UPF1

治疗性mRNA设计的目标是定制mRNA序列以达到最符合治疗的应用场景。在许多情况下，这仅需要最大限度地提高每个递送的mRNA分子的功能性蛋白质表达量。这一目标主要取决于细胞中的mRNA半衰期及其翻译效率，而翻译效率又取决于结合mRNA的核糖体数量（即核糖体密度）以及这些核糖体移动的速度（即延长翻译蛋白质）。虽然从直觉上看，最大化核糖体密度似乎是一种可行策略，但过多的核糖体会促进翻译依赖性mRNA衰变，从而降低总蛋白表达量，并可能降低药理作用持续时间。因此，了解如何适当平衡核糖体负荷对于最大限度地提高蛋白质表达量至关重要。对于某些应用，还可能需要内置允许根据细胞类型或细胞状态调节蛋白质合成的功能。然而，仅追求最大蛋白质输出而设计得到的并不一定是有效的mRNA药物。mRNA还需要具备易于大规模生产，并保证产品一致性的特点。此外，尽管延长细胞中mRNA的半衰期是提高治疗效果和蛋白质表达持续时间的关键因素，但还需要优化储存过程中mRNA的稳定性，考虑mRNA如何与各种递送载体成分相互作用以及是否会受到其不利影响。在某些情况下，还必须考虑其他分子的影响，如联合疗法给药所引入的其他药物分子。尽管其中一些参数起初可能看起来是独立的，但实际上，mRNA容易通过自身相互作用形成二级和三级结构，并与其他分子紧密交织在一起，继而影响mRNA的命运。全面了解mRNA序列和结构之间的相互作用，以及这两个参数如何影响mRNA的功能和稳定性，对于开发有效的mRNA药物至关重要。图1. mRNA药物的基本原理2023年11月29日，Moderna研发团队在Nature Reviews Drug Discovery上发表了题为“Tailor made: the art of therapeutic mRNA design”的综述文章。在这篇综述中，作者描述了mRNA的物理稳定性和生物活性的原理，并特别强调了核苷酸序列、核苷酸修饰和RNA二级结构之间的相互作用。在mRNA药物开发实践中，我们逐渐发现，仅追求最大限度提高蛋白质表达量的mRNA并不总是能产生最高的抗体滴度；满足足够蛋白表达量的同时还需要兼顾mRNA的体内外稳定性；采用AI算法对不同序列进行同一特征的优化，最终的蛋白质表达效果也可能存在很大差异；细胞内tRNA丰度和转录后调控也因细胞类型和细胞状态而异。因此，在可及的细胞类型中最大限度地提高mRNA的治疗效力可能需要更多定制的设计策略。下面我们将继续跟随Moderna研发团队的视角，总结目前mRNA序列和结构设计中可以最大化治疗性mRNA性能的设计策略，为mRNA药物的研发提供更多可参考的思路。密码子选择的理论“公式”治疗性mRNA设计面临的主要挑战是编码任意一种蛋白质的可能编码序列（CDS）数量极多。由于遗传密码的冗余，其中大多数氨基酸由多个密码子编码。对于任何给定的蛋白质，可以使用以下公式计算CDS数量：其中ki为氨基酸i的密码子选择数，ci为蛋白质中氨基酸i的数量举个例子，对于像具有14个氨基酸的生长抑素这样的激素小肽，就有393,216种可能的CDS。对于较长的蛋白质，数字很快就会变得难以估算。具有1273个氨基酸的SARS-CoV-2刺突蛋白就有多达10^632种可能的序列，而已知宇宙中的原子数也仅为10^80。面对如此庞大的可能性基数，我们具体应该如何选择？到目前为止，人类所研究的生物体都表现出对某些密码子的偏倚，这些更常用或“最佳”的密码子通常与较高的转运RNA（tRNA）水平有关。研究表明，依靠稀缺tRNA的密码子会导致核糖体在空缺的A位点停留更长时间，因此使用更丰富tRNA的密码子被认为有助于翻译的延伸。在哺乳动物中，最佳密码子往往富含GC，在摆动位置（wobble position）处对C有强烈的偏好。Wobble positon是密码子中的第三个核苷酸，与同源tRNA的结合较少受到限制。因此，GC碱基对通常比AU碱基对更稳定，最大化密码子最优性也倾向于增加编码区的二级结构强度。事实上，对于缺乏内含子的序列，在不特别考虑密码子最优性的情况下，简单地最大化GC含量，特别是在编码区的前半部分，可以将蛋白质表达提高5至30倍。此外，还有其他多个指标被认为与密码子最优性相关。其中使用最广泛的是同义密码子相对使用度（RSCU），同义密码子相对使用度指对于某一特定的密码子，在编码对应氨基酸的同义密码子间的相对概率。每个密码子的RSCU值可以按如下方式计算：其中Xij是第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数，n是第i个氨基酸的可能密码子的数量（从1到6）。这些值可用于推导出总体最优性分数，即密码子适应指数（CAI），范围为0–1，适用于任何编码区域：CAIobs为基因中观察到的CAI，CAImax为基因最大可能的CAI值，定义为：其中RSCUk是基因第k个密码子的RSCU值， RSCUkmax是基因第k个密码子的最大RSCU值，L是基因中的密码子数。tRNA适应指数（tAI）也被用来解释带电荷差异的tRNA丰度和每个密码子-反密码子配对的效率。由于带电荷差异的tRNA丰度极难测量，因此tRNA基因数量或通过tRNA测序（tRNA-seq）测量的tRNA水平被用作丰度代理。需要注意，个体tRNA丰度可能因不同的哺乳动物组织和细胞类型而异，因此只能计算已测量tRNA丰度的细胞类型中的tAI才最为可靠。尽管在整个转录本中平均密码子使用偏差的指标很有用，但也可能存在局部使用偏差。例如，内源性转录本中的前30-50个密码子较多为稀有密码子。这一现象引出了“翻译斜坡假说”（translational ramp hypothesis），该假说表明，在CDS的5'末端减慢翻译延伸有助于将延伸的核糖体间隔开来，从而减少核糖体“交通拥堵”的可能性并有利于蛋白质表达。然而，一项针对酵母的研究表明，稀有密码子的这种局部富集是非适应性的，这是由于编码区5'末端的突变率更高，实际上导致蛋白质表达降低。目前还没有发表的论文支持CDS 5'端的稀有密码子对于最大限度地提高哺乳动物蛋白质表达的重要性。影响RNA折叠的“平衡木”治疗性mRNA设计的第二个重要考虑因素是核苷酸序列和RNA折叠之间的相互作用。mRNA不是简单地作为遗传信息的被动传递者，而是通过分子内碱基配对（二级结构）和高阶相互作用（三级结构）形成复杂结构，使其能够积极参与mRNA自身的调控。mRNA的结构差异可以对翻译的起始、延伸和终止产生积极或消极的影响，或可能作为调节翻译或引起细胞内mRNA衰变的蛋白质复合物的结合位点。适当的结构还可以有助于延长储存中的治疗性mRNA的寿命。事实上，究竟形成哪些结构，是否存在修饰核苷酸以及mRNA是线性还是环状，都是核苷酸稳定性和动力学的重要影响因素。因此，了解如何设计mRNA结构以实现最佳的药品稳定性和蛋白质产量，以及RNA拓扑结构和修饰核苷酸会如何改变这些结构，在mRNA设计中至关重要。为设计具有理想结构特性的mRNA，必须首先了解驱动RNA折叠的化学原理。二级结构在生理pH值下，每个磷酸键都带有负电荷，并且几乎没有碱基质子化。因此，在正离子不足以中和磷酸基团的水环境中（如纯水），主要是碱基之间的氢键和碱基堆叠形成的相互作用驱动RNA结构的形成。这些相互作用将最大数量的疏水碱基埋在A形螺旋茎环内，通过电荷排斥保持彼此分开。而在正离子存在下，这些茎环可以相互接近，如二价阳离子Mg2+和Ca2+可以桥接两个磷酸盐并形成更紧凑的结构，其中还包含非碱基配对，形成如GA碱基对、K-turns、G-四链体和假结等复杂结构（图2a）。图2. mRNA非碱基配对的结构折叠自由能RNA结构稳定性通常表示为从完全展开状态到特定结构时释放的自由能变化ΔG。ΔG值可以通过以下公式转换为平衡常数：ΔG0= −RTln（Keq），其中ΔG0=标准自由能变化，R=通用气体常数，T=温度（开尔文）和 Keq=平衡常数。ΔG是两种状态之间焓差和熵差的函数：ΔG0=ΔH0−TΔS0，其中ΔH0=焓变，ΔS0=熵变，T=温度（开尔文）。任何复杂结构形成所需的自由能都是结构所有部分的能量增益和损失的总和。对于二级结构来说，其稳定性主要依靠相邻碱基堆叠和碱基对之间的氢键作用。这些作用的焓增在很大程度上被有序链的熵损失所补偿，如形成RNA骨架螺旋、磷酸基团排斥等有序结构，但也不可避免地限制了分子构象自由度（图3）。RNA折叠自由能的预测通常参考热力学测量数据库，然后使用这些参数来推导最邻近模型，提供对给定序列如何折叠的预测。图3. 序列中各种相互作用类型的自由能GC含量与最小自由能从理论上讲，RNA可以形成的二级结构的数量估计为2.3n，其中 n 是核苷酸中 RNA的长度。这意味着一个典型的2000nt长度治疗性mRNA的理论结构数量将是天文数字。然而，在这些无数可能的二级结构中，具有最小自由能（MFE）的二级结构是最有可能且结构最稳定的。尽管可以采用邻近参数的算法预测可能的二级结构，但目前已知的算法均存在一定局限性，例如深度学习的算法将会受到训练数据集偏差的影响。由于GC碱基对相较于AU碱基对更稳定，普遍认为GC含量是结构稳定性的最有利驱动因素。虽然通常情况下具有极高GC含量的长转录本确实比相反极端的转录本具有更低的最小自由能，但根据最近的研究进展表明，这一直觉性概念不一定适用于具有中等GC含量的mRNA。以最大化碱基对总数或创建具有最低MFE的序列的mRNA设计算法（LinearDesign、Ribotree、CDSFold）输出所得的序列普遍具有中等含量的GC。GC含量最大化与高碱基对总数/低MFE序列之间的主要区别在于它们的平均“位置熵”（positional entropy）或“碱基对熵”（base-pairing entropy）。位置熵是从结构预测中得出的可靠指标，在大多数低能结构中单链或碱基对的位置被称为具有低位置熵。简而言之，位置熵为0即表示预测的位置始终不成对或始终与另一个碱基形成相同的相互作用，可以据此推断出该位置并预测构型。相反，位置熵为1表示该位置具有高度的结构混杂性。与普遍认知的情况相反，具有最大GC含量序列的平均位置熵（即序列中所有位置的平均熵）往往比高碱基对总数/低MFE设计高得多。这一现象表明，尽管GC碱基对在热力学上比AU碱基对更稳定，但与核苷酸含量更平衡的序列相比，富含GC的序列更为活跃，倾向于形成更具多样性的结构（图4,5）。图4. 对比富含GC茎环与GCAU-混杂茎环的位置熵：富含GC的茎环要比GCAU-混杂茎环倾向于拥有更高的位置熵，尽管两个茎环仅有一个碱基对的不同（红色方框）。图5. 上述序列具有最低能量的十种结构：虽然富含GC的茎环（-26.1 kcal/mol）要比GCAU-混杂茎环(-23.4 kcal/mol)具有更低的最小MFE，但是，仅含GC的茎环的其他低能量结构相互之间的折叠能量更加接近，显示富含GC的茎环具有更多样化的结构。细胞内折叠态根据理论，人们很容易就会假设具有最低MFE的结构为唯一选择，然而并不能忽视动力学屏障造成的不同折叠状态。多个折叠态将会共存于RNA分子之中，如果两个折叠态之间不存在动力学上有利的转化途径，则不会达到平衡（图6）。图6.长RNA分子的中间和最终折叠状态由于mRNA的化学合成仅限于<120个核苷酸的序列，长RNA分子通常由DNA模板的体外转录产生。从RNA聚合酶中出现时，RNA片段按照先后顺序发生共转录折叠。因此，除非全长转录本完全变性，然后缓慢恢复折叠，否则并不可能采用其最小自由能（MFE）结构。尽管如此，最近研究共转录折叠的研究表明，RNA可以使用中间折叠状态来达到最终折叠状态（图6a-h）。这种最终折叠状态高度依赖于环境条件，例如一价和二价阳离子浓度、分子拥挤剂以及RNA结合蛋白（RBP）的存在与否，这些蛋白可以稳定或破坏稳定局部结构。细胞内结构重塑在真核细胞核中，产生新的mRNA折叠是一个非常复杂的过程：首先，分子内和分子间的相互作用通过激烈竞争以构建 mRNA-蛋白质颗粒（mRNP）。当mRNA离开细胞核并进入细胞质时，这种初始mRNP结构会经历多次重塑事件，被核糖体反复转变并最终导向衰变。应用细胞内结构探测方法来检测来自人和小鼠细胞核质和细胞质中染色质相关RNA的相对结构，首次在转录组范围内瞥见了这种重塑。对于内源性mRNA，它们在核质和细胞质中的整体结构非常相似。因此，在细胞核中获得的内源性 mRNA结构印记（折叠态、相互作用的 RBP）将影响转运至细胞质后的结构和功能。外源性mRNA从未与核质相互作用，因此不受这种核印记的影响。目前，人们对外源性mRNA的细胞内折叠状态或RBP相互作用以及这些因素如何影响外源性mRNA功能知之甚少。无论其来源如何，细胞中长mRNA都不太可能实现其理论上的MFE结构。mRNA中与环境无关的元件倾向于形成更确定的结构，这类元件通常出现在非翻译区（UTR）内（例如，在病毒RNA中发现的内部核糖体进入位点IRES）。这种结构中的单个核苷酸具有低位置熵，因为它们往往具有固定的相互作用。相反，位置依赖性结构（例如，隐藏或暴露microRNA（miRNA）的茎结合位点）更具延展性，在遇到不同的细胞环境时通过不同的RBP和结构重塑机制（如，解旋酶和核糖体）发生定期重塑。由于位置依赖性结构与周围序列的相互作用更加混杂，其核苷酸具有更高的位置熵。小结如何平衡这篇文章中所讨论的多种设计考虑因素仍然是一个巨大的挑战，即使是目前最前沿的mRNA设计方法也存在局限性，表明我们尚未完全了解影响治疗性mRNA性能的所有参数。在mRNA药物开发的实践中，我们逐渐发现，旨在最大限度提高蛋白表达的mRNA并不总是能产生最高的抗体滴度。同样，经由同一算法优化的具有相同特征的不同mRNA序列，也可能在整体蛋白质表达量上有很大差异。此外，细胞内tRNA丰度和转录后调控也因细胞类型和细胞状态而异。因此，在新可及的细胞类型中最大限度地提高效力可能需要更多定制的设计策略。下期内容，我们将继续跟随Moderna研发团队的视角，总结目前mRNA序列和结构设计中可以最大化治疗性mRNA性能的策略，为mRNA药物的研发提供更多可参考的思路。在mRNA药物开发实践中，我们逐渐发现，仅追求最大限度提高蛋白质表达量的mRNA并不总是能产生最高的抗体滴度；满足足够蛋白表达量的同时还需要兼顾mRNA的体内外稳定性；采用AI算法对不同序列进行同一特征的优化，最终的蛋白质表达效果也可能存在很大差异；细胞内tRNA丰度和转录后调控也因细胞类型和细胞状态而异。因此，在可及的细胞类型中最大限度地提高mRNA的治疗效力可能需要更多定制的设计策略。在上期文章中，我们已讨论了治疗性mRNA序列和结构设计的几个重要考虑因素。下面我们将继续跟随Moderna研发团队的视角，总结目前mRNA序列和结构设计中可以最大化治疗性mRNA性能的设计策略，为mRNA药物的研发提供更多可参考的思路。修饰核苷酸哺乳动物细胞含有多种模式识别受体（PRR），这些受体对RNA病毒的共有特征做出反应并引发炎症，抵御病毒感染。对于mRNA疗法来说，主要面对的是Toll样受体7/8（TLR7/8），它们检测内吞后的外源RNA。因此，用这些受体无法识别的修饰版本取代尿苷，例如5-甲基尿苷（m5U），2-硫尿苷（s2U），假尿苷（Ψ）或1-甲基假尿苷（m1Ψ），可产生免疫学上“隐身”的mRNA药物。迄今为止，m1Ψ是已进入临床的治疗性mRNA中使用最广泛的修饰方法。m1Ψ天然存在于人类细胞的pre-18S核糖体RNA（rRNA）中，对核糖体的生物发生至关重要。有趣的是，在对干扰素刺激有反应的mRNA中发现了内源性Ψ位点，这表明Ψ对免疫反应检视下的成功翻译具有重要意义。与其他天然存在的修饰核苷酸一样，m1Ψ等修饰的引入会显著改变RNA二级结构（图1a）。例如，m6A修饰（图1b绿圈处）降低了在MALAT1 RNA中打开HNRNPC（灰色）结合位点的热力学消耗。因此，不能确保经过一个或多个核苷酸修饰后的mRNA仍可以保留相同的结合位点或其他功能元件的结构以及功能。即使保持整体结构，单个碱基上的其他化学基团也会促进或干扰蛋白质结合。然而，目前修饰核苷酸对mRNA结构和功能的影响仅依靠经验和测试验证，而推导参数的光熔化实验昂贵耗时。这一问题下，需要进一步确定和细化所需修饰的最接近参数，继而结合算法计算推导。现有算法尚未纳入足够样本以解释修饰核苷酸对mRNA结构的影响。图1. 修饰核苷酸对mRNA结构的影响5′UTR设计调节翻译起始大多数真核生物mRNA的翻译起始是按照线性进行的。转录前起始复合物（PIC）与m7G-5′ppp5′-N帽结合并沿5′端至3′端寻找翻译起始点位（通常是第一个AUG）以启动翻译。任何给定mRNA的总翻译起始率皆需要考虑5′UTR扫描效率、起始密码子识别效率、帽近端PIC和亚基的募集。因此，非结构化5′UTR通常有利于更高的翻译起始率，而紧邻帽的茎环或G-四链体结构则会抑制翻译起始（图2a）。一项大规模平行基因测定测试了~280,000个长度为~50nt的5′UTR，报告发现核糖体负荷随着UTR的结构化程度降低而增加，特别是对于富含U（>40%）的UTR。这项研究支持紧邻帽的结构元件抑制哺乳动物细胞中初始PIC募集的观点。因此，最简化结构的5′UTR可能是最大限度地提高启动率的策略。图2. 5′UTR影响mRNA翻译效率然而有报道指出，快速启动的5′UTR也会相应增加翻译依赖性mRNA的衰变速率，对总蛋白质表达量产生不利影响，需要调节核糖体负荷或设计适当强度和位置的茎环平衡翻译起始率。因此，可以设计一种mRNA，根据特定代谢物或小分子的浓度变化调控翻译起始。例如，铁响应元件（IRE）是铁调节蛋白1（IRP1）的结合位点，通过响应铁水平调控PIC组装和翻译（图2c）。另一种思路是利用不同细胞类型中内源性翻译因子的丰度差异实现细胞状态依赖性蛋白表达。翻译起始因子eIF4F的过表达是癌症的一个重要指标。研究发现，增加eIF4A1活性可增加具有长且高度结构化的5′UTR以及含有G四链体序列的致癌mRNA的翻译。基于上述研究，5′UTR的序列和结构设计也是调控mRNA翻译效率和蛋白质表达量的重要考虑因素。防止扫描遗漏为了优化表达特定蛋白质的mRNA序列，大多数商业使用的算法旨在同时优化人类密码子并最大限度地提高序列GC含量，同时避免DNA合成和质粒组装中产生问题基序。然而，越来越多的数据表明，这种简单的方法可能需要在设计时额外考虑起始密码子识别和整体编码序列（CDS）结构。未能识别第一个翻译起始密码子AUG可能会导致使用下游起始位点，这种扫描遗漏（leaky scanning）在内源性mRNA中普遍存在。因此在治疗性mRNA的设计中也需要尽量避免这一现象。研究发现，PIC识别特定起始密码子的效率取决于其序列和结构。其中Kozak序列最有可能通过稳定起始密码子和起始复合物的相互作用来帮助减少遗漏扫描。此外，起始密码子下游区域的结构也可以促进识别，从而增加所需蛋白质的表达。在编码PTEN的mRNA中，存在具有差异定位和功能的较长蛋白质亚型，称为 PTENβ，通过在AUG原起始点位前400个核苷酸位置的非常规AUU起始产生。这一翻译起始因Kozak序列在+18点位存在12nt长度的发夹序列而发生。因此，也需要关注起始密码子下游二级结构对全局翻译起始的主导地位。编码序列（CDS）设计除了起始密码子下游的区域外，CDS其余部分的二级结构也会显着影响总蛋白产量。例如，哺乳动物多外显子基因的第一个外显子往往比后续的外显子具有更高的GC含量，更具结构性，并且CDS 5′末端的较高GC含量与基因表达呈正相关。直观来看，CDS结构最小化似乎应该促进核糖体延伸以及更快速的转运，从而最大限度地提高蛋白质产量。二级结构探测表明，内源性转录本的CDS较UTR结构化程度更小。然而，越来越多的研究表明，高度结构化的CDS二级结构可以显著增加外源性mRNA的功能蛋白表达。虽然需要在起始密码子的上游和下游区域最小化二级结构，但在其余区域，蛋白质输出和CDS结构之间存在很强的正相关关系。这种正相关关系主要是由CDS结构和mRNA功能半衰期之间的强正相关关系驱动的。更高度的外源性mRNA结构通常会导致mRNA疫苗的蛋白质表达更高或抗体滴度更高。研究表明，高度的CDS二级结构有助于共定位5'和3'末端，从而有助于转录前起始复合物和重新启动复合物识别。通过减慢PIC扫描速度，AUG相邻结构增加了PIC在预期起始密码子上的驻留时间，从而增加了其识别概率。有趣的是，多核糖体分析数据表明，与半衰期较短、结构较简单的mRNA相比，具有更多结构化CDS区域和更长半衰期的mRNA的总核糖体占有率通常较低。核糖体-核糖体之间长时间的相互作用容易导致mRNA发生不进行衰变（no-go decay）。因此，需要在维持CDS高度结构的同时降低翻译起始速率，将核糖体延伸间隔开，防止核糖体碰撞导致的翻译效率降低和mRNA衰变。研究表明，这种“暂停”式的调控方式可以促进复杂多结构域蛋白质的正确折叠和组装，从而增加活性蛋白质分子的比例。为了优化治疗性mRNA设计，理想情况下应该测量蛋白质活性，而不仅仅是总蛋白质产量。3′UTR设计调节翻译和稳定性长RNA的一个内在特征是分子内碱基配对自然地将5'和3'末端并列，这种功能性mRNA“环化”有助于解释poly（A）结合蛋白（PABP）如何通过与eIF4F的相互作用刺激翻译起始。有研究报道，在poly（A）尾部上游插入一个长非结构化区域可能通过减少PABP和eIF4F相互作用减少无细胞系统中的翻译起始。茎环结合蛋白（SLBP）同样可以促进翻译启动，例如，可通过结合非多聚腺苷酸化组蛋白mRNA的3'末端16nt发夹茎环协调组蛋白翻译和DNA合成。在S期起始，发夹结合的SLBP与起始因子相互作用以促进组蛋白翻译，一旦DNA合成完成并且不再需要组蛋白，茎环-SLBP复合物就会与UPF1相互作用以启动组蛋白mRNA降解。目前CureVac的多种mRNA疫苗设计中均引入了3'末端的组蛋白茎环，尚不清楚这类疫苗是否会在经历S期的细胞中优先翻译。一些正链RNA病毒缺乏5′帽和poly（A）尾，依赖于结构化的3′UTR帽非依赖性翻译元件（3′-CITE）该元件包含eIF4G或eIF4E的高亲和力结合位点，以及与5′UTR发夹形成桥接复合物的短序列。这种3′UTR–5′UTR相互作用将eIF4F定位在mRNA的起点附近，从而允许PIC募集和5′UTR扫描。因此，将这种3′-CITE掺入治疗性mRNA中可以消除对5′-帽的需要。在某些情况下，病毒3′UTR结构也会延缓mRNA降解。在乙肝病毒中，一种称为转录后调节元件（PRE）的~20至23 nt的结构元件被证明可以通过poly（A）尾部延伸来增加mRNA半衰期。相关报道称，TENT5酶促进的poly（A）尾部延伸有助于抗原蛋白表达并提高了mRNA-1273产生的免疫反应强度。末端修饰、环化或自复制延长半衰期最近的一项研究受到细菌无帽mRNA的启发，这些mRNA天然含有末端茎环以保护它们免受核酸外切酶降解。结果表明，哺乳动物mRNA两端的茎环可以提供比传统帽结构和poly（A）尾mRNA更高的蛋白质表达量。由于哺乳动物翻译通常依赖于5′-cap识别，因此缺乏帽结构的mRNA需要另一种翻译起始方式，例如IRES。IRESs首次在小核糖核酸病毒中发现，其结构复杂性和对内源性起始因子的依赖性各不相同。简单结构的IRES仅绕过帽识别步骤，而结构最复杂的IRES甚至绕过AUG识别，并依赖于与大核糖体亚基和小核糖体亚基的密切直接相互作用。然而将任何与上下游序列无关的元件应用于治疗性mRNA将涉及全局影响，包含修饰核苷酸带来的不可避免的结构变化。例如，CVB3 IRES中的m1Ψ就取消了其启动翻译的能力。对于circRNA来说，引入修饰核苷酸的问题十分复杂，可能对需要大规模筛选工作进行前期投资，并以此优化算法工具。自复制mRNA（saRNA）由特定的病毒RNA依赖性RNA聚合酶作用进行扩增，又需要由核糖体翻译，因此saRNA构建体的优化比非复制mRNA的优化要复杂得多，需要考虑与其他循环病毒重组的可能性。展望如何平衡这篇文章中所讨论的多种设计考虑因素仍然是一个巨大的挑战，即使是目前最前沿的mRNA设计方法也存在局限性，表明我们尚未完全了解影响治疗性mRNA性能的所有参数。在mRNA药物开发的实践中，我们逐渐发现，旨在最大限度提高蛋白表达的mRNA并不总是能产生最高的抗体滴度。同样，经由同一算法优化的具有相同特征的不同mRNA序列，也可能在整体蛋白质表达量上有很大差异。此外，细胞内tRNA丰度和转录后调控也因细胞类型和细胞状态而异。因此，在新可及的细胞类型中最大限度地提高效力可能需要更多定制的设计策略。mRNA序列和结构如何影响最后产品的可制造性和稳定性也是需要进一步考虑的因素。鉴于各种mRNA特性（如 GC 含量、密码子使用偏差和mRNA结构）之间的复杂关系，在应用机器学习方法开发mRNA预测和生成模型仍有巨大的未开发潜力。Moderna已着眼于改进计算机模拟算法预测引入修饰核苷后的mRNA折叠和结构变化，同时包括组织和细胞类型特异性tRNA丰度，mRNA衰变因子的综合数据集，再加上高通量筛选和机器学习的应用，最终将有望实现完全合理的mRNA治疗设计。参考资料：https://www.nature.com/articles/s41573-023-00827-x#Abs1识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

MeiraGTx’s gene therapy was able to rescue movement function or prevent motor neuron loss in several rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. New data from mouse and rat studies show that MeiraGTx’s gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis, or ALS, can repair a key cell-killing process that’s common in both genetic and sporadic forms of the disease. In a presentation Oct. 27 at the European Society of Cell and Gene Therapy conference in Brussels, the company showed that a single treatment with its gene therapy AAV-UPF1 prevented the loss of motor neurons in mouse and rat models with genetic and cellular defects seen in ALS, thereby improving clinical symptoms. The type of defect the treatment corrects is present in the vast majority of ALS patients, suggesting it could have wide-ranging benefit if validated in future studies. ALS is a progressive neurodegenerative disease where multiple aberrant cell processes destroy motor neurons. It’s more common in men than in women, though the gap closes with age, and comes in two forms: familial and sporadic. The familial form, or fALS, accounts for about 5% to 10% of cases, while the rest of patients have no obvious family history. Both types typically arise in people's late 40s through early 60s, with fALS starting slightly earlier. Though the timeline varies, patients usually progress from subtle muscle weakness to paralysis, respiratory failure and death within two to 10 years after the disease begins. There is currently no cure for ALS. Seven drugs have been approved by the FDA to treat the disease, including a new antisense oligonucleotide drug from Biogen and Ionis called tofersen, sold as Qalsody. The therapy targets a mutation in the gene SOD1, which affects about 10% to 20% of inherited or fALS patients. The SOD1 mutation leads to protein misfolding and aggregation within motor neurons, ultimately killing them. MeiraGTx’s new therapy also impacts the pathways that lead to protein misfolding and aggregation in motor neurons, but not the type that’s caused by SOD1. Instead, it targets a different cytotoxic, or cell damaging, process where a motor neuron protein called TAR DNA-binding protein 43, or TDP-43, incorrectly moves from the nucleus to the cytoplasm and builds up. While the TDP-43 pathology isn’t found in patients who have the SOD1 mutation, it is present in those who have the most common form of fALS, which is linked with the gene C9ORF72. It’s also found in nearly all patients with sporadic ALS, bringing its prevalence to more than 95% of ALS patients overall. To counteract TDP-43’s effects, MeiraGTx’s gene therapy increases the expression of the gene UPF1, which is important to RNA metabolism and several pathways that are dysregulated in ALS. Activating UPF1 seems to ameliorate the effects of TDP-43, along with other pathways leading to ALS pathology. The new data come from experiments in four models: one neonate and one adult model with reflex impairments induced by TDP-43 toxicity; a mouse model with a mutation in the C9ORF72 gene; and a mouse model with a mutation in the gene FUS, which is primarily associated with fALS but is also seen in some patients with sporadic disease. For the studies in the neonate rats with the induced TDP-43 dysfunction, the researchers measured whether AAV-UPF1 prevented them from developing forelimb impairment. Over the course of 12 weeks, forelimb function remained intact in all seven of the treated rats, while around 75% of the seven untreated rats showed impairments by Week 4. In the adult rats with induced TDP-43 dysfunction, the researchers looked at how well the treatment reduced the degree of impairments in hindlimb reflexes. While the untreated rats’ reflexes degraded to 25% of normal by Week 6 of the study—and fell further as the study progressed—the treated rats’ reflexes degraded to only about 75% of normal, even by Week 24. For the mice with genetic disease, the researchers measured whether the treatment could protect against motor neuron loss. In the FUS model, treated mice had nearly the same amount of motor neurons as controls, while the untreated mice exhibited motor neuron loss. The same was true for mice in the C9ORF72 model: The treated animals were protected from cell loss, while those that didn’t receive the treatment were not. In addition to the rodent studies, the MeiraGTx team presented data on AAV-hUPF1, a version of AAV-UPF1 that had been made smaller and more potent to optimize it for the clinic. They showed that it improved survival in human neurons derived from induced pluripotent stem cells with mutations in the TDP43 or C9ORF72 genes and rescued motor neuron loss in mice with the FUS gene mutation. Finally, the researchers also presented data on a new capsid, AAV2-retro, to deliver the ALS gene therapy as well as other neuronal indications. It was able to transduce the therapy in the brains and spinal cords of primates and also showed an effect in ALS patient-derived neurons harboring different disease-causing mutations.   MeiraGTx is continuing to optimize the vector for the clinic and plans to start studies for an investigational new drug application in 2024, presentation documents said.

胰腺癌是世界范围内常见的胃肠道恶性肿瘤，具有诊断晚、预后差、死亡率高等特点。胰腺癌目前是癌症相关死亡的第四大原因，5年存活率仅约为10%。胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见的一种。 胰腺癌是世界范围内常见的胃肠道恶性肿瘤，具有诊断晚、预后差、死亡率高等特点。胰腺癌目前是癌症相关死亡的第四大原因，5年存活率仅约为10%。胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见的一种。吉西他滨是治疗胰腺癌的一线化疗药物，吉西他滨辅助化疗可显著延长胰腺癌患者的总生存期和无瘤生存期。 然而，恶性肿瘤细胞对吉西他滨(GEM)的耐药性显著影响其治疗效果。肿瘤干细胞是导致胰腺癌化疗耐药的重要因素。肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，与肿瘤的耐药、复发和转移密切相关。然而，肿瘤干细胞(CSCs)影响胰腺癌进展和耐药的机制仍然不清楚，还需要进一步的研究。 图片来源: https://doi.org/10.1186/s12943-022-01647-0 近日，来自天津医科大学肿瘤研究所的研究人员在Molecular Cancer杂志上发表了题为“The  m6A demethylase ALKBH5-mediated upregulation of DDIT4-AS1 maintains pancreatic cancer stemness and suppresses chemosensitivity by activating the mTOR pathway”的文章，该研究揭示了ALKBH5介导的m6A修饰导致DDIT4-AS1在胰腺导管腺癌（PDAC）中过表达，DDIT-AS1通过破坏DDIT4的稳定性和激活mTOR通路而增加肿瘤的干性并抑制对GEM的化疗敏感性。靶向DDIT4-AS1及其通路可能是治疗PDAC化疗耐药的有效策略。 化疗耐药是导致胰腺癌患者预后不良的主要因素，而肿瘤干细胞是与化疗耐药相关的最关键的因素之一，也是肿瘤治疗的一个非常有前途的方向。然而，肿瘤干性的确切分子机制尚未完全阐明。 用M6A-RNA免疫沉淀和测序筛选M6A相关的mRNAs和lncRNAs。采用QRT-PCR和FISH技术分析DDIT4-AS1基因的表达。用球体形成法、集落形成法、Western印迹法和流式细胞术分析PDAC细胞的肿瘤干细胞性和化疗敏感性。通过异种移植实验，分析成瘤率和体内生长情况。 通过RNA测序、Western印迹和生物信息学分析确定了DDIT4-AS1的下游途径。IP、RIP和RNA下拉实验检测DDIT4-AS1、DDIT4和UPF1之间的相互作用。建立患者来源的异种移植(PDX)小鼠模型以评估GEM的化疗敏感性。 DDIT4-AS1被确定为ALKBH5的下游靶标之一，而Hur在m6A修饰的位点上的募集对于DDIT4-AS1的稳定是必不可少的。DDIT4-AS1在PDAC中表达上调，且与预后不良呈正相关。DDIT4-AS1沉默抑制了茎的生长，并增强了对吉西他滨的敏感性。 机制上，DDIT4-AS1通过阻止SMG5和PP2A与UPF1的结合而促进UPF1的磷酸化，从而降低DDIT4 mRNA的稳定性，激活mTOR通路。此外，在PDX衍生模型中抑制DDIT4-AS1增强了GEM对PDAC的抗肿瘤作用。 机制总结示意图 图片来源: https://doi.org/10.1186/s12943-022-01647-0 总之，在PDAC细胞中，DDIT4-AS1被扩增、过表达并被ALKBH5和HUR稳定。DDIT4-AS1是一种癌基因，可显著促进PDAC的茎化并抑制对GEM的化疗敏感性。DDIT4-AS1与UPF1在物理上相互作用，覆盖SMG5和PP2A的结合部位，促进UPF1的磷酸化、DDIT4 mRNA的降解和mTOR途径的激活。 在以PDX为基础的模型中，DDIT4-AS1 shRNA与GEM联合治疗显著增加了PDAC的抗肿瘤活性。DDIT4AS1的发现为PDAC癌症的发生提供了洞察力，并可能促进癌症筛查和治疗的精确方法的开发。（生物谷 Bioon.com） 参考文献 Yi Zhang et al. The m6A demethylase ALKBH5-mediated upregulation of DDIT4-AS1 maintains pancreatic cancer stemness and suppresses chemosensitivity by activating the mTOR pathway. Mol Cancer. 2022 Sep 2;21(1):174. doi: 10.1186/s12943-022-01647-0.