Coproporphyria, Hereditary

©氨基观察-创新药组原创出品作者 | 武月在中国，每天都有患者需要人血清白蛋白——这种被称为“救命药”的血浆制品，是烧伤、肝硬化和大出血患者的生命防线。国内人血球蛋白用量非常之大，根据弗若沙利文数据，2023年中国人血白蛋白药用市场规模达到361亿元，预计2025年该市场将达到425亿元。然而，国内60%以上的供应依赖进口，血浆采集量仅能满足不到40%的需求。仅靠捐献的血浆，并不能满足国内庞大的需求，药企一直在能想方设法通过基因工程的方法大规模生产白蛋白。由于白蛋白使用剂量高、用量大，对安全性、成本、规模化生产要求高，一直未能有超高纯度且安全性拉满的重组白蛋白产品出现。转机出现在2024年-2025年。禾元生物的植物源重组白蛋白注射液HY1001与安睿特的重组白蛋白注射液产品相继完成国内III期临床，疗效与安全性数据直逼传统人血白蛋白。其中，HY1001的国内上市申请已受理并纳入优先审评名单，禾元生物预计今年三季度获批上市；此前安睿特的产品已经在俄罗斯获批上市。这些突破或许意味着，白蛋白市场要变天了，轰轰烈烈的国产替代终于要在这一领域上演了。/ 01 /从水稻到酵母人血清白蛋白是血浆中最丰富的一种蛋白质，能够挽救一些休克、大出血、手术性失血等重症病人的生命。重组人血清白蛋白，顾名思义就是要对血浆提取得到的人血白蛋白进行替代。早在1981年，科学家就成功在大肠杆菌中表达出重组人白蛋白，但遗憾的是由于缺乏正确折叠和翻译后的修饰加工，这个重组白蛋白并没有生物功能。也就是说，重组人白蛋白必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰才能具备其特定的结构和功能。因此，其中的关键就在于选择一个合适的表达系统。科学家努力到现在，开发了原核表达系统、酵母表达系统、转基因动物表达系统、转基因植物表达系统来生产重组人血清白蛋白。其中，国内药企的研发主要聚焦在植物细胞和酵母细胞两大表达体系。禾元生物作为前者的代表，其重组白蛋白正是利用水稻产生出来的。尽管“水稻造血”听上去不可思议，但这的确是科学进步带来的成果。简单来说，其将人血清白蛋白基因植入水稻染色体，利用植物光合作用实现白蛋白合成。按照公司创始人杨代常的说法，5公斤稻米提纯出的人血清白蛋白，相当于1升血浆提取的量。2024年11月底，禾元生物宣布HY1001在确证性临床研究中成功达到研究终点。结果显示，在肝硬化低白蛋白血症患者中，HY1001给药剂量20g/天，最长给药14天，其提升血清白蛋白水平的疗效不劣于人血浆来源的白蛋白（pHSA），且能在随访期保持与pHSA相当的稳定疗效。达到了临床试验设计的主要研究终点，并有良好的安全性。研究中没有产生有临床意义的抗药抗体和抗HCP抗体。除了禾元生物，“酵母派”代表安睿特也取得了重大突破。日前，其宣布研发的重组人白蛋白产品国内Ⅲ期临床研究完成揭盲。初步结果显示，该产品在治疗肝硬化腹水患者低白蛋白血症具有良好的疗效，与人血白蛋白疗效相当，起效速度相近且疗效维持时间更具优势，安全性和耐受性良好。在此之前，安睿特已经完成在俄罗斯的注册，获得欧亚经济联盟-俄罗斯联邦卫生部的批准上市，成为全球首个上市的重组人白蛋白注射液。尽管技术路线不同，但这些突破都意味着，经历多年的研究失败，重组白蛋白终于跨过了实验室的验证鸿沟。/ 02 /国产替代攻坚战基于战略属性、日常治疗需求和随着国内批签发的增长，白蛋白表现出不错的成长性。根据弗若斯特沙利文的数据，2020年中国人血白蛋白治疗药物市场规模为258亿元，2030年预计增长至570亿元，2025-2030年复合增长率达6%。 市场起步较早、规模稳定增长、可观，然而国内人血白蛋白至今仍未实现自给自足。按照WHO的相关报告，一个国家需要至少10L/千人的采浆量，来满足国民对白蛋白的基本临床需求。按我国14亿人口估算，则需超过14000吨的采浆量。受限于国内血浆供应，一直以来我国需要依靠进口来填补供需缺口。根据中检院批签发数据，2024年，白蛋白共批签发5470批次，其中，进口白蛋白共批签发3677批次，国产白蛋白批签发批次占比则为33%，整体与2023年持平。Octapharma、CSL Behring、Takeda和 Grifols这四家海外血制品巨头，市场份额超60%，存在较大的国产替代空间。也正因此，血制品公司核心成长逻辑之一是扩张浆站、提高单产来实现进口替代。目前来看，重组白蛋白也将加入这一替代攻坚战。一直以来，由于专利及技术壁垒等问题，全球涉足重组人血清白蛋白赛道的企业较少。再加上，白蛋白使用剂量高、用量大，对安全性、成本、规模化生产要求高，一直未能有超高纯度且安全性拉满的重组白蛋白产品出现。若禾元生物及安睿特的重组白蛋白能够成功获批上市、大规模产业化供应，势必会如当初国产重组凝血因子上市般，加速进口替代，惠及更多患者。毕竟，重组白蛋白有着成本、安全性优势。目前，市面上的人血白蛋白的价格并不便宜，即便在集采后，人血清白蛋白价格仍维持在300-600元/10克。2024年12月上海阳光医药采购网数据，进口人血清白蛋白中标价为58-62元/克（CSL Behring）。如果植物源重组人血清白蛋白能够成功，事情就不一样了。禾元生物披露数据显示，目前重组人血白蛋白的成本大概是在10-13元/g，未来随着技术升级迭代带动表达量的提升，成本有望进一步降至7-10/g。实现规模化生产后，生产成本将远低于血浆分离人血清白蛋白的生产成本。在安全性上，重组白蛋白也更具优势。人类血液中存在慢性乙肝、艾滋病和未知病毒等传染性疾病的潜在风险，且即使经过纯化工艺也难以保证不会将病毒带入产品中，而来源于植物的重组白蛋白则没有这一重顾虑。而酵母表达的重组白蛋白，虽仍有日本田边三菱酵母重组白蛋白因免疫原性问题撤市的阴影，但是按照安瑞特的说法，与之相比其将产品纯度提升了近1000倍，糖基化水平则从45%降至3%以下，并且从分子结构上与人肝脏新生的血清白蛋白几乎完全一致，从源头上避免了血源匮乏的影响与重组人白蛋白的免疫原性问题，杜绝了病毒污染问题。一切迹象都在表明，白蛋白市场终于要变天了。/ 03 /还需翻越的大山随着重组白蛋白的商业化，在一定程度上改写市场竞争规则，也犹未可知。毕竟，重组凝血因子的国产化之路已经证明，从实验室到临床到产业化的成功跨越，足以重构市场格局。当然，在此之前，重组白蛋白还需翻越几座大山。首先就是，纯度与工艺的终极考验。由于白蛋白的广谱性结合能力，能结合许多内源性和外源性物质，其在发酵、植物合成过程中极易结合未知 杂质，因此在纯化过程中不仅要去除表达环境中有关杂质，还需取出白蛋白结合和聚合的杂质。如何低成本地获得高质量高纯度的重组白蛋白，并且在大规模生产中保证生产工艺的稳定，仍需后续的持续验证。目前看，禾元生物、安睿特均已经提前进行了产业化布局。前者已经建成年产10吨的单条产线，在IPO募集资金到位的情况下，并计划在Ⅲ期临床完成后再建一条年产120吨的生产线。后者则已经于去年投产一个年产量50吨的生产基地，还计划在10年内建设12条年产50吨的生产线。其次是适应症的拓展。目前，无论是已经完成Ⅲ期临床的重组白蛋白，还是其他处于临床的产品，基本均以肝硬化相关并发症为适应症，而肝脏疾病在白蛋白临床使用比例不到10%。 为此，药企都在布局。比如禾元生物，其在招股书中表示，未来将在严重烧伤、重症脓毒血症、恶性肿瘤恶病质等适应症上进行拓展研究。然而对于这些完全不同病理的适应症，其病理过程、治疗规范、疗效 终点、受试人群等无法做到与肝硬化有效接轨，将大大增加临床试验难度和实现时间。 后续这些适应症的拓展，尤其一些高危适应症市场的研究，仍需时间的严谨验证。当然，尽管前方的挑战不容忽视，眼下重组白蛋白的突破也足够珍贵，尤其是在美国对中国、对生物技术产业反复加码制裁的背景下。期待这场以技术为驱动的重组白蛋白革命，能够让我们在生命急救的战场上，早日摆脱进口依赖。PS：欢迎扫描下方二维码，添加氨基君微信号交流。

摘要：宿主细胞蛋白（HCPs）是生物制药过程中可能与药物共纯化的杂质，其中部分被视为 “高风险” HCPs，会对药品质量、安全性等产生不良影响。BioPhorum 开发小组的 HCP 工作流团队经多方调研，整理出常见 HCPs 和高风险 HCPs 清单，并分类给出风险评估和控制策略建议 ，旨在助力生物制药行业有效监测和控制高风险 HCPs，保障药品质量和安全 。一、引言：关注高风险 HCPs 的重要性在生物制药过程中，宿主细胞蛋白（HCPs）作为一类杂质，有可能和药物一起被纯化出来 。其中，一些 HCPs 问题较为突出，被称为 “高风险” HCPs。它们可能具有免疫原性、生物活性或酶活性，会降解药物分子或制剂中的辅料，还可能难以通过纯化去除 。虽然目前已知 HCPs 对患者安全有直接影响的案例较少，但生物制药行业仍高度关注这些高风险 HCPs 。BioPhorum 开发小组（BPDG）的 HCP 工作流团队开展了 26 家公司的合作项目，旨在梳理出高风险 HCPs 相关信息，为行业提供指导 。二、下游工艺中常见的 HCPs 及相关研究方法常见 HCPs 清单：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达系统常用于生物制药，经研究发现，许多 HCPs 在不同公司的下游工艺中普遍存在 。BPDG HCP 工作流团队整理出一份常见 HCPs 清单（原文 Table 1，展示常见 HCPs 的详细信息，包括分子量、等电点等），并提供了相关数据库链接，方便企业在开发下游工艺或优化现有纯化平台时参考 。共纯化机制及研究方法：部分 HCPs 能通过特异性或非特异性结合的方式，与产品一起在纯化过程中留存下来 。为研究 HCP 与单克隆抗体（mAb）的相互作用，可采用交叉相互作用色谱结合 ELISA 和液相色谱 - 质谱（LC - MS）的方法 。表面等离子共振（SPR）技术则常用于表征 HCP 与 mAb 的结合特异性、亲和力和动力学参数，但该方法需要足够量的目标 HCP 。此外，改变洗涤条件或使用不同的树脂，可用于探究 HCP 与 mAb 非特异性结合的原因 。三、HCPs 的分类风险分类依据：对单个 HCPs 进行免疫原性高低风险分类并不简单，会受到药物适应症、给药途径、给药频率等多种因素影响 。BPDG HCP 工作流团队依据 HCPs 与产品共纯化的能力、在下游工艺中出现的频率、对药物和辅料的影响以及潜在免疫原性等因素，将问题 HCPs 分为产品质量、制剂、对人体直接生物功能和免疫原性四大风险类别 。各类高风险 HCPs 举例：在产品质量方面，像组织蛋白酶、金属蛋白酶等具有酶活性的 HCPs，可能会降解 mAbs；伴侣蛋白 GRP78 表达过高，可能导致重组产品在细胞内聚集 。在制剂方面，脂蛋白脂肪酶（LPL）、溶酶体磷脂酶 A2（LPLA2）等脂肪酶家族的 HCPs，会降解制剂中的聚山梨酯 。具有细胞因子功能的 HCPs，如单核细胞趋化蛋白 - 1，可能会引发人体生物学反应 。还有一些 HCPs，如谷胱甘肽 - S - 转移酶 P1、过氧化物还原酶（PRDX）等，可能会引起人体不必要的免疫反应（原文 Table 2，呈现各类高风险 HCPs 的具体信息，如功能、影响和相关参考文献） 。四、BPDG HCP 工作流团队的调查结果HCPs 的识别与清除情况：BPDG 团队对 26 家公司进行调查，多数公司（69%）表示在药物生产过程中遇到过单个 HCPs 相关问题 。调查结果显示，磷脂酶 B - 样 2（PLBL2）是被识别和检测出最多的 HCP，且多数公司能证明其在生产过程中被清除 。此外，LPL、组织蛋白酶（D、B 和 L）和 LPLA2 等也常被检测到 。分析方法的使用情况：在识别和定量单个 HCPs 的分析方法上，多数公司（13/18）采用质谱（MS），11 家公司使用针对特定 HCP 的酶联免疫吸附测定（ELISA） 。在定量总 HCPs 和表征总 HCPs 时，多数公司使用一种或多种 HCP ELISA 方法，也有部分公司采用 MS 定量、Gyros 和 Meso Scale Discovery（MSD）等技术 。关于 MS 分析，多数公司（15/18）用于工艺开发支持，64% 的公司采用相对定量法 。在样品制备方面，67% 的公司在分析前不富集 HCPs，多数公司（13/18）使用胰蛋白酶进行消化 。在 MS 方法选择上，数据依赖采集和数据独立采集的使用比例相同（均为 6 家公司）。（原文 Figure 1、Figure 2、Figure 3、Figure 4，更直观地展示调查结果）监管反馈情况：45% 的受访者表示未收到监管机构关于 HCP 分析测试策略的反馈，36% 的受访者表示收到过反馈，其中 18% 的人提到监管机构要求提供 2D 覆盖相关信息 。反馈内容还包括要求描述 HCP 检测方法、建议在后期开发中使用特定工艺或平台的 HCP 检测方法等。五、行业监测和控制高风险 HCPs 的建议综合分析策略：采用免疫分析（如 ELISA）测定总 HCP 水平，这是指导工艺开发和支持药品生产质量管理规范（GMP）批次放行检测的主要方法 。同时，使用 2D - 凝胶 / 免疫印迹或抗体亲和提取结合 MS 等正交方法，评估针对特定工艺 HCP 的关键抗体试剂的覆盖范围 。定期进行总 HCP ELISA 检测，监测工艺样品中的 HCP 水平 。当 ELISA 检测到总 HCP 水平升高、出现稀释非线性或产品质量受影响时，建议采用 MS 等正交方法或其他单个 HCP 检测方法，确保产品纯度 。针对高风险 HCPs 的措施：若识别出潜在高风险的单个 HCP，可开发特定的免疫分析（如 ELISA）或靶向 MS 分析方法，监测其水平和潜在影响 。对于具有酶活性的 HCP，开发活性检测方法，监测、去除或灭活该蛋白 。通过计算机模拟方法评估免疫原性风险，若预测结果显示风险较高，则进一步进行体外比较免疫原性评估（IVCIA） 。此外，毒理学评估有助于确定 HCP 对临床的风险 。ELISA 方法具有高通量的优势，但在方法验证时需确保抗 HCP 多克隆抗体试剂的充分覆盖；MS 分析可提供 HCP 的身份信息，有助于识别潜在高风险 HCP，但由于最终产品中单个 HCP 水平极低，对一些公司来说，获取完整的 HCP 谱仍具有挑战性 。六、结论HCPs 的检测、定量和从生物治疗过程中去除是复杂的工作 。本文提供的高风险 HCPs 清单，可作为企业开发 CHO 细胞生物治疗药物的参考 。对高风险 HCPs 进行分类，有助于企业在生产过程中识别 HCPs 后，进行风险评估并制定控制策略 。综合运用文献调研、LC - MS/MS HCP 谱分析、单个 HCP 定量和酶活性检测等方法，可确定 HCPs 对产品质量和制剂的影响 。计算机模拟免疫原性评估和体外细胞实验，有助于评估 HCPs 对人体的潜在风险 。这些综合信息对于制定有效的 HCP 控制策略、确定产品稳定性和临床安全性风险以及是否需要进一步纯化或调整配方至关重要 。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在治疗性抗体生产这场大戏中，一次性深层过滤器可是个重要角色。它能降低浊度，去除工艺相关杂质，比如宿主细胞蛋白（HCP）和 DNA ，这些杂质可都是关键质量属性。本研究发现，深层过滤器居然能再生，而且至少能重复使用 10 次，同时还能保持相当高的澄清能力。研究评估了三种过滤器类型，包括标准纤维素和完全合成基质材料，采用酸性或碱性溶液交替进行上样和再生操作。碱性和酸性溶液都挺有效，不过，从整体来看，过滤材料的酸性再生似乎更适合多次使用。这在含二氧化硅的 XOSP 过滤器上表现得尤为明显，HCP 和 DNA 几乎被 “赶尽杀绝”，而且在 10 次使用中都维持在较低水平。同时，产品质量也得以保持，这说明过滤器基质对再生有很强的抵抗力。这些意外发现，为下游工艺中过滤器载量提供了更大灵活性，比起一次性应用，还有生态优势。说到过滤工艺的碳足迹，计算表明能实现 4 倍的潜在节省，主要是因为塑料废物减少了。所以，深层过滤器的重复使用对生产过程中的可持续性很有帮助，还能减少二氧化碳排放。 简介 基于细胞培养的生物制药，比如单克隆抗体（mAb）的生产，那可得经过大量纯化程序，才能有满意的产量和纯度。而且现在高细胞密度和 mAb 滴度带来的挑战越来越大，这就意味着工艺相关杂质含量很高。在各种澄清技术里，深层过滤方法可能出现在下游纯化工艺的好几个步骤中。通常离心之后，它就会在初级（一级）澄清中闪亮登场，主要任务是从细胞培养收获物里去除细胞碎片和不溶性物质，从而保护后续的层析柱或除菌过滤器，不让它们堵塞，维持填料的高性能和长寿命。在更下游的地方，比如 mAb 捕获之后，深层过滤可以用于二级澄清和降低浊度，像在低 pH 调节和洗脱液中和可能产生沉淀的情况下就派上用场了。此外，深层过滤还能在病毒灭活、离子交换层析、除病毒过滤和超滤之前或之后灵活使用，延长精纯步骤中基质和层析柱的寿命。 深层过滤器除了有这些优点，还能清除相当多的杂质，尤其是工艺相关成分，比如 HCP 和 DNA，甚至有报道说它还能去除产品相关杂质，像高分子量和低分子量形式。尽早降低杂质含量，通常能让后续层析步骤更顺利。 一般来说，深层过滤器利用多层材料基质构建密度和孔径梯度。除了尺寸排阻，颗粒和杂质的截留还涉及通过疏水、离子和其他相互作用，比如氢键进行吸附。不同的过滤材料对应不同类型的深层过滤器。通常，多孔基质由纤维素纤维组成，还会加上助滤剂来增加表面积，用粘合剂稳定。比如说，带负电荷的硅藻土（DE）作为助滤剂，就特别适合结合带正电荷和疏水性的蛋白质。不过，天然来源的成分性能可能会有变化，还可能是有机和离子可提取物的来源。相比之下，最近推出的全合成过滤介质，过滤器规格更明确，被认为能提供更高的过滤器成分和功能特性一致性，和标准过滤器比起来，它在去除 HCP 和聚合物杂质方面表现更好。和 DE 一样，这种基质中用作助滤剂的二氧化硅，适合通过静电和疏水相互作用吸附带正电荷的 HCP。 深层过滤器一般都是一次性使用，是典型一次性技术的代表。一次性过滤器除了有稳定的清除特性，还能连续处理，很适合连续生产系统，因为这样可以避免系统停机进行在线清洗。不过，和多次使用比起来，一次性应用的浪费和成本通常会增加。除了要降低总体成本，生态节约资源也很迫切。 深层过滤器在使用过程中的污染机制，可能包括孔隙堵塞、滤饼形成和孔隙收缩。所以，得有有效的再生方法，去除过滤出的杂质，恢复和未使用过滤器一样有效的基质条件和清除特性。用氢氧化钠进行碱性再生，因为有杀菌和灭菌特性，已经成了清洁和消毒层析柱的标准方法。不过，用蛋白质配基或基于二氧化硅以及玻璃的层析介质，可能对氢氧化钠敏感。比如说，氢氧化钠处理会诱导二氧化硅基质中硅氧烷键水解。对碱性溶液敏感的材料，可以选择酸性处理，这是另一种大家熟知的再生基质和填料的方法。 本研究调查了在二级澄清中用作一次性耗材的深层过滤器，通过再生，其清洁和截留性能能不能恢复到可以多次使用的水平。为此，进行了好几个实验系列，包含多个过滤器使用和再生循环，评估了不同过滤器类型在碱性和酸性再生溶液中的表现。让人惊讶的是，这两种再生方法都能在多个循环中有效恢复 HCP 和 DNA 去除能力，还不影响单体产品质量。总体而言，尤其是酸性再生展现出的高截留清除能力，表明深层过滤器至少能重复使用 10 次，性能和一次性使用差不多。基于这些意外结果，我们估算了相应的生态节约潜力。详细实验操作和结果，请看原文。 深层过滤器 PDD1 SUPRAcap - 50 深层过滤器（Pall Corporation）：由纤维素纤维、DE 和珍珠岩组成，过滤面积为 22 cm² 。 Zeta Plus Biocap VR02 深层过滤器（Zeta GmbH）：由纤维素纤维基质和通过离子电荷改性产生的带电表面基团组成，过滤面积为 25 cm² 。 Millistak + HC Pro XOSP 深层过滤器（Merck Millipore）：由合成聚丙烯酸纤维基质和作为助滤剂的二氧化硅组成，过滤面积为 23 cm²，适用于二次澄清应用。 孵育和再生溶液 平衡和洗涤缓冲液：150 mM 乙酸 /tris，pH 5.5。 碱性再生溶液：1.0 M 氢氧化钠。 酸性再生溶液：两种，一种是 500 mM 磷酸，一种是 167 mM 乙酸 / 300 mM 磷酸。 实验设计 过滤实验用 Äkta Avant 150 层析系统（Cytiva）进行，过滤器安装在柱阀上。监测压力、pH 值、电导率、OD280 ，通过样品泵调节施加量。过滤器操作压差不能超过 2.8 的极限。 使用前，用水和平衡缓冲液（各 100 L/m² ，流速 10.0 mL/min）调节过滤器。上样时，进料流量在 200 L/m²/h 范围内（XOSP：200 L/m²/h、PDD1：191 - 200 L/m²/h、VR02：184 L/m²/h），质量吞吐量约为 600 g/m² (599 - 690 g/m²)。体积吞吐量始终调整为计算出的上样流量 7.67 mL/min。收集 OD280 值超过 0.5 AU 的过滤器流出物。上样完成后，用平衡缓冲液冲洗过滤器，洗出剩余蛋白质溶液，并收集 70 L/m² 的流穿物。 用水和平衡缓冲液调节过滤器，准备下次过滤。这是参考实验的过滤器再生程序，在碱性和酸性溶液再生之前进行。 如果进行碱性处理，过滤器在初始调节后，用 70 L/m² 1 M 氢氧化钠（流速为 7.67 mL/min）预孵育，然后在使用前孵育 4 小时。用 1 M 氢氧化钠冲洗蛋白质约 30 分钟后进行过滤器再生。用水（100 L/m²）去除再生溶液。总的来说，过滤器在 pH 值高于 10 的环境中暴露约 50 分钟。为了准备过滤器用于下一次过滤，像上面说的那样用平衡缓冲液调节。 滤膜的酸性再生在蛋白质冲洗后进行，用 500 mM 磷酸或较温和的 167 mM 乙酸溶液 / 300 mM 磷酸溶液（流速为 7.67 mL/min）处理约 30 分钟。用水（100 L/m²）去除再生溶液。总的来说，滤膜在 pH 值低于 2 的环境中暴露约 50 分钟。为了准备滤膜用于下一次过滤，用平衡缓冲液调节，和上面说的一样。交替进行产品过滤和再生的过程，重复了多达 9 个循环，这样过滤器就能使用 10 次（参见图 1 中过滤器再生过程的概述（大规模实验）和支持信息：图 S1（小规模实验）。总之，过滤器上施加的蛋白质量高达约 6000 g/m²（10 × 600 g/m²）。获得的过滤池在分析前一直保存在−80°C 下。 图 1：实验装置概览，比较了 10 个深层过滤单元的单次使用和 10 次使用单个过滤单元的情况。计算了 2000 L 过滤规模 (2k) 的材料和溶液消耗量，相当于从 Protein A (ProtA) 洗脱液中获得约 3300 g 蛋白质。结果与讨论碱再生与酸再生的比较 在一系列实验中，用碱性（1 M 氢氧化钠）和酸性（0.5 M 磷酸）再生溶液，评估了恢复用于亲和捕获获得的 mAb 洗脱液二级澄清的过滤器的清除能力的可能性。和用于洗涤和平衡的缓冲溶液（150 mM 乙酸 /tris，pH 5.5）对比，研究了这些再生溶液对过滤器性能的影响。根据 GMP 关于封闭系统中的灭菌和内毒素灭活的指导原则，还用氢氧化钠进行初始过滤器预孵育。在每个系列中，通过交替进行蛋白质上样、过滤和过滤器再生循环，检查了过滤器总共 10 次的使用情况。每次使用时，测量过滤器在清除 HCP 和 DNA 杂质方面的性能，通过主峰分析评估过滤后的 mAb 产品质量。纤维素纤维基质过滤器 PDD1 过滤器是含有 DE 和珍珠岩作为助滤剂的标准纤维素过滤器的代表。一开始上样中的 HCP 和 DNA 水平很高，这个过滤器在第一次使用时，几乎把所有杂质都 “扫地出门” 了（图 2A、B）。第二次使用过滤器（包括一个再生循环）后，在缓冲液参考和酸性再生的流穿中，检测到 HCP 水平略有上升，值低于 5%，而碱性程序的 HCP 含量保持在较低水平（图 2A）。第三次使用后，缓冲液对照显示出明显增加（21%），在后续使用中继续上升，最终达到一个平台期，值在上样的 50% 范围内。相比之下，通过连续酸再生获得的 HCP 水平，只是稍微增加了一点，最终达到上样值的 6.5%。不过，碱再生的水平在 7 次过滤器使用后才保持在 2% 以下，然后持续上升到上样值的 22%。 图 2：纤维素深层过滤器 PDD1 重复使用的碱性和酸性再生比较（蓝色，平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；黄色，碱性溶液 1 M 氢氧化钠；灰色，酸性溶液 500 mM 磷酸）显示（A）HCP 去除、（B）DNA 去除和（C）SE - HPLC 主峰分析产品质量。L，上样。如果缺少柱状图，则测量值低于检测限或太小而无法可视化。HCP，宿主细胞蛋白；SE - HPLC，尺寸排阻高效液相色谱法。 至于 DNA 含量，缓冲液处理后，在使用 3 次过滤器后，DNA 含量开始明显增加，使用 4 次后达到起始水平的约 40%（图 2B）。相比之下，用酸再生时，整个系列中 DNA 水平都检测不到，而碱再生在使用 7 次后，DNA 水平略有上升，最终在使用 10 次时达到 23% 的水平。在碱性和酸性再生过程中，主峰单体的产品质量保持良好，值≥98%，而缓冲液对照值下降到 96% 的范围（图 2C）。 总体而言，这些意外结果表明，PDD1 过滤器在再生和多次使用过程中，保持了高清除能力。碱性和酸性再生在多次循环中都保持了令人满意的 HCP 和 DNA 去除效果。虽然酸性处理能完全去除 DNA，HCP 值只是略有上升但很稳定，最多使用 10 次；碱性处理能在最多使用 7 次时，几乎完全去除 HCP 和 DNA，然后导致两种杂质略有增加，这表明清除能力仍然很高，但随着进一步使用，清除能力缓慢下降。不过，直到最后一次循环获得的优异单体质量表明过滤器性能未受影响。所以，循环实验表明，过滤器再生能有效去除 HCP 和 DNA，效果很惊人。在酸性处理的情况下，过滤器最多使用 10 次没问题，在碱性再生的情况下，至少 6 次过滤器使用似乎是可行的。合成纤维基质过滤器 在相同实验条件下，用由聚丙烯酸纤维和二氧化硅组成的 XOSP 过滤器，研究了第二种过滤器类型的再生效果。关于 HCP 去除，酸性再生非常有效，能把 HCP 水平保持在最低值，最多可使用 10 次，这表明甚至还能进一步重复使用（图 3A）。本研究观察到 HCP 几乎完全去除至 100 ppm 以下的水平（见图 3D），证实了最近报道的 XOSP 过滤器与标准过滤器相比，对 HCP 和聚合物杂质去除效果更好。相比之下，碱性再生和对照缓冲液处理实现了整体减少，但没达到酸性再生的水平，然后随着循环进行，HCP 持续增加。有意思的是，过滤器的碱性预处理似乎影响了 HCP 的截留，表现为第 1 次使用后值升高，并在接下来的两个循环中进一步增加。 图 3：合成深层过滤器 XOSP 重复使用时的碱性和酸性再生比较（蓝色，平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；黄色，碱性溶液 1 M 氢氧化钠；灰色，酸性溶液 500 mM 磷酸）显示 (A) HCP 去除、(B) DNA 去除和 (C) SE - HPLC 主峰分析产品质量。(D) 显示使用 500 mM 磷酸（灰色）或 167 mM 乙酸、300 mM 磷酸（绿色）进行酸性过滤器再生的 HCP 去除。L，上样。如果缺少柱状图，则测量值低于检测限或太小而无法可视化。HCP，宿主细胞蛋白；SE - HPLC，尺寸排阻高效液相色谱法。 对于 DNA 清除率，酸性再生再次提供了几乎检测不到的值，直至 10 次过滤器使用，而从第 2 次过滤器使用开始，碱性处理观察到少量且恒定的残留 DNA 水平（图 3B）。这种现象表明在酸性处理过程中，该过滤基质的全部 DNA 结合能力得以保留，而碱性再生导致 DNA 结合能力部分丧失，大概是通过第 1 次再生循环后生效的化学改性。令人惊讶的是，即使是缓冲液对照，在 5 次重复使用前也能观察到有效的 DNA 截留，这表明这种过滤器类型有很强的 DNA 去除能力。同样，在所有酸性和碱性再生测试的重复使用中，产品质量都保持在高水平，而使用缓冲液对照时产品质量下降（图 3C）。 所以，对于合成 XOSP 过滤器，获得的结果明显支持酸性再生，以在过滤器重复使用期间保持有效的清除能力。相反，HCP 和 DNA 的去除似乎受到碱性处理的一些影响，这表明氢氧化钠与这种合成过滤基质的相容性较差。除了各自结合位点可能发生变化外，这也可能与报道的二氧化硅对碱性处理的敏感性有关，但在本研究范围内没有进一步研究。在这方面，有趣的是，增加 pH 值已被证明可以增加从 XOSP 过滤基质中提取硅的量。 综合起来，这项比较研究表明，两种类型的过滤器都能有效再生并多次使用。磷酸展现出的出色清除能力，显然更建议对合成 XOSP 过滤器进行酸性再生，而纤维素基 PDD1 过滤器在酸性和碱性再生方面都有令人满意的表现。不过，碱性处理的过滤器重复使用次数似乎比酸性再生的次数更有限，酸性再生似乎对两种过滤器都能实现 10 次以上的重复使用。酸性再生的整体优越结果，促使人们评估第 2 种再生溶液，这种溶液更温和，在实验室实践中更常见。图 3D 显示了 500 mM 磷酸与 167 mM 乙酸、300 mM 磷酸在多次过滤器重复使用过程中对 HCP 的清除率的比较，结果相似，表明再生效果相同。因此，在进一步的再生实验中选择了较温和的酸性溶液。三种过滤器类型的酸性再生比较 为了更有力地证实酸性再生深层过滤器的可重复使用性，我们把使用较温和酸性再生溶液（167 mM 乙酸、300 mM 磷酸）的实验拓展到了 3 种过滤器类型。从 XOSP 和 PDD1 这两种过滤器获取的关于 HCP、DNA 以及产品质量的结果（如图 4A - C 和图 5A - C 所示），再次彰显了其对杂质去除的显著效果，和第 1 次重复使用系列相比毫不逊色，这也凸显出温和酸性溶液那相当优异的再生性能。有意思的是，使用平衡溶液在保留对杂质结合能力方面，尤其在前两个循环中表现尚可，可在此之后，其清除性能和酸性处理相比就有点 “掉队” 了。第 3 个过滤器 VR02，是由经带电表面基团改性的纤维素纤维构成。这家伙的清除能力似乎天生就比较 “弱鸡”，和其他两个参与测试的过滤器相比，它在单次使用后残留的 HCP（约 25%）和 DNA 含量要高得多（请看图 6A、B）。不过，酸性过滤器再生在它身上还是很有效的，因为在过滤器重复使用期间，最初达到的 HCP 和 DNA 水平基本没啥变化，而缓冲液对照那边，两种杂质含量都出现了明显上升。此外，也没有任何迹象表明过滤器的酸性再生以及重复使用会影响单体产品的高质量，其质量范围和其他两种过滤器是一样的（见图 6C）。这 3 种过滤器类型得出的一致结果，支撑了这样一种观点：酸性再生通常能够实现深层过滤器的重复使用，甚至可以将其看作是过滤器的一项通用特性。 图 4 展示的是合成深层过滤器 XOSP 的酸性再生（蓝色代表平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；绿色代表 167 mM 乙酸，300 mM 磷酸），该图呈现了（A）HCP 去除情况、（B）DNA 去除情况以及（C）通过 SE - HPLC 主峰分析的产品质量情况。L 表示上样。要是没有柱状图，那就说明测量值低于检测限或者数值太小，难以直观呈现。HCP 指宿主细胞蛋白；SE - HPLC 即尺寸排阻高效液相色谱。 图 5 呈现的是酸性再生用于重复使用纤维素深层过滤器 PDD1（蓝色为平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；绿色为 167 mM 乙酸，300 mM 磷酸），展示了（A）HCP 去除、（B）DNA 去除以及（C）SE - HPLC 主峰分析产品质量。L 为上样。若缺少柱状图，意味着测量值低于检测限或过小无法可视化。HCP 是宿主细胞蛋白；SE - HPLC 是尺寸排阻高效液相色谱法。 图 6 展示的是酸性再生用于重复使用带有带电表面基团的纤维素深层过滤器 VR02（蓝色表示平衡缓冲液 150 mM 乙酸 /tris pH 5.5；绿色表示 167 mM 乙酸，300 mM 磷酸），呈现了（A）HCP 去除情况，（B）DNA 去除情况（6 次使用，平衡缓冲液出现异常情况），以及（C）SE - HPLC 主峰分析产品质量。HCP 指宿主细胞蛋白；L 是上样；SE - HPLC 是尺寸排阻高效液相色谱法。 在单体含量以及 HCP 和 DNA 的剩余清除能力方面取得的优异成果，表明过滤基质在多次重复使用过程中具备良好的稳定性，并且对重复再生条件有着足够的抵抗力。 很明显，深层过滤器能够多次重复使用这一特性，大大减轻了供应链的负担。而且，过滤器的重复使用还给下游工艺带来了操作上的优势，毕竟过滤器面积的可用性变得更加灵活了。从这个角度看，过滤器再生能够增加可用的过滤器面积以及处理量，从而有效避免高负载、过滤器过载、堵塞以及杂质突破等风险，这对稳健程序的实施可谓是提供了极大的支持。虽说在具体情况中需要权衡利弊，但获得的灵活性以及在二氧化碳足迹方面的节省，很有可能弥补再生过程所增加的时间成本。这个假设是有事实依据的：目前的结果是基于最大再生时间和溶液体积得出的，而这些其实是可以优化的，比如缩短孵育步骤、减少溶液消耗。在这方面进一步的调整，对于连续生产方法而言尤为重要。可持续性方面的考量 本研究结果清晰地表明，深层过滤器再生能够让过滤器实现多次使用，而不是像以前那样只能一次性使用。除了能节省原材料、减少塑料废物这些显而易见的好处之外，多次使用还能降低纯化过程对环境的影响。为了更细致地估算节约潜力，我们把一次性使用 10 个不同过滤器单元的程序，和 10 次使用或重复使用单个过滤器单元进行了对比，就像图 1 所展示的那样，2000 L 深层过滤装置差不多对应着约 3300 g 蛋白质，这在生产过程中是比较常见的规模。基于对材料和缓冲液消耗的假设，我们把节约潜力评估换算成了二氧化碳当量（见图 7），结果显示，和一次性使用程序相比，3 种过滤器重复使用方案中的每一种，二氧化碳排放量都大约低了 4 倍。对于使用 167 mM 乙酸和 300 mM 磷酸的酸性再生而言，节约潜力为每 2k 批次 522 kg 二氧化碳当量。这超过 4 倍的差异主要是因为过滤器在计算中占了大头，而额外使用的再生溶液所产生的影响相对较小。尽管由于过滤器值的估计存在一定不确定性，但图 7 表明，即便过滤器部分的占比降低，一次性使用和重复使用之间仍然存在较大的剩余差异。此外，我们所呈现的结果（见图 2 和图 3）还显示，过滤器甚至可以使用 10 次以上，这就又提供了额外的节省空间。 图 7 展示的是计算 2000 升（2k）过滤装置的碳足迹（kg CO₂当量），对比了一次性使用 10 个深层过滤单元的程序和 10 次使用单个过滤单元的程序，应用了再生溶液 Reg A（500 mM 磷酸）、Reg B（1 M 氢氧化钠）和 Reg C（167 mM 乙酸、300 mM 磷酸）。柱状图由水（蓝色）、缓冲化学品（黄色）、再生溶液（黑色）和过滤器（橙色）几部分构成。 所以，本研究表明，多次使用深层过滤器有助于减少二氧化碳排放，还能提升生产规模下游工艺的整体可持续性。这些发现对当前越来越多地应用一次性技术的趋势发起了挑战，也提醒我们要延长那些通常被当作一次性用品的材料的生命周期。一旦二氧化碳 “价格” 持续上涨，从经济角度来看，节约效应也会变得愈发重要。结论 本研究对深层过滤器的再生能力展开了探究，结果出乎意料地发现，过滤器能够重复使用，并且不会损失二次清除性能，这一性能是通过从亲和捕获的 mAb 制剂中去除 HCP 和 DNA 杂质来评估的。为了实现多次使用，根据过滤器的组成，酸性和碱性再生或许都可行。不过，从对 3 种过滤器类型的评估来看，酸性再生似乎更有效、更稳定，其中合成过滤器貌似至少可以重复使用 10 次。除了减轻供应链负担之外，过滤器的重复使用还提高了工艺过程中过滤器面积的可用性，有助于实施稳健的程序，而且通过减少浪费和二氧化碳排放，为生物制药生产的可持续性提供了支持。鉴于深层过滤器在二级澄清中重复使用所展现出的优势，研究过滤器在一级澄清中的多次使用是很有价值的，尽管由于细胞碎片和杂质含量较高，实现有效再生可能面临更大的挑战。然而，依据本研究令人惊喜的发现，再生即便在更严苛的条件下也有可能发挥作用，或者我们可以相应地调整程序。此外，本研究的结果对于除 mAb 之外的生物治疗产品形式的处理同样适用。 原文: B.Spensberger, F.Stueckler, M.Pompiati, et al., Multiple Use of Regenerated Depth Filters in Antibody Purification Processes. Biotechnology and Bioengineering, 2025. 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。