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Texas Biomed now part of global "100 Days Mission" effort aimed at preventing and quickly containing infectious disease outbreaks through accelerated vaccine development SAN ANTONIO, Oct. 28, 2024 /PRNewswire/ -- Texas Biomedical Research Institute (Texas Biomed) has entered a global partnership with the Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI). The five-year agreement will see the Institute join CEPI's specialized preclinical network totaling 16 laboratories worldwide. Under the partnership, Texas Biomed will deliver preclinical research and resources to help develop vaccines for reducing global epidemic and pandemic risks. "This is an exciting moment for Texas Biomed as we take a leading role in the development of viable countermeasures for infectious diseases," said Larry Schlesinger, M.D., President/CEO. "This decade has seen a tripling of large outbreaks relative to prior decades and the threat is not going away. Texas Biomed has a vital role to play in addressing this global public health issue and this partnership with CEPI is a major recognition of the quality of our science." CEPI was formed in 2017 after the devastating West African Ebola epidemic that killed 11,000 people. The coalition aims to transform the world's response to the next novel threat by supporting researchers and scientists in producing safe and effective vaccines, among other strategies. It has received support from over 30 national governments and key philanthropic organizations, including the Bill & Melinda Gates Foundation and the Wellcome Trust. "CEPI is committed to preventing future epidemics and pandemics. We were impressed by Texas Biomed's nimble and forward-leaning approach and we are honored to now be partners. We look forward to collaborating on world-class science together," said Amy Shurtleff, Ph.D., Director, Department of Laboratory Research and Innovations at CEPI. Part of the work undertaken at Texas Biomed will include testing vaccines against CEPI's priority pathogens, such as Lassa fever and Nipah, in preclinical models and generating data to more rapidly assess CEPI-supported vaccine candidates in development. The strategies are at the heart of CEPI's 100 Days Mission, said Texas Biomed Executive Vice President, Cory Hallam, Ph.D., who directs the Institute's Applied Science and Innovation (ASI) unit focused on advancing contract research, innovation and commercialization. "Texas Biomed shares CEPI's goal of enabling the world to be prepared for the next potential pandemic with a new vaccine developed in just 100 days," Hallam said. "It's a bold and inspired approach that draws on the power of a global collaborative network. Our new partnership builds on Texas Biomed and CEPI's complementary strengths and provides a compelling opportunity for our senior scientists and researchers to make a significant contribution to international efforts to combat infectious disease." About Texas Biomedical Research Institute Texas Biomed is a nonprofit research institute focused on infectious diseases. Through basic research, preclinical testing and innovative partnerships, we accelerate diagnostics, therapies and vaccines for the world's deadliest pathogens. Learn more at txbiomed.org. About CEPI CEPI is an innovative partnership between public, private, philanthropic and civil organisations. Its mission is to accelerate the development of vaccines and other biologic countermeasures against epidemic and pandemic threats so they can be accessible to all people in need. CEPI has supported the development of more than 50 vaccine candidates or platform technologies against multiple known high-risk pathogens or a future Disease X. Central to CEPI's pandemic-beating five-year plan for 2022-2026 is the '100 Days Mission' to compress the time taken to develop safe, effective, globally accessible vaccines against new threats to just 100 days. Find out more at SOURCE Texas Biomedical Research Institute WANT YOUR COMPANY'S NEWS FEATURED ON PRNEWSWIRE.COM? 440k+ Newsrooms & Influencers 9k+ Digital Media Outlets 270k+ Journalists Opted In GET STARTED

摘要：流感病毒是最重要的人畜共患病原体之一，能够引起严重症状，有潜力造成大量死亡和巨大的经济损失。疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳选择。已经开发了不同类型的流感疫苗，包括减毒活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗、病毒体疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。然而，它们存在一些限制，如相对较高的制造成本和长时间的生产周期，某些疫苗在特定人群中的中等效力，以及缺乏交叉反应性。这些问题是需要解决的。在这里，我们总结了不同类型流感疫苗开发和应用的最新进展，包括病毒载体流感疫苗的最新发展。我们还描述了基于重组流感病毒作为病毒载体的其他疫苗的构建。本综述文章提供的信息可能会促进安全高效新型流感疫苗的开发。 1.引言 流感病毒是一种包膜RNA病毒，其病毒基因组由8个节段的负义单链RNA组成，编码10种核心蛋白，包括聚合酶基础2（PB2）、聚合酶基础1（PB1）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2），以及其他一些功能性辅助蛋白，如聚合酶基础1-F2（PB1-F2）、聚合酶基础1 N40（PB1N40）、聚合酶酸性-X（PA-X）等。由PB1、PB2和PA组成的聚合酶三聚体复合体与病毒RNA和NP蛋白形成RNA核蛋白（RNP），负责病毒RNA的转录和复制。HA、NA和M2蛋白嵌入病毒颗粒的外层包膜中，其中HA和NA易于暴露，因此是两种主要的免疫原性蛋白。在感染过程中，HA在病毒进入步骤中发挥重要作用，如附着和穿透。HA也是流感病毒表面的主要抗原糖蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体反应。NA负责切割细胞表面存在的末端唾液酸残基，从而促进子代病毒从感染细胞中释放，并在流感病毒的传播中发挥重要作用。根据HA和NA的抗原多样性，流感病毒被分类为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型（N1-N11）。 根据世界卫生组织的估计，全球约有300万至500万人感染流感，导致大约29万至65万例因严重呼吸系统疾病相关并发症而死亡。然而，流感病毒感染通常会导致一种常见的季节性疾病，其特征是较轻的临床表现，如发热、喉咙痛、肌肉无力和一系列相对轻微的呼吸道症状（包括咳嗽和流鼻涕）。大多数患者在一周内从这些症状中恢复；然而，在某些人群亚组中，如老年人、儿童、孕妇和免疫抑制疾病患者，流感病毒感染可能非常严重，可能导致死亡。在20世纪，已经记录了4次流感病毒感染的大流行，包括1918年H1N1大流行（也称为西班牙流感）、1957-1958年H2N2大流行（亚洲流感）、1968-1969年H3N2大流行（香港流感）和2009年的另一次H1N1大流行（墨西哥或猪流感）。据估计，1918年西班牙流感在全球造成了约20亿感染和2100万死亡。在1957-1958年，H2N2亚型流感病毒的爆发起源于亚洲，然后传播到全球，造成约100万至400万人死亡。十年后，由H3N2亚型流感病毒引起的另一次流感大流行起源于香港，导致全球100万至300万人死亡。最新的2009年墨西哥或猪流感大流行是由H1N1亚型流感病毒引起的，影响了214个国家，造成约20万人死亡。除了主要包括H1N1和H3N2的人类流感病毒外，一些流感病毒还可以感染其他动物物种，包括猪流感H1N1、H3N2和H1N2，以及H5、H7和H9亚型的禽流感病毒。值得注意的是，在上述流感大流行中，有几次是由禽源性流感病毒的跨物种传播引起的，如西班牙流感H1N1、亚洲流感H2N2和香港流感H3N2病毒。 目前，有几种治疗流感病毒感染的治疗方法。三类抗流感病毒药物可以分类为病毒M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。首批获准用于治疗流感病毒感染的抗病毒药物是金刚烷胺和金刚乙胺，这两种小分子药物来自金刚烷药物类别。这两种药物通过作为病毒M2离子通道的抑制剂，通过施加静电阻碍，阻止H+流通过M2通道进入病毒颗粒，从而抑制病毒复制。由于M2离子通道被阻断，病毒核糖核蛋白的传递被阻止。尽管金刚烷胺和金刚乙胺是最早的两种获准抗流感药物，流感病毒迅速进化为具有药物耐药表型的病毒变体，通过在M2的跨膜域的氨基酸位置27、30、31和34处获得突变。在药物治疗后2-3天，30%-50%的患者中可以观察到病毒耐药株。自从金刚烷耐药病毒出现以来，针对流感病毒神经氨酸酶的抑制剂已经被开发出来。扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦是N-乙酰神经氨酸（2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸）的衍生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NAIs。这些NAIs结合到NA的活性位点，竞争性地抑制NA与其底物N-乙酰神经氨酸的结合。由于这种抑制，NA不能再从宿主蛋白中切割N-乙酰神经氨酸，从而阻止病毒从细胞表面膜释放。正如预期的那样，在接受这些NAIs治疗的患者中，流感病毒的NA中发生了自然突变。已经描述了两种对NA抑制剂的耐药机制。第一种涉及NA酶催化位点内的突变，破坏了它与药物的直接相互作用。第二种涉及HA的突变，减少了对其受体的亲和力，从而补偿了药物对NA活性的影响。最常见的观察到的突变，如流感A病毒N1 NA亚型的H275Y和N295S（N1编号）；流感A病毒N2 NA亚型的R292K和E119V（N2编号）和流感B病毒的R152和D198N，是赋予NA抑制剂耐药性的NA突变，以减少唾液酸酶活性和/或稳定性。除了上述两种主要的抗流感治疗药物外，还发现了一些新的抗病毒抑制剂，如聚合酶抑制剂（例如法匹拉韦和利巴韦林）、HA抑制剂（例如RO5464466、阿比多尔、MBX2329和MBX2546）、NP抑制剂（例如萘普生和姜黄素）和宿主靶向剂（例如DAS18），它们也可以作为对抗流感病毒感染的额外治疗选择。 尽管有几种治疗药物可用于抗流感治疗，但接种流感病毒疫苗仍然是预防和控制流感病毒传播的最有效方法之一，可以显著降低流感病毒感染的发病率和相关医疗并发症。常用的流感疫苗包括灭活流感疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位流感疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组病毒载体流感疫苗。在这篇综述中，我们讨论了不同流感疫苗的优缺点，病毒载体流感疫苗的开发，以及其他使用流感病毒作为载体的病毒疫苗的构建，以提供开发有效和安全新型流感疫苗的重要见解。 2.不同类型的流感疫苗及其优缺点 流感疫苗是预防和控制流感病毒感染的重要措施。目前，商业化和实验性的流感疫苗主要包括灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗。 2.1.减毒活流感疫苗（LAIV） 减毒活流感疫苗是通过流感病毒基因组中自然发生的突变产生的毒力较低的流感病毒株，或者是通过在病毒易感细胞、胚胎鸡蛋中多次传代所谓的亲本流感病毒，或其他使病毒毒力降低的过程，即不太可能在实验感染动物中引起重大疾病的病毒。选择毒力较低的流感病毒株作为候选疫苗，进一步在人类志愿者中进行测试，然后才能被FDA考虑批准作为人类流感疫苗使用。这种类型的流感疫苗株具有低毒力和致病性，但仍允许病毒在接种后相对较短的时间内感染和增殖。LAIV主要包括流感A(H1N1)、A(H3N2)亚型和流感B病毒的维多利亚系。根据迄今为止公布的数据，LAIV的鼻内接种可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。特别是，LAIV诱导的细胞免疫反应，如高交叉反应性CD8+ T细胞反应和IFN-g+ T细胞反应，在学龄儿童和婴儿中比成人更好。随着反向遗传技术的进步，即在实验室环境中使用称为质粒的圆形DNA片段来工程化病毒的分子方法，许多研究中使用手动删除或替换病毒的毒力基因，以减弱病毒的毒力或工程化病毒携带一个或多个所需的外源基因。使用这些现代技术，可以产生三价和四价LAIV，分别表达三种或四种流感病毒HA基因。四价LAIV已被证明对美国2-17岁儿童提供有效的保护效果。在中国，首个三价LAIV（长春百克生物科技有限公司，中国）于2020年获得市场批准。然而，考虑到LAIV仍然可以在接种者中复制，因此可能通过称为遗传逆转的过程将其基因组演变为亲本样病毒，这可能允许它在人类群体中传播，LAIV可能对公共卫生构成潜在风险。因此，需要更多的研究来调查这些LAIV的安全性，然后才能广泛使用。 2.2.灭活全病毒疫苗 在20世纪40年代，由Thomas Francis Jr., MD和Jonas Salk, MD领导的密歇根大学研究小组开发了第一种基于灭活流感A病毒的流感疫苗，并在1945年获得军用许可。他们的疫苗使用受精鸡蛋的方法至今仍用于生产大多数流感疫苗。这种方法涉及在鸡胚（或真核细胞）中培养病毒以允许病毒增殖，然后通过加热或用化学试剂（主要是甲醛）处理来灭活病毒，以减弱病毒的感染细胞和增殖能力。然后添加佐剂以增强最终疫苗配方的免疫原性。灭活全病毒疫苗配方中包含的灭活流感病毒被剥夺了毒力和传播能力，同时保留了病毒表面蛋白抗原（如HA和NA）提供的完整抗原性。因此，灭活全流感病毒疫苗具有高安全性、保持完整病毒抗原组分、高免疫原性、提供长期免疫保护以及无毒力逆转风险的优点。如前所述，反向遗传方法的进步已经彻底改变了制备灭活全流感病毒疫苗的过程，该疫苗由已知毒力基因被删除或以某种方式操纵以灭活病毒的重组流感病毒组成。除了人类使用，灭活全流感病毒疫苗也是预防家禽行业禽流感病毒（AIV）感染的重要工具。 中国预防禽流感的流感疫苗主要是灭活全病毒疫苗。2018年，中华人民共和国农业农村部批准的六种灭活禽流感疫苗产品主要针对AIV的H5和H7亚型。这六种疫苗包括重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗和灭活疫苗（H5N2株rSD57+株rFJ56, H7N9株rGD76）。这些疫苗株使用H5N2亚型流感病毒株（D7）作为病毒基因组骨架（提供六个内部病毒基因）和来自H5N1、N5N6和H7N9突变病毒株的HA和NA基因。这些重组疫苗株是通过使用反向遗传技术产生的，针对在中国家禽养殖场主要传播的几种病毒，包括携带2.3.2.1d和2.3.4.4d亚型HA基因的H5亚型病毒，以及在家禽中产生高免疫效应的H7N9病毒。同样，由哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院新批准的重组疫苗，由灭活的重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗（H5N1株Re-11+株Re-12和H7N9株H7-Re3）组成，也是通过反向遗传技术产生的。值得注意的是，这些AIV灭活疫苗不仅可以预防家禽中的AIV感染，而且对人类公共卫生也大有裨益。自2013年开始，H7N9亚型AIV造成了数百例人类病例死亡，因此被认为是中国的一个主要公共卫生威胁。然而，在2017年9月将H5/H7二价灭活流感疫苗引入家禽业以控制H7N9流感病毒感染后，家禽中H7N9病毒的流行率大幅降低，并且使用这种疫苗对鸡进行免疫接种在预防人类感染H7N9病毒方面也非常有效，事实上，在H5/H7二价疫苗广泛使用后的两年内，仅有4例人类H7N9病例报告，与2016年10月1日至2017年9月30日记录的人类H7N9病例数量相比减少了99.5%。 灭活全流感病毒疫苗可以在体内诱导体液免疫，并产生高滴度的特异性IgG抗体。然而，这种疫苗对不同基因型或亚型的病毒交叉免疫保护效果并不理想。此外，还有其他一些缺点，包括相对较低的抗体产生率、相对较低的细胞免疫应答诱导效果，以及更多免疫剂量可能给接种动物带来过大的压力。还有报道指出，灭活全人类流感病毒疫苗可能会引起儿童高热，因此不推荐12岁以下儿童使用。随着疫苗生产工艺的进步，全人类流感病毒疫苗的生产已逐渐被淘汰。相比之下，裂解病毒疫苗和亚单位疫苗的开发和应用取得了进展，这些疫苗可以提供相当和有益的免疫效果，并具有更高的安全性。 图1、五种常用流感疫苗的组成：(A) 减毒活流感疫苗，(B) 全病毒灭活疫苗，(C) 裂解病毒流感疫苗，(D) 亚单位流感疫苗，以及 (E) 病毒体流感疫苗。这五种不同的流感疫苗在活性、抗原成分和结构组织上有所差异，这些差异影响了疫苗的免疫原性和保护效力。该图是用 Biorender.com 创建的。 2.3.裂解病毒流感疫苗 裂解病毒流感疫苗是基于灭活全流感病毒疫苗制备的。选择合适的裂解剂和条件破坏病毒包膜并裂开病毒颗粒。裂解剂以及病毒的核酸和大分子量蛋白被丢弃，而活性抗原组分（HA和NA）和部分M和NP蛋白（增强免疫反应）得以保留。这种疫苗配方可以集中并增加一定体积疫苗中活性抗原蛋白的水平，这可以在最大程度上刺激抗体产生效果，同时大大减少由病毒颗粒其他组分可能引起的不必要副作用。因此，裂解流感疫苗比灭活全流感疫苗更安全。目前，中国市场上已经批准的这类疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）和四价灭活流感疫苗（IIV4）。裂解流感疫苗是IIV3的主要组成部分，而所有的IIV4都是裂解流感疫苗。先前的研究表明，对于6个月以上儿童接种裂解病毒免疫接种，具有令人满意的保护效果，2011-2012年接种数据显示，36-59个月和6-35个月儿童接种IIV3的保护效果分别为58.2%和49.6%。此外，其他研究也表明，IIV4对流感B病毒的免疫原性高于IIV3。IIV4主要包括流感A(H3N2)、A(H1N1)亚型，以及流感B病毒的维多利亚和山形株。血凝抑制（HI）阳性转化率作为衡量接种个体血清中能中和流感病毒的抗体存在的标志，HI的几何平均滴度（GMT）平均增长率，以及疫苗免疫后血清抗体保护率均达到预期，表明疫苗具有高免疫原性。 2.4.亚单位流感疫苗 传统的亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗制备的，其中HA和NA抗原蛋白进一步提取、纯化和浓缩。然后，添加相应的佐剂以制备最终的亚单位疫苗配方。或者，随着基因工程技术的进步，分子克隆技术已被应用于构建亚单位流感疫苗。简言之，通过限制性内切酶消化和连接过程，将流感病毒的主要抗原蛋白基因（如HA和NA）克隆到蛋白表达质粒中。将工程质粒转移到原核或真核细胞中，以产生HA或NA蛋白抗原，然后进行浓缩和纯化，添加相应的佐剂以获得最终的亚单位疫苗（严格意思上的亚单位疫苗）。常用的IIV3疫苗包括一些通过这种方法制备的疫苗。例如，Influvac®（Solvay Pharmaceuticals BV, Weesp, The Netherlands）和Agrippal®（Chiron SRL, 现为Novartis Vaccines, Viaflorentina, Italy）疫苗在健康儿童、成人和老年人中显示出良好的免疫原性、安全性和耐受性。由于孕妇极易感染流感病毒，特别为孕妇设计了三价流感亚单位疫苗Agrippal S1和Grippol Plus，这些疫苗符合药品委员会（CPMP）标准，并已显示出为孕妇提供高滴度抗体以及长达6个月的婴儿免疫保护效果。除了人类使用，也广泛研究了猪和家禽的亚单位流感疫苗。Hernandez等同事使用杆状病毒载体系统表达猪流感病毒（SIV）HA蛋白与猪IgG2a Fc结合，可以为猪提供有效的抗H1N1 SIV效果和高滴度血清抗体，并减少肺损伤。此外，Song等同事评估了重组HA1-2亚单位疫苗对禽源H7N9流感的免疫原性，并发现含佐剂的灭活疫苗候选物可以在小鼠中诱导有效的HA1-2特异性体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。值得注意的是，它们有一些缺点，包括相对较低的免疫原性、所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。 2.5.病毒体流感疫苗 病毒体是重组流感病毒包膜，由HA、NA和病毒磷脂组成。它们的颗粒结构使病毒体保持病毒膜融合和细胞结合能力，这可以增加与亚单位和裂解病毒疫苗相比的免疫原性。病毒体可以将封装的货物送入抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并随后诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，由于缺乏佐剂，病毒体在激活APCs和触发交叉呈递方面的效率不高，这限制了CTL免疫的诱导。因此，添加合适的佐剂可以克服这一缺点。Dong等同事开发了一种新型流感疫苗配方，该配方由含有Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂质A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni的病毒体组成。体外研究表明，含MPLA的病毒体比未加佐剂的病毒体更能强烈激活APCs，并且用含MPLA的病毒体免疫小鼠，病毒NP附着可以促进NP特异性CTLs的启动。病毒体也被用作短肽抗原的传递系统。Soema等同事构建了含有保守的人类HLA-A2.1流感T细胞表位M158-66的病毒体。在HLA-A2转基因小鼠中评估了这些肽装载病毒体的免疫原性和保护效果。在小鼠和树突状细胞培养中研究了病毒体的传递特性。用含肽病毒体和佐剂CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1转基因C57BL/6小鼠，增加了肽特异性CTLs的数量。用含佐剂的肽装载病毒体免疫接种减少了小鼠在异源流感病毒挑战后的体重损失。 自20世纪70年代首次提出病毒体流感疫苗以来，经过20多年的发展，流感病毒体疫苗已积累了足够的临床实验数据，并由此产生了两种产品Epaxal®和Inflexal®，它们分别由瑞士伯尔尼瑞士血清和疫苗研究所在1994年和1997年生产。其中，Inflexal®是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，它在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。它能够诱导B细胞反应并产生病毒抗原特异性抗体。然而，一项临床研究未能证明其能够诱导针对嵌入病毒体的两个肽段（CTL靶标抗原）的CD8+ T细胞。这一缺陷表明的是病毒体技术的局限性，还是仅仅反映了目标抗原选择的非最优性，目前尚不清楚。与灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗和病毒体疫苗类似，主要诱导B细胞介导的体液免疫。未来的研究需要开发能够同时诱导细胞免疫和体液免疫的流感疫苗，如前述的减毒活流感疫苗和下文描述的活病毒载体疫苗。 活病毒载体流感疫苗利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到不同类型的病毒基因组中，使得这种重组病毒能够在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 3.病毒载体流感疫苗 病毒载体流感疫苗是指利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到另一种病毒的基因组中，这使得这种重组病毒能在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 图2、复制缺陷型腺病毒载体流感疫苗的工作原理。携带流感病毒HA基因的复制缺陷型腺病毒载体能够诱导产生高滴度的血凝抑制(HI)抗体。该图是用 Biorender.com 创建的。 3.1.腺病毒载体流感疫苗 腺病毒载体疫苗使用腺病毒作为载体，通过将其与腺病毒基因组结合，表达感兴趣的病原体的保护性抗原蛋白的转基因。腺病毒载体疫苗具有几个优点，包括高水平的抗原蛋白转基因表达，以及同时诱导体液和细胞免疫应答的能力。它们也是安全的，易于制备，不需要佐剂。目前，它们被广泛开发作为预防性疫苗。 腺病毒载体疫苗策略已被用于尝试开发通用流感疫苗。由于流感病毒包括许多基因型（或亚型），并且可以通过自然遗传突变和/或基因组重排（称为抗原漂移和抗原移位）相对快速地进化，因此同时为个体提供针对不同流感病毒的保护的疫苗生产面临真正的挑战。开发通用流感疫苗是解决这一重要问题的重要方法。为此，已构建腺病毒载体流感疫苗以表达流感病毒蛋白的保守抗原区域，如HA2的茎区、嵌合HA、M2e、NP及其T/B细胞表位，因为这些主要蛋白抗原对各种亚型的流感病毒显示出高度的免疫原性和免疫保护效果。例如，Tutykhina等同事构建了一种携带流感病毒保守M2和NP抗原表位的重组腺病毒载体（Ad5-tet-M2NP），该载体能够诱导高水平的CD8+和CD4+ T细胞产生，表明接种这种重组病毒载体疫苗可以诱导针对流感病毒的强效T细胞介导的免疫应答。接种这种活腺病毒载体疫苗的小鼠在8个月后能够产生高水平的效应记忆CD44+CD62- T细胞，并对五种流感病毒（H9N2、H1N1、H5N2、H2N3和H3N2）显示出有效的长期保护效果。Hassan等同事构建了一种不同的活腺病毒载体疫苗，包含H5N1流感病毒的保守抗原表位，包括由M2外域（M2e）、血凝素（HA）融合域（HFD）、核蛋白的T细胞表位（TNP）和HA a-螺旋域（HaD）组成的多表位（ME）。这种腺病毒载体ME疫苗诱导了体液和细胞免疫应答，减少了接种小鼠肺部的流感病毒滴度，并显示出相对良好的免疫保护效果，能够抵抗H5、H7和H9流感病毒的挑战。然而，用Ad-ME载体疫苗免疫的小鼠在挑战后的肺部流感病毒滴度仍然显著高于匹配的HA对照疫苗接种动物，这表明最佳的抗体介导保护可能需要结构完整的HA免疫原。因此，还可以基于所谓的计算优化广谱反应原（COBRA）概念，计算设计表达结构完整、全长HA作为免疫原的其他类型的基于Ad的疫苗。 目前，5型腺病毒（Ad5）是最常用的人腺病毒（AdV）载体。Wu等同事构建了一种复制缺陷的重组AdV（rAd5-avH1HA），在单轮细胞感染后能够表达H1N1流感病毒（A/swine/Zhejiang/199/2013株）的HA蛋白。作者表明，这种疫苗能够诱导产生高滴度的中和抗体，并显著减少接种的BALB/c小鼠鼻腔和肺部的挑战流感病毒的复制。由于大多数人对Ad5具有自然免疫力，非人源重组腺病毒载体，如牛腺病毒（BAdV），也越来越多地受到研究人员的关注。例如，Ekramy等同事使用BAdV-3构建了一种重组腺病毒载体流感疫苗BAd-H5HA，表达H5N1亚型禽流感病毒的HA基因，并在小鼠中比较了与HAdV类型C5（HAdV-C5）载体H5N1疫苗（HAd-H5HA）的免疫效果。他们首次发现，低剂量（1×106 PFU）肌肉注射BAd-H5HA可以在小鼠中诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并提供针对异源H5N1病毒的有效免疫保护。相比之下，HAd-H5HA需要较高剂量（1×108 PFU）才能达到相当的免疫效果。 3.2.沙粒病毒载体流感疫苗 沙粒病毒是一类具有双节段RNA基因组的包膜RNA病毒。沙粒病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）、马丘波病毒（MACV）、皮钦德病毒（PICV）等。这些沙粒病毒（也称为哺乳动物沙粒病毒）可以通过感染啮齿动物的粪便、尿液、血液或唾液传播给人类，它们是沙粒病毒的自然宿主。由LASV、JUNV和MACV等致病性人类病毒引起的严重出血热是主要的感染相关症状。相反，许多其他沙粒病毒，如PICV，在感染后不引起人类和哺乳动物的任何临床表现，因此被认为是非致病性的（即无害的）偶然宿主。同样，LCMV通常不会对普通人群构成严重健康威胁，因为大多数LCMV感染的病例都是无症状或轻微的。 先前的研究表明，沙粒病毒在感染的早期主要感染重要的免疫细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，这使它们成为疫苗开发的理想病毒载体，因为它们靶向这些能够自然增强对抗原蛋白免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）。已有几项研究利用反向遗传技术生成携带感兴趣抗原蛋白的重组LCMV。Emonet等同事开发了一种三质粒反向遗传系统来生成三节段LCMV。通过该系统恢复的重组LCMV能够同时携带多达两个感兴趣的抗原蛋白的转基因。2018年6月，专注于肿瘤学和传染病创新活性免疫疗法的临床阶段生物技术公司Hookipa Biotech AG（“Hookipa”）和研究型生物制药公司Gilead Sciences, Inc.（“Gilead”）宣布了一项研究合作和许可协议，授予Gilead对Hookipa的TheraT®和Vaxwave®沙粒病毒载体技术的独家权利，用于乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）两种主要慢性传染病的指示。值得注意的是，基于LCMV载体并表达人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E7和E6开放阅读框（ORFs）的非致癌性融合蛋白作为模型肿瘤相关抗原的TheraT®载体，以及基于PICV的类似病毒结构，目前正在作为HPV16阳性头颈癌的重复原始增强免疫策略进入临床1期测试。这是首次在人类（FIH）第1期（剂量递增）/第2期（剂量扩展）多国、多中心、开放标签研究中包括140名HPV16+确诊癌症参与者。虽然这在使用LCMV等沙粒病毒载体作为治疗性肿瘤疫苗方面迈出了重要一步，但值得注意的是，约5%的人类人群显示出先前接触LCMV的证据，因此存在预先存在的（LCMV）载体免疫问题。此外，尽管大多数获得性LCMV感染是无症状或轻微的，但先天性LCMV感染可能非常严重，可能导致自然流产和胎儿死亡，或引起脑功能障碍。最近的报告还表明，LCMV感染免疫受损个体也可能导致一些严重的医疗并发症。在极少数情况下，LCMV感染可能导致某些形式的神经系统疾病，如无菌性脑炎、脑炎、脑膜炎或甚至在健康个体中引起小头畸形，因此必须谨慎使用。 PICV与LCMV具有相似的病毒基因组结构，但与全球发现的LCMV不同，其宿主是普通家鼠属Mus musculus。PICV仅在南美洲哥伦比亚的皮钦德谷特有的稻大鼠属oryzomys albigularis中发现。与LCMV不同的是，PICV在人类中不会引起疾病。Dhanwani等同事构建了一个PICV的三质粒反向遗传系统，并用它来开发PICV载体流感疫苗。当将A型流感病毒（HA和/或NP）的抗原蛋白转基因插入重组PICV载体疫苗（rP18tri）时，这些PICV载体流感疫苗可以有效地在接种的小鼠中诱导针对HA和NP的特异性体液和适应性免疫应答，并能提供持久的、有效的保护效果，使接种的动物能够抵御致命的小鼠适应株流感病毒（PR8）。此外，对PICV的中和抗体（nAb）反应水平非常低。这种免疫逃避现象部分可以用Pichinde病毒粒子表面膜上的糖蛋白（GPC）高度糖基化来解释，这使得病毒无法被nAbs识别。因此，PICV载体疫苗比LCMV载体疫苗具有一个主要优势，即PICV基疫苗可以克服初次加强免疫期间抗载体免疫的问题。尽管仍处于开发的早期阶段，但PICV载体已被证明相对安全，可以避免由于PICV仅在哥伦比亚自然发现而预先存在的免疫力，并且已显示出作为开发新型流感和其他病原体疫苗的病毒载体的巨大潜力。 最近的一项研究表明，基于PICV和LCMV的病毒载体可以被设计来传递肿瘤相关抗原，如HPV16 E6和E7基因的非致癌性融合蛋白，在异源原始增强方案中可以有效诱导肿瘤特异性CTL（CD8+ T细胞）反应，消除已建立的实体肿瘤并保护接种的小鼠免受肿瘤再挑战。沙粒病毒家族成员可以诱导强烈的CTL反应和低水平的中和抗体，这有助于克服其他病毒载体中常见的抗载体免疫问题，例如痘病毒和腺病毒载体。基于这些激动人心的新发现，已经建立了一种新的基于沙粒病毒的免疫治疗策略。 图3、不同类型病毒载体及其疫苗的优势、劣势以及应用。该图是用 Biorender（Biorender.com）创建的。 3.3.新城疫病毒载体流感疫苗 新城疫病毒（NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏液病毒科，其基因组从3'端至5'端依次编码六个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）。NDV基因组能够被改造以稳定表达大片段的感兴趣转基因（4.5 kb或更大），并且能够表达超过3种不同的非NDV蛋白。理论上，任何插入NDV两个蛋白编码序列之间的外源基因都可以被表达。先前研究表明，当外源基因插入NDV P和M基因之间时，表达水平最高。 NDV能够感染不同哺乳动物的呼吸道上皮细胞，如家禽、人类、猪、小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。NDV能够激活宿主的局部粘膜免疫，诱导产生高效的体液和细胞免疫应答。此外，NDV的整个复制周期都在细胞质中进行，从而最小化了病毒基因组与宿主基因组之间重组的风险。NDV载体疫苗的应用可以通过喷雾和/或将疫苗加入饮水等大规模免疫方法进行。另一个优点是NDV在鸡胚中高效增殖，有利于重组NDV载体疫苗的大规模生产。因此，NDV载体已成为人类和动物疫苗开发的重要对象。 人类不是NDV的自然宿主，因此NDV对人类不太致病。此外，已经证明NDV与已知的多种人类副黏液病毒（如呼吸道合胞病毒RSV和人类副流感病毒hPIV）的氨基酸同源性和相似性较低，因此人类对这些其他呼吸道病毒的免疫对NDV的影响有限。Bukreyev等同事构建了一种表达人类副流感病毒3型（HPIV3）HN蛋白的重组NDV，随后将其作为活病毒载体疫苗（106.5 PFU）用于非洲绿猴和恒河猴的鼻内和气管内接种。活重组NDV载体HPIV3疫苗仅在接种动物的呼吸道复制。28天后进行第二次免疫。结果显示，接受活重组NDV载体HPIV3疫苗免疫的动物的中和抗体血清滴度显著高于接受野生型HPIV3免疫的动物。为了评估NDV载体疫苗对人类流感病毒的有效性，Nakaya等同事使用NDV Hitchner B1株作为病毒载体，将人类流感A/WSN/33病毒的HA基因插入NDV P和M基因之间，构建了rNDV/B1-HA疫苗。结果表明，重组NDV载体流感疫苗能够在接种的小鼠中诱导产生强大的体液免疫应答，通过高水平的针对流感病毒HA蛋白的抗体滴度提供对A/WSN/33病毒的保护效果。DiNapoli等同事研究了NDV载体疫苗对非洲绿猴高致病性禽流感病毒（HPAIV）的免疫效果，他们用活重组NDV载体疫苗（10 PFU）表达H5N1 HPAIV HA蛋白（NDV-HA）对动物进行免疫。两次疫苗接种后，诱导产生了高滴度的中和抗体，并在呼吸道诱导产生了高水平的粘膜免疫球蛋白IgA反应。这些发现表明，NDV载体流感疫苗可能对人类使用具有潜力。 新城疫和禽流感都是严重威胁家禽业的重要传染病。因此，通过疫苗接种预防这两种疾病具有特别的意义。构建高效的新城疫和禽流感二价疫苗可以减少疫苗生产成本和通过多种疫苗给动物带来的不利压力。NDV载体AIV疫苗是解决这一问题的策略之一。Ma等同事构建了一种表达A/chicken/Iowa/04-20/2015 (H5N2)病毒HA蛋白的重组NDV病毒，用作流感疫苗候选物。作者发现，无论是活NDV载体流感疫苗还是灭活NDV载体流感疫苗都能在接种后两周诱导产生针对H5N2 HA蛋白和NDVLaSota株的中和抗体。然而，活NDV载体流感疫苗的免疫原性低于灭活NDV载体流感疫苗。此外，这些疫苗对高致病性H5N2 A/turkey/Minnesota/9845-4/2015病毒的复制显示出效果，这通过接种动物的有限病毒脱落证明。免疫鸡的血清还能在病毒挑战后中和高致病性H5N1和H5N8病毒。在另一项研究中，Xu等同事将H9亚型AIV HA蛋白的外域与NDV F蛋白的跨膜域和细胞质尾区融合，构建了重组NDV载体流感rmNA-H9F疫苗候选物。接种后，这种疫苗能够保护鸡免受致死剂量的NDV和AIV H9N2的挑战，并诱导产生高水平的NDV-HI、H9-HI和分泌型IgA。 尽管NDV载体AIV疫苗已经在实验室实验中显示出显著的积极免疫效果，但存在针对NDV的母源抗体可能会减少NDV载体疫苗的有益免疫效果。为了解决这个问题，一些研究小组建议使用嵌合NDV载体。通过用具有不同血清学特性的禽副黏液病毒2型（APMV-2）的对应物替换NDV F和HN蛋白的外域构建了嵌合NDV载体（NDV株BeaudetteC）。这绕过了针对NDV的预先存在的母源抗体，并为HPAI病毒提供了有效的保护。Chowdhury等同事也使用这种方法构建了表达H7 HA蛋白保守序列的重组嵌合NDV载体。他们的发现显示，由于母源抗体的影响，4周龄鸡在异源初次加强免疫策略后没有诱导出高滴度的NDV LaSota特异性抗体。然而，通过NDV/HA异源初次免疫后，H7中和抗体的滴度已经超过了16 HI，这可以保护肉鸡和火鸡免受H7N8 HAPI的侵害，同时也减少了病毒脱落。 3.4.杆状病毒载体流感疫苗 杆状病毒是一种感染昆虫细胞的病毒，因此，只有无脊椎动物能被这种病毒感染。Autographa californica多重囊核多角体病毒（AcMNPV）是研究实验室中最常用的杆状病毒。AcMNPV是一种大型双链DNA病毒，基因组为133.9 kb，包含156个开放阅读框（ORFs）。AcMVPV的基因组较大，因此有足够的位置插入感兴趣的外源基因以在病毒感染的细胞中表达。在过去的三十年中，为了这个目的，杆状病毒表达载体系统（BEVS）不断优化。在过去的十年中，基于BEVS的疫苗研究逐渐增加，有7种商业化产品已获批准用于人类，其中包括人类乳头瘤病毒疫苗、流感疫苗、前列腺癌疫苗和脂蛋白脂酶缺陷疫苗。 随着BEVS的不断进步，这些技术也被应用于构建杆状病毒载体流感疫苗。Influenza-Flublok Quadrivalent，一种四价重组杆状病毒载体流感疫苗，配方每0.5 mL剂量含有180 mg，每种流感病毒株的HA含量为45 mg：A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/Minnesota/41/2019（类似A/Hong Kong/45/2019的病毒）(H3N2)、B/Washington/02/2019和B/Phuket/3073/2013，可用于2020-2021年流感季节的人类疫苗接种。Flublok Quadrivalent是一种用于主动免疫以预防由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的疫苗。它已于2017年获批用于18岁及以上人群。Influenza-Flublok的三价版本于2013年获得许可，但后来被四价版本取代。与灭活流感疫苗相比，Flublok配方中相对较高的流感抗原水平可以增强疫苗的免疫原性并减少局部反应原性。此外，Liu等同事评估了另一种基于BEVS的H5亚单位疫苗（A/goose/Guangdong/1/96），发现这种疫苗可以保护BALB/c小鼠以及无特定病原体（SPF）和商业肉鸡，因此可以作为人类和动物候选H5流感疫苗株。此外，Yu等同事使用BEVS构建了一种重组杆状病毒载体BmNPV-CMV/THB-P10/CTLT疫苗，该疫苗包含H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的T淋巴细胞表位（CTLT）的融合密码子优化序列，以及H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的Th和B细胞表位（THB）的融合密码子优化序列，然后用于小鼠和鸡的免疫。他们的发现表明，疫苗可以在两种动物中激活流感病毒特异性的体液和细胞反应，表明疫苗可以作为针对不同亚型AIV的通用疫苗。尽管BEVS具有作为疫苗开发有吸引力的载体平台的独特特性，但考虑到与BEVS相关的因素，如蛋白质复杂性、翻译后修饰、规模和成本，它并不适用于所有疫苗产品开发。应用杆状病毒载体疫苗作为常用疫苗载体平台的主要限制是缺乏人类免疫的安全指南。需要进一步研究以成功将技术整合到现实生活情况中。还需要在哺乳动物系统中建立完整的杆状病毒基因表达，以进一步增强基于杆状病毒的疫苗的安全性。杆状病毒可能是具有作为潜在疫苗的一些有吸引力属性的下一代流感疫苗。 3.5.疱疹病毒载体流感疫苗 疱疹病毒是一种具有大型双链DNA基因组的病毒，大小范围约为125到240 kbp。这些疱疹病毒在宿主范围上受到限制，例如，禽类疱疹病毒只能感染禽类。有几种疱疹病毒载体可用，包括火鸡疱疹病毒（HVT）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。MDV疫苗已经在养禽业中使用了40多年，因为它可以诱导对抗马立克氏病的终身免疫。HVT已被用作病毒载体来表达各种抗原蛋白，如AIV的HA蛋白和NDV的F蛋白。已有几种基于HVT载体的商业疫苗表达H5亚型AIV的HA蛋白，如Vectormune® AI [CEVA Animal Health, Lenexa, KS, USA (www.vectormune-ai.com)]。这种疫苗为火鸡和家鸭提供了针对H5亚型HPAI的有效免疫保护。Kapczynski等同事构建了一种表达2.2 H5N1 AIV HA蛋白的重组HVT载体AIV疫苗，该疫苗在鸡接种后对H5N1和H5N2 HPAIV挑战产生了显著的保护效果，使动物的存活率达到80%-95%。此外，接种HVT载体AI疫苗的鸡的脾T淋巴细胞能够识别MHC匹配的目标细胞感染H5、H6、H7或H9 AI病毒。Li等同事使用细菌人工染色体（BAC）克隆技术构建了另一种表达H7N1 HPAIV HA基因（rHVT-H7HA）的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H7HA可以诱导产生H7特异性免疫反应，帮助鸡抵御高致病性H7N1病毒的感染，并显著减少病毒脱落。Liu等同事还使用BAC克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种表达H9 HA蛋白的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H9可以在接种后35天诱导鸡产生体液和细胞免疫反应，这通过针对H9的高滴度中和抗体HI和激活IFN-g+ CD4+和IFN-g+ CD8+ T细胞证明。当接种的动物在接种后35天受到H9N2 AIV挑战时，在鸡的气管和肛门拭子中在挑战后3天和5天没有观察到病毒脱落。此外，在接种鸡的器官（气管、肺、脾和肾）中没有检测到H9N2病毒。这些发现表明，HVT作为禽流感疫苗开发的病毒载体具有前景。然而，疱疹病毒载体的一些缺点，如高水平的预先存在的抗载体免疫、通过卵内途径提供完全保护所需的相对较长时间以及宿主细胞终身感染可能造成的风险，可能会阻碍这种病毒载体在疫苗开发中的考虑。 流感疫苗的开发包括季节性流感疫苗和通用流感疫苗两个主要方向。季节性流感疫苗针对每年流行的流感病毒株进行设计，而通用流感疫苗则旨在提供针对多种流感病毒株的广泛保护。 4.季节性流感疫苗和通用流感疫苗的开发 许多前述的病毒载体疫苗已被证明是安全且具有免疫原性的，它们能够激活针对感兴趣抗原蛋白的体液和细胞免疫反应，无论是在局部粘膜部位还是系统性地。因此，病毒载体疫苗可以克服传统灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗的一些固有缺点。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需要进一步研究。流感疫苗开发中真正的挑战是如何应对流感病毒频繁的抗原漂移和抗原转变，以及流感病毒的快速突变率。为了克服这个问题，最近的努力集中在改进流感病毒的流行预测，以开发能够与预测的季节性病毒紧密匹配的疫苗候选物，以及开发能够对多种流感病毒株提供广泛保护效果的通用流感疫苗。 4.1.季节性流感疫苗的开发 流感监测是一项全球性的公共卫生活动，每年在全球范围内进行。世界卫生组织（WHO）自1952年起组织了这一协调的全球性努力，以追踪流感病毒感染，最初称为全球流感监测网络（GISN），2011年更名为全球流感监测与响应系统（GISRS），并扩展到包括113个成员国的143个机构。根据这一流感病毒监测系统的主要两种方法，通过综合征监测系统从门诊或医院收集信息，以监测当地社区流感疾病的新出现，而循环流感病毒株的病毒学特征则由实验室监测系统收集。每年两次，全球季节性流感病毒循环的所有收集到的信息都会被GISRS整合、分析，并提供给适当的当局，用于季节性流感疫苗株的选择和通用流感疫苗的开发。自20世纪50年代以来的几十年里，流感病毒疫苗株的选择依赖于年度血清学检测的数据，这些数据提供了免疫系统对当前循环流感病毒的反应的表型测量。然而，血清学检测有一定的缺点，包括劳动强度大、实验室间数据不一致，以及数据不公开和/或难以解释或扩大规模。因此，这些方法只能应用于分析一小部分流感病毒。因此，迫切需要开发基于监测数据的流感病毒持续进化分析工具，并为选择具有更广泛保护潜力的流感疫苗株提供建议。系统发育树或进化树是用于可视化循环流感病毒遗传进化的工具之一。多年来，研究人员开发了多个类似的工具来生成系统发育树并分析循环流感病毒的遗传进化。其中一种方法称为Nextflu（https://bedford.io/projects/nextflu/），这是一个由Neher和Bedford设计的在线可视化工具。Nextflu可以实时跟踪循环流感病毒的进化，特别是人类季节性流感病毒的进化。用户可以通过可视化循环流感病毒株的遗传和流行病学特征来分析季节性流感循环模式，这可以为即将到来的流感季节提供预测。同样，人群水平流感病毒序列的AD图结合了系统发育推断和祖先特征状态重建的信息，这是一种依赖于使用最大简约法将生物体的特征状态映射到系统发育树上的方法，以识别可能处于定向选择下的等位基因和相关遗传变化。除了系统发育树，抗原图或抗原图也是重要的分析工具。抗原图已经使用A型（H3N2）人类流感病毒的数据开发，并常规用于分析WHO流感监测网络的全球数据，作为流感疫苗株选择过程的一部分。抗原图基于反映病原体抗原特性的血清学数据。流感病毒的抗原特性通常基于对病毒分离物进行的血凝抑制（HI）数据，这些数据针对特定株的感染后雪貂抗血清进行测试。通过使用上述工具可视化流感病毒的自然进化，研究人员可以构建统计学习模型来解释抗原差异并预测流感病毒的下一步进化。例如，Steinbrück及其同事结合AD图和抗原树分析了2002年至2007年收集的流感A型（H3N2）的HA基因的进化，并成功预测了H3N2病毒在回顾性测试场景中的抗原进化。 尽管能够预测下一个季节性流感病毒株，但通常需要大约一年的时间来完成流感疫苗株的选择，并通过疫苗生产、发布和分发过程。然而，在这段时间里，循环的流感病毒可能会进一步变异，使其与选定的疫苗株不相似，正如最近的例子所示，预测的H3N2病毒流感疫苗，这种病毒与其他季节性流感病毒相比，进化得特别快且不可预测，并在2004年至2019年过去十五个流感季节中的六个季节中，使季节性流感疫苗与自然循环的H3N2株不匹配。此外，季节性流感疫苗刺激的抗体水平可能只能在相对较短的时间内维持，然后在流感季节结束前降至亚保护水平。这些问题可能会使预测和生产最佳季节性流感疫苗的能力复杂化，因此可能需要其他方法（例如，通用流感疫苗的开发）来生产覆盖不同流感病毒株的更广泛流感疫苗。 4.2.通用流感疫苗的开发 通用流感疫苗旨在提供针对甲型和乙型流感病毒的保护，而不受它们已知的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）或其他病毒基因或基因片段的抗原漂移和移位的影响。目前，通用流感疫苗开发的几种常见靶点包括HA蛋白的保守茎部结构域、M2离子通道（M2e）的外域以及内部蛋白核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。 由于流感病毒的茎部区域位于病毒粒子表面的一个不易被中和抗体接近的区域，因此它受到宿主免疫系统的选择压力较小，因此在不同流感病毒之间高度保守。因此，针对HA蛋白的这个保守茎部区域，可以合理地假设能够诱导出针对流感病毒内部亚型、不同亚型之间以及不同群组之间的广泛反应性抗体。 已经探索了包括生成具有HA头部高度糖基化、"无头"HA、仅表达茎部的长α螺旋（LAH）结构域以及开发嵌合和马赛克HA以诱导针对茎部的抗体等不同策略的候选通用流感疫苗。通过这些策略开发的一些通用流感疫苗已进入人体临床试验，并显示出一些令人鼓舞的结果。例如，一项包括65名参与者的I期临床试验结果表明，他们接受了两次不同组合的嵌合HA活流感病毒、灭活流感病毒或灭活流感病毒加佐剂的免疫接种，显示出诱导抗茎部H1抗体的证据。更令人鼓舞的是，结果显示，在接受了两次嵌合HA灭活和佐剂流感病毒疫苗的参与者中，诱导的抗茎部抗体在1.5年内比基线高出4倍以上。 其他尝试生产通用流感疫苗的方法涉及以流感病毒M2e蛋白为靶点。虽然由流感病毒M2e蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与感染病毒的宿主细胞上的M2e结合，但一些研究表明，接种个体中M2e特异性血清抗体滴度迅速下降。这种弱抗原免疫原性的例子，再加上大多数诱导的抗体是非中和抗体，突出了通用流感疫苗开发过程中的一些挑战。因此，建议通过研究更保守的流感病毒抗原（或某些病毒抗原的保守区域）与使用适当的佐剂和其他增强抗原免疫原性的方法相结合，以及/或研究将通用流感疫苗与其他已知疫苗联合使用，这些方法可能有助于增强产生针对不同流感病毒株的更持久和广泛保护性的HA/NA中和抗体的潜力。 通用流感疫苗的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑病毒的保守抗原、疫苗设计策略、佐剂的选择以及免疫程序的优化等多个方面。随着对流感病毒以及宿主免疫应答机制的深入了解，未来有望开发出能够提供广泛保护的通用流感疫苗。 5.重组流感病毒作为疫苗载体的开发 反向遗传系统可用于实验室中生成重组流感病毒，这是将其作为疫苗载体的基础。流感病毒(IAV)感染可以诱导CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，这些细胞因子进而促使CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞。Th1细胞参与CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫应答，识别并破坏病毒感染细胞，抑制病毒复制和增殖。另一方面，Th2细胞可以激活B细胞，促进中和抗体的产生，从而参与宿主的体液免疫。减毒活流感疫苗(LAIV)在感染早期也能诱导粘膜免疫。 近年来，重组流感病毒已被用作病毒载体。将外源基因以不同的克隆策略插入流感病毒基因组，可能会产生不同的免疫应答。例如，一些研究表明，当外源基因插入流感病毒HA或NA的基因片段时，重组流感病毒载体疫苗能够介导针对外来蛋白的强烈中和抗体应答。相反，将外源基因插入流感病毒内部蛋白（例如NP和M1）或编码核糖核蛋白（例如PB2、PB1和PA）的基因片段，可以诱导针对外来蛋白的CD8+ T细胞应答。 图4、研发针对流感病毒血凝素（HA）茎部的通用流感疫苗的策略：超糖基化HA、无头HA、长α螺旋（LAF）片段、嵌合HA和马赛克HA。该图是用 Biorender.com 创建的。 基于这些发现，Isakova-Sivak等同事构建了两种重组活流感病毒载体腺病毒疫苗(LAIV-AdV)，通过将AdV的T细胞表位插入授权的冷适应H7N9 LAIV病毒的全长NA基因和截短的NS1基因的ORF中。使用这种LAIV-AdV疫苗免疫，可在C57BL/6J小鼠中诱导相对较强的流感病毒特异性抗体和细胞介导的免疫，足以保护接种动物免受致病性H7N9流感病毒和人AdV5感染。此外，Matyushenko等同事构建了两种重组LAIV载体疫苗，通过将编码RSV M2蛋白T细胞表位的基因插入H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)或非结构蛋白(NS1)中。这两种重组LAIV载体疫苗都能同时保护小鼠免受流感病毒和RSV感染，并在接种和挑战动物的肺部及肺组织驻留记忆T细胞(TRM)亚群中激活流感和RSV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。 尽管取得了这些积极的结果，重组流感病毒载体疫苗的安全性和有效性仍需进一步研究和改进。作为减毒活流感病毒，当用作病毒载体时，它仍能复制，因此存在与流通的野生型流感病毒发生基因重组和重配的可能性。此外，当病毒载体疫苗在实验室或接种个体中连续传代时，可能会丢失外源基因。 6.结语 许多病毒载体流感疫苗已被证明是安全和具有免疫原性的，能够激活针对局部粘膜位点或系统性抗原蛋白的体液和细胞免疫应答。这些病毒载体流感疫苗因此可以克服传统流感亚单位疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗的一些固有缺点。到目前为止，已经研究了许多病毒载体流感疫苗，其中一些显示出可接受的有效性水平。这些新型病毒平台和技术为人类、家畜以及伴侣和外来动物的许多疾病提供了快速、高效和成本效益的疫苗生产方式。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需进一步研究。流感疫苗开发中的一个真正挑战是如何应对频繁的抗原漂移和移位，以及这些病毒的快速变异率。解决这一棘手但重要问题的潜在解决方案是通过优化预测下一种主要流感病毒株的方法，以便开发出具有最大保护价值的更好的季节性疫苗，和/或通过开发仍在深入研究和开发阶段的通用流感疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：病毒载体和病毒样颗粒(VLPs)疫苗是新型疫苗设计平台，用以克服传统疫苗的局限性。病毒载体疫苗高效且能快速激发保护作用。许多基于重组病毒载体的人类疫苗候选株，基于不同病毒科的病毒，如腺病毒科、逆转病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科和细小病毒科。此外，首个获批用于人类疫苗接种的病毒载体疫苗是日本脑炎病毒疫苗。此后，已有几种病毒载体获批用于针对拉沙热病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、SARS-CoV-2病毒和疟疾的疫苗接种。VLPs是能模仿病毒颗粒的纳米颗粒，由结构蛋白的自组装形成，针对乙型和戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒以及疟疾的VLPs疫苗已商业化。正如COVID-19疫苗加速生产所证明的，这些新方法对于疫苗学以及针对病原体和新出现大流行威胁的快速响应是重要的工具。 1.引言 疫苗学的时代始于1789年，当时爱德华·詹纳开发了第一种针对天花的疫苗。从那时起，疫苗预防了数百万人死亡，并且在1978年甚至导致了这种疾病的根除。在19世纪，巴斯德开创了基于病原体灭活或减毒的疫苗发展。在20世纪下半叶，使用细胞培养来培养病毒，促进了几个灭活和减毒疫苗的发展。有关疫苗历史的综述， 在20世纪末分子生物学出现之前开发的常规疫苗包括灭活或减毒病原体、类毒素、基于蛋白的疫苗或细菌多糖。因此，它们的使用减少了如脊髓灰质炎、麻疹、破伤风和白喉等疾病的影响。尽管经过数十年的深入研究，针对某些人类病原体的有效疫苗尚未开发出来，例如，那些表现出高度遗传变异性（如人类免疫缺陷病毒[HIV]和丙型肝炎病毒）、导致持续或潜伏感染（如HIV、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒）或未能诱导无菌免疫的病原体。此外，传统疫苗存在几个缺点，如安全问题，包括减毒活病毒恢复毒力的风险、与活生物污染的可能性以及对免疫系统减弱人群的风险。同时，疫苗生产成本高昂且耗时，需要更高水平的生物安全和专业实验室。近几十年来，新的有希望的疫苗平台已经出现，这些平台得到了遗传工程、分子和细胞免疫学、结构生物学、生物信息学、计算生物学、纳米技术、合成生物学等领域进展的支持，如重组病毒载体、病毒样颗粒(VLPs)、mRNA、合成DNA和细菌载体疫苗。此外，疫苗设计新技术是疫苗学中的重要工具，用于克服传统技术的限制，并促进对新威胁（如新出现的病原体和大流行爆发）的快速和有效响应。在这篇综述中，我们旨在总结病毒工程的最新进展，这些进展导致了针对当前流行病病原体（如流感、埃博拉、艾滋病和COVID-19）的安全有效疫苗的开发，特别关注病毒载体和基于VLP的疫苗平台。 2.基于病毒载体的疫苗  重组病毒是经过基因改造并设计用作针对传染病和抗癌及基因疗法的疫苗。具体来说，20世纪90年代开始使用病毒载体进行基因疗法。从这一点开始，遗传工程、重组DNA技术以及发展反向遗传技术以恢复重组病毒，促进了基于载体的疫苗平台的发展。病毒载体是通过将外来抗原或转基因（如感兴趣的免疫原）通过重组DNA工程插入病毒遗传物质构建的。此外，病毒载体被特别修改以根除其固有的致病属性。然后使用新构建的病毒载体将抗原基因传递给宿主，在那里它被短暂地高度表达以引发强大的免疫反应。此外，构建了多价或多病原体疫苗，以同时从同一或不同病原体表达各种转基因。而且，在被动免疫中，重组病毒携带抗体转基因。 迄今为止，已经设计了两种主要类型的病毒载体：复制型和复制缺陷型载体。复制型载体扩增转基因并产生感染性后代，而非复制型载体传递单一的转基因副本而不复制，这提高了其安全性。复制型载体通过模仿自然感染产生强烈的免疫反应。复制缺陷型载体在外来启动子的控制下表达免疫原，产生较弱的疫苗反应，可能需要使用佐剂。复制型载体包括腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒和副黏病毒载体，而复制缺陷型载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体（表2）。还有单周期病毒载体可用，它们通过一轮复制增加抗原表达并避免病毒后代的形成。已从腺病毒和弹状病毒开发出单周期载体。病毒载体疫苗通常极其有效，并通过诱导强烈的体液和细胞免疫反应（包括干扰素和炎症细胞因子的产生）提供快速保护。通常不需要使用额外的佐剂，这简化了疫苗的组成和配方过程。表1总结了基于病毒载体的疫苗的主要优点和缺点。有关载体疫苗免疫反应的综述。 许多基于病毒载体的疫苗已获准用于兽医用途，如犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒和马立克病。例如，基于NDV的流感疫苗保护鸡免受高致病性禽流感的侵害，并在墨西哥和中国作为兽医疫苗使用。牛痘病毒是第一个作为针对乙型肝炎的疫苗载体开发的。2010年，针对黄病毒属日本脑炎病毒的第一种病毒载体疫苗ChimeriVax-JE(Imojev)获准用于人类。ChimeriVax-JE是一种利用黄热病黄病毒株17D构建的减毒活疫苗，通过用日本脑炎病毒的相应序列替换编码前膜和包膜蛋白的序列。这个载体在澳大利亚和亚洲商业化，单剂量可迅速引发免疫反应，具有良好的安全性。 尽管目前只有少数病毒载体疫苗获准用于人类（表3），但针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗的广泛使用已被证明是安全的。因此，目前正在进行许多使用重组病毒载体疫苗的临床试验。有关在欧洲进行的病毒载体疫苗临床试验的综述。 许多基于人类的重组疫苗候选株都是基于腺病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、togavirus科和细小病毒科的病毒，其中腺病毒和逆转录病毒是最广泛使用的载体。然而，那些被选为设计疫苗的载体是根据要插入的基因的特性以及与预先存在的免疫力、病毒复制和遗传稳定性相关的安全问题来选择的。下面总结了被选为设计基于病毒的疫苗的五种主要类型的病毒载体（表2）。 3.用于开发疫苗的主要病毒载体  3.1.腺病毒载体 腺病毒（Ad）载体已被广泛用作基因治疗的工具，并且是最常见的疫苗平台之一。腺病毒科由非包膜的双链线性DNA病毒组成，长度范围从26到45 kb。基因组包含五个早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3和E4）、四个中间转录单元（IX、IVa2、L4中间和E2晚期）、五个晚期单元（L1-L5）以及两端的两个倒置末端重复（ITR）序列。二十面体衣壳由三种主要蛋白质组成：纤维蛋白、五聚体和六聚体，后者是最丰富的蛋白质，含有主要的中和表位。存在100多种不同的人类腺病毒血清型，分为七个不同的物种（A-G）。最初，Ad5和Ad2是最广泛用于构建载体的血清型，因为它们最容易操作，生产和免疫原性都很高。然而，由于预先存在的免疫力，Ad5已被其他血清流行率较低的血清型所取代，如Ad6、Ad26和Ad35。此外，还开发了针对不同病原体和疾病的猴源腺病毒载体，包括流感、HIV、埃博拉、SARS-CoV-2和疟疾。 使用腺病毒载体的优点包括增加转基因转导能力、广泛的细胞嗜性、能够感染分裂和非分裂细胞以及抗原呈递细胞，以及它们不整合到宿主基因组中（表2）。此外，重组基因组在连续传代中表现出稳定的维持，这有助于快速和大规模生产，并产生高滴度稳定库存。如上所述，腺病毒载体的主要缺点是预先存在的免疫力和载体本身的免疫原性。这是因为腺病毒具有很强的免疫原性，能够引起针对Ad主要衣壳蛋白的高滴度中和抗体。 根据病毒基因组编辑，Ad载体被分类为第一代、第二代或第三代载体（图1a）。然而，第一代载体已从病毒复制基因E1B和E1A中移除。此外，通过同源重组插入外源基因以及E3基因的删除，使得转基因的大小从5增加到8 kb。E3产物的删除促进了免疫原性，因为它对于抑制宿主的免疫反应至关重要。在第二代Ad载体中，E4和E2区域的删除增加了转基因容量并减少了宿主细胞中的毒性。第三代Ad载体，称为无肠道载体或助手依赖载体，除了包装信号Ψ和对病毒包装至关重要的ITR序列外，大部分结构和功能基因都被删除（图1a）。这些载体可以容纳高达35 kb大小的转基因。助手依赖载体在保持免疫反应的同时提高了安全性。 图1. 不同基于病毒的载体示意图：(a) 腺病毒载体。在第一代载体中，腺病毒基因组的E1A、E1B和E3基因被删除；在第二代载体中，额外删除了E2和E4基因；在第三代载体或无肠载体中，除了包装信号Ψ和ITR序列外，大部分病毒基因被删除。(b) 慢病毒载体。包含转移载体质粒（带有慢病毒5'和3' LTRs，修改为自灭活和转基因）的第三代慢病毒载体；包含一个启动子和HIV env或VSG-G的假型慢病毒颗粒的包膜质粒；以及分别编码gag或pol和rev的两个包装质粒。(c) 副黏病毒载体。显示了NDV载体。使用T7启动子系统从克隆的DNA（cDNA）中恢复NDV。NDV，新城疫病毒；T7Pro，T7聚合酶启动子；T7ter，T7末端序列。ITR，反向末端重复；Ψ，包装信号；LTR*，自灭活长末端重复。使用BioRender.com创建。 Ad载体通常是复制缺陷型的。此外，通过删除IIIa衣壳水泥蛋白设计了单周期Ad载体；例如，用于针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗。使用动物模型进行的几项临床前研究导致了良好的免疫反应，使得单周期Ad载体用于人类疫苗的开发非常有希望。 使用Ad载体技术的疫苗已经为广泛的病原体开发（表3）。一些Ad载体疫苗仍在研究中，而针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗已经被商业化，正如我们将在以下部分讨论的。 3.2.逆转录病毒载体 在腺病毒之后，慢病毒是病毒载体设计中第二常用的载体。慢病毒，如HIV-1，属于逆转录病毒科，这是一类包膜的单链RNA病毒。进入宿主细胞后，RNA被逆转录成DNA并整合到染色体DNA中。基因组编码三个必需基因（gag、pol和env）以及几个调节和辅助基因，用于小型六蛋白（tat、rev、vif、vpr、vpu和 nef），这些基因对于病毒复制、感染和灭活宿主限制系统至关重要。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码蛋白酶、这一组特有的逆转录酶和整合病毒DNA到宿主基因组所需的整合酶。env基因编码包膜（Env）糖蛋白，gp160，它经过蛋白水解裂解产生gp120和gp41跨膜糖蛋白。 慢病毒载体在免疫方面具有巨大潜力，因为它们最佳地转导树突细胞并有效刺激T和B淋巴细胞。临床前研究表明，慢病毒载体能够引发强烈且持久的体液和T细胞反应，为许多传染病提供有效保护。导致慢病毒载体广泛使用的其他优点包括它们增强的能力来携带大型转基因（<8 kb），它们整合到宿主基因组中，确保了高水平和持久的转基因表达，它们在分裂和非分裂细胞中的高转导效率，以及它们的低遗传毒性和免疫原性，包括低抗载体免疫。然而，慢病毒载体的广泛使用可能受到相对较高的生产成本和与大规模制造相关的技术挑战的阻碍。主要缺点源于它们的整合，这可能诱发肿瘤发生（表2），尽管基于慢病毒的基因疗法临床研究表明插入性突变的风险很低。此外，慢病毒的前病毒整合位点不是随机的，而是相对非特异性。对于HIV，位点整合的偏好包括活跃转录的基因，而不是启动子区域。尽管如此，通过突变病毒整合酶已经为疫苗生产了非整合慢病毒载体。 大多数慢病毒载体是从HIV产生的。第一代慢病毒载体是使用三质粒表达系统开发的，该系统包括携带gag和pol基因以及辅助和调节基因的包装质粒；包膜质粒；以及带有被慢病毒长末端重复序列(LTR)包围的转基因盒的转移质粒（图1b）。慢病毒载体的细胞嗜性可以通过伪型化来修改，从而增加病毒的嗜性。在伪型化载体中，病毒受体结合蛋白Env被异源包膜糖蛋白所取代，其中弹状病毒狂犬病病毒(VSV-G)的G蛋白是最常用的。缺乏对伪型化慢病毒载体的预先存在的免疫力，加上它们低促炎特性，使它们成为粘膜疫苗策略的合适候选者。第二代慢病毒载体通过从包装质粒中删除辅助毒力基因vif、vpr、vpu和nef而变得更安全。第三代慢病毒载体目前用于基因传递，也通过疫苗接种诱导强烈的免疫。在第三代载体中，病毒基因组被分离成三个不同的质粒（gag/pol、rev和env或VSV-G）。为了防止整个HIV基因组的转录，转基因被包含在一个额外的含有用于自我失活的慢病毒LTR序列的质粒中（图1b）。 慢病毒载体作为癌症疫苗的使用也在研究中，特别是用于黑色素瘤、淋巴瘤和前列腺癌。正如下一节将讨论的，已经设计了许多针对不同病原体的慢病毒载体，如流感病毒、西尼罗河病毒、HIV-1和SARS-CoV-2。 3.3.腺相关病毒载体 在腺病毒和慢病毒之后，腺相关病毒（AAVs）是第三广泛使用的病毒载体。AAVs是一种属于细小病毒科的非包膜单链DNA病毒。AAVs是依赖性病毒，因为它们需要辅助病毒，如腺病毒或单纯疱疹病毒，才能复制。大多数AAV载体已用于基因治疗。AAV载体可以感染分裂和非分裂细胞，并携带高达5 kb大小的转基因。AAV载体主要作为游离基因组存在，并以较低频率整合到第19号染色体。它们的优点包括缺乏致病性、广泛的嗜性、低免疫原性、易于生产，并能够建立长期的转基因表达。主要缺点是转基因的大小有限（表2）。构建AAV基载体时，病毒复制（rep）和结构（cap）基因被转基因表达盒（转基因以及启动子和调控元件）替换，该表达盒由AAV ITRs包围。几种基于AAV载体的疫苗候选物已被评估，它们编码针对病原体如尼帕病毒、登革热病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、HIV、埃博拉病毒（EBOV）、流感病毒和SARS-CoV-2的抗原。此外，还开发了许多基于AAV的载体，用于被动免疫策略，以传递中和抗体的基因。这种策略针对HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）等几种病原体产生持续的抗体表达，对于这些病原体，疫苗尚未可用或效果较差。例如，已证明通过鼻腔给药AAV血清型9载体表达重组单克隆抗体palivizumab，可以有效保护小鼠模型免受RSV挑战。 3.4.弹状病毒载体 已开展了许多基于弹状病毒载体的疫苗候选物的临床前和临床研究，包括一些商业化的病毒载体疫苗（表3）。然而，与腺病毒、AAV和慢病毒载体相比，进行的研究数量较少。弹状病毒科由具有典型子弹形状的包膜病毒组成，它们具有非分段的负义单链RNA基因组。基因组编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大聚合酶（L）。反向遗传技术的使用已使负义RNA病毒能够从克隆的DNA中恢复。1994年首次开发该系统，用于从cDNA中恢复狂犬病病毒。其基因组的模块化组织便于通过反向遗传学进行基因修饰，并提供比大多数更复杂的DNA和正义链RNA病毒更大的操控性。 使用弹状病毒载体的优点包括转基因大小（高达6 kb），这允许表达多价弹状病毒疫苗的多种抗原，细胞质复制，这降低了病毒整合到宿主基因组的可能性，低或不存在预先存在的免疫力，以及在组织培养中高滴度复制（表2）。基于弹状病毒的疫苗候选物主要使用狂犬病病毒和VSV。许多基于弹状病毒的载体是减毒的复制型，尽管也设计了单周期载体。此外，在基于VSV的伪型载体中，G蛋白（病毒神经毒性的主要贡献者）被另一种糖蛋白所取代。然而，复制缺陷的弹状病毒载体疫苗的免疫原性较低。 已开发了相当数量的重组狂犬病病毒，用作针对HIV、淋巴细胞性脑膜炎病毒、埃博拉和马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒和SARS-CoV-2等多种病原体的疫苗载体。特别是，表达拉沙热病毒糖蛋白复合物的狂犬病病毒载体疫苗，是一种针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的灭活双重候选疫苗。这种载体在小鼠和豚鼠模型中诱导了针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的持久体液反应，并提供了针对拉沙热病毒的有效保护。 与狂犬病病毒不同，VSV会在牛、马和猪中引起疾病，但不会在人类中引起。编码外源蛋白的重组VSV是针对HIV、EBOV、结核病和SARS-CoV-2等疫苗载体的优秀候选物。使用VSV载体进行的首次成功试验之一是使用基于VSV的载体编码流感病毒血凝素抗原对小鼠进行疫苗接种。还开发了针对致命的新兴副黏病毒亨德拉和尼帕病毒的基于弹状病毒的疫苗候选物。在许多情况下，受体结合G糖蛋白被免疫原所取代。如上所述，VSV的G糖蛋白也可以被纳入伪型慢病毒载体。 至少有两种基于重组VSV的疫苗已获准用于人类，即rVSV-ZEBOV和GamEvac-Combi，后者结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5（表3）。 3.5.副黏病毒载体 副黏病毒科由具有负义单链RNA基因组的包膜病毒组成。副黏病毒基因组的组织与弹状病毒相似，编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、附着糖蛋白（HN/G）和大聚合酶（L）（图1c）。与弹状病毒类似，副黏病毒的模块化基因组便于通过反向遗传学进行操作。麻疹病毒（MV）于1995年首次恢复，NDV于1999年恢复。许多基于副黏病毒的疫苗载体基于MV、人副流感病毒3型（HPIV3）和NDV。 基于副黏病毒的载体提供了几个优点。它们不整合到目标细胞的基因组中，而是仅在细胞质中复制，没有DNA中间体。它们可以容纳6 kb的插入大小，提供高且稳定的异源基因表达，具有黏膜疫苗接种的潜力，制造简单且成本效益高。在NDV载体疫苗的情况下，它们基于卵清的性质使它们适合大规模生产（表2）。 由于使用减毒活麻疹病毒取得了巨大成功，因此很早就开始将其作为疫苗载体用于病毒载体疫苗学领域。不同的麻疹病毒基载体已在针对HIV、RSV、登革热、SARS-CoV、MERS-CoV、基孔肯雅、埃博拉和寨卡病毒、乙型肝炎、西尼罗河和SARS-CoV-2等广泛病原体和病毒的临床前和临床试验中使用。 天然无致病性的NDV株作为家禽业中活减毒疫苗的广泛使用。NDV载体疫苗也已开发用于兽医用途。此外，由于宿主范围有限且缺乏预先存在的免疫力，NDV基载体在人类中使用是安全的。已设计NDV载体来携带来自EBOV、流感病毒、HIV、SARS-CoV和尼帕病毒等的抗原。还描述了使用编码SARS-CoV-2 S蛋白的NDV载体（表3）。 基于HPIV3的载体疫苗已针对EBOV、RSV和SARS-CoV开发，包括针对儿童COVID-19疫苗的候选疫苗，但并未达到MV和NDV载体疫苗的程度。 4.病毒样颗粒  VLPs是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，它们模仿病毒颗粒。VLPs不含遗传物质，因此是复制缺陷型和非感染性的。这显著提高了它们的安全性，与减毒活疫苗或重组病毒载体相比，因为不会像病毒载体疫苗那样合成更多的免疫原副本。VLPs可分为两类：非包膜和包膜。非包膜VLPs缺乏外部脂质包膜，而包膜VLPs具有来自宿主细胞的膜包膜，允许糖蛋白抗原被整合到脂质膜中。非包膜和包膜VLPs都可以是单层或多层，并由单个或多个蛋白质组装而成。一个简单的非包膜VLP的例子是HPV VLP疫苗，它由单层组成。流感VLPs是包膜VLPs的一个成熟例子。 病毒样颗粒（VLPs）携带它们自己的特定病毒表位或外来抗原（嵌合VLPs），这些表位安全地刺激体液和细胞免疫反应，并引发强大的免疫原性。VLPs通常表现出与它们起源的病毒的抗原相似性。它们以有组织且高度重复的方式呈现抗原，从而有效激发体液和细胞免疫反应，这归功于具有重复表面的颗粒对B细胞的最佳刺激。此外，VLPs具有激活T辅助细胞的能力，因为它们自然编码激活细胞免疫反应的T辅助细胞表位。通过将特定的病原体相关分子模式（PAMPs）如单链RNA或CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODNs）装入VLPs，可以进一步激活免疫系统。这一特性即使在较低剂量下也增强了VLPs的免疫原性。 来自35个病毒家族的100多种病毒蛋白，包括包膜和非包膜病毒，已被证明能够组装成VLPs。这解释了为什么使用VLPs提供了一个多功能的新兴平台，用于创建提供病毒载体替代方案的疫苗。由于设计的疫苗种类多样以及它们的临床应用，这项技术在近年来经历了显著增长。通常，较低剂量的抗原足以诱导与亚单位疫苗相似的保护反应。病毒蛋白自发组装成VLPs确保了快速高效的生产，允许VLPs经济地大规模生产（表2）。除了用于预防传染病和癌症的疫苗，VLPs还可以用作药物、染料或纳米材料的载体，用于纳米医学。 VLPs是通过将病毒结构基因分子克隆到表达载体中，然后在表达系统中表达这些基因而开发的。大约30%的VLPs是在细菌中生产的，尽管也使用不同的表达系统，如杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。大肠杆菌表达系统以其易用性和成本效益而著称。然而，由于缺乏翻译后修饰（PTM）系统，它在生产非包膜VLP方面的效用有限。在酵母中的生产具有低成本的生产和维护成本，但引入PTMs（例如，糖基化、磷酸化）的能力有限。相反，杆状病毒-昆虫细胞和哺乳动物细胞系统具有引发更完整的PTM修饰的优势，有助于生产包括多蛋白VLP组装在内的包膜和非包膜VLPs。此外，植物表达系统已成为降低蛋白质生产成本的多功能和有前途的平台。有关设计、生产和开发基于VLP疫苗的不同方法的综述。 第一种基于VLP的疫苗，Recombivax HB，于1986年获得许可用于人类。这是一种在酵母中生产的乙型肝炎VLP疫苗，最早开发于1982年。从那时起，已有几种基于VLP的疫苗被商业化（表3）。Engerix-B是另一种针对乙型肝炎病毒的疫苗，也是在酵母中生产的。Gardasil和Gardasil9是另外两个在酵母中生产的商业化VLP疫苗，它们携带HPV的L1蛋白。最近的研究已经成功生产了携带Gag和p17以及p24蛋白的基于HIV的VLPs。最近批准的两种疟疾疫苗，RTS, S/AS01（Mosquirix）和R21/Matrix M，利用乙型肝炎表面抗原（HBsAg）VLP作为平台，在酵母中形成的VLP表面展示疟疾表位。 Hecolin是唯一能有效预防戊型肝炎的疫苗。它是第一种在细菌中生产的VLP疫苗，携带戊型肝炎病毒的p239截短衣壳蛋白。III期临床试验已证实Hecolin具有高度的免疫原性和效力，证明了它能够诱导显著的戊型肝炎病毒抗体滴度。此外，利用大肠杆菌表达系统有助于成本效益生产。Hecolin于2011年在中国获得监管批准。最近，它作为第三代乙型肝炎疫苗PreHevBio获得批准，该疫苗在哺乳动物细胞中生产。针对疟疾、流感、HPV和西尼罗河病毒的疫苗是其他在细菌中生产的VLP疫苗候选物。杆状病毒/昆虫细胞系统是VLP生产的优选系统，因为它有助于高表达具有许多PTMs的多蛋白VLPs。Cervarix是一种含有HPV 16和HPV 18的L1衣壳蛋白的HPV疫苗，就是这种情况。 针对SARS-CoV-2、流感A、EBOV、腺病毒-7、HPV、HIV-1、乙型肝炎、SARS-CoV、登革热、狂犬病、轮状病毒、诺如病毒和疟疾的不同基于VLP的疫苗最近已获批准或目前正在临床试验中测试（表3）。 5.针对主要传染病和病原体的病毒载体疫苗  在这一部分，我们将总结一些已获得许可用于预防主要疾病或正在几个临床试验中测试的新型疫苗载体。 5.1.埃博拉病毒疫苗 埃博拉是由丝状病毒EBOV引起的一种新兴疾病，已在西非和中非国家引起多次爆发，导致25%至90%的死亡率。迄今为止，可获得的获批埃博拉疫苗基于编码EBV的GP糖蛋白的病毒载体（表3）。Adv5-EBOV是2017年在中国获批的第一种EBV疫苗，基于Ad5载体。Ervebo或rVSV-ZEBOV疫苗是一种活减毒重组VSV基载体疫苗，其中VSV的G蛋白被EBOV扎伊尔物种的GP蛋白所取代。rVSV-ZEBOV是2019年获得FDA批准的第一种抗EBOV疫苗。临床前研究表明，Ervebo在小鼠和非人灵长类动物中对致命EBOV挑战提供保护，主要由抗GP抗体介导。最初由加拿大公共卫生机构开发的疫苗，作为单剂量1毫升剂量给药，并在2018年至2020年持续爆发期间给药超过200,000人。第三种EBOV疫苗是Zabdeno（Ad26.ZEBOV），一种腺病毒载体（Ad26）和Mvabea（MVA-BN-Filo）的两剂量组合，以及编码不同EBOV物种GP蛋白的改良牛痘病毒安卡拉（MVA）载体。GamEvac-Combi是一种异源载体疫苗，已获得紧急使用许可，结合了重组VSV和Ad5表达EBOV的包膜糖蛋白。 此外，许多埃博拉疫苗候选物正在临床前或临床试验中研究，包括使用副黏病毒载体、VSV和狂犬病病毒载体、巨细胞病毒载体和基于VLP的疫苗。 5.2.流感病毒疫苗 流感是由正黏液病毒科的病毒引起的疾病，影响全球15%的人口，每年导致多达645,000人死亡。感染人类的三个主要属是流感A、B和C。正黏液病毒具有负义、单链、分段的RNA基因组，由于遗传突变和基因组重组，经常导致新变种。这一特性使有效疫苗的生产变得复杂。存在于家禽和野生鸟类中的许多禽流感病毒对人类构成人畜共患威胁。除了病毒的不同季节性变种的出现，流感病毒是导致未来大流行的强有力候选者。流感A是开发重组疫苗的主要目标，病毒包膜的血凝素（HA）是主要的抗原靶点。此外，NA、M1、M2、NP和病毒RNA聚合酶复合物免疫原也可以包括在载体中。 基于不同病毒载体的流感A疫苗主要涉及阿尔法病毒、痘病毒和腺病毒，已进入临床试验阶段。此外，副黏病毒、腺相关病毒和疱疹病毒也被考虑用作疫苗载体。特别是，基于Ad5和Ad4腺病毒的疫苗，以及基于非人腺病毒载体（黑猩猩AdC7、AdC68和ChadOx1；牛BAdV-3；猪PAV-3）的疫苗，正在临床前和临床试验中研究。据报道，基于Ad5的疫苗在单剂量下对流感病毒产生了更强大和更有效的免疫反应。编码流感病毒NP和M1基因的ChAdOX载体已完成两个I期临床试验。VXA-A1.1是一种基于Ad5载体的流感疫苗，编码HA免疫原，并使用双链RNA作为佐剂进行给药。VXA-A1.1疫苗也已完成II期临床试验。 此外，基于MVA载体的几种疫苗已在动物模型和临床试验中进行了研究和测试。例如，表达流感A病毒NP和M1蛋白的MVA-NP + M1疫苗（VTP-100载体）在I/2a期临床试验中进行了测试，但未获成功。此外，委内瑞拉马脑炎病毒作为流感疫苗载体也进行了测试。慢病毒载体也被设计为流感病毒平台疫苗，并在临床前试验中进行了测试。具体来说，使用缺陷整合酶的慢病毒载体传递了流感病毒的HA和NP抗原。使用该载体免疫的小鼠对流感病毒表面蛋白持续产生功能性抗体，并引发能够中和病毒致病性的功能性T细胞反应。 最后，在I、II和III期的多个临床试验中测试了基于VLP的流感疫苗的有效性，包括流感B疫苗。一项III期试验评估了针对流感病毒的四价植物源性VLP疫苗。该疫苗的配方包括来自四种不同毒株的HA蛋白，并使用Nicotiana benthamiana作为生产平台。研究结果突出了这种植物源性VLP流感疫苗的免疫原性和安全性。表达HA和不同NA亚型的VLP衍生疫苗被认为是开发通用流感A疫苗的有前途的平台。 5.3.HIV-1疫苗 HIV在1980年代首次被确认，当时它造成了全球公共卫生威胁。该病毒属于逆转录病毒科，如前所述，包含具有单链RNA基因组的包膜病毒，在病毒生命周期中被逆转录为DNA。两种主要的HIV物种感染人类，即HIV-1和HIV-2。主要的抗原蛋白是病毒包膜糖蛋白，Env或gp160，它被蛋白水解激活成受体结合蛋白gp120和融合蛋白gp41。Env蛋白的两个主要特征赋予了它逃避中和抗体和非中和体液及细胞反应的机制。暴露的表位高度变异，具有高突变率，并且蛋白质具有高度的糖基化，使表位无法接触。因此，尽管进行了深入研究，至今仍未商业化有效的HIV疫苗。 为HIV疫苗接种设计了不同的病毒载体。HIV疫苗旨在刺激针对Env蛋白（刺激产生中和抗体）或Gag、Pol和Nef蛋白（刺激T细胞反应）的保守表位的体液和细胞免疫反应。此外，腺病毒载体已被广泛使用。例如，STEP和Phambili IIb期试验测试了编码HIV-1 B亚型gag、pol和nef基因的Ad5衍生疫苗。由于对这些载体的预先存在的免疫力，结果令人沮丧，导致设计了具有不同Ad血清型的载体，如Ad26、Ad35或黑猩猩腺病毒，这些载体已在几个临床试验中进行了测试。 除了腺病毒载体，还基于其他类型的载体设计了几种HIV疫苗，如慢病毒载体。THV01是一种第三代慢病毒疫苗，它是一个复制缺陷型和自失活载体，编码HIV Gag、Pol和Nef蛋白片段。I/II期临床试验表明，这种载体具有高度免疫原性。基于NDV副黏病毒的载体表达gp160 Env和p55 Gag蛋白已在临床前研究中进行了测试。编码env、gag和pol基因的canarypox ALVAC-HIV载体也在III期RV144试验中进行了测试。在这项研究中，病毒载体与增强剂和重组gp120蛋白疫苗结合使用。这次试验对HIV免疫产生了适度的结果。目前正在进行几项正在进行的有效性试验，以进一步阐明RV144试验的发现，包括对各种佐剂的有效性研究。 5.4.SARS-CoV-2疫苗 SARS-CoV-2是最近COVID-19大流行的病原体，是一种属于冠状病毒科的动物源性呼吸道病毒，具有包膜的正单链RNA。表面刺突S糖蛋白是设计针对SARS-CoV-2疫苗的主要靶标。这种蛋白对于病毒进入目标细胞至关重要，因为它在亚基S1和S2上分别具有受体结合和融合活性。 已迅速且成功地开发了针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。此外，目前正在开发大量使用不同平台的SARS-CoV-2疫苗，包括病毒载体和基于VLP的疫苗。 许多疫苗基于复制缺陷型腺病毒载体，编码不同版本的S蛋白或表位，如受体结合域（RBD）。迄今为止，已有四种腺病毒载体疫苗获得批准（表3）。Janssen（Johnson & Johnson）Ad26.COV2–S SARS-CoV-2疫苗是一种复制缺陷型Ad26载体，编码全长S蛋白的前融合构象，于2021年全球获批使用。Gam-COVID-Vac或Sputnik疫苗由基于Ad26载体的异源方案和Ad5增强剂组成，两者都编码全长S蛋白，于2021年春季在俄罗斯作为紧急疫苗获批。Oxford/AstraZeneca疫苗基于黑猩猩腺病毒载体（ChAdOx1 nCov-19），包含编码蛋白S的转基因。Convidecia疫苗基于Ad5（Ad5-nCov9），由中国的CanSino开发。 此外，目前正在进行大量临床前和临床试验。AdCOVID是一种基于Ad5载体的疫苗，表达S蛋白的RBD区域。这种载体可以在小鼠中有效引发粘膜免疫。第二代Ad载体hAd5-S-Fusion + N-ETDS编码刺突和N蛋白。该载体旨在免疫并保护可能的新出现的变种，目前正在进行I期临床试验。GRAd-COV2是第一代大猩猩腺病毒载体，编码在前融合构象中稳定的S蛋白，已在II期临床试验中进行了测试。 一种携带全长膜锚定的S蛋白的慢病毒载体已被证明，在通过鼻内接种后，能够在临床前动物模型中对SARS-CoV-2提供保护。基于新城疫病毒（NDV）的载体表达S蛋白，也已针对SARS-CoV-2设计并在I、II、III期临床试验中进行了测试。NDV-HXP-S载体含有一种增强免疫原性的S蛋白版本，该版本保持了刺突蛋白在稳定的前融合构象。这种疫苗可以在鸡蛋中以低成本高效生产。NDV-HXP-S既适用于活疫苗，也适用于灭活疫苗。I期临床试验表明，通过肌肉注射或鼻内途径给予NDV-HXP-S载体是安全且高度免疫原性的。在泰国，灭活的NDV-HXP-S疫苗已获得紧急使用授权。使用狂犬病病毒（VSV）作为疫苗载体也已针对SARS-CoV-2进行了使用，利用了为设计埃博拉疫苗而发展起来的成熟平台。这些载体表达S蛋白，无论是在其原始未修饰的非稳定构象中，还是在优化的前融合稳定构象中，以及核衣壳。大量的基于改良型安卡拉病病毒（MVA）的疫苗候选物已针对SARS-CoV-2设计并在临床前和临床试验中进行了测试。此外，来自不同病毒的病毒样颗粒（VLP）平台，如流感、新城疫病毒和莫洛尼鼠白血病病毒等，也被用于SARS-CoV-2疫苗的开发。基于VLP的SARS-CoV-2疫苗目前正在临床前和临床研究中，Novavax的NVX-Cov2373疫苗是唯一商业化的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。最近，加拿大批准了植物制造的SARS-CoV-2 VLP疫苗Covifenz。 6.结论性评论  病毒载体最初用于基因治疗，其中第一种疫苗是20世纪80年代开发的天花病毒载体疫苗。自那以后，许多病毒载体疫苗已被设计用于人类疫苗接种，并已成为解决传统疫苗限制的新平台。腺病毒载体在COVID-19疫苗接种中的广泛使用已证明这项技术既安全又有效。此外，病毒载体促进了对新病毒变种和新出现的病毒的新病毒载体的重新设计，并可用于大规模生产。 腺病毒载体是临床试验和批准疫苗中最常用的载体。由于Ad5血清流行率，其他较少见的人类和猴血清型被用作载体。然而，出于安全考虑，更倾向于使用复制缺陷型载体。此外，通常去除载体的病毒复制必需基因和防止宿主免疫反应的基因。这一领域的大量研究导致了第三代载体的设计，主要是腺病毒和慢病毒载体，从而增加了转基因的大小并提高了安全性。 一些病毒载体疫苗已获得人类疫苗接种的许可，然而，许多使用病毒载体疫苗候选物的临床前和临床试验仍在进行中。病毒载体疫苗已在单一试验中进行了测试，并对HIV免疫接种产生了适度的结果。因此，开发针对没有有效传统疫苗的病原体的疫苗，如HIV、丙型肝炎病毒和埃博拉病毒等，至关重要。 VLP是一种新兴的多功能疫苗平台，近年来已被显著用于生产几种商业化疫苗。从这个意义上说，VLP衍生的疫苗被提出作为对抗新出现的病毒和开发通用流感A疫苗的有希望的解决方案。 利用病毒载体和其他技术，如mRNA和蛋白质亚单位疫苗，迅速开发COVID-19疫苗进行全球疫苗接种，突显了这些技术的成功。这一成功强调了拥有基于先前研究的正确平台的重要性，并验证了病毒载体针对新出现的病毒和大流行爆发的有效性。 7.展望  病毒载体和VLP基础疫苗的巨大潜力推动了新疫苗的持续设计。大量针对重要病原体的疫苗，如流感、HIV、RSV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2，目前正在开发中，有些处于临床前或临床试验阶段。然而，尽管在开发病毒载体和VLP基础疫苗方面取得了显著进展，但仍需解决许多挑战。具体来说，进一步的研究对于提高其安全性至关重要，解决与预先存在的免疫、可能整合到宿主细胞基因组以及产生致病表型相关的担忧。此外，开发针对主要人类病原体或疾病（如HIV、Epstein-Barr病毒、丙型肝炎病毒和结核病）的有效疫苗至关重要。努力还应集中在创建通用流感疫苗和发展新的载体以免疫针对新出现的变体上。此外，改进多价疫苗、克服扩大病毒载体在被动免疫中使用的挑战，以及推进病毒载体在预防性或治疗性癌症疫苗中的应用，是未来研究的关键领域。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 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