CD8 x TNF-α x IFNγ

调节性 T 细胞（Tregs）的 30 个标记物在其识别、功能、分化成熟、抑制活性以及在多种疾病中的作用等方面都具有重要意义。FoxP3作为 Treg 谱系最关键的标记，是一种转录因子，对 Tregs 的分化、成熟及获得抑制功能起着核心作用。其基因发生突变会引发 IPEX 综合征，导致多器官自身免疫疾病。FoxP3 有多种异构体，全长变体（FL）的 Tregs 表现出更高的抑制活性和增殖率。Helios属于 Ikaros 基因转录因子家族，多数人和小鼠的 Tregs 会表达。虽其在人类 Treg 稳定性和功能的确切作用尚未完全明确，但可作为 Tregs 稳定性和纯度的监测标记，还可能与细胞激活和增殖相关。CD25即 IL-2 受体的 α 链，高表达是常规 Tregs 的显著特征之一。在 T 细胞增殖、激活诱导的细胞死亡以及 Tregs 和效应（Teff）T 细胞的功能中发挥重要作用，FoxP3 + Tregs 中 CD25 水平最高的亚群具有最强的免疫抑制活性。CD127是 IL-7 受体的 α 链，在 T 细胞的动态调节、淋巴细胞分化和细胞免疫方面有重要影响。稳态时，Tregs 表达低水平的 CD127，激活时其表达显著上调，可辅助更精准地识别 Tregs。CD39作为一种外切酶，在调节嘌呤能信号传递给免疫细胞的持续时间、强度和化学性质方面发挥关键作用。其在 Tregs 上的表达存在个体差异，在炎症部位表达较高。CD39 + Tregs 被认为具有高活性、强抑制性，能分泌 IL-10，且高表达 CD39 可维持更高水平的 FoxP3 表达。CTLA-4属于 CD28 免疫球蛋白超家族的抑制性受体，对 Treg 细胞功能至关重要。它调节 T 细胞的共刺激，持续表达，在免疫抑制活动期间高度表达，可定义具有强抑制活性的 Tregs。CTLA-4 通过与树突状细胞表面的共刺激分子 CD80/86 结合，阻止其与效应 T 细胞上的 CD28 相互作用，从而抑制 T 细胞激活，还能诱导树突状细胞表达吲哚胺 2,3 - 双加氧酶（IDO），调节免疫反应。GITR是 TNF 受体超家族成员，通过提供共刺激信号来调节免疫反应，影响 T 细胞的激活、分化、存活和记忆形成以及巨噬细胞极化。然而，其在 Tregs 中的作用存在争议，既能导致 Tregs 不稳定、细胞耗竭和抑制功能下降，又能诱导 Tregs 在体外增殖和扩增。TIGIT是具有免疫球蛋白和 ITIM 结构域的 T 细胞免疫受体，为跨膜糖蛋白受体。在 Tregs 激活后高表达，TIGIT + Tregs 相比 TIGIT - Tregs 具有更强的抑制作用，能特异性抑制促炎的 Th1 和 Th17 细胞反应，但不影响 Th2 细胞反应。此外，TIGIT 表达与 Treg 效应分子表达增加相关，如颗粒酶 B、IL-10 和纤维蛋白原样蛋白 2（Fg12）。CD120b（TNFR2）具有抗炎活性，对少突胶质细胞、心肌细胞和角质形成细胞有保护作用，通过影响不同类型免疫细胞来实现免疫抑制功能。在激活的 Tregs 上高度且持续表达，TNF-α 与 TNFR2 的相互作用对 Tregs 的激活、扩增和表型稳定至关重要，还能维持 FoxP3 启动子的去甲基化，支持 Tregs 的分化和稳定。LAP即潜伏期相关肽，是转化生长因子 -β（TGF-β）前体的氨基末端结构域，与 TGF-β 形成潜伏复合物，调节单核细胞募集。LAP + Tregs 在 Treg 特异性去甲基化区域（TSDR）高度去甲基化，在体内外均具有抑制作用。CCR6属于 C-C 趋化因子受体蛋白，在协调免疫细胞向炎症部位迁移、维持免疫稳态和免疫系统完整性平衡方面具有关键作用。在多种炎症性疾病中，CCR6 + Tregs 的比例较高。CD223（LAG-3）是一种免疫检查点受体蛋白，可抑制细胞增殖、免疫功能、细胞因子分泌和维持免疫稳态。在 Tregs 上持续表达，通过抑制促进 Tregs 在炎症部位维持的信号通路来限制其增殖和功能，但也能刺激 Treg 介导的抑制作用，还可与 CTLA-4 和 PD-1 协同增强 Tregs 的抑制活性。GARP（LRRC32）作为潜伏 TGF-β 的膜受体，调节膜结合潜伏 TGF-β 的可用性并调节其在 Tregs 和血小板上的激活。在激活的 Tregs 表面表达，是具有高抑制活性的人类 Tregs 的特异性标记。然而，GARP 与 FoxP3 的表达关系存在争议，有研究表明二者相互依赖，也有研究显示它们并非相互调节。GPA33是一种细胞表面抗原，与免疫失调相关。高表达 GPA33 可定义 CD4 + CD25 + CD127 – FoxP3 + Helios + Tregs，这类 Tregs 无法产生常规 T（Tconv）细胞效应细胞因子。CD137CD137 是 TNFR 家族的共刺激受体，可促进自然杀伤（NK）细胞增殖和细胞因子分泌。CD137 + CD154 −是抗原激活的 FoxP3 + Tregs 的标记，具有高效抑制效应 T（Teff）细胞增殖的能力，具体作用取决于免疫反应类型。Nrp-1即神经毡蛋白 - 1，参与轴突导向和血管生成。在小鼠 Tregs 中富集，在人类中表达较低。在诱导 Tregs（iTregs）表面表达 Nrp-1 可识别和分离出在炎症条件下具有卓越抑制功能的 iTreg 亚群，且在周围淋巴器官中的表达高于胸腺 Tregs。FR4是叶酸结合蛋白的异构体，在小鼠中表达，与人类 FR-δ 高度同源。FR4 过表达可增强 Tregs 在体外的增殖能力，在天然和外周 Tregs 中均有表达。CD103属于整合素 αE，通过与 E-cadherin 相互作用介导细胞粘附、迁移和淋巴细胞归巢。CD103 + Tregs 在炎症部位积累的能力增强，参与皮肤局部 Treg 功能，与 FoxP3 的高表达相关，可能增强 TGF-β 依赖的 FoxP3 表达。CD44作为细胞表面的透明质酸受体，参与细胞的运动、存活和粘附等多种过程。其配体高分子量透明质酸（HMW-HA）可促进 Treg 介导的抑制作用，且与 HMW-HA 共刺激可促进 FoxP3 的表达。CD62L即白细胞粘附分子 L - 选择素，是一种跨膜凝集素受体，可调节幼稚和中枢记忆 T 细胞进入淋巴结以及激活的 CD8 + T 细胞向病毒感染部位的迁移，使 Tregs 归巢到次级淋巴器官。CCR7参与将树突状细胞和 T 细胞定位到淋巴结，在诱导外周免疫耐受方面有重要作用，可使 Tregs 归巢到次级淋巴器官。nTregs 高表达 CCR7，而中央记忆 Tregs（cmTregs）和效应记忆 Tregs（emTregs）下调其表达。CD31（PECAM-1）是高度糖基化的 Ig 样膜受体，在免疫和血管系统中均具有粘附和信号传导功能，是 Treg 分化的标记。ICOS属于 CD28 超家族的同源二聚体蛋白，参与 Tregs 的产生、增殖和存活。在癌症中，Tregs 高表达 ICOS，其与 ICOSL 的信号通路对 Treg 介导的自身耐受至关重要。此外，一小部分 ICOS + Tregs 在正常人和小鼠的外周血中可产生 IFN-γ 和 IL-17。Gal-1即半乳糖凝集素 - 1，参与细胞生长、迁移、炎症、血管生成等多种过程，在肿瘤进展、免疫逃逸和免疫耐受中发挥作用。其对 Treg 细胞的作用具有环境依赖性，阻断 Gal-1 会显著削弱 Tregs 的抑制作用。PD-1（CD279）属于 I 型跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族成员。PD-1 可调节 Treg 的生成及其免疫抑制特性，在癌症中，其阻断对 Tregs 的影响存在争议，既可能降低 Treg 介导的抑制作用，也可能增强 Treg 功能；在自身免疫疾病中，PD-1 在 Tregs 上的表达与疾病相关，如在系统性红斑狼疮中，PD-1 + 滤泡调节性 T 细胞功能受损。CCR7参与免疫细胞向淋巴结的定位和外周免疫耐受的诱导，对 Tregs 归巢到次级淋巴器官具有重要意义，其表达水平在 Tregs 的不同分化阶段有所变化。Granzyme B（GZMB）在结直肠癌中，表达升高，介导肿瘤免疫，参与 Tregs 对肿瘤细胞的抑制作用，是评估肿瘤免疫状态的重要指标之一。TIM-3在多种癌症（如结肠癌、黑色素瘤）中标记肿瘤内 Tregs，其表达与 Tregs 的抑制功能增强和肿瘤生长促进相关；在类风湿关节炎中，TIM-3 表达降低与 Tregs 功能活性下降有关；在移植物抗宿主病（GvHD）中，TIM-3 表达升高与 Tregs 功能活性增加相关。LAG-3 在结直肠癌中，LAG-3 + TIM-3 Tregs 表达更高水平的 TGF-β、IL-10 和 CTLA-4，具有更强的抑制功能，参与肿瘤免疫逃逸和疾病进展的调节。 CD45RA/RO属于受体蛋白酪氨酸磷酸酶，在 T 细胞受体信号起始中发挥作用，是 Tregs 分化状态的标记。初始 Tregs（nTregs）表达 CD45RA，记忆 Tregs 通常表达 CD45RO。参考资料Gootjes, C.; Zwaginga, J.J.; Roep, B.O.; Nikolic, T. Defining HumanRegulatory T Cells beyond FOXP3: The Need to Combine Phenotype with Function. Cells 2024, 13, 941. https://doi.org/10.3390/ cells1311094Santosh Nirmala S, Kayani K, Gliwin ´ski M, Hu Y, Iwaszkiewicz-Grzes ´ D, Piotrowska-Mieczkowska M, Sakowska J, Tomaszewicz M, Marı ´n Morales JM, Lakshmi K, Marek-Trzonkowska NM, Trzonkowski P, Oo YH and Fuchs A (2024) Beyond FOXP3: a 20-year journey unravelling human regulatory T-cell heterogeneity. Front. Immunol. 14:1321228. doi: 10.3389/fimmu.2023.1321228Sayitoglu EC, Freeborn RA and Roncarolo MG (2021) The Yin and Yang of Type 1 Regulatory T Cells: From Discovery to Clinical Application. Front. Immunol. 12:693105. doi: 10.3389/fimmu.2021.693105

许多患者在CAR T细胞治疗后复发，原因是癌细胞表达的相关抗原低于CAR T细胞有效反应所需的阈值，即使同时靶向不同抗原的CAR T细胞试验也出现了类似的复发情况，如靶向CD19和CD22。需要开发更有效的CAR T细胞疗法，以提高对抗原低表达细胞的敏感性和持久性。3月10日，科罗拉多大学在《Cancer Cell》期刊上发表了一篇文章，研究开发了一种新的ALA-CAR-T，通过恢复LAT活性，增强了CAR-T细胞的抗原敏感性、疗效和持久性，从而克服了CAR-T细胞治疗后复发的多种机制。在体外和体内均表现出更强的细胞毒性、增殖能力和抗肿瘤活性，有望改善CAR-T细胞疗法的长期疗效，并拓展其在实体肿瘤等领域的应用。CD22抗原低表达的癌细胞通过削弱CAR T细胞远端信号传导逃避免疫攻击。尽管CD22BBz CAR T细胞对CD22-low（22Low）和野生型（WT）NALM6细胞的体外杀伤能力无显著差异，但在小鼠模型中无法有效控制22Low-NALM6的生长，与T细胞体内扩增能力显著下降相关。蛋白质组学分析显示，22Low-NALM6刺激导致CAR T细胞中与细胞骨架重组（如ACTN1、TLN1）和MAPK信号通路（如MAPK1、MAPK3）相关的磷酸化位点显著减少。这种信号抑制可能源于CAR受体在低抗原密度下无法有效聚集，导致T细胞免疫突触形成障碍，进而影响远端信号传导的持续性和强度，最终削弱CAR T细胞的体内持久性和抗白血病活性。低抗原刺激导致CAR T细胞中ERK/MAPK信号通路激活不足。与野生型NALM6刺激相比，CD22-low NALM6（22Low-NALM6）刺激的CAR-Jurkat细胞中磷酸化ERK（pERK）水平显著降低，这一现象在健康供体来源的CD4+和CD8+ CAR T细胞中一致出现。低抗原刺激通过抑制LAT磷酸化阻断下游信号传导。近端信号分析显示，ZAP70激活位点Y319的磷酸化仅轻微下降，可能与CAR的scFv结构域自二聚化引发的抗原非依赖性激活有关。健康供体来源的CAR T细胞在低抗原刺激下同样表现为LAT-Y226和PLCγ-Y783磷酸化减弱，但ZAP70-Y319磷酸化无显著变化。双靶向ALA-CART平台通过强制激活LAT信号逆转低抗原刺激下的功能缺陷。设计了双顺反子载体22x19ALA-CART，共表达CD22BBz CAR和含LAT胞内域的CD19靶向辅助CAR。该设计使22x19ALA-CART在受到WT或22Low-NALM6刺激时，LAT-CAR的磷酸化水平显著高于传统CD22BBz CAR，进而增强下游PLCγ的磷酸化，通过补偿LAT信号缺陷克服了抗原密度限制。ALA-CART在体内完全清除CD22-low白血病并依赖CD4+ T细胞扩增。在NSG小鼠模型中，传统CD22BBz CAR T细胞对22Low-NALM6的控制效果有限，而22x19ALA-CART实现白血病完全清除并显著延长生存期。进一步分析显示，22x19ALA-CART的疗效与骨髓中CD4+ T细胞在第7天和第15天的显著扩增相关。双CAR结构在ALA-CART平台中独立且叠加发挥抗白血病作用。当靶细胞仅表达CD22（CD22+）或CD19（CD19+）时，22x19ALA-CART分别通过CD22BBz CAR或19LAT-CAR单独激活即可有效杀伤，且两种CAR独立激活时均能诱导IL-2和IFNγ分泌。在低剂量治疗实验中，22x19ALA-CART不仅完全清除野生型NALM6，还能根除仅表达CD22或CD19的白血病细胞，表明两种CAR独立激活即可实现治疗效果，且未观察到CAR激活模式对T细胞持久性的影响。CD22靶向ALA-CART通过优化scFv组合与信号强化实现低抗原白血病清除。将ALA-CART平台改造为单一靶向CD22的22ALA-CART，其体外杀伤能力显著增强，并在小鼠模型中完全清除22Low-NALM6，而传统CD22BBz CAR T细胞治疗组白血病持续进展。进一步验证显示，仅完整包含LAT信号域的22ALA-CART能清除低抗原白血病，而高亲和力CD22BBz或缺失LAT域的22Null CAR均无效。ALA-CART平台具有广谱抗原适用性并显著提升低抗原阈值下的疗效。在患者来源的B-ALL异种移植模型（PDX）中，当CD22密度低于1,500分子/细胞时，传统CD22BBz CAR T细胞治疗组外周血仍可检测到白血病细胞，而22ALA-CART实现完全清除，且脾脏肿瘤负荷显著降低。此外，研究扩展至CD19靶向的19ALA-CART，其对CD19-low NALM6的体外杀伤能力增强，并在体内显著延长小鼠生存期。这些结果表明，ALA-CART通过强制激活LAT信号，可在不依赖抗原密度的情况下提升CAR T细胞敏感性，为单靶点低抗原逃逸提供了通用解决方案。ALA-CART细胞增强的体内疗效未伴随毒性增加。在高负荷白血病小鼠模型中，22ALA-CART对野生型NALM6的清除速度显著快于传统CD22BBz CAR T细胞，但两组小鼠体重下降程度无显著差异。22ALA-CART组小鼠TNFα水平升高，而CD22BBz组IL-2水平较高，但与细胞因子释放综合征（CRS）密切相关的IL-6水平在两组间无显著差异。ALA-CART的体内扩增能力依赖于LAT-CAR，而效应功能由第二代CAR主导。通过拆分双CAR结构发现，单独表达22BBz-HA CAR的T细胞在应对22Low-NALM6时扩增能力显著受限，而LAT-CAR的共表达通过促进T干细胞记忆（TSCM）和中央记忆（TCM）表型的形成，显著提升ALA-CART的体内持久性。双CAR协同实现增殖与效应功能的平衡以应对抗原异质性。体外实验表明，22BBz-HA CAR单独可介导对WT-NALM6的杀伤，但对22Low-NALM6的清除需依赖LAT-CAR的协同作用。LAT-CAR通过增强T细胞增殖支持效应分子（如颗粒酶A/B）的分泌，而22BBz-HA CAR则负责直接触发细胞毒性功能。这种功能互补机制使ALA-CART在提升疗效的同时维持安全性，为克服抗原逃逸提供了动态调控策略。ALA-CART平台通过转录组重编程维持T细胞未分化状态。转录组显示，未受刺激的22ALA-CART细胞呈现初始T细胞特征，而传统CD22BBz CAR T细胞富集效应分化和干扰素应答通路。22ALA-CART中与长寿命T细胞相关的基因（如SELL、CD27、IL7RA）表达显著上调，表型分析证实其T干细胞记忆（TSCM）比例高达53%，远高于CD22BBz组的13.4%，同时效应记忆（TEM）和中央记忆（TCM）亚群比例显著降低。LAT-CAR在制造阶段抑制分化，但体内疗效需双CAR协同。体外重复刺激实验显示，22LAT-CAR单独可维持较低CD39表达和较高增殖能力，但其TOX和TCF1表达水平介于22ALA-CART与22BBz-HA之间。过表达野生型LAT（LAT-OE）虽能模拟22ALA-CART的TSCM优势表型和体外杀伤能力，却无法在体内清除CD22-low白血病。这表明，ALA-CART的体内疗效不仅依赖LAT-CAR对分化的抑制，还需第二代CAR在遭遇肿瘤时的主动信号协同。ALA-CART细胞通过维持中央记忆表型显著提升体内持久性。在清除野生型NALM6白血病的小鼠模型中，22ALA-CART的CD4+ T细胞在骨髓中持续存在长达35天，且中央记忆T细胞（TCM）比例显著高于传统CD22BBz CAR T细胞。双靶向22x19ALA-CART的CD4+亚群也富集TCM表型，且持久性与CD39低表达相关。LAT-CAR通过抑制终末分化维持T细胞持久性。拆分双CAR结构发现，单独表达22LAT-CAR或完整22ALA-CART的T细胞在清除白血病后持久性显著优于仅表达22BBz-HA CAR的T细胞，这与其更高的TSCM比例和更低的TEMRA分化相关。此外，22BBz-HA CAR持久性差的T细胞高表达耗竭标志物KLRG1，而LAT-CAR通过抑制效应分化程序，维持T细胞的长期存活能力。CD4+ ALA-CART亚群主导持久性与效应功能的平衡。无论抗原密度如何，CD4+ 22ALA-CART细胞在体内扩增优势显著，其TCM比例更高，IL7RA表达上调，并富集多功能性T细胞。CD4+细胞在低抗原刺激下虽减少细胞因子分泌，但其持续增殖能力和效应功能足以清除白血病，揭示了ALA-CART通过CD4+主导的持久性与CD8+效应功能的协同实现长期疾病控制。总之，这种新型ALA-CART通过恢复LAT活性，提高CAR T细胞对低抗原急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的敏感性和持久性，从而克服了传统CAR T细胞疗法在治疗抗原低表达癌症细胞时面临的挑战，这种新型的设计应该对实体瘤同样有效。推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

-01-引言目前，肿瘤免疫治疗已成为第三代肿瘤治疗中最活跃的研究领域。以PD-1、CTLA-4和PD-L1为靶点的免疫检查点抑制（ICI）疗法在多种癌症的治疗中显示出卓越的效果，并且ICI的免疫疗法随着新的免疫检查点的开发（如TIM-3、LAG-3和TIGIT）而继续扩大。然而，ICI治疗的主要目的是维持先前已建立的抗肿瘤活性。相比之下，刺激性免疫治疗靶点，如CD40、ICOS、CD27、GITR、OX40和4-1BB则用激动剂来激活免疫，主要集中在免疫反应的早期阶段。这些分子最先起作用的很可能是CD40，因为它在抗原呈递过程中起着关键作用，间接地激活T细胞。最新研究显示，CD40激动剂不仅可直接激活树突状细胞（DC）、B细胞等免疫“指挥官”，还能重塑肿瘤微环境（TME），甚至让“冷肿瘤”变得对免疫治疗敏感。CD40激动剂在癌症免疫治疗中正展现出巨大的潜力。-02-一、CD40/CD40L的表达为了获得强大而特异的免疫反应，固有免疫系统和适应性免疫系统需要在多个环节上进行协调。免疫反应的许多关键阶段是由肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的配体及其受体介导的，包括CD40/CD40L。抗原特异性T细胞的有效抗原识别关键取决于特异性抗原呈递细胞（APC）的存在和功能，如B细胞和DC细胞。这些APC通常在细胞表面表达共刺激表面受体CD40（TNFRSF5）。CD40是一种48kda大小的Ⅰ型跨膜蛋白，是连接固有免疫和适应性免疫的重要免疫细胞通讯介质。CD40存在于血小板、B细胞和髓系细胞，但也存在于非造血细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞甚至某些类型的肿瘤细胞。CD40的同源配体是CD154（TNFSF5/CD40L），一种39kda的II型跨膜蛋白。CD40L的表达通常可诱导并局限于造血系统的细胞，如血小板、粒细胞、活化T细胞、活化B细胞和活化自然杀伤细胞（NK）细胞，但内皮细胞和平滑肌细胞也有弱表达。-03- 二、CD40/CD40L的结构、组成及信号通路TNFRSF信号传导的结构已经比较明确，需要恰当的三维受体聚集和三聚体化。虽然TNFSF配体天然以三价功能单位存在，但受体通常分散分布在细胞表面。TNFSF配体以同源三聚体的形式自然地聚集在细胞表面，其中三个受体结合位点位于相邻单体之间的三个完全相同的缝隙处。关键的是，受体组装成功能性的三聚体复合物是通过天然配体单元的结合发生的。这些三聚体TNFSF配体与在其他细胞表面表达的相应受体的相互作用导致了非常精确的受体聚集。配体对细胞外受体的指令传递给邻近的受体细胞内结构域，然后是细胞内信号复合物的有序组装。TNFSF配体的三聚体结构和由此产生的受体簇是信号传递到细胞的前提。由于这种特殊的要求，一价和二价的结构在体内通常被证明是极低效的。与TNFRSF的其他成员一样，CD40是一种膜结合分子，可以通过细胞间直接接触被膜结合配体激活，也可以被溶液中的可溶性配体激活。多种下游分子和细胞反应进程已被证明受到CD40结合的调节。同源配体连接受体可诱导形成空间上明确的三聚体信号复合物，促进TNF受体相关因子（TRAFs）和NFκB激活剂-1（Act1）的招募。信号复合物的特定组成，主要取决于细胞类型，触发各种途径。例如，与TRAF6的结合主要激活JAK/Stat3通路，TRAF1/2诱导MKK/p38/ERK1/2信号传导，Act1在NFkB通路、JNK和PI3K信号传导中具有多种功能，并与TRAF3一起放大MKK/p38/ERK1/2信号。此外，根据特定的环境，CD40结合可以激活“经典”和非典型的NFkB通路。-04-三、CD40/CD40L的生物学作用CD40在单核细胞及其子代巨噬细胞和DC细胞以及B细胞上的表达在发挥免疫细胞的功能中起着重要作用。单核细胞是固有免疫前体细胞，具有很高的可塑性。它们具有分化为多种细胞类型的能力，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和DC细胞。CD40信号是单核细胞成熟过程的重要触发因素，主要驱动分化为M1谱系的巨噬细胞和DC细胞。CD40与DC细胞表面的结合促进了细胞因子和趋化因子的产生，诱导共刺激分子的表达，并促进抗原的交叉呈递。CD40L的主要功能之一是通过激活DC细胞来增强抗原对T细胞的提呈。这一步称为“许可”，通过上调表面蛋白如CD54和CD86，增加DC与T细胞的相互作用，从而激活后者。B细胞也是CD40L活性的靶点。在胸腺中，T细胞和B细胞之间广泛的串扰使之必须维持表达CD40的B细胞，从而保持自体反应性T细胞对B细胞的阴性选择。B细胞与CD4+T细胞的直接相互作用诱导T细胞表达CD40L，进而保护B细胞不受凋亡的影响。在这个功能中，CD40L通过激活PI3K/Akt提供一个生存信号，使活化的B细胞维持寿命并向浆细胞分化。抗原特异性B细胞通过CD40的稳态增殖和生存机制是通过抗凋亡成员Bcl-2家族的上调来维持的。事实上，CD40/CD40L系统的缺陷与B细胞的抗体类别转换以及细胞超突变的缺陷（hyper-IgM综合征）有关。B细胞与活化的表达CD40L的T细胞的相互作用也增加了MHC-II和CD80或CD86等共刺激分子的表达，并诱导B细胞中的Ig类别转换。活化的B细胞迁移到淋巴器官，在那里向T细胞呈递抗原，CD40激活的DC和B细胞通过释放免疫刺激性细胞因子和趋化因子如IL-6、IL-12p70、IFNγ、CXCL10和TNFα来支持免疫应答。此外，CD40活化的B细胞能够通过促进TNFα和IFNγ等细胞因子的分泌来诱导抗原特异性CD8+T细胞。一些研究证明，体外活化的表达CD40的B细胞是完全功能性抗原提呈的B细胞，随后用这些细胞进行过继细胞转移（ACT）治疗可提高抗肿瘤的疗效。-05-四、CD40/CD40L与肿瘤免疫数十年来，CD40/CD40L信号传导同步免疫反应的固有、细胞和体液分支的非凡能力激发了基础和临床研究的灵感。鉴于CD40的一般表达谱和生物学活性，人们已经做了许多尝试来探索CD40/CD40L信号在抗肿瘤免疫中的作用。CD40激活的DC细胞可用于癌症和传染性疾病（如结核病）的疫苗治疗。CD40信号的另一个有趣结果是表型从“另类活化”的M2型向抗肿瘤或“经典活化”的M1型的转变。这种M1/M2型的命名与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤免疫治疗中特别相关。所谓的M1型的“经典活化”巨噬细胞产生于对GM-CSF以及IFNγ和LPS等刺激物的反应，通常被认为具有促炎性免疫反应和抗原交叉呈递的作用。M1型巨噬细胞主要与良好的抗肿瘤免疫反应相关。“另类活化”的M2型巨噬细胞是由于暴露于M-CSF和细胞因子（如IL-4和IL-10）而产生的，并参与组织修复和消除炎症状态。肿瘤相关的M2型被认为是癌症进展和转移的关键驱动因素。肿瘤和浸润性巨噬细胞的紧密相互作用强烈地塑造了肿瘤微环境，从而建立了炎症或促肿瘤的局部条件。有人提出，改善肿瘤内M2/M1谱系的平衡可以通过促进细胞毒性T细胞的浸润和激活来提高抗肿瘤免疫反应。这一点已经在多个模型中进行了描述，例如胰腺癌和小鼠异种移植胶质母细胞瘤模型。巨噬细胞复极化与CD40活化诱导CD206下调和CD54表达增加一致，表明巨噬细胞迁移能力的改变和有效激活。有趣的是，尽管CD40在许多组织中广泛表达，肿瘤细胞似乎更易受膜结合CD40L诱导的CD40杀伤。在B16黑色素瘤小鼠模型中，DC细胞上表达的膜结合CD40L可直接诱导CD40阳性肿瘤细胞凋亡，而非T细胞依赖的的细胞生长抑制活性则源于CD40刺激的IFNγ激活的巨噬细胞。这一现象的部分原因可能不是CD40信号的直接作用，而是对易感细胞类型死亡受体的二次上调。然而，抗CD40抗体Lucatumumab和dacetuzumab对B细胞恶性肿瘤有一定的临床效果，这可能归因于抗体介导的巨噬细胞吞噬和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的作用。结合CD40后，肿瘤细胞显示出DNA损伤的迹象，分泌促血管生成因子，如VEGF和IL-8，并且通常表现出衰老相关分泌表型（SASP）的状态，这是由于CD40诱导的NFκB通路的激活。-06-五、CD40激动剂的药物开发现状基于其独特的受体聚集模式，从TNFRSF产生的下游信号依赖于具有非常精确的结构和三维组成的激动剂化合物。由于CD40在抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用，诱导CD40信号的各种策略已经被广泛地研究探索。大致可分为基于激动剂抗体的方法或基于CD40L的方法。目前，临床开发中有9种激动性人抗CD40抗体：4种IgG1抗体（APX005M、mitazalimab、2141-V11、SEA-CD40），2种IgG2抗体（selicrelumab和CDX-1140），1种IgG突变抗体（LVGN7409）和2种双特异性抗体（RO7300490、ABBV-428）。SelicrelumabSelicrelumab（也称为CP-870893，RO7009789）是一种完全人IgG2抗体，不依赖于通过Fc结构域交联来激活CD40。selicrelumab是临床试验中研究最广泛的CD40激动剂。最近，一项1期研究评估了selicrelumab在胰腺导管腺癌（PDAC）患者手术前使用或不使用化疗（nab-紫杉醇和吉西他滨）的新辅助治疗（NCT02588443）。接受selicrelumab单药治疗的患者的1年OS率（中位数+SE）分别为81.8%+11.8%，接受selicreumab联合化疗的患者为100%。Selicrelumab耐受性良好，相关不良事件（AE）大多较轻。此外，发现了selicrelumab诱导TME调节的证据，包括T细胞浸润、DC成熟、巨噬细胞复极化和肿瘤基质密度降低。CDX-1140CDX-140是一种人IgG2单克隆抗体，可驱动NF-kB激活。它结合CD40L结合位点之外的结构域，其激活机制独立于FcR交联。来自评估CDX-1140与抗PD-1治疗（pembrolizumab）联合使用或不使用的I期试验的数据显示，1.5 mg/kg CDX-1140联合200 mg pembrolizumab的剂量具有良好的安全性。观察到临床益处，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，有80%的可评估患者具有稳定疾病（SD），而所有患者在之前的基于抗PD-1/L1的治疗中都经历了进展性疾病（PD）（NCT03329950）。APX005MAPX005M是一种人源化IgG1单克隆CD40抗体。通过Fc结构域中的点突变，APX005M增强了与FcγRIIb的结合亲和力，促进了CD40的交联并介导了ADCC。多个早期临床试验评估了APX005M与免疫疗法的联合应用。一项II期研究评估了APX005M与化疗（nab-paclitaxel和吉西他滨）联合使用或不使用抗PD-1（nivolumab）治疗转移性胰腺癌患者的疗效。研究表明，APX005并没有显著改善OS：在105名患者中，nivo/化疗达到了1年总生存期（OS）的主要终点，但APX005M/化疗或APX005M/Cnivo/化学均未达到。然而，APX005M/化疗后的存活率与更显著的肿瘤内CD4+T细胞浸润、循环分化的CD4+T细胞和APCs相关（NCT03214250）。最近，在随后的一项II期研究中，研究了APX005M与纳武单抗联合治疗抗PD-1疾病进展后的转移性黑色素瘤患者。客观反应率（ORR）为15%，中位反应持续时间至少为26个月。MitazalimabMitazalimab（也称为ADC-1013和JNJ-64457107）是一种靶向CD40的人IgG1单克隆抗体。它被设计为以FcγR依赖的方式与CD40结合，具有高效力和亲和力，这有利于肿瘤内给药，以减少剂量和不良免疫相关事件。在一项针对晚期实体瘤患者的I期研究中，静脉注射0.075-2mg/kg的Mitazalimab显示出可控的安全性。 2141-V112141-V11是一种完全人IgG1 CD40抗体，是selicrelumab的Fc优化版本，其中人IgG1 Fc经过5位点突变改造，可增强Fc与FcγRIIB的结合。一项I期研究评估了2141-V11在皮肤转移的实体瘤患者中的作用，在局部和远处病变中显示出抗肿瘤活性的迹象（NCT04059588）。另一项I期研究调查了2141-V11单药治疗对标准治疗无效的非肌肉浸润性癌症（NMIBC）患者的安全性和剂量（NCT05126472）。局部膀胱内给药用于减轻全身毒性。此外，在复发性胶质母细胞瘤患者的I期研究中，通过增强递送（CED）将2141-V11与免疫毒素（D2C7-IT）联合用于肿瘤内给药是安全且有一定疗效的：在入组的5名患者中，一名0.70 mg剂量的患者和两名2.0 mg剂量的患者观察到肿瘤响应的早期迹象。SEA-CD40SEA-CD40是一种全人源的非岩藻糖基化IgG1单克隆CD40抗体。非岩藻糖基化抗体增强了与FcγRIIIa受体的结合，可能提高了激动疗效。一项首次人体I期试验评估了晚期实体瘤和淋巴瘤患者的静脉注射SEA-CD40单一疗法。然而，SEA-CD40的抗肿瘤作用很小，在基底细胞癌患者中有1.8%（1/56）的部分反应，在滤泡性淋巴瘤患者中有1.8%（1/56）的完全反应。另一项研究检查了SEA-CD40联合化疗（nab紫杉醇和吉西他滨）和pembrolizumab治疗转移性PDAC患者的疗效。在10μg/kg和30μg/kg的剂量组中，分别有48%和38%的患者观察到了客观响应。两个剂量组的中位反应持续时间均为5.7个月（NCT02376699）。LVGN7409LVGN7409是一种IgG突变重组单克隆CD40抗体，具有工程Fc片段，可选择性结合FcγRIIB。LVGN7409以FcγRIIB交联依赖的方式激活CD40，因此在富含CD40和FcγRIIB的TME中发挥最佳作用。目前，有两项LVGN7409的I期研究。LVGN7409的第一项人体I期研究是在有或没有抗PD-1抗体（LVGN3616）和/或CD137激动剂抗体（LVGD6051）的情况下评估LVGN7407。静脉注射LVGN7409单药治疗在2 mg/kg以下具有良好的耐受性（NCT04635995）。RO7300490RO7300490是一种针对CD40和成纤维细胞激活蛋白（FAP）的新型双特异性抗体，后者在肿瘤组织中经常过表达，在健康组织中表达较低。因此，RO7300490能够直接重塑TME，同时可能避免与全身CD40激活相关的毒性。目前，一项I期研究正在评估RO7300490在晚期实体瘤患者中使用或不使用atezolizumab的疗效（NCT04857138）。ABBV-428ABBV-428是另一种双特异性抗体，旨在通过与肿瘤抗原间皮素相互作用实现CD40的局部激活。第一项人体I期研究评估了ABBV-428在晚期实体瘤患者中使用或不使用纳武单抗的情况（NCT02955251）。根据接受ABBV-428单药治疗的患者的中期数据，36%的患者在推荐的II期剂量（3.6 mg/kg）下的最佳临床反应为SD。未观察到CD40激动剂的毒性。然而，ABBV-428产生的临床活性很小，这可以用肿瘤细胞上间皮素的低表达来解释，这将限制肿瘤的可及性和ABBV-428对CD40的交联。-07-结语增强抗肿瘤免疫应答的策略是肿瘤学最有希望的新进展之一，而TNFRSF成员，如CD40，是其中重要的靶点。由于产生高效TNF-R-SF信号的独特要求，激动剂分子必须产生非常精确的受体结构和三维结构。虽然已经探索了诱导CD40信号的各种策略，但是20年来有限的临床成功表明需要探索新的方法，这种信号通路激动剂的真正威力尚未在临床开发中充分释放出来。目前CD40激动剂临床疗效有限的原因归咎于抗体的结构和功能特性，包括每个分子只有两个靶结合位点，不适合刺激TNFRSF。由于这一信号通路具有广泛的靶向性，因此也可与其他药物和疗法联合应用。相信不久的将来会产生更多令人鼓舞的临床数据，提高治疗效果，并拓宽更多癌症患者的治疗选择。参考资料：1.Concepts for agonistic targeting of CD40 in immuno-oncology. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(2):377-387.2. Harnessing the Potential of CD40 Agonism in Cancer Therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2023 Dec 4;75:40–56公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。