可疫苗的覆盖范围，以符合WHO的免疫目标，以最大限度地影响AMR。 许可的结合疫苗：向更高价发展 为了提高儿童疫苗的有效性，已经许可了几种PCV（表1）。2000年和2001年，美国和欧盟分别开发并许可了一种7价肺炎球菌结合疫苗（Prevnar，辉瑞）。PCV7包含来自美国最常见的七种IPD血清型的CPS，并与白喉毒素的遗传解毒突变体CRM197结合（表1）。PCV7的使用导致儿童中IPD病例迅速减少，成人中肺炎球菌感染急剧下降。在美国，2004年即疫苗引入后，1岁以下儿童的IPD发病率降低了77%，1岁儿童降低了83%，2岁儿童降低了73%。在美国人群中也发现了非侵袭性肺炎球菌感染的减少，如急性中耳炎（-20%）。由于PCV7施加的选择压力，疫苗中未包含的其他血清型变得有问题，如19A型。这一过程，称为血清型替代，推动了PCV10（Synflorix，GSK）和PCV13（Prevnar 13，辉瑞）的开发，自2009年以来已有供应。这些疫苗包含PCV7中的7种肺炎球菌荚膜多糖血清型，另外还有3种或6种额外的血清型（表1），根据全球肺炎球菌病的流行病学发展选择。另一种10价PCV疫苗（Pneumosil，印度血清研究所），与PCV10和PCV13有重叠的血清型，于2019年被WHO预认证。总的来说，PCV10和PCV13减少了疫苗类型的鼻咽部定植，并在人群中导致了群体免疫。尽管PCV10和PCV13中血清型的主要选择标准是基于疾病负担，但也包括了与抗生素耐药性相关的血清型，几项研究表明，当前的PCV在减少耐药感染的流行率方面非常有效。在美国首次使用PCV五年后，2岁以下儿童中由多重耐药（MDR）菌株引起的IPD减少了84%，65岁以上成人中由青霉素耐药IPD减少了49%。在南非，PCV的使用使儿童中青霉素耐药肺炎球菌病的发病率减少了82%，由青霉素敏感菌株引起的疾病减少了47%。为了进一步提高覆盖范围，FDA最近批准了默克和辉瑞的PCV15和PCV20，它们包含15种或20种不同的血清型，已显示出在减少非侵袭性疾病（如急性中耳炎、非菌血症性肺炎和鼻窦炎）方面的影响。然而，除非在覆盖范围上达到一个临界点，以防止血清型替代，否则这些疫苗的有效性将逐渐减弱。即使这在技术上是可行的，疫苗的制造成本将使开发在发展中国家尤其具有挑战性。一个合理的解决方案是，根据最相关的循环IPD血清型不断变化的配方。计算机模拟表明，根据最新的流行病学数据调整疫苗组成有望减少IPD负担，然而疫苗不能完全根除人群中的肺炎球菌定植。所有许可的结合物都使用CRM197作为载体蛋白，除了Synflorix使用蛋白D用于1、5、6B、7F、9V、14、23F血清型，4、TT用于18C血清型，DT用于19F血清型。最近，使用TT作为载体蛋白的PCV13已由Walvax许可（产品列表walvax.com）。不一致的疫苗效力 结合疫苗成功地保护了免受感染，但并非所有肺炎球菌血清型都具有相同的效力。对于某些血清型，通过吞噬细胞杀菌（OPK）检测的许可疫苗诱导的功能抗CPS抗体水平并不理想。其中包括1、3和5型，我们将在以下段落中进一步评论。 1型 通常认为，带负电荷和中性的多糖是2型T细胞非依赖性抗原（TI-2，或胸腺非依赖性2型抗原）。这包括大多数肺炎球菌CPS。TI-2多糖无法招募CD4+T细胞帮助，因为它们不与主要组织相容性复合体II类（MHC-II）分子相互作用。然而，某些类型的糖苷，特别是具有双重或两性离子电荷基团的糖苷，确实可以通过传统的MHCII途径激活T细胞。1型肺炎链球菌多糖胶囊（Spn-1）（图1）是这些分子中最研究的之一。已经表明，即使没有与载体蛋白结合，Spn-1也可以通过使用MHC-II途径的抗原呈递细胞处理和呈递，这导致Spn-1诱导的T细胞增殖。然而，在一项更近的研究中，表明Spn-1多糖不会在人类中诱导记忆B细胞的形成，与其他多糖类似。从参加随机临床试验以研究使用23价肺炎球菌普通多糖疫苗免疫后记忆B细胞反应的成人中获得的外周血单个核细胞。这种含有1型疫苗的使用导致与基线相比，1型抗原特异性预先存在的记忆B细胞的耗尽。这一发现表明，这种两性离子多糖不是通过MHC-II途径内的经典T依赖性机制处理的。 此外，Bjarnarson等人表明，无论是两性离子（Spn-1）还是非两性离子（Spn-19F）多糖，在新生小鼠模型中加强免疫后都会引起低反应性。与即使没有结合也能预期的免疫活性相反，含有Spn-1的市售结合疫苗对这种血清型诱导的功能抗CPS抗体水平低，这是撒哈拉以南非洲脑膜炎的主要原因。这可能是由于在化学活化和与载体蛋白结合过程中保护性表位的掩盖。Spn-1 CPS含有不寻常的单糖，2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三去氧-d-半乳糖（D-AAT），含有游离胺（图1）。由于市售结合疫苗的制造使用还原胺化（Prevenar）或1-氰基-4-二甲氨基吡啶活化化学（Synflorix, Pneumosil），这些化学反应与游离胺反应，D-AAT部分的某些化学衍生化可能导致疫苗效力降低。此外，在制造过程中多糖被解聚，例如通过钠周期酸介导的二醇氧化，这也可能导致效力的额外降低。 图1 肺炎链球菌1型荚膜多糖重复单元的示意表示 →4)-α-D-GalpA2/3Ac-(1→3)-α-D-GalpA-(1→3)-D-AAT-α-Galp-(1→ 5型 肺炎链球菌5型（Spn-5）被报道为全球儿童侵袭性肺炎球菌病第五大常见血清型。此外，在加拿大温哥华，识别出与这种血清型（多位点序列类型或MLST 289）相关的IPD大簇，导致2005年至2009年在加拿大西部蔓延的大规模肺炎球菌病爆发。市售结合疫苗在预防Spn-5感染方面并不完全有效，这种行为的原因再次在于结合后的一些稳定性问题。Spn-5在与载体蛋白的化学结合过程中的不稳定性的根本原因可以通过观察多糖的重复单元（图2）轻松识别。5型重复单元由5种不同的残基组成，其中3种构成多糖的主链，其余2种是连接到中心N-乙酰-L-岩藻糖的分支的一部分。除了D-葡萄糖（主链的一部分）和D-葡萄糖醛酸（分支的一部分），还有两种罕见的去氧氨基残基完成结构：N-乙酰-L-肺炎球菌胺（L-PneuNAc）和2-乙酰氨基-2,6-二去氧-D-木糖己糖-4-酸（Sugp）。特别是，这种后一种酮胺糖的不稳定性，是主链的一部分，是结合疫苗制造问题的主要原因。事实上，在允许多糖与载体蛋白结合的还原胺化反应中，这种糖的酮基部分或全部被还原。使用还原胺化的常规条件，绝大多数Sug残基转变为三种可能的化合物：N-乙酰-D-奎诺糖胺（QuiNAc，酮官能团还原为醇官能团），N-乙酰-D-岩藻糖胺（FucNAc，N-乙酰-D-奎诺糖胺的异构体）和第三种由Sug残基更显著转化产生的副产品。发现Sug化合物向这种第三种副产品的转化对多糖的免疫原性有害，即使这种转化只是部分的，而QuiNAc或FucNAc转化没有显著影响。已经尝试通过修改结合条件来克服这个问题。一种可能的修改是将还原胺化反应的pH从8变为更酸性的pH（4至6.5之间），与常规方法相比，Sug残基的修饰程度至少降低了65%，其中大部分转化为QuiNAc，因此对结合免疫原性的影响较小。另一种可能性是将Sug完全转化为QuiNAc或FucNAc，使用强还原剂如NaBH4还原酮基团。然而，有必要将还原的多糖片段化，以重新引入末端醛基团，同时防止随后的还原胺化进行任何修饰。Seeberger和同事合成了一系列类似于Spn-5重复单元的寡糖。特别是，一个包含次级醇代替Sug残基的不稳定酮的片段，比多价Prevnar13疫苗诱导了更高的抗体滴度，具有显著更高的吞噬细胞杀菌特性和强大的免疫记忆。他们还用兔和人的参考血清证明，分支，特别是PneuNAc残基，主要参与抗体识别和亲和力，证实替换非必需的、不稳定的Sug的酮基团不影响免疫原性，从而成为一个有希望的更稳定的疫苗候选物。 图2 肺炎链球菌5型荚膜多糖重复单元的示意表示。 类型3 血清型3是一个特别的问题，值得讨论。尽管非疫苗血清型的出现，肺炎球菌结合疫苗(PCVs)在减少侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的发病率方面发挥了关键作用。然而，尽管血清型3被包含在13价肺炎球菌结合疫苗中，由Spn-3分离株引起的疾病发病率并未下降，且对该血清型的疫苗有效性报告为非显著性，导致它在一些疫苗效力研究中被记录为非疫苗类型。Spn-3产生大量的荚膜。与其他大多数血清型不同，Spn-3的荚膜不是共价连接到细菌表面，导致不断释放多糖。这可能导致远离细菌表面的荚膜结合抗体的杀菌能力降低。此外，与其他与IPD相关的血清型相比，Spn-3的病例携带者比例高，儿童已被证明携带高水平的血清型3抗体，这被认为是由于自然暴露率高，但携带持续时间较短，支持了这种血清型具有高度侵袭性的建议。此外，这种多糖的化学成分（图3）为其提供了一些特定特征，例如在琼脂平板上生长时呈现“湿润”或粘液状外观，这可能意味着其对体内调理素杀伤具有特殊的抗性。Choi等人评估了PCV13的血清型特异性保护效果。研究表明，0.2微升血清型3细菌培养上清液就足以压倒被动免疫小鼠中疫苗诱导抗体的保护效果。据估计，需要产生八倍的抗体才能诱导对血清型3侵袭性疾病的保护。值得注意的是，由Spn-3引起的疾病特别严重，包括肺炎并发症和不良心脏事件。 图3 肺炎链球菌血清型3荚膜多糖重复单元的示意图 →3)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→ 缺乏交叉保护 鉴于肺炎球菌CPSs的数量众多，理解它们的交叉保护是定义肺炎球菌疫苗配方最佳策略和评估疫苗效力的重要元素。事实上，在各种CPSs中，有些血清型的结构足够相似，可以进行抗体交叉保护，如血清型6、19、10（图4）。在血清型6A、6B、6C和6D中，它们在结构上略有不同。Spn-6A和Spn-6B是临床意义最大的。Spn-6B和Spn-6A多糖（图4）是线性共聚物，它们在单一结合位点上有所不同，并且已经表明血清型6B可以诱导与血清型6A交叉反应的抗体。两种血清型6B和6A都是感染的常见原因，但由于血清型6B的早期水解稳定性优于6A，早期商业肺炎球菌疫苗只包含血清型6B作为6群的唯一代表。然而，研究表明，尽管含有血清型6B的疫苗可以诱导与6A型交叉反应的抗体，但并非所有抗6B抗体都具有功能性交叉反应。 图4 肺炎链球菌血清型共享相似结构的示意图，预期应具有交叉保护：(A) Spn-6A 和 Spn-6B；(B) Spn-19A 和 Spn-19F；(C) Spn-10A, Spn-10B, Spn-10C 和 Spn-10F。 在过去的十年中，合成方法被用来生产几种Spn血清型共有的糖结构。与关键孔帽章鱼血蓝蛋白（KLH）蛋白结合的Spn-6B的合成糖片段，在小鼠和兔子中诱导了能够与血清型6B和6A交叉反应的抗体，并刺激了肺炎球菌血清型6A和6B的微生物细胞的吞噬作用。Spn-19A和Spn-19F多糖是另一个由非常相似的重复单元组成的血清型的例子，两者仅在糖苷键的位置上有所不同（图4）。然而，接种只含有血清型19F的肺炎球菌疫苗后，由血清型19A引起的感染数量增加，似乎表明这两种血清型之间没有抗体交叉保护，可能是由于两种多糖链之间的构象差异。几年前，合成了一个包含Spn-19A和Spn-19F重复单元的嵌合抗原，并与CRM197结合。在兔子中测试的结合物能够诱导高抗体滴度，能够识别原生血清型19A和19F。此外，抗体能够杀死两种肺炎球菌菌株。其他研究人员合成了含有不同组合的常见二糖ManNAc-β-(1→4)-Glc的化合物库，存在于Spn-19F和19A的重复单元中，通过微阵列格式表明，上游端磷酸化的二糖被免疫兔子的参考血清中的抗体强烈识别，无论是针对Spn-19F还是19A。血清型10包括五种变体：10A、10B、10C、10F和最近识别的10D。其中，Spn-10A已被包含在最新一代的PCVs中（表1），是最常见的。Spn-10A、Spn-10B、Spn-10C和Spn-10F由一个重复单元组成，其骨架由半乳糖呋喃糖、半乳糖吡喃糖、N-乙酰半乳糖胺和核糖醇磷酸组成，主要在核糖醇磷酸的糖苷键位置和侧链替代上有所不同（图4）。新的血清型10D则与其它血清型相比具有明显不同的骨架。血清型Spn-10A、Spn-10B、Spn-10C和Spn-10F之间的交叉反应性复杂，结构原因尚不清楚，针对一种血清型产生的血清型特异性兔子抗血清能够识别其他血清型，尽管亲和力较低。Ravenscroft和Kuttel最近发表了一项分子建模研究，与相关的血清学研究一起支持将血清型10A包含在疫苗中，以最好地保护免受10型疾病的侵害。 肺炎球菌结合疫苗对中耳炎的影响 不幸的是，基于荚膜的疫苗在对抗侵袭性疾病方面的成功被其在粘膜部位（如肺炎和中耳炎）的弱效性所抵消。像许多其他成功的细菌病原体一样，肺炎球菌会经历相位变异，在此过程中，表面成分（如荚膜）会从高水平随机变化到低水平表达。特定相位变体在不同解剖部位的频率是宿主环境中解剖部位特异性选择压力的结果。粘膜表面的细菌已被证明比血液分离的对应物的包膜化程度要低，从而暴露出表面粘附素，使针对荚膜的抗体在促进粘膜水平的调理吞噬作用上处于不利地位。除了这种对利基的遗传适应外，新近认识到的荚膜脱落现象也降低了抗荚膜抗体的效力。当进入肺部时，肺炎球菌会遭遇抗菌肽，作为一种防御，细菌在数小时内脱落大部分荚膜，这可能使基于荚膜的疫苗在这些情况下的效力降低。在急性中耳炎（AOM）感染中也观察到一些血清型特异性。AOM是儿童呼吸道感染的重要疾病，也是医生就诊和抗生素处方的主要原因。血清型19A ST320似乎是肺炎球菌乳突炎的主要病因，这是一种AOM的化脓性并发症，即使用高剂量的β-内酰胺类抗生素治疗，这种血清型也会引起持续症状。在台湾，Spn-19A ST320克隆在低PCV7疫苗接种率下非常普遍。大约50%的5岁以下儿童的IPD病例是由Spn-19A ST320引起的。在2009年至2012年间对0-18岁AOM患者进行的一项回顾性研究中，通过取样中耳液，观察到436例中有108例（24.8%）是肺炎球菌AOM。血清型19A ST320（50例，58.8%）是与AOM最频繁相关的血清型。在西班牙进行的另一项研究中，在2010年引入PCV13之前和之后分析了肺炎球菌OM的流行病学。在2008年至2016年间，收集了2653名14岁以下OM儿童的中耳渗出物，其中235例（8.9%）分离出肺炎球菌。204个可用的分离株在三个3年期间进行了血清分型：一个在PCV13引入之前，两个在引入之后。研究表明，PCV13的引入确实改变了肺炎球菌OM的流行病学，疫苗血清型的比率下降，非疫苗血清型的多样性增加，以及每个地区不同单一克隆的克隆扩散。观察到的例外情况如血清型3的持续存在和血清型19F的微弱再现。在美国进行的一项更大规模的纵向观察研究中，涉及在私人儿科诊所就诊的健康儿童，对接受了完整基础系列PCV13疫苗接种的30个月以下儿童进行了随访，直到30-36个月大，通过收集中耳液（MEF）来识别AOM发作。评估了PCV7和PCV13共有的AOM MEF血清型（4、6B、9V、14、18C、19F和23F）以及PCV13特有的六个额外血清型（1、3、5、6A、7F和19A）。对照组来自2007年至2009年进行的另一项纵向研究，新生儿接种了PCV7，AOM发作时前瞻性收集MEF，并随访至30个月大。研究表明PCV13在减少与肺炎球菌相关的AOM方面是有效的，特别是由PCV7中额外的六个血清型引起的发作。在AOM期间获得的MEF样本中，PCV13中六个额外血清型的相对减少了86%，血清型19A的相对减少了91%。在接种PCV13的儿童的MEF样本中未鉴定出血清型6A分离株。尽管两个队列中这种血清型的发病率都很低，但未发现由荚膜血清型3引起的AOM儿童数量有所减少。在PCV13中的三个额外血清型，即1、5和7F，两个队列中均未检测到。值得注意的是，尽管它存在于PCV7和PCV13中，但血清型19F的疾病发病率相当可观，尽管比PCV7引入前低得多。基于对OM处方分析的额外论文巩固了这一发现，即尽管在引入PCV7和PCV13后观察到了减少，但所有年龄段儿童的AOM疾病负担仍然很高。总体而言，这些研究支持PCV疫苗接种对OM的部分影响，并强调了根据AOM病因和循环肺炎球菌血清型的效力变化性。 制作结合疫苗的新技术 尽管肺炎球菌结合疫苗(PCVs)广泛使用并随之减少了疾病，但研究仍在积极进行，正在探索创新技术以合成更高价的多糖基疫苗，这些疫苗具有更高的效力、覆盖面，并降低成本。事实上，开发包含额外血清型的PCVs仍然是公共卫生的优先事项，因为血清型替代和向非疫苗含有血清型的转变。将额外的血清型纳入现有的PCVs导致对个别血清型的免疫反应减少，很可能是由于载体抑制。一种24价PCV（VAX-24, Vaxcyte）基于无细胞蛋白合成（CFPS）平台正在健康成人中进行1/2期试验（NCT05266456）。这种结合方法提出了使用含有多个非天然氨基酸（nnAAs）的eCRM载体蛋白，这些氨基酸位于主要T细胞表位区域之外，通过点击化学实现肺炎球菌CPSs的位点特异性共价结合。这导致了一个更一致的结合过程，并增加了多糖：蛋白比例，使得包含更多血清型的同时最小化载体介导的免疫学干扰。在兔子研究中，VAX-24显示出与Prevnar13相当的IgG反应和OPA滴度，并且高于PPV23。已经生产并证明了血清型1、2、3、5和8的完全或半合成寡糖与PCV13在小鼠和兔子模型中相当或更优。合成寡糖可以设计成携带用于位点选择性蛋白结合的连接物，同时保持保护表位完整。化学合成的结合物可以独立使用或作为当前PCV13配方的补充。此外，还开发了蛋白质荚膜基疫苗（PCMVs），避免了在碳水化合物表位中引入不需要的修饰：PCMVs是通过混合CPS、载体蛋白和化学交联剂形成的聚集体，其中未修饰的CPS与蛋白质一起被捕获。PCMVs的免疫原性取决于颗粒大小，表明较大的颗粒可能更可被抗原呈递细胞优先摄取。外膜囊泡（OMV）也被提出用于展示Spn-14糖苷。OMV结合了免疫刺激的最佳大小与多种抗原展示和自我佐剂特性。细菌被设计在OMV上展示糖链，产生了所谓的glyOMV，简化了不包括任何结合步骤的制造过程。在小鼠中，Spn-14 glyOMV诱导的IgG和调理吞噬活性与PCV13诱导的相当。PCVs无法保护非疫苗血清型和未包膜细菌，其他限制包括由于复杂配方导致的高成本、某些血清型的低免疫反应和需要多次剂量，这使得它们不太可能在需求最高的发展中国家广泛使用。因此，一种提供广泛血清型覆盖、诱导粘膜和系统免疫并阻碍初级鼻内定植以及侵袭性疾病的肺炎球菌疫苗是非常理想的。跨肺炎球菌血清型保守的蛋白质抗原可能提供一种替代血清型限制疫苗策略的方法。关于对定植的影响，蛋白质可能发挥基础作用。大多数已研究的肺炎球菌分离株表现出基于其不透明或透明菌落的两种形态之间的相位变异。在定植的初始阶段，表达较薄荚膜和其他促进与宿主组织结合的特性的透明变体优于不透明变体。事实上，一旦到达上皮表面，厚荚膜的表达似乎对肺炎球菌不利，因为它对粘附有抑制作用。此外，尽管抗荚膜抗体未能保护已经建立的鼻咽炎定植，但对肺炎球菌粘附素的抗体可以部分阻断定植的启动并减少鼻咽部的肺炎球菌负担。同样，已经发现，尽管自然获得的对IPD的免疫被认为依赖于抗荚膜抗体，但Spn的鼻咽部定植也诱导了对可能具有保护作用的蛋白质抗原的抗体。不幸的是，尽管许多这些蛋白质的临床前评估显示了被动转移免疫血清在预防小鼠的败血症和致命性肺炎中的效力，通常针对多种肺炎球菌血清型，但肺炎球菌蛋白疫苗在人类中尚未显示出很大的效力。然而，蛋白质可以被认为是PCVs的附加值，以克服它们的一些限制。一种名为多重抗原呈递系统（MAPS）的新技术开发平台从Affinivax公司已经被用于开发一种结合了24种肺炎球菌CPS和两种保守肺炎球菌蛋白融合的疫苗，具有载体和抗原的双重作用。该平台利用生物素和根瘤菌素之间的高亲和力、非共价结合，并将肺炎球菌蛋白的潜力与CPSs所引起的保护结合起来。使用生物素-根瘤菌素系统，蛋白质表位保持完整，也增加了抗蛋白质T细胞反应。最近，1期试验的结果在2期试验中得到了确认，其中疫苗候选物显示出与Prevnar13共享的13种血清型的IgG和OPA免疫反应相似或更好。 这项技术还表明，CPS与载体蛋白之间的直接共价连接不是启动T依赖性反应所必需的，而是需要两个组分的共呈递。只要CPS与蛋白质之间的相互作用能在内质网环境中存活，由此产生的抗原应该能够招募T细胞帮助。与蛋白质载体非共价结合的CPS，无论是附着在细菌大小的乳胶珠上，都显示出与PCVs相似的行为。这方面的一个优势是使用肺炎球菌表面蛋白A（PspA）作为载体。为了克服在单一疫苗中包含许多CPS类型的困难和成本，也探索了全细胞疫苗作为替代品。由于安全原因和免疫接种后产生的复杂免疫反应，这类疫苗的开发并不那么直接。这些替代品要用于人类还需要一段时间。 分析挑战，因为许多结合物以多价形式组合 新疫苗中包含的多糖血清型数量不断增加，最近在Affinivax 和Vaxcyte 的1/2期测试中达到24种，这对疫苗制造商在疫苗配方以及产品释放的分析测试方面都构成了巨大挑战。对于单价工艺中间体（即，纯化的普通多糖，多糖-蛋白结合物-药物物质）和多价疫苗配方的测试，通常用Alum佐剂（药物产品），已经开发了一系列方法。在表2、3和4中，报告了用于纯化普通多糖、药物物质和药物产品的分析方法的示例列表。迄今为止使用的一些测试可能会被先进技术所取代，以增强分析控制并简化分析小组。例如，NMR也可用于纯化多糖中间体中的多糖和酒精含量测定。虽然现有的检测方法在单价工艺中间体（即，纯化的多糖，药物物质）的水平上似乎是可行的，即使需要新的试剂（抗体）进行免疫测试，但对于多价药物产品的产特性，抗原数量的增加显著增加了检测的复杂性，如干扰、交叉反应等。还需要多重方法来减少每个单独检测的时间和成本。 许可策略 通过比较每个血清型与之前许可的疫苗的免疫原性，评估了基于结合物的疫苗对不同年龄人群中IPD的有效性。例如，PCV20对IPD和肺炎的有效性是从与美国许可的肺炎球菌疫苗（PCV13和PPV23）的比较免疫原性推断出来的。通过OPA检测测量了PCV20和对照肺炎球菌疫苗所诱导的免疫反应。OPA检测用于测量对Spn的功能性抗体。在60岁及以上的成人中，PCV20诱导的所有13种匹配血清型的免疫反应在接种疫苗一个月后不逊于PVC13诱导的血清型。令人惊讶的是，在接种疫苗一个月后，PCV20诱导的7种额外血清型中的6种的免疫反应不逊于PPSV23诱导的相同血清型的免疫反应。血清型8的反应在统计上没有达到非劣性标准，差距很小。考虑到PCV20和PCV13在制造和配方方面的相似性，PCV13在预防疫苗型肺炎球菌IPD和CAP方面的有效性支持了PCV20可能的有效性，特别是对13种常见血清型。尽管如此，计划在65岁及以上的成人中进行一项研究，以确认PCV20预防由7种新血清型引起的肺炎的临床效益。 结论 尽管有100多种Spn血清型，但大多数致病株都被目前可用的PCVs所覆盖。然而，由于疫苗接种导致的血清型替代和主要血清型的区域差异，需要扩大现有疫苗以包含额外的血清型。研究仍然非常活跃，旨在降低制造成本，增加血清型覆盖范围，避免与增加价数相关的免疫干扰和载体表位抑制可能引起的问题。此外，针对Spn的疫苗的高成本是使用的一个重大障碍。结合疫苗领域的进展可以帮助简化疫苗制造和分析，尽管所需疫苗的组成复杂，通过在疫苗配方中增加保守的蛋白质抗原来增加保护，并克服与特定Spn结构和化学（例如，Spn-1和Spn-5）相关的一些限制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

据不完全统计，2024年上半年FDA拒批了16款新药，涉及ADC药物、细胞疗法、基因疗法、抗体和组合疗法。小编汇总如下： 六月： Rocket:KRESLADI 2024年6月28日，Rocket Pharmaceuticals宣布美国食品和药物管理局（FDA）针对其公司在研基因疗法KRESLADI™ （marnegragene autotemcel; marne-cel）的生物制剂许可申请发出了一份完整答复函 (CRL)，其中FDA要求提供有限的额外化学制造和控制 (CMC) 信息以完成审查。此前，该机构以需要更多时间审查生产过程为由，将其决定推迟了三个月。 Kresladi（曾用名RP-L201）是一款用以治疗严重白细胞粘附缺陷-I（LAD-I）的在研基因疗法，该疗法通过慢病毒对患者的自体造血干细胞进行基因工程化改造，以递送ITGB2基因的功能性拷贝。该基因编码β-2整合素成分CD18，这是一种促进白细胞粘附并使其从血管中渗出以抵抗感染的关键蛋白质。 默沙东/第一三共:HER3-DXd 6月26日，FDA 已对第一三共和默沙东提交的加速批准Patritumab Deruxtecan（HER3-DXd）生物制品许可申请（BLA）发出完全回复信（CRL），该药物用于治疗先前接受过两种或两种以上系统疗法的成人局部晚期或转移性EGFR突变非小细胞肺癌（NSCLC）患者。该完全回复信是由于对第三方制造设施的检查发现的问题。信函中未发现提交的疗效或安全性数据存在任何问题，这也意味HER3-DXd仍有望成为首款获批上市的HER3 ADC。 Patritumab Deruxtecan是一种专门设计的潜在首创的HER3靶向DXd抗体药物偶联物（ADC），目前正由第一三共和默沙东联合开发。去年10月，默沙东与第一三共达成合作协议，以220亿美元的总交易额获得该产品以及另外两款ADC在日本以外的全球开发和商业化权益。 艾伯维:ABBV-951 6月25日，艾伯维（AbbVie）公司表示已收到美国FDA关于帕金森病候选药物ABBV-951新药申请的完整回应函。这是FDA自去年以来针对该药物发布的第二封完整回应函，这次是因为第三方供应商出现的问题。 对该工厂的检查不涉及ABBV-951或任何艾伯维药品。CRL没有发现任何与ABBV-951的安全性、有效性或标签（包括设备）有关的问题。CRL没有要求艾伯维进行更多与药物或设备相关的疗效和安全性试验。 ABBV-951复方中的两种成分foslevodopa / foscarbidopa分别是左旋多巴和卡比多巴的前药，具有较高水溶性，可以通过一个连接到皮下的泵实现持续24小时皮下输注给药，从而使体内的左旋多巴和卡比多巴浓度在24h内保持稳定，改善晚期帕金森病患者的药效波动。 五月： 江苏恒瑞/HLB:“双艾”疗法 5月17日，Elevar Therapeutics子公司HLB及其在中国的合作伙伴江苏恒瑞医药宣布收到FDA对于注射用卡瑞利珠单抗联合甲磺酸阿帕替尼片用于不可切除或转移性肝细胞癌患者的一线治疗的BLA申请的完整回复信（CRL），在CRL中FDA表示会对恒瑞提交的生产现场检查缺陷完整回复进行全面评估，以及由于部分国家的旅行限制，无法在审查周期内完成必需的生物学研究监测计划(BIMO)临床检查，因此该产品的BLA申请将被拒绝。对此，恒瑞表示将尽快重新提交申请。 卡瑞利珠单抗（camrelizumab）是恒瑞医药研发的人源化抗PD-1单克隆抗体，于2019年5月在中国获批上市，此前已在肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌以及淋巴瘤五大瘤种中获批了9个适应症。阿帕替尼（rivoceranib）是恒瑞医药开发的一款针对血管内皮生长因子受体（VEGFR）的小分子酪氨酸激酶抑制剂，于2014年10月在中国获批上市，目前有3个适应症获批，分别为单药用于晚期胃腺癌或胃食管结合部腺癌、既往接受过至少一线系统性治疗后失败或不可耐受的晚期肝细胞癌、联合卡瑞利珠单抗用于不可切除或转移性肝细胞癌。 Dynavax：Heplisav-B 5月14日，Dynavax Technologies 宣布FDA拒绝了其重组蛋白乙型肝炎疫苗用于在血液透析中患者的补充生物制品许可证申请。 这家加州生物制药公司表示，它收到了监管机构关于其sBLA的完整回复函（CRL），其中包括来自119名接受血液透析的成人的四剂量Heplisav-B方案的I期HBV-24研究的临床免疫原性和安全性数据。根据CRL，“申请没有提供足够的数据来支持对有效性或安全性的全面评估。” FDA 认为该申请没有提供足够的数据来支持有效性或安全性的全面评估。CRL表示，HBV-24的数据不足，因为第三方临床试验现场运营商销毁了大约一半参加试验的受试者的数据源文件。该公司还透露，FDA发现单臂研究中的受试者总数“不足以评估四剂方案的安全性”。 Dynavax在其新闻稿中表示，FDA拒绝其sBLA不会影响欧盟委员会于2023年10月批准血液透析患者四剂量方案的决定，或Heplisav-B在美国、欧盟和英国被批准用于预防所有已知乙型肝炎病毒亚型引起的成人感染的适应症。 四月： Abeona：pz-cel 4月22日，Abeona Therapeutics宣布FDA针对其细胞疗法 prademagene zamikeracel (pz-cel，EB-101)的完整回复信 (CRL)，FDA拒绝了该疗法上市，并要求其提供治疗的有效信息，以及满足额外的CMC 要求才能批准申请。受此消息影响，Abeona股价大跌53%。 Pz-cel是一种体外基因校正的自体细胞疗法，用于治疗RDEB患者。该疗法由表皮片组成，旨在将功能性COL7A1基因传递到患者自身的皮肤细胞中，以实现正常的VII型胶原蛋白表达，并促进伤口愈合。 试验表明，pz-cel可以帮助治愈伤口，并减轻RDEB患者的疼痛。然而，FDA对其位于俄亥俄州克利夫兰的制造工厂进行检查，因pz-cel制造相关的问题，FDA驳回了pz-cel的上市申请，但没有要求提供额外的试验或数据来支持后续申请。pz-cel原定PDUFA 日期是2024年5月25日，现在将有所推迟。 Supernus：SPN-830 4月8日，FDA宣布Supernus Pharmaceuticals治疗帕金森病的药物SPN-830第二次被拒，原因是质量和设备问题。SPN-830是一种阿朴吗啡注射剂，用于持续治疗帕金森病（PD）的运动波动（间歇性发作）。受此影响，Supernus股价在盘前下跌了10%。 CRL中表示有两个方面需要FDA进行更多审查。第一个问题是Supernus需要提供更多信息，包括有关产品质量的更多信息。Supernus指出最近向监管机构提交了更多的产品质量数据，但尚未得到审查。FDA 提出的另一个问题与输液设备的主文件有关。Supernus 表示，主文件是专有的，并计划与设备制造商讨论监管机构要求的信息和重新提交 NDA 所需的步骤。与此同时，Supernus公司表示，没有发现任何临床安全性或有效性问题需要获得批准。 三月： Vanda：Hetlioz 3月6日，Vanda Pharmaceuticals宣布，已经收到FDA就Hetlioz（他司美琼）治疗失眠补充新药申请（sNDA）发出的完整回应函。FDA表示发现了标签和上市后要求/保证之外的缺陷，不能批准目前的sNDA。Vanda正在对其进行审查，并评估下一步行动。 Hetlioz是一款褪黑素受体激动剂，2014年1月在美国获批治疗非24小时睡眠觉醒障碍。2020年12月，该产品拓展新适应症，获FDA批准治疗史密斯-马吉利综合征 (SMS) 夜间睡眠障碍。 Viatris/Mapi Pharma：GA Depot 3月11日，晖致（Viatris）和Mapi Pharma共同宣布收到FDA就GA Depot（醋酸格拉替雷，40mg）用于治疗复发型多发性硬化症的新药申请（NDA）发出的完整回复函（CRL）。关于FDA拒绝的具体细节很少，这两家公司仅表示，他们目前正在审查完整回复函，以更好地确定GA Depot 40的“适当下一步”。 GA Depot 40的活性成分醋酸格拉替雷是一种免疫调节剂，1996年在美国获批用于治疗多发性硬化症（MS），商品名为Copaxone。2023年6月，格拉替雷在中国获批上市。GA Depot的NDA主要是基于一项III期研究的积极结果。该研究评估了GA Depot对比安慰剂治疗RMS患者的有效性、安全性和耐受性。结果显示，GA Depot组患者的年复发率相比安慰剂组降低了30.1%（P=0.0066）。 Regeneron：Odronextamab 3月25日，再生元宣布，FDA拒绝其CD3/CD20双抗Odronextamab治疗复发性或转移性滤泡淋巴瘤（FL）和弥漫大B细胞淋巴瘤的上市申请，再生元表示唯一原因是确证临床的入组状态问题，FDA在完整的回复函（CRL）中没有发现任何与有效性、安全性、试验设计、标签或制造有关的问题。 这款CD3/CD20双抗已在复发/难治性滤泡性淋巴瘤以及复发／难治弥漫大B细胞淋巴瘤( DLBCL )中获得批准，均经过2线或2线以上的系统治疗。在12月的ASH上，Regeneron报告了DLBCL的2期数据，显示52%的反应率。如果上市成功，Odronextamab将是继基因泰克(Genentech)的Lunsumio和Genmab/艾伯维(AbbVie)的Epkinly之后，市场上第三种CD20xCD3双特异性抗体。 二月： Venatorx/Melinta：cefepime-taniborbactam 2月23日，Venatorx和Melinta共同宣布，FDA发布了关于头孢吡肟-他尼波巴坦（cefepime-taniborbactam）新药申请的完整回应函。 CRL没有发现NDA中的临床安全性或有效性问题，FDA也没有要求任何新的临床试验来支持头孢吡肟-他尼波巴坦的批准。FDA要求提供额外的化学、生产和控制(CMC)以及有关药物、测试方法和生产工艺的相关数据。 头孢吡肟-他尼波巴坦是一种实验性静脉注射(IV) β-内酰胺/ β-内酰胺酶抑制剂(BL/BLI)抗生素组合，用于治疗成人复杂尿路感染(cUTIs)，包括肾盂肾炎、医院获得性细菌性肺炎和呼吸机相关细菌性肺炎(HABP/VABP)。 Minerva：Roluperidone 2月27日，Minerva Neurosciences宣布收到FDA就5-HT2A受体和σ2受体拮抗剂Roluperidone用于治疗精神分裂症阴性症状的新药申请（NDA）发出的完整回复函（CRL），表示拒批其精神分裂症新药。受此消息影响，Minerva股价大跌59%。 在CRL中，FDA 指出了以下四点拒批理由：虽然MIN-101C03研究在主要疗效终点上显示出统计学意义，但其本身不足以确立实质性的有效性证据；提交的NDA缺乏有关同时服用抗精神病药物的数据；NDA材料缺乏证明Roluperidone对改善精神分裂症阴性症状具有临床意义的必要数据；在已提交的安全性数据中，至少服用12个月拟议剂量（64mg）Roluperidone的患者数量不足。 为了解决这些缺陷，FDA规定Minerva必须至少再提交一项积极、充分和对照良好的研究，以支持Roluperidone治疗阴性症状的安全性和有效性。Minerva还必须提供额外的数据来证明Roluperidone与其它抗精神病药物联合用药的安全性和有效性，以进一步支持Roluperidone的有效性并证明拟议剂量的长期安全性。 Theratechnologies：Trogarzo 2月27日，Theratechnologies宣布，美国食品和药物管理局（FDA）已就该公司关于Trogarzo®（ibalizumab-uiyk）维持剂量的肌肉注射（IM）给药方法的补充生物制品许可申请（sBLA）发出了拒绝备案函（RTF）。 经初步审查，FDA认定该sBLA不够完整，无法进行实质性审查。RTF指出，sBLA没有包含建立Trogarzo® IM给药途径与静脉输注给药途径之间药代动力学桥梁所需的数据。 Trogarzo®（ibalizumab-uiyk）是一种长效、CD4导向、附着后HIV-1抑制剂。在美国，Trogarzo®与其他抗逆转录病毒药物联用，适用于治疗目前抗逆转录病毒疗法无效的多重耐药HIV-1感染的重度治疗经验成人的1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染。Trogarzo® 在加拿大未获批准。 一月： 安斯泰来：zolbetuximab 2024年1月9日，安斯泰来宣布其收到FDA就CLDN18.2单抗zolbetuximab上市申请发出的完整回复函（CRL），暂时拒绝批准上市，作为Claudin18.2阳性、HER2阴性的局部晚期不可切除或转移性胃或胃食管交界处（G/GEJ）腺癌的一线治疗方案。 在CRL信函中，FDA指出了zolbetuximab第三方生产工厂未解决的缺陷，表示不能在原定的PDUFA日期前批准该药上市。其中，FDA未对zolbetuximab的临床数据提出任何疑问，也没有要求开展额外的临床试验。安斯泰来表示，这些生产缺陷不会造成任何安全性和有效性数据的隐患，公司正在与FDA和第三方制造商密切合作，以尽快解决该生产缺陷。 Venatorx/Melinta：cefepime-taniborbactam 2024年1月18日，FDA 拒绝批准日本SNBL旗下Satsuma Pharmaceuticals用于治疗急性偏头痛的双氢麦角胺鼻粉产品 STS101上市。STS101 是鼻腔给药偏头痛药物甲磺酸双氢麦角胺 (DHE) 的重新配制版本，利用 Satsuma 的专有设备进行递送，整体只有口红大小，方便携带和使用。 完整回应函 (CRL) 中指出了STS101的化学、制造和控制 (CMC) 方面的问题。CRL 没有指出STS101有任何安全问题，也没有要求进行额外的研究。Satsuma 将与 FDA 讨论拒绝事宜，以重新提交上市申请。 Defender：DPI-386鼻用凝胶 1月30日，Defender Pharmaceuticals宣布FDA签发了一份完整答复函（CRL），拒批了该公司用于预防晕动病引起的恶心和呕吐的鼻内东莨菪碱凝胶（DPI-386鼻用凝胶）NDA。该公司没有说明监管机构拒绝该药物的原因。 DPI-386凝胶在一项3期、双盲、安慰剂对照研究(NCT05548270)中进行了评估，该研究包括约500名在海上航行中暴露于运动的成年人。研究参与者被随机分配到自行服用东莨菪碱鼻用凝胶(每0.12克凝胶含0.2毫克东莨菪碱HBr)或安慰剂组。研究结果显示，与安慰剂组相比，鼻内东莨菪碱组未报告呕吐和未请求抢救药物(主要终点)的患者比例显著更高。 总结 被美国FDA批准上市往往相当于拿到了全球通行证。但近年来FDA在创新药的上市审批上日渐趋严，以高标准、高要求将多款创新药被拒之门外。从这半年的拒批理由来看，CMC问题是FDA新药拒绝占比最大因素，其次第三方问题也愈发普遍，这提示药企需高度重视对第三方的监管和核查，审慎避坑。 参考资料：各公司公告 来源 | 生物药大时代

摘要：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的出现，为儿童和成人患者中复发/难治性血液系统恶性肿瘤的长期清除带来了前所未有的成果。然而，与CAR-T细胞相关的严重毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性，影响了治疗的实用性；并且对实体瘤的治疗效果仍然不够令人印象深刻。因此，出现了修改其他免疫细胞类型的工程策略，特别是自然杀伤（NK）细胞。由于CAR依赖性和CAR非依赖性（先天免疫介导的）抗肿瘤杀伤能力、主要组织相容性复合体非依赖性细胞毒性、降低异体反应风险以及缺乏主要CAR-T细胞毒性，CAR NK细胞构成了有前景的下一代CAR免疫细胞，并且也适用于“现成的”治疗。在这篇综述中，我们比较了CAR-T和CAR NK细胞疗法，特别关注免疫突触、工程策略和挑战。 引言 CAR T细胞疗法基于用重组抗原特异性CAR分子对T细胞进行工程改造，赋予CAR T细胞目标特异性细胞毒性，独立于T细胞抗原受体（TCR）。与传统的细胞毒性T细胞功能不同，后者受TCR复合物在T细胞上与目标细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合和识别的限制，CAR介导的CAR T细胞的细胞毒性是非MHC限制性的。CAR T细胞在患有复发/难治性血液系统恶性肿瘤的患者中实现了持久的缓解。然而，严重的毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以及对实体瘤的有限疗效，促使人们改造具有细胞毒性潜力的替代免疫细胞，如NK细胞。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）批准的所有CAR T细胞疗法都依赖于患者衍生的和工程改造的CAR T细胞的自体转移以避免移植物抗宿主病（GvHD），但FDA也批准了基因改造的同种异体CAR T细胞的临床试验。目前正在研究低免疫原性同种异体CAR T细胞的开发，以实现健康捐赠者的同种异体CAR T细胞的大规模工程和输血。在这篇综述中，我们比较了T细胞和NK细胞抗肿瘤细胞毒性的机制、CAR设计和工程策略，并讨论了解决CAR T细胞和CAR NK细胞疗法面临的挑战如何影响它们未来的应用，特别是针对实体瘤。 NK细胞是如何与T细胞一起抗击癌症的NK细胞是先天免疫细胞，作为第一线的防御者。与T细胞不同，NK细胞的抗肿瘤功能独立于MHC分子，并且不需要抗原启动。NK细胞表达一系列激活受体（aNKRs）和抑制受体（iNKRs）；取决于aNKR和iNKR信号之间的协调是倾向于NK细胞激活还是抑制，分别导致目标细胞的裂解或免疫自我耐受。当肿瘤细胞下调自身MHC I类分子，创造出“缺失自我”的状态，或者通过aNKRs识别肿瘤相关的压力配体时，NK细胞的脱颗粒和目标细胞裂解就会发生。NK细胞的细胞毒性也可以通过FasL与肿瘤细胞上的相应受体结合发生，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）发生，涉及NK细胞上的CD16与抗体结合的目标细胞的结合，或者间接通过释放免疫原性细胞因子。免疫系统与实体瘤的战斗涉及一个复杂的先天和适应性免疫细胞网络。这些细胞在肿瘤内的丰度和它们的信号协调影响肿瘤进展或控制的命运。在新转化的实体瘤中，NK细胞可以检测到肿瘤细胞亚群上的压力配体。 CAR NK细胞相对于CAR T细胞的优势  CAR NK细胞相对于CAR T细胞具有几个优势，可以用来治疗实体瘤。例如，CAR NK细胞可以利用NK细胞的先天抗肿瘤能力，同时更倾向于目标特异性的杀伤。这使得CAR NK细胞能够杀死表达目标的癌细胞（CAR介导的杀伤）和缺乏目标的癌细胞。 (CAR独立/先天NK细胞毒性介导的)，这一优势对于治疗实体瘤尤为重要，对于治疗实体瘤来说尤其重要，因为这些肿瘤通常以抗原异质性和逃避免疫细胞毒性为特征。由于大多数NK细胞的细胞毒性能力在癌症患者中在肿瘤进展过程中以及在如手术等治疗性方案后会降低，大多数CAR NK细胞需要同种异体来源。迄今为止，对接受同种异体CAR NK细胞治疗的患者进行的临床研究记录显示，由于缺乏MHC I类限制，没有发生移植物抗宿主病(GvHD)。 尽管可逆，细胞因子释放综合征(CRS)是一种危及生命的状况，通常发生在接受CAR T细胞治疗的患者中，这是由于效应免疫细胞的过度激活和血清细胞因子水平的放大分泌，无论是由CAR T细胞还是CAR T细胞激活的巨噬细胞分泌的，包括干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称为CCL2)和白细胞介素-6 (IL-6)及IL-10。然而，在接受CAR NK细胞治疗的患者中，CRS的发生率非常低。虽然原因尚未完全理解，但在CAR NK细胞治疗后CRS病例的罕见可能部分归因于NK细胞激活后不同的细胞因子谱，包括干扰素γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和趋化因子CCL1、MCP-1、MIP-1α（也称为CCL3）、MIP-1β(CCL4)、CCL5和CXCL8，以及与CAR T细胞试验相比完成的CAR NK细胞临床研究的数量有限。 此外，从脐带血、干细胞分化、外周血或NK细胞系大量生产CAR NK细胞的前景对于未来的现成生产是有希望的。例如，在一项研究中，通过在70天内进行五轮刺激，从脐带血中获得的NK细胞扩增了大约1100万倍，从外周血中获得的NK细胞扩增了超过2500亿倍。在另一项研究中，使用辐照的自体外周血单核细胞、IL-2和抗CD3抗体的混合物，可以获得高达15000倍的高活性外周血衍生NK细胞扩增。 CAR与典型T细胞和NK细胞免疫突触的比较  CAR淋巴细胞与目标肿瘤细胞之间形成的免疫突触的类型和特征对CAR淋巴细胞抗肿瘤效果至关重要（图1）。CAR T细胞与肿瘤细胞的第一次接触涉及通过形成免疫突触，在T细胞上的CAR分子与肿瘤细胞上的目标抗原之间进行识别和稳定结合；然而，由CAR分子形成的免疫突触与典型TCR在许多方面都有所不同。一个经典的成熟的免疫突触由三个同心的超分子激活簇(SMACs)区域组成，这些对于TCR细胞毒性功能是必不可少的。在溶解性免疫突触中，中央SMAC由Lck激酶-TCR微簇组成，参与启动激活信号级联和释放溶解颗粒。外围SMAC控制LFA-1整合素与目标细胞表面的ICAM-1粘附分子的结合，被认为是稳定突触的，远端SMAC主要是一个含有如CD43和CD45等糖萼蛋白排斥因子的肌动蛋白环，这些因子保护T细胞，并由CD2的冠与目标细胞上的CD58结构域相互作用，从而实现额外的共刺激信号。然而，在某些情况下，单个受体的参与或膜微簇的形成就足以触发T细胞激活，无需成熟的突触形成。另一方面，CAR T细胞中的免疫突触不涉及成熟的突触形成，而是包括复杂的Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。这种较不组织的突触使得CAR介导的参与更快，随后比TCR更快地释放信号级联，并且与更快的细胞毒性颗粒分泌和随后CAR从目标细胞上的脱离有关。 肿瘤激活的NK细胞释放XCL1、XCL2和CCL5趋化因子，吸引传统的1型树突状细胞（cDC1s），导致炎症活跃的微环境，通常被称为“热肿瘤”。新抗原呈递或肿瘤相关抗原（TAA）呈递的cDC1s在肿瘤引流淋巴结中启动CD8+ T细胞，使进一步的T细胞浸润和MHC I类介导的肿瘤细胞裂解成为可能。多克隆的CD4+和CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞，包括一个能够通过MHC II类介导的肿瘤杀伤的细胞毒性CD4+ T细胞亚群，具有多样化的TCR库和不同的记忆分化和耗竭表型，响应于这种启动而浸润实体瘤。免疫逃逸可以通过肿瘤细胞分泌前列腺素E2来促进，它不仅阻断了CD8+的细胞毒性，还降低了NK细胞的存活率、活性以及趋化因子CCL5和XCL1的分泌，这削弱了NK细胞介导的cDC1s到肿瘤微环境（TME）的招募。肿瘤细胞内在的对干扰素-γ（IFNγ）的敏感性，由活化的TAA特异性CD8+ T细胞分泌，促进肿瘤细胞上PD-L1和其他免疫检查点配体的表达，通过与T细胞上的相应检查点受体（如PD-1）结合，使肿瘤细胞对T细胞细胞毒性产生抗性。在这种情况下，免疫检查点阻断（ICB）可以是一种有效的免疫疗法；然而，肿瘤也可以通过减少抗原呈递来逃避T细胞细胞毒性并获得对ICB的抗性，从而使肿瘤内的T细胞通过CXCL12-CXCR4介导的趋化作用进入邻近的淋巴结。由于iNKR与自身MHC I类复合物的结合有利于NK细胞的抑制，ICB耐药肿瘤细胞中MHC I类复合物的丢失通过限制iNKR的结合，重新使肿瘤内的NK细胞敏感，从而恢复NK细胞的细胞毒性。然而，并非所有肿瘤内的NK细胞都具有细胞毒性。一项研究发现，在三阴性乳腺癌患者中存在一个促进肿瘤发生的亚群Socs3hiCD11b−CD27−未成熟NK细胞，这与预后不良相关，并可能促进肿瘤进展和阻碍异种移植小鼠模型中ICB的效力。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和髓源性抑制细胞被肿瘤细胞招募以创造一个缺氧和免疫抑制的TME。抗炎M2样巨噬细胞通过释放抑制性的转化生长因子-β（TGFβ）并推动NK细胞上CD85j抑制性受体的上调来抑制NK细胞的脱颗粒和功能。根据肿瘤类型、恶性阶段和TME的状态，TAMs可以通过向CD4+ T细胞交叉呈递新抗原来增强抗肿瘤功能，这些T细胞获得细胞毒性能力。TAMs也可以帮助肿瘤逃逸。最近的研究显示，TAMs是TME内主要的葡萄糖消耗者；通过细胞内在的持续糖酵解作用导致TME内乳酸积累，TAMs有利于调节性T（Treg）细胞的招募和CD8+ T细胞的驱逐。髓源性抑制细胞表达NK抑制性配体，分泌活性氧，有助于抑制性的腺苷和TGFβ的积累，并激活Treg细胞释放更多的TGFβ，这些协调作用对NK和T细胞功能有严重影响。TME中丰富的Treg细胞和表达PD-1的滤泡调节性T（TFR）分化细胞，具有强大的免疫抑制能力，可以减少肿瘤浸润性淋巴细胞的细胞毒性，并可能进一步抑制抗PD-1 ICB的效力。因此，持久的免疫抑制TME和克服肿瘤免疫逃逸机制对于成功的CAR T或CAR NK细胞疗法至关重要。 图1 | T细胞和NK细胞中的典型免疫突触与CAR免疫突触。辅助T细胞-APC相互作用代表了TCR和MHC之间典型的免疫突触。这种免疫突触由中心TCR-Lck复合体（中心SMAC）构成，但不包含溶解颗粒，周围是由外周LFA-1/ICAM-1组装（外周SMAC）和伴随CD45和CD2结合的远端肌动蛋白聚合环（远端SMAC）所环绕。CTL-肿瘤细胞溶解突触具有类似的SMAC簇，但也涉及MTOC极化后的中心SMAC内溶解颗粒释放。NK溶解免疫突触包括aNKR配体结合以及CD16介导的ADCC，抑制性NK细胞受体-自身MHC I类结合的丰度低或缺失，并由LFA-1/ICAM-1的外周组装所环绕。NK细胞在静息阶段含有溶解颗粒，并且只有在涉及MTOC极化的时空有序的信号级联发生后，才会经历“定向分泌”。CAR T细胞中的免疫突触包括卷曲的CAR-Lck微簇，对LFA-1的依赖性较小，并且缺乏粘附环。同样，CAR NK细胞的免疫突触涉及溶解颗粒释放和多个CAR-抗原聚集，但在突触裂隙处的肌动蛋白组织较少。PDZ CAR NK细胞-肿瘤细胞溶解突触与CAR NK细胞相比具有更好的突触组织，其特征是Scribble的积累以及浓缩的突触区域和激活的ZAP70与溶解颗粒的增强聚集。使用BioRender.com创建。 NK细胞的功能取决于aNKRs和iNKRs之间的信号平衡。抑制性受体，如人类杀手免疫球蛋白样受体（KIR）和小鼠Ly49，在维持自身MHC I类耐受对内源性健康细胞的同时，在促进NK细胞激活对抗低MHC I类表达细胞的过程中也起着关键作用，这一过程被称为“教育”。在NK细胞激活过程中，NK溶解免疫突触的形成始于含有SH2结构域的磷酸酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）形成小的中心簇，周围环绕着LFA-1，随后是细胞毒性颗粒在中心SMAC中的聚集，而LFA-1重新定位到外围，这一步骤使得NK细胞激活突触对低MHC I类表达目标的教育成为可能。有趣的是，在未受教育的自耐受小鼠Ly49A+ NK细胞（来自MHC I类敲除小鼠）与经过MHC I类分子H2Dd教育的自耐受Ly49A+ NK细胞（来自H2Dd转基因小鼠）中，SHP-1在NK细胞激活突触中的聚集模式不同，包括SHP-1在激活免疫突触中的积累程度以及SHP-1与F-肌动蛋白和SLP-76信号适配器的共定位。研究表明，激活突触中SHP-1的积累导致下游信号蛋白的去磷酸化，以维持“自我耐受”。一旦激活突触通过iNKRs接受“教育”，SHP-1就被排除在激活突触之外，从而解除抑制，激活下游信号，并提高NK细胞的响应性。 一般而言，免疫突触形成的多步骤过程对于许多免疫细胞相互作用都是成立的，包括辅助T细胞-抗原呈递细胞（APC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）-肿瘤细胞，以及NK细胞-肿瘤细胞或NK细胞-健康细胞。对于溶解突触，它始于抗原识别和受体信号，并随后是效应器激活、微管组织中心（MTOC）极化和脱颗粒，并以从溶解目标细胞的解离结束，使免疫稳态和串行杀伤级联成为可能。然而，研究表明NK和CTL溶解突触之间存在一些动力学和机械转导差异。与T细胞不同，T细胞是在激活后诱导溶解颗粒，NK细胞在静息阶段就含有溶解颗粒，因此在激活和突触形成期间遵循精确的空间时间机制的溶解颗粒分泌，这一过程称为“定向分泌”。NK细胞也可以通过聚集iNKRs，例如与健康细胞上的自身决定因素结合的KIR，形成抑制性突触，形成超分子抑制簇，阻止SMAC形成并保护健康细胞不受溶解。NK细胞膜突出物有助于抑制性突触形成和细胞间蛋白转移。在一项研究中，从肝癌患者体内分离的肿瘤内NK细胞与肿瘤周围NK细胞或健康供者的外周NK细胞相比，膜突出物较少。肿瘤诱导的丝氨酸代谢改变降低了肿瘤内NK细胞膜中的鞘磷脂水平，导致膜突出物调节异常，损害了溶解突触形成和细胞毒性。阻断鞘磷脂代谢增加了解离自膜突出物的突触数量，并在体外以及在肝癌人源化小鼠模型中恢复了肿瘤内NK细胞的溶解活性。 由于CAR溶解突触需要比典型免疫突触更高的抗原识别阈值才能启动杀伤，并且更容易受到磷酸酶诱导的失活，科学家们假设通过靶向细胞极化并引发CAR免疫突触的更有序组装，可能会实现更好的CAR实体瘤细胞毒性。通过将细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM）的突触后密度-95、discs large和紧密连接蛋白-1结合基序（PDZbms）插入到称为CAR PDZ NK的CD28z CAR的C末端，生成了突触调节的CAR NK细胞。与传统CAR NK细胞相比，这些发现表明体外增强了亲和力、抗原敏感性、细胞毒性、突触强度和CAR PDZ NK细胞极化，以及在实体瘤小鼠模型中延长了CAR PDZ NK细胞的存活和持久性。同样，当在T细胞中测试时，CAR PDZ构建物与传统CAR T细胞相比，在体外和异种移植小鼠模型中都有增强的效应功能。 CAR T细胞与CAR NK细胞工程 CAR设计的相似之处、差异和进展 与传统的T细胞受体（TCR）相比，CAR是一种合成受体，它赋予CAR T细胞以非MHC限制性机制的靶向特异性细胞毒性。第一代CAR由一个细胞外的单链可变片段（scFv）构成，通过一个铰链域和跨膜域连接到C末端的CD3ζ激活域，该激活域将非TCR外部-内部激活信号传递到T细胞。然而，第一代CAR T细胞的临床效果有限，可能是由于有限的植入和细胞毒性。为了提高CAR T细胞的细胞毒性、产生细胞因子和对目标刺激的增殖能力，后来对CAR分子进行了修改，包括插入一个（第二代）或两个（第三代）细胞内共刺激（ICS）域在CD3ζ上游（见图2a）。值得注意的是，CAR模块化域或链接结构的任何遗传改变都可能影响CAR T细胞的亲和力、效力和持久性。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的六种靶向CD19或BCMA的CAR T细胞疗法已经在许多血液恶性肿瘤患者中实现了持久缓解。然而，为了创造下一代CAR T细胞以治疗实体瘤并增强CAR T细胞的细胞毒性、持久性、渗透性和安全性，已经实施了额外的工程策略。 CAR NK细胞采用了用于CAR T细胞工程的CAR骨架，但在跨膜和ICS域方面有更多的变化[7]（见图2a）。将scFv替换为aNKR的细胞外域，如NKG2D CAR T细胞和CAR NK细胞，可以增加对传统NK细胞靶标的效力。纳米抗体是单域骆驼抗体片段，由于更高的稳定性、改善的TME渗透性和更容易的遗传工程，比传统的单克隆抗体表现更好。对于CAR T细胞和CAR NK细胞，将CAR scFv域替换为纳米抗体在临床前对血液和实体瘤都显示出有效性。CAR NK细胞的一个主要特点是缺乏MHC依赖性细胞毒性，这使得来自健康捐赠者的异体NK细胞可以耐受MHC I类分子在供体和受体之间的差异。然而，从健康捐赠者异体CAR T细胞中遗传删除TCR以及MHC类-I相关和MHC类-II相关基因，以及在诱导的多能干细胞（iPS）细胞衍生的CAR T细胞中过表达HLA-E，允许生成通用CAR T细胞，这些细胞可以承受受体宿主免疫系统而不会诱发GvHD。尽管供体细胞中MHC类I的遗传删除提供了来自受体异体T细胞的保护，但它创造了一个“缺失自我”信号，使供体细胞暴露于受体NK细胞攻击。因此，规避受体NK细胞细胞毒性的策略包括额外过表达HLA-E、HLA-G或CD47，以生成低免疫原性CAR T或CAR NK细胞。 图2 | CAR设计和工程策略以克服实体瘤逃避CAR T和CAR NK细胞。a，典型TCR信号涉及Lck、CD3ζ和ZAP70的顺序激活，以及SLP76和LAT的磷酸化，它们与GADS和PLCγ形成信号复合体，导致T细胞激活。第一代CAR通过一个重组细胞外（Exc）域通过一个铰链和TM域连接到细胞内CD3ζ作为主要激活信号，以促进CAR细胞激活。在第二代和第三代CAR中，信号由一个或两个ICS域支持。LINK CAR T细胞使两个scFv CARs的门控激活成为可能，其信号取决于SLP-76与LAT作为ICS域的复合，仅当肿瘤细胞上呈现两种认知抗原并且与scFv CARs结合时。b，通过工程DN-TGFβ-RII单独或与IL-15受体激动剂（HCW9218）复合；DN-PD-1作为ICB；或者通过遗传删除T细胞或NK细胞中的负调节因子来阻断CAR细胞功能障碍。增强CAR T细胞细胞毒性的方法包括工程化TRUCK CARs，这些CARs使CAR诱导的细胞因子分泌，插入细胞因子受体作为额外的ICS，工程化组成型活性IL-7受体（C7R），或者通过过度表达orthoIL-2/orthoIL-2Rβ。增强CAR NK细胞细胞毒性的方法包括增加细胞因子载荷或使用K562/4-1BBL/膜结合IL-21（mbIL-21）或K562/膜结合IL-15（mb15）/4-1BBL饲养细胞，或补充IL-2、IL-15和/或IL-21的培养基，体外扩增CAR NK细胞。通过与IL-12、IL-15和IL-18的刺激，可以产生具有改善持久性和代谢适应性的类似记忆的CAR NK细胞。多靶向CAR设计的例子以克服抗原异质性和丧失包括IL-13/抗EphA2 Tan-CAR T细胞或一种多靶向CAR NK细胞，该细胞共表达肿瘤可切割的抗CD73 scFv连接到抗GD2 CAR以及NKG2D CAR。抗CD73 scFv与CD73的结合阻止了从腺苷酸（AMP）产生免疫抑制腺苷。通过过度表达趋化因子受体或肝素酶，可以增强CAR T细胞的渗透和持久性，肝素酶降解蛋白聚糖和其他细胞外基质（ECM）蛋白，与CAR一起。αFAP-scFv CAR T细胞靶向癌症相关成纤维细胞上的FAP，以减轻FAP诱导的ECM重塑。将scFv替换为FAP在CAR NK细胞上改善了ECM降解，并增加了NK细胞的渗出和渗透。癌症相关成纤维细胞（CAF）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、髓源性抑制细胞（MDSC）。使用BioRender.com创建。 成功实施CAR T和CAR NK细胞疗法的另一个主要挑战是，由于正常组织共享抗原识别，存在严重的肿瘤外毒性风险。为了缓解这个问题，已经开发了几种逻辑门控和开关受体CAR T细胞[1]。最新的是一种可逆的布尔逻辑AND门控细胞内网络(LINK) CAR，其中CD3ζ被替换为细胞内近端下游信号分子LAT和SLP-76，以产生CD19-28TM-LAT和HER2-8TM-SLP-76 CAR T细胞(图2a)。CD19+ HER2+ 目标细胞诱导的LINK CARs刺激在体外和体内效应功能改善以及限制肿瘤外靶向毒性方面，优于以前开发的逻辑门控平台。同样地，对于CAR NK细胞，SENTI-202是一种新型的“或门和非门逻辑门控”CAR NK细胞候选物，它被设计成通过一个或门激活CAR靶向急性髓系白血病(AML)相关靶标FLT3或CD33，同时通过一个非门EMCN靶向抑制性CAR，避免健康造血干细胞受到肿瘤外毒性的影响。这最终将增强AML白血病干细胞/母细胞肿瘤清除，同时减少对骨髓移植的需求。 针对血液肿瘤的CAR T和CAR NK细胞的临床试验已在其他地方讨论。这里我们关注以实体瘤为靶标的CAR T或CAR NK细胞的临床试验，从Clinicaltrials.gov截至2023年7月1日提取，胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌是目标肿瘤列表中的首选。对于CAR T细胞，针对实体瘤的试验总数为340（23项已完成，23项正在进行/不招募，165项积极招募或邀请注册，67项状态未知，33项暂停/终止/撤回，29项尚未招募）。与此同时，已报告19项针对实体瘤的CAR NK细胞试验（9项积极招募，6项状态未知，4项尚未招募）。表1列出了所有CAR NK细胞试验和已完成的针对实体瘤的CAR T细胞试验。虽然来自CAR T细胞疗法的临床数据未能再现血液肿瘤的持久反应率，但CAR NK细胞的数据仍在等待中。对于CAR T和CAR NK细胞来说，肿瘤内归巢和在实体瘤环境中的持久性是尚待克服的主要障碍。缺乏关于CAR NK细胞在实体瘤中的归巢的临床数据；然而，从第一个CAR NK细胞试验中推断出的投入，该试验利用了携带人类IL-15的CD19 CAR NK细胞，证明了输注的CAR NK细胞在患者外周血中至少持续1年，尽管水平较低。在NK细胞中过表达DNAM-1和/或NKG2D是增强NK细胞肿瘤内渗透的提议策略之一，并已在体外对患者衍生的肉瘤标本显示出有效性。 增强CAR T和CAR NK细胞特别是对实体瘤的抗肿瘤细胞毒性是一个不断增长的研究领域。研究人员使用的策略包括工程化共刺激域，增强CAR修饰细胞的激活细胞内信号。尽管TCR是介导T细胞细胞毒性的唯一主要受体，但许多跨膜共刺激分子，如CD28、4-1BB、ICOS和OX-40，可以放大TCR下游的信号能力，以获得优越的细胞毒性效果。这些分子中的每一个都有利于不同的信号通路，一旦包含在CAR构建物的ICS域中，就会影响CAR T细胞的细胞毒性、增殖和持久性。与此同时，NK细胞有各种激活和抑制受体，它们招募不同的下游信号介导者，其信号线索的微调控制了NK细胞的激活与抑制作用。研究表明，使用NK特异性信号域，如2B4和DAP10或DAP12，作为ICS域，定制NK细胞的CAR工程，可以增加CAR NK细胞抗肿瘤功效和IFNγ分泌，与T细胞定制的CAR构建物相比（图2a）。 克服实体瘤逃逸是CAR基础细胞工程中另一个积极扩展的领域。克服CAR T和CAR NK细胞功能障碍的方法包括过表达TGFβ（DN-TGFβ-RII）或PD-1（DN-PD-1）的优势负性受体(DNRs)，或遗传删除包括PD-1和二酰甘油激酶在内的负面CAR细胞调节器。正交和/或膜结合细胞因子/细胞因子受体工程策略也已被用于增强CAR T或CAR NK细胞的抗肿瘤功能。通过CAR T或CAR NK细胞对TAAs进行多靶向和串联靶向可以提高对实体瘤及其相关抗原异质性或丢失的功效，与单一CAR相比。改善CAR T或CAR NK细胞通过基质屏障的运输和渗透的策略包括过表达趋化因子受体，生成FAP-scFv CAR T或过表达FAP的CAR NK细胞，或过表达肝素酶。图2b总结了已经研究的突出工程方法。 增强抗肿瘤效果的联合免疫疗法 癌症免疫疗法是一系列旨在动员并增强免疫细胞效应功能以消灭肿瘤的治疗方式。图3a描述了CAR T和CAR NK组合免疫疗法的主要模型。 重组单克隆抗体或作为替代品的纳米抗体可以用多种方式增强CAR T和CAR NK细胞的功能[57]。激活性单克隆抗体作为特定激活受体或共刺激分子（如CD28、4-1BB和SLAMF7）的激动剂，对T细胞或NK细胞的扩增和持久性很重要。肿瘤特异性单克隆抗体单独使用或与高亲和力CD16的过表达结合，通过抗体结合的肿瘤细胞的Fc部分的包被作用，将CAR表达细胞重定向至肿瘤细胞和/或增强ADCC功能。阻断性单克隆抗体（如ICB中使用的）通过阻断免疫检查点受体或配体（如TIM3、CTLA4和PD(L)-1）靶向免疫抑制性的TME。尽管FDA批准的ICB作为单一疗法为一些实体瘤患者提供了持久缓解，但在许多其他患者中失败是因为肿瘤特异性的一级和二级抵抗机制。NK抑制性受体阻断单克隆抗体通过模仿通常在抑制配体下调或丢失时发生的“缺失自我”信号，促进NK功能。其他阻断性单克隆抗体靶向炎症性细胞因子受体。例如，tocilizumab是一种FDA批准的阻断性单克隆抗体，靶向IL-6受体（IL-6R），用于管理CAR T细胞诱导的CRS。免疫结合剂，如BiTE和TriTE（对T细胞）以及BiKE、TriKE和TetraKE（对NK细胞），是双特异性或多特异性T细胞或NK细胞结合剂，结合了scFv、纳米抗体和/或其他分子如细胞因子，以促进CAR表达细胞有针对性地消灭肿瘤。 Lenalidomide是E3泛素连接酶途径的免疫调节剂，具有多种免疫效应。除了诱导肿瘤细胞周期停滞外，lenalidomide可以通过阻断血管生成和抑制Treg细胞来调节TME，以及介导恢复与淋巴瘤相关的免疫突触缺陷。与T细胞结合使用时，lenalidomide是一种共刺激剂，增强了抗CD133或抗HER2 CAR T细胞对实体瘤的细胞毒性和细胞因子分泌。在I期临床试验中，lenalidomide促进了NK细胞的扩增，与抗抑制性KIR疗法结合使用，增强了对多发性骨髓瘤的类固醇节约细胞毒性。 溶瘤病毒是一组经过工程改造的病毒，可以增强肿瘤免疫原性和树突状细胞诱导的NK细胞活性，以及实现转基因的肿瘤靶向传递。溶瘤病毒表达截断CD19（OV19t）和抗CD19 CAR T细胞的联合瘤内治疗导致实体肿瘤消退。同样，溶瘤病毒表达人类IL-15/IL-15受体α sushi结构域融合蛋白（IL-15–suIL-15Rα）复合物（OV-IL15C）和抗EGFR CAR NK细胞的组合，在胶质母细胞瘤小鼠模型中引发了协同抗肿瘤细胞毒性和CAR NK细胞的持久性，并改善了生存率。 对于所有这些组合疗法，正在进行血液和实体瘤的临床前和临床评估。虽然ICB与CAR T细胞结合使用的临床评估看起来很有前景，但它在CAR NK细胞毒性中的作用还有待商榷。基于纳米抗体的疗法可能很快会在针对实体瘤的免疫疗法时代占据主导地位，因为它们能够穿透密集的基质；然而，纳米抗体从循环中的快速清除需要额外的工程化。增强两种CAR基础疗法的细胞毒性和持久性的细胞因子装甲已被证明是有效的，还有更多灵活的机会有待探索。最终，由不同癌症免疫疗法介导的多模式机制在增强CAR基础疗法时，考虑到可能的肿瘤外毒性，对未来选择与CAR T和CAR NK细胞一起的最佳组合免疫疗法至关重要。 这些数据来源：https://clinicaltrials.gov。DLL3，类DLL3配体3；CLDN6，紧密连接蛋白6；ROBO1，漫游导向受体1；MUC，粘液蛋白；Meso，间皮素；CIR，嵌合免疫受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；CEA，癌胚抗原；CD133，蛋白I；CLDN18.2，紧密连接蛋白18.2；GD2，二唾液酸神经节苷脂；HCC，肝细胞癌；PSMA，前列腺特异性膜抗原；TNBC，三阴性乳腺癌；Cytoxan，环磷酰胺；Fludarabine，抗代谢物；Pembrolizumab，针对PD-1的单克隆抗体；Ezabenlimab，针对PD-1的人源化单克隆抗体；Aldesleukin，重组人类IL-2；AP1903，一种通过交联FKBP结构域发挥作用的化学二聚体剂。NA，不适用。 影响实体瘤中细胞毒性和持久性的挑战 用于体外扩增的T细胞来源包括外周血和iPS细胞衍生群体，很少有文献报告使用脐带血扩增的T细胞，因为这些细胞在扩增后往往富含Treg细胞。尽管CAR T细胞治疗在对抗血液恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤方面却表现不佳[1]。除了长期体外扩增后诱导的CAR T细胞产品耗竭，影响记忆表型、寿命和增殖能力外，阻止CAR T细胞成功治疗实体瘤的第一障碍是由癌症相关成纤维细胞形成的密集基质，这抑制了CAR T细胞渗透到肿瘤部位。绕过这一障碍的肿瘤内CAR T细胞在持续刺激目标抗原和/或免疫抑制性肿瘤和相关TME后可能会变得耗竭。肿瘤逃逸可能发生，因为肿瘤试图通过突变逃避有效的肿瘤内CAR T细胞毒性，导致抗原丢失或抗原异质性。肿瘤内CAR T细胞也可能因内在和外在因素的复合作用而被驱逐到淋巴结，导致增殖能力降低和持久性丧失。 与可以存活数月的T细胞不同，NK细胞的寿命很短，年轻成人的半衰期不到10天，这一限制因素强调了需要反复输注NK细胞产品以维持体内的有效性和持久性。此外，扩增的NK细胞对冷冻和解冻的敏感性影响了输注后的细胞毒性和存活率。在三维肿瘤模型中，解冻后迁移NK细胞的比例下降了六倍，对细胞毒性效果有严重影响，这可能部分解释了冷冻保存的CAR NK细胞在体内的持久性受损。目前正在研究优化冷冻保存方案，包括使用替代二甲基亚砜的替代品，二甲基亚砜是传统上用于冷冻细胞的保护剂，以保持CAR T和CAR NK细胞在解冻后的完整性、活性、功能和效力，并促进未来的现成生产和冷冻保存。 体外扩增NK细胞需要用细胞因子进行启动，以防止NK细胞耗竭和衰老。NK细胞可以从多种来源扩增用于临床测试，如外周血、脐带血、iPS细胞和不朽的NK细胞系，如NK-92细胞；每种来源都有特定的限制和优势。CAR NK细胞的产生反映了未经编辑的NK细胞的体外扩增方案，尽管后者需要额外的病毒或非病毒工程以表达CAR构建物。这些扩增方案依赖于持续的细胞因子刺激，有或没有饲养细胞的共激活。尽管扩增的CAR NK细胞在体外对目标细胞提供了显著的细胞毒性，但研究表明，它们对细胞因子和激活信号的依赖可能是输注到患者后功能失常和寿命缩短的原因，特别是当这些信号线索在TME内变得稀疏时。 NK细胞暴露于许多肿瘤诱导和TME介导的细胞因子和代谢物中，这可以减少NK细胞的持久性和功能。对患者的血液和实体瘤样本分析表明，肿瘤介导和TME介导的NK细胞功能障碍，以及细胞毒性、持久性和寿命受损，可以总结为五种主要机制：耗竭、抑制、无反应、可塑性和增殖缺陷。导致NK细胞耗竭的肿瘤相关因素包括肿瘤细胞持续激活NK细胞导致效应功能降低。肿瘤相关和TME相关释放的TG-β和其他抑制性代谢物诱导aNKR下调；溶解颗粒释放减少；细胞因子产生缺陷；以及iNKR过度表达。无反应可能是由于过度抑制性信号或在缺乏iNKR许可的情况下持续刺激aNKR所致。由于NK细胞属于第1组先天淋巴细胞（ILC1），肿瘤相关因素诱导的ILC1和ILC3亚类之间的可塑性可能允许将传统的细胞毒性NK细胞转换为细胞毒性较低的或ILC1样表型，具有促肿瘤潜力。NK细胞功能障碍还伴随着增殖能力受损和NK细胞浸润数量减少。 图3 | CAR T和CAR NK组合免疫疗法及CAR细胞工程方法。a，抗CD3和抗CD3/抗CD28激活单克隆抗体偶联珠增强CAR T细胞扩增。CAR NK细胞激活单克隆抗体(mAbs)和纳米抗体(Nbs)的靶标包括共刺激分子和aNKR，单独或与高亲和力CD16(ha-CD16)的过表达结合。阻断单克隆抗体和纳米抗体针对免疫检查点受体或配体(ICB)、iNKR或IL-6受体(IL-6R)。FDA批准的阻断单克隆抗体的例子包括托珠单抗、阿特珠单抗、尼伏单抗和伊匹单抗。来普尼增强了CAR T细胞的细胞毒性和增殖，并且通过在多发性骨髓瘤(MM)细胞上增加aNKR配体的表达，与KIR阻断单克隆抗体(IPH2101)联合使用时增强了CAR NK细胞的细胞毒性。OV19t溶瘤病毒通过实体瘤细胞诱导截短型CD19(CD19t)的表达，使其易于受到抗CD19 CAR T细胞的细胞毒性，而OV-15C诱导肿瘤细胞表达和分泌人类IL-15/IL-15受体α寿司结构域融合蛋白(IL-15–suIL-15Rα)，这提高了抗EGFR CAR NK细胞的抗肿瘤效果。免疫结合剂的例子包括BiHC(抗HER2-Nb/抗CD3-scFv BiTE)或布利纳图单抗(抗CD19-scFv/抗CD3-scFv BiTE)用于CAR T细胞，以及抗EGFR-Nb/抗CD16-Nb BiKE或抗CD16-Nb/重组IL-15/抗CLEC12A-Nb TriKE，后者结合了ADCC和TAA特异性杀伤CAR NK细胞。b，病毒CAR转导导致CAR在T细胞或NK细胞内的整合。c，非病毒CAR工程策略的例子包括通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的mRNA，DNA纳米载体平台和转座子以及CRISPR-Cas9和碱基编辑作为基因编辑工具。正在开发中的先进策略包括使用生物材料进行体内CAR传递和扩增，以及通过顺序磁声激活将抗CD3/抗CD28珠与CAR T细胞结合创建的CAR T细胞基活体微型机器人(M-CAR T细胞)的靶向传递和扩增。使用BioRender.com创建。 当前CAR T和CAR NK细胞高效开发的工程策略包括通过额外的遗传操作或组合疗法来增强这些细胞，以解决T和NK细胞功能障碍和持久性问题。 增强CAR-T和CAR NK细胞的传递技术  传统的CAR T细胞生成涉及病毒载体传递CAR构建体，以实现高转导效率和CAR的稳定表达。最广泛使用的载体是慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。与T细胞相比，NK细胞更难进行工程改造，这是由于其固有的抗病毒能力、对凋亡的高敏感性和有限的扩增潜力。由于慢病毒包膜直接影响原代NK细胞的转导效率，因此可以使用泡状口炎病毒G（VSV-G）、长臂猿白血病病毒包膜（GALV）、猫科内源性逆转录病毒包膜蛋白（RD114-TR）或狒狒包膜（BaEV）对慢病毒进行伪型化，后者显示出与逆转录病毒相当的转导效率。然而，增加的免疫原性、可能的插入突变、有限的插入大小、高昂的GMP级病毒生产成本和相关的监管复杂性是主要缺点，这些缺点激发了探索成本效益的非病毒传递途径。非病毒转座子平台Sleeping Beauty和PiggyBac能够更安全地整合CAR构建体，但效率低于病毒系统。通过电穿孔或脂质纳米颗粒传递的非病毒mRNA基CAR构建体产生高但短暂的CAR表达效率。科学家们还开发了一种简单、多功能、经济实惠、非病毒、非整合的DNA纳米载体平台，能够在体外和体内实现T细胞的非染色体CAR表达，且没有免疫原性或遗传毒性。其他的非病毒基因编辑平台包括CRISPR-Cas9，它能够实现CAR和其他有利基因的位点定向整合或免疫细胞负调节因子、TCR或MHC相关基因的删除。在一项研究中，通过结合T细胞相关基因的基础编辑和CAR-慢病毒转导，产生了抗兄弟细胞毒性的双重CAR T细胞。最后，生物材料传递车辆允许定向转移编辑或未编辑的免疫细胞，有病毒或非病毒编辑的选项，在体内，而无需事先的体外扩增，而基于CAR T细胞的活体微型机器人能够通过磁声激活实现CAR T细胞的靶向传递和激活。 结论  过去十年在CAR基础免疫疗法的工程方面取得了革命性的成功，已有六种FDA批准的CAR T细胞疗法使一些儿童和成人患者的血液恶性肿瘤实现了长达十年的缓解。然而，血液恶性肿瘤患者在接受CAR T细胞输注后的复发率是可变的，而且尚未实现对实体瘤有显著数量的完全缓解。CAR T和CAR NK细胞的耗竭、低反应性和被宿主免疫系统排斥被认为是许多患者肿瘤抵抗和复发的主要因素。因此，要实现CAR基础免疫细胞功能的最优化，需要解决这些细胞疗法面临的多重挑战，同时优化临床给药环境，并利用组合免疫治疗模式。 尽管一些CAR NK和CAR T细胞基础的临床前研究展示了对实体瘤的有效细胞毒性，但CAR NK细胞的临床数据很少，而CAR T细胞在临床上尚未成功。未来的治疗方案应该操纵工程策略和组合疗法，以解决阻碍CAR T和CAR NK细胞对实体瘤效果的挑战。这些挑战包括克服肿瘤诱导的抗原异质性或丧失；促进长期肿瘤内抗原遭遇，以实现有效的肿瘤细胞毒性；在肿瘤内维持更好的CAR表达细胞的持久性和保留；耐受缺氧和免疫抑制的TME；以及维持类似记忆的CAR细胞库，以实现更持久、更具肿瘤特异性的细胞毒性。与溶解性突触形成和稳定性相关的额外挑战，如免疫细胞-目标识别、结合动力学和效力，应该得到解决。应该继续研究消除受体中超活性或有毒CAR细胞的方法，包括逻辑门控和开关式CAR设计以及其他新方法，直到实现最佳平台。最终，成功开发针对实体瘤的高效CAR疗法可能需要一个全面的组合方法，而不是单独针对个别障碍。 未来需要从MHC不匹配的健康捐赠者那里生产“现成的”通用CAR T细胞产品，以促进在疾病关键阶段向患者、弱势社区或缺乏CAR T细胞开发设施的医疗机构提供已经FDA批准的产品。基于MHC非限制性细胞毒性、降低的肿瘤外靶向毒性和“现成的”生产便利性，我们预计未来十年将带来更多的研究结果，帮助优化NK细胞扩增工作流程；减轻NK细胞耗竭，改善解冻后恢复，并增强移植后的细胞毒性和持久性。然而，由于同种异体CAR NK细胞可能促进免疫原性并在后期被宿主免疫细胞排斥，因此需要进行额外的遗传操作，类似于应用于通用CAR T细胞的操作。也应该采用创造最佳无饲养层扩增的新型策略，以实现CAR NK细胞的大规模生产，并绕开监管和一致性问题。 关于CAR T或CAR NK细胞抗肿瘤效果的大多数临床可用数据都是从分析晚期癌症的重度预处理患者中推断出来的，同时缺乏作为早期肿瘤进展阶段的一线疗法的有效性证据。因此，进一步研究CAR基础疗法的最佳时间、剂量、途径和频率，将更好地指导临床决策，并扩大治疗适用患者的范围。CAR基础细胞疗法的另一个主要缺点是治疗成本的显著提高，包括对伴随副作用的症状管理。未来有助于降低成本的步骤包括优化“现成的”生产和冻存“通用”工程CAR产品，减轻肿瘤外靶向毒性，缩短体外扩增工作流程，优化非病毒CAR递送以及微调体内动力学和个别CAR设计的效力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。