Dysequilibrium Syndrome

摘要：生物转化的发展必须整合上游和下游过程。上游生物加工将影响下游生物加工。考虑这一点至关重要，因为下游过程可能构成生物加工中最高的成本。这篇综述全面概述了酶促生物催化中上游和下游生物加工最关键的方面。讨论的主要上游过程包括酶的生产、酶的固定方法、溶剂选择和统计优化方法。本文回顾的主要下游过程是生物催化剂的回收以及产品的分离和纯化。正确选择和结合上游和下游方法将允许开发一个可持续且高效的系统。 1.引言 一个健全的生物过程的开发必须包括适当整合上游和下游过程。上游生物加工包括生物转化初始阶段的任务，但这些也会影响下游过程。这些阶段包括生物催化剂的准备、作为反应介质一部分的溶剂的使用，以及优化方法（见图1）。在开始酶促过程之前，一个关键方面是酶在工业规模上的可用性。全球酶市场正在以6.8%的速度增长。最常用的酶类包括碳水化合物酶、水解酶、聚合酶和核酸酶。它们被用于食品、营养保健品、洗涤剂、动物饲料和生物燃料等行业。大多数酶是由微生物产生的，其次是动物来源的酶，最后是植物来源的酶。这些信息表明了这些工业领域中酶的极佳可用性。来自天然来源的酶由于其生物学起源，通常表现出有限的活性和稳定性。生物催化剂工程包括使用蛋白质工程通过固定化技术或这些的结合来修改酶。蛋白质工程涉及战略性地修改蛋白质结构内的特定氨基酸，主要目标是提高酶的催化性能。另一种稳定和重复使用酶的策略是固定化，它包括将酶固定在材料上（与支持物结合）或在相同分子之间形成交联酶聚集体（CLEAs）。物理和共价键是支持物结合方法之一。物理结合在疏水材料上进行，弱范德华结合，或使用聚合物、生物聚合物或两者结合进行封装。酶与支持物的共价结合是使用双官能团化学物质进行的，该物质与支持物的化学基团和酶表面的氨基酸（如赖氨酸基团）结合。混合方法还结合了物理和共价结合，如异双官能团支持物，酶首先通过疏水作用结合，然后共价结合。统计优化是寻找影响反应转化或产率的变量的最佳条件的有价值工具。为了获得适当的调整和近似，进行先前的实验测试和多个实验设计是必要的。在酶促生物催化中，上游过程有时是必要的，因为它们取决于新技术的要求。例如，一些公司购买已经固定的生物催化剂，而其他公司则为特定应用量身定制它们，以降低成本。必须强调的是，在不回收酶的工业过程中，这些方法将不包括在上游过程中。下游加工确保了商业可行产品的高效回收。在酶系统中，这些过程包括生物催化剂的回收（如果是固定的）和反应产物的分离和纯化（见图1）。正如图1所示，下游过程通常比上游过程更多，这就是为什么它们更昂贵。在需要高纯度最终产品的某些情况下，成本可以达到生产过程总成本的80%。同样，下游过程中对感兴趣产品的纯化需求将取决于它们的应用。例如，如果最终产品是药物化合物，它必须具有高纯度，就像食品工业产品一样。相比之下，一些大宗化合物不需要太多的纯化。关于生物催化剂的回收，这篇综述包括了离心和过滤过程，并将分析包括蒸馏过程、液-液萃取、结晶和色谱在内的分离和纯化示例。通过这种方式，了解感兴趣的产品应用，可以设计生物转化中的上游和下游策略。鉴于此背景，本综述旨在仔细审查结合到生物转化中的上游和下游过程的最新进展。 图1. 酶技术中的上游和下游过程。 2.上游生物加工  在酶促反应中，上游过程包括在细胞中表达感兴趣的酶、用于生物催化剂回收和稳定的固定化方法，以及作为反应介质一部分的溶剂的选择。 2.1.酶的生产 确定一个健壮的生物催化剂作为过程催化剂是一个挑战，因为它的固有不稳定性以及对大规模酶生产的需要。为了确保某些酶的适当可用性，必须遵循一系列步骤来优化酶的生产。最初，需要从天然来源中分离出负责酶生产的微生物。一旦分离出来，了解其基因组变得至关重要，因为这允许进行遗传修饰，从而产生更活跃和更稳定的酶（图2）。这些遗传修饰随后可以通过在通常被认为是安全的（GRAS）微生物中克隆来表达。在文献中，可以发现许多例子展示了遗传修饰和表达如何增强酶的特性和能力。其中之一是在枯草杆菌（Bacillus subtilis）中表达土壤微生物枯草杆菌（Bacillus licheniformis TIB320）的溶菌酶。这种酶在pH值3到9和温度20℃到60℃的范围内显示出高活性和稳定性。根据现有文献，生物催化中最重要的酶包括脂肪酶、漆酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶和淀粉酶。 图2. 酶的生产。 对脂肪酶生产的研究集中在优化培养条件以产生来自Yarrowia lipolytica NNRL Y-1095的胞外脂肪酶，特别强调使用磁场（MF）。成功的条件包括使用10 g/L的葡萄糖、15 g/L的橄榄油和2 g/L的Triton X-100作为表面活性剂。在培养期的第72至144小时应用30 mT MF后，记录到的最高脂肪酶活性达到34.8 U/mL。这些发现证明了MF作为高效生产Yarrowia lipolytica NNRL Y-1095脂肪酶的替代方法的可行性；在随后涉及相同酶生产的调查中，建立了一个双相系统，使用四丁基溴化铵（[N4444]Br）进行脂肪酶分离。该系统实现了100%的提取效率。 漆酶的多样化应用推动了对其生产的研究，同时减少生产成本。漆酶生产有两种主要策略：液体深层发酵（SF）和固态发酵（SSF）。SSF因其高产量和不产生液态废物而优于SF。在固态发酵（SSF）中，一层薄膜紧密粘附在固体基质上；主要的流动相是气体，从而阻碍了质量和热量的有效传递。此外，SSF通常涉及高度异质的成分，进一步复杂化了发酵过程。解决这些挑战对于推进工业发酵技术至关重要。王等人2023年提出的一个替代方案是使用氢氧化钠预处理作为固定支持、营养和诱导剂的木质纤维素废物，以生产漆酶。结果表明，使用氢氧化钠预处理有效地产生了一个底物，显著提高了酶的可消化性，并优化了水分保持能力，从而创造了一个促进Funalia trogii IFP0027菌丝生长的理想环境。此外，记录到的漆酶活性达到了令人印象深刻的2912.34 U/g，与对照组相比增加了7.72倍。另一项研究指出，应用Triton X-100从Shiraia sp. S9中获得漆酶。发现Triton X-100诱导产生大量活性氧（ROS），增加膜通透性，调节乳糖酶的基因表达，并最终导致更高的乳糖酶产量，达到约9.2 ×104 U/L，比对照组大约增加了108倍。 纤维素酶是将复杂的植物细胞壁多糖转化为具有经济重要性的有价值、易于获取的糖的关键酶。提高生产性能的基础原则是：仔细检查发酵过程中的操作变量至关重要。在这种情况下，Triphati等人，2023年，研究了温度和pH对SSF产生纤维素酶的影响。在最佳底物浓度（木质纤维素废物）10 g下，获得了22 IU/gds滤纸（FP）。发现最佳纤维素酶生产条件为40℃和pH 5.5。这些发现强调了利用木质纤维素废物作为成本效益高和可持续底物扩大工业纤维素酶生产的可行性。另一个例子是，使用由羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和小麦麸（WB）组成的底物组合，从Penicillium oxalicum P-07中产生纤维素酶，显示出显著的滤纸（FPase）活性水平。通过精心优化降解条件，观察到在pH 5.0和37℃的温度下，FPase活性增加了1.5倍，从最初的0.30 U/mL增加到提高的水平0.45 U/mL。这些精细调整的操作条件促进了Penicillium oxalicum P-07高效生产纤维素酶。 β-葡萄糖苷酶是一种多才多艺的酶，具有许多应用，包括选择性水解纤维二糖以产生可发酵糖，以及生产用于食品工业的芳香化合物。在这种情况下，Oliveira等人，2021年，优化了碳源，使用中心组合实验设计从Malbranchea pulchella中获得β-葡萄糖苷酶。模型拟合系数为n (R2) 0.9960，F值高。纤维二糖成为最佳碳源，产生了具有显著性能的酶，相对活性为100%，酶活性水平为1.55 U/mg。另一项研究集中在利用从大西洋森林生物群系中分离出的微生物Aspergillus fumigatus菌株生产β-葡萄糖苷酶。这种酶可以有效地使用经济的培养基，如菜籽粉作为底物进行合成。值得注意的是，当在40℃下，pH为4.2，用2.9%的菜籽粉培养101小时时，该酶表现出显著的活性水平，达到24.53 U/mL。 α-淀粉酶是人体消化碳水化合物的关键酶。它在包括唾液腺和胰腺在内的多个器官中产生。α-淀粉酶将复杂的碳水化合物，如淀粉和糖原，分解成更简单的糖，如麦芽糖和葡萄糖。由于其重要性，各种研究旨在增加其产量，如Abo-Kamer等人，2023年的研究。研究人员从土壤样本中分离出来自微生物Bacillus cereus的α-淀粉酶。分离过程涉及系列稀释和平板技术，淀粉酶活性通过淀粉琼脂平板法进行评估。随后，通过使用Plackett-Burman单因素逐一统计设计，优化了酶的生产。在检查的独立变量中，葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4和MgSO4显示出最高的重要性，产生了令人印象深刻的250 U/mL的α-淀粉酶。最适酶生产物理条件为35℃和pH 5.5，维持48小时。 另一项研究深入研究了从Pontibacillus sp. ZY中生产α-淀粉酶。在这项研究中，重点是使用枯草杆菌作为宿主生物体表达酶，然后精心优化碳和氮源。值得注意的结果揭示了，在微调基因表达调节器、信号肽启动子序列和amyZ1基因上游的核糖体结合位点（RBS）后，酶活性达到了比天然酶高2.6倍的惊人水平，总计达到令人印象深刻的4824.2 U/mL。此外，通过严格的碳和氮源优化过程，在3 L发酵罐中达到了显著的α-淀粉酶活性49,082.1 U/mL。 2.2.酶的固定化 当需要回收并获得具有高稳定性的生物催化剂时，酶的固定化策略非常重要。固定化包括将酶固定在材料上（与支持物结合）或在相同分子之间形成交联酶聚集体（CLEAs）（图3）。 图3. 酶固定化的类型。 物理和共价键是支持物结合方法之一。物理结合在疏水材料上进行，弱范德华力结合，或使用聚合物、生物聚合物或两者结合进行封装。关于通过吸附进行的固定化，最常用的支持材料包括甲基丙烯酸酯、二氧化硅、磁性纳米粒子、碳和各种聚合物。这种固定化的一个例子是将来自Piriformospora indica的多聚半乳糖醛酸酶（Exo-PG）吸附在κ-卡拉胶-壳聚糖磁性纳米粒子（CCMNs）和壳聚糖-果胶磁性纳米粒子（CPMNs）这种新型支持物上。当Exo-PG固定在CPMNs和CCMNs上时，分别展现出了令人印象深刻的比活性479 U/mg和204 U/mg。Exo-PG在CPMNs上的固定化导致了其酶活性的显著恢复率71.11%，伴随着令人印象深刻的固定化产率89.15%。另一方面，将Exo-PG固定在CCMNs上导致酶活性的恢复率略有下降，为65.96%，固定化产率为63.85%。 一个说明性的例子涉及将磷脂酶Lecitase Ultra（LU）固定在大孔树脂上，特别是LXTE-1000，以催化二酰基甘油（DAG）的生产。吸附过程持续了2小时，产生了令人印象深刻的90%的固定化率。值得注意的是，即使在4℃下储存60天后，使用LXTE-1000-LU进行的甘油解反应仍然产生了显著的41.31%的DAG产率。 酶通过共价键固定在载体上的过程，是利用一种双官能团化合物，该化合物能够与载体上的化学基团（如赖氨酸基团）以及酶表面的氨基酸结合。一个共价固定的例子是将纤维素酶固定在功能化的核壳磁性金纳米粒子上。蛋白质的固定效率为84%，滤纸(FPase)的活性为0.78 mmol·mL-1。此外，新的生物催化剂比游离酶更稳定。Candida rugosa 脂肪酶也通过共价键固定在磁性Fe3O4@SiO2上。这种生物催化剂被用来催化酸化大豆油的水解，以产生脂肪酸。研究了诸如生物催化剂的用量、反应时间和水/油比等反应条件。优化结果表明，在10 wt%生物催化剂、3:1(v/v)水/油比和313 K下，经过12小时，水解率达到了98%。在五个反应周期后，生物催化剂的水解活性仍然保持在55%，这对工业应用来说是有希望的。 通过包埋法固定酶也已应用于工业酶促反应中，例如将Aspergillus oryzae 脂肪酶(AOL)和Rizomucor miehei (RML) 脂肪酶固定在磁性壳聚糖微胶囊上。包埋过程是通过自组装负电荷磁性纳米粒子(citrate-modified Fe3O4)在交联的壳聚糖柠檬酸脂肪酶聚集体上进行的。结合Tween 80生物印迹的AOL@RML共固定脂肪酶，实现了98%的生物柴油产率，这比单独固定的AOL和RML酶分别高出1.3倍和1.6倍。生物催化剂展现出显著的稳定性，在连续三个反应周期后，保持了其初始活性的96%。 使用CLEAs固定酶有多种例子；一种固定方法涉及使用糖类辅助的Trametes versicolor 漆酶的交联聚集体。优化过程关注了诸如沉淀剂的选择、交联时间、交联剂类型和糖浓度等关键变量。然后将这些优化条件与富含牛血清白蛋白(BSA)的漆酶-CLEAs进行了比较。结果揭示了果糖-CLEAs固定方法实现了大约45%的酶活性恢复。此外，动力学参数，特别是Kcat和Km，显示出的值是使用BSA-CLEAs获得的两倍。 另一个例子涉及通过形成交联聚集体（称为TL-CLEAs）来固定化Pseudomonas stutzeri脂肪酶。这种生物催化剂在深共熔溶剂（DESs）中表现出了显著的韧性和高活性。此外，它显示出在用甘油酯化苯甲酸时可重复使用多达三个周期的潜力，效率仅下降50%。混合方法也结合了物理和共价结合，如异双官能团支持物，其中酶首先通过疏水作用结合，然后共价结合。还有使用CLEAs的结合，然后通过使用Lentikats®（LentiKat’s a.s., Stráž pod Ralskem, Czech Republic）（聚乙烯醇）进行第二次包埋固定化，以增加稳定性和机械阻力，用于连续填充床反应器的应用。固定化方法的选择取决于酶的类型、支持物的简单性、成本以及在需要放大过程时所选反应器的类型。例如，在具有工业应用的脂肪酶固定化中，吸附或异双官能团方法（吸附和共价结合）在甲基丙烯酸酯树脂上是一个不错的选择，因为支持物具有高机械和化学稳定性，适用于批量和连续填充床生物反应器。包埋或固定化技术产生的生物催化剂具有较弱的机械阻力，它们在具有机械搅拌器的批量生物反应器中的操作构成了一个适当的放大替代方案。 2.3.反应介质制备中溶剂的选择 在处理不同极性的底物时，应用溶剂或共溶剂对酶促反应至关重要。然而，其选择并不简单，因为它不能影响酶的活性；它必须是环境友好的（见图4）。除了图4中指出的要点外，溶剂还可以改善酶的活性，以增加反应的转化率和产率。根据底物的极性，可以设计能够溶解底物的绿色溶剂。绿色溶剂包括离子液体（ILs）、深共熔溶剂（DESs）和基于生物的溶剂。ILs由阳离子和阴离子组成，制备复杂且昂贵。相比之下，DESs是由氢键受体（如胆碱氯化物）和氢键供体（可以是醇、酸或尿素）形成的。它们易于制备且比ILs便宜。ILs在生物催化中提供了几个优势，主要是它们显著的底物溶解性。然而，必须注意，在这些溶剂环境中操作时，酶的活性和稳定性可能会受到影响。Cui等人，2022年，确定酶的水合作用对于酶保持其活性和稳定性至关重要。例如，Zhao等人，2021年合成了模仿水的ILs，具有如乙二醇醚和叔醇这样的基团。这些新的ILs允许使用Candida antarctica的脂肪酶B（Novozym 435®, Novozymes, Bagsværd, Denmark）和固定化的Bacillus licheniformis蛋白酶获得高转酯化活性。不同ILs含有2%和3% v/v水分增加了Novozym 435®生物催化剂的活性，比叔丁醇高出1.8倍，比二异丙醚高出1.6倍。DES已被用于多种酶促催化应用中作为反应介质，允许与不同极性的底物进行反应。DES在生物催化中既作为溶剂又作为底物。添加少量水分，通常为2-5% v/v，可以有效降低DES的粘度，减轻质量传递挑战。此外，已证明其在连续填充床生物反应器和微反应器中的应用达到了高产率。如CyreneTM这样的基于生物的溶剂也已在生物催化中使用，主要作为酶促水解反应中的共溶剂，作为甘油与苯甲酸酯化反应中的溶剂，以及作为α-酮酯还原反应中的共溶剂。 图4.溶剂在酶促反应中必须具备的主要特征。2.4.统计优化 统计优化工具对于获取进行反应的最佳操作条件非常有价值。在文献中，有许多应用这种技术来确定最佳反应条件的研究。例如，酶促水解从酸性米糠油（RBAO）中去除甘油酯。RBAO包含脂肪酸（FFAs）、甘油酯和抗氧化剂，如γ-谷维素。通过中心组合旋转设计优化酶促水解，研究了三个独立变量——时间、温度和水：RBAO比例及其相互作用对响应（甘油酯去除、γ-谷维素损失和FFA产生）的影响，并确定描述它们关系的统计模型。使用最佳反应条件22小时、48.5°C和水：RBAO比例为1:1，在95%的预测区间内实现了甘油酯去除率99%、γ-谷维素损失32%和FFA产生73-75%。这项工作证明了在提取抗氧化剂γ-谷维素之前，酶促水解是去除甘油酯的有价值工具。 另一个应用统计优化的例子是通过Alcalase对小球藻微藻蛋白进行酶促水解（见图5）。为此，使用了响应面优化（RSM）方法。研究的独立变量包括pH值、反应温度、反应时间和酶电荷：底物比例。在Alcalase酶的最佳反应条件下，达到了3%的酶负载：底物比例、60°C、pH 6.5反应3小时和蛋白浓度为0.58 mg/mL。 关于酶促合成反应，已经根据Box-Behnken的实验设计，使用两种固定化脂肪酶（Novozym 435®和Thermomyces lanuginosus（TL））在Immobead 150上进行了5-羟甲基糠醛（HMF）与月桂酸的酯化反应的优化。使用Novozym 435®，在40°C、65 mM的HMF和16 U Novozym 435®的条件下，实现了75%的最佳转化率。使用TL生物催化剂，在50°C、30 mM的HMF和16 U的条件下，达到了78%的转化率。 图5. 优化小球藻微藻的酶促水解以获得蛋白质水解产物。 3.下游生物加工  先进的回收、分离和纯化技术在开发生物催化过程中至关重要。下游操作对于保持产品特性至关重要，旨在实现高产量和高纯度。本节仅考虑酶促反应产品的分离和纯化。 3.1.过滤 过滤是一种在实验室和工业规模上广泛使用的固液分离技术。过滤具有多功能性，因为它可以连续和不连续地进行。压力过滤器使用大于大气压的压力，通过介质产生的压力差使流体流过介质。在真空过滤器中，施加轻微的压力差；因此，必须注意压力损失。流动流体中的低压可能导致“空化”现象，即溶解的气体或蒸汽气泡释放到液体中。这些过滤器在工业中广泛使用，因为它们评估悬浮液的过滤性以及过滤介质的适用性。 半乳糖寡糖（GOSs）是含有多个半乳糖和一个末端葡萄糖的短寡糖链——由来自乳糖的β-半乳糖苷酶催化的GOS的酶促合成。原始GOSs是含有寡糖、未反应乳糖和单糖的混合物；因此，纳米过滤是产品纯化的替代方法。在从GOSs中分离乳糖方面，膜选择性差是它们的主要缺点。因此，通过在之前加入乳糖水解步骤，采用纳米过滤进行了酶促产生的GOSs的纯化。使用两种纳米过滤聚合物膜（Synder NFG和TriSep XN45）在搅拌死端单元中以不同的跨膜压力（8-30 bar）评估了原始和水解GOSs的纯化。水解原始GOS纳米过滤的最佳操作条件是在20 bar、45℃和1500 rpm下使用TriSep XN45膜获得的。加入之前的乳糖水解增加了GOS保留率、单糖和乳糖去除率，改善了GOS纯化。 膜生物反应器具有改善生物催化反应的功能，并且同时分离产生的反应产物。然而，尽管它们具有激动人心的应用，但由于系统的催化和质量传递特性，它们的商业使用受到限制。这方面的一个例子是设计由聚烯丙胺盐酸盐/多巴胺（PAH/PDA）共沉积形成的新膜，以获得酶活性、水渗透性和酶负载之间的最佳平衡（见图6）。由纤维制成的柔性固定化基质具有大表面积、轻重量和可控孔隙度等物理属性，赋予它们创建过滤器、传感器、支架和其他功能界面所需的机械属性。涂层还可以促进生物催化膜的寿命，这也是它们在膜生物反应器中引起兴趣和应用的原因。 图6. 用于制造膜生物反应器的膜实现了生物催化剂及其产品的同步分离. 3.2.液-液萃取 液-液萃取主要用于生物转化中的反应产物分离。液-液萃取，或分配，是一种涉及将溶质从一个溶剂转移到另一个溶剂的分离过程。溶剂必须不混溶或部分不混溶，该过程通常通过混合相然后分离它们来完成。转移的驱动力是目标化合物在双相系统的每个相中的溶解度差异。 萃取可以批量和连续模式进行。当样品体积大、分配常数不利或萃取速率慢时，使用连续模式。选择用于萃取的溶剂并不简单。溶剂必须具备特定特性：它必须与其他溶剂不混溶，感兴趣的产品必须在其中一个相中溶解，并且它必须对环境友好。最后一个方面至关重要，并且有很多研究使用ILs和DES作为提取溶剂。 液-液萃取中也已将ILs集成到生物催化系统中。ILs由有机阳离子和无机阴离子组成，根据其组分，它们可溶于水性和有机介质，并且具有低蒸气压。然而，它们高昂的价格、毒性风险和复杂的制备限制了它们在工业过程中的应用。通常的方法是将它们用作反应介质，并将它们与生物催化剂和底物混合进行反应过程。然后，使用与ILs不混溶的有机溶剂提取反应产物，而生物催化剂和ILs则回收用于下一个反应周期（见图7）。这一过程的可持续性取决于ILs的价格、ILs回收和用于萃取的溶剂类型。最推荐的是那些来自可再生资源的，包括胆碱乙酸酯和胆碱丙酸酯等。 图7.采用ILs和DESs的下游过程。(1) 反应系统，(2) 过滤，(3) 液-液萃取，(4) 蒸馏。 具有与ILs类似特性的DESs易于制备；许多是可生物降解的，由氢键受体如胆碱氯化物和氢键供体如醇、酸等组成。这些特性使它们非常适用于工业应用。文献中有多种DESs应用于液-液萃取操作的例子。其中一个例子是乙酸乙酯与HMF的酯化。在这项工作中，通过使用由胆碱氯化物和甘油形成的DES（摩尔比1:2）进行液-液萃取，实现了81%的分离效率，仅需要一个分离阶段。González和Guajardo进行的另一项工作证明，可以将连续的酶促酯化过程与使用由胆碱氯化物/甘油1/2（摩尔比）形成的DES进行的半连续液-液萃取过程集成，实现了8%的转化率和70%的萃取效率。Pánic等人，2021年，还研究了使用DES（ChCl:甘油）作为反应介质和萃取剂的同时进行的(R, S)-1-苯乙酸酯的动力学分辨率。在最后的分离阶段，使用了与DES形成两个相的乙酸乙酯，获得了95%的效率。 3.3.蒸馏 蒸馏是一种几个世纪前开发的工艺，它利用化合物沸点的差异来选择性地分离化合物。相对挥发性的差异越大，非线性越高，混合物的分离就越容易。实现分离的一个关键方面是了解液相(x)-汽相(Y)的平衡图。在处理恒沸混合物时必须特别小心，这种混合物在特定组成和恒定沸点下表现为仿佛由单一组分构成；即在沸点时，汽相的组成与液相相同。这样，混合物就不能被分离。 在工业上，使用两种类型的蒸馏：间歇和连续。间歇蒸馏是最古老的方法，已经使用了数个世纪。该系统由一个底部锅炉组成，锅炉中装载有待分离的馏出物，以及一个置于锅炉上的精馏塔（板式或填充式）；两者都连接到一个冷凝器。在连续蒸馏中，要分离的料液在塔的一点或多点输入到塔中。蒸汽向上移动，而在底部，富含重组分的液体从塔中抽出。从塔顶离开的蒸汽被冷凝。部分冷凝液回流到塔中，其余的作为馏出物提取。 在生物转化中，蒸馏被应用于各种过程，例如，在甘油和大豆油使用叔丁醇作为溶剂的酶促合成二酰基甘油（DAG）中。DAG被用作食品添加剂，用于低脂食品的配方。为了回收感兴趣的DAG产品，研究人员使用真空蒸馏从混合物中去除叔丁醇（见图8）。成功实现了98.7%的转化率，这是通过采用大豆油与甘油6.23:1的摩尔比，并利用40% w/v底物溶解在叔丁醇中实现的。反应结束后，二酰基甘油（DAG）的浓度达到了48.5%。通过分子蒸馏的进一步精炼，最终获得了96.1%的高纯度水平。 图8.由Novozym 435® 生物催化剂催化的大豆油和甘油的甘油解反应生产的二酰基甘油的纯化。 在由羟四氢呋喃脂肪酸酯形成的生物润滑剂的化学酶合成中，蒸馏过程对于获得精炼产品至关重要。首先，发生亚油酸的水合反应，然后是环氧化反应。环氧化后，使用真空蒸馏来获得环氧化物，该环氧化物将与醇一起酯化，并由Novozym 435® 生物催化剂催化。然后进行短程蒸馏，其冷凝液对应于最终获得的生物润滑剂的前体酯。这一过程在图9中有详细说明。 图9. 基于亚油酸的羟四氢呋喃（HTHF）酯作为生物润滑剂。(A) 亚油酸，(B) 10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸，(C) 12,13-环氧-10-羟基-十八碳烯酸，(D) 12,13-环氧-10-羟基-十八碳烯酸酯，(E) 12,13-环氧-12-羟基-十八碳烯酸酯，以及 (F) HTHF脂肪酸酯。 3.4.结晶 从溶液中结晶是化学过程工业中最常用的单元操作之一。晶体颗粒的形成和从溶液中的分离涉及悬浮和沉淀期。在这些时期，流体颗粒移动，物质可以从液态变为固态。 相平衡和结晶模式是开发结晶过程的原理和技术。相平衡的发展考虑了组分在溶剂中的溶解度，这取决于其浓度和温度。此外，使用的一种策略是应用抗溶剂，这允许溶解其他溶剂无法溶解的组分，从而改善结晶。结晶方法利用过饱和，通过冷却或蒸发实现。“沉淀”过饱和结晶是通过添加诱导化学反应以产生溶质或降低其溶解度的第三组分产生的。 存在各种类型的结晶器，包括非搅拌和搅拌容器（见图10）。非搅拌容器是最简单的设备，在其中热液体以批量模式倒入并冷却至室温。在这种操作模式下，会发生局部和瞬时的过饱和变化，导致形成大的、相互锁定的、聚集的和细小的晶体，这些晶体难以分离（图10A）。在搅拌结晶器的情况下，系统中的传质得到改善，规模形成减少，过饱和度曲线平滑，晶体悬浮，产生更均匀的产品，并缩短结晶时间（图10B）。图10C详细说明了大规模连续晶体生产的几种选择。 图10.结晶设备。(A) 非搅拌容器，(B) 搅拌容器，(C) 搅拌结晶器 DTB(带有导流管和挡板)。 D-Allulose是一种低热量糖，用于加工食品中增强风味和外观。然而，由固定化葡萄糖异构酶催化从D-葡萄糖生产D-Allulose将产生额外的副产品，这会降低产量并妨碍分离过程。幸运的是，模拟移动床色谱(SMBC)随后通过结晶纯化是分离D-Allulose的有效方法。这种方法具有低溶剂消耗和高生产力及纯度的优点。D-Allulose溶液通过色谱柱后，使用纳米过滤膜浓缩至3%，然后在65°C的真空下用旋转蒸发器进一步浓缩，直到糖的浓度达到70%。以1:4(v/v)的比例添加无水乙醇（无水乙醇与D-Allulose的比例）；随后，加入D-Allulose晶种以在4°C下开始结晶过程，持续96小时，从而实现98%的纯度。 一个有趣的将结晶集成到生物转化中的方法是使用膜生物反应器。一个例子是合成(S)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，这是对抗阿尔茨海默病的药物前体。使用带有两室的膜生物反应器进行合成，在第一室中首先进行反应。在第二室中，反应产物被浓缩并进入结晶阶段，以获得99.5%纯度的产品。 3.5.色谱法 色谱法可以完成两个基本功能。第一个是作为合成反应下游纯化过程的一部分，用于分离混合物组分。在生物转化中，色谱法用于下游过程以纯化产品。色谱法有多种类型，包括纸色谱法、薄层层析法、液相色谱法、气相色谱法、超临界流体色谱法等。在液相色谱法的情况下，样品通过固定相（填充柱）进行洗脱以进行分离。根据分离化合物的特性，使用溶剂和水的混合物或仅使用溶剂进行洗脱。色谱法最关键的方面是柱子的制造——其填充可以由各种材料、粒径和孔径制成——以及可以使用不同比例的溶剂和水作为流动相。 色谱法是生产手性化合物的基本工具。这是Sun等人在2020年对D-泛酸及其在食品、制药和其他工业中使用的添加剂成分生产进行研究的情况。D-泛酸的酶促动力学解决方案在生产成本、毒性和污染方面具有明显优势。这项工作的目的是克隆催化D/L-泛酸内酯(DL-PL)水解为D-泛酸(D-PA)或L-泛酸(L-PA)的Lactonohydrolases (Lacs)酶。最终反应产物通过配备手性柱的HPLC进行监测，流动相由甲醇和0.1%甲酸组成。反应4小时后，对映体过量达到了99%。 3.6.分离方法的选择和比较 适当的分离技术的选择取决于需要分离的产品类型、其物理特性及其纯度。资本支出（CAPEX）和运营成本（OPEX）也至关重要，如图11详述。例如，如果需要高纯度的产品并且有大量的副产品，色谱法是一个很好的选择。然而，CAPEX和OPEX将会很高，所需的能源将会相当可观。 图11. 选择分离方法时的考虑因素。 如果产品具有不同的极性，液-液萃取可能是一个好的选择，如果溶剂可以重复使用且对环境友好的话。蒸馏是经典的分离过程之一；尽管能源成本高，但它应该是最少使用的替代方案之一。然而，如果必须使用，它应该被选择用于沸点差异很大的产品，以及存在副产品回收和再利用可能性的情况。 过滤是一种从能源角度来看昂贵的分离方法，需要高额的投资和维护，以在膜使用后更换它们。然而，在特定过程中，感兴趣的产品对高温条件和溶剂不稳定时，它是其他分离策略的适当替代方案。 4.结论  上游和下游过程的正确组合促进了可持续和高产出生物过程的开发。上游操作对下游过程有显著影响。因此，酶的生产、固定化、溶剂选择和优化技术有助于在工业规模上增强酶技术的发展。各种下游过程构成了工业过程总成本的约80%。因此，它们必须根据产品类型、简单性、放大、CAPEX、OPEX和环境考虑进行战略选择。最后，上游和下游过程必须结合简单性、可持续性、经济性等多种特性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

药物涂层球囊（Drug-Coated Balloon, DCB）是一种创新的介入治疗方法，旨在通过局部递送抗增生药物来减少血管再狭窄的发生率。近年来，多项临床试验和观察性研究已经评估了DCB在冠状动脉疾病治疗中的应用效果。一些研究表明，DCB在短期和中期随访中可以有效地减少再狭窄率，并且与药物洗脱支架（DES）相比具有类似的临床效果。然而，这些研究大多集中在短期至中期（1-2年）的效果评估上，对于更长时间范围内的影响，数据仍然有限。 9月2日，来自空军军医大学西京医院心血管内科陶凌教授领衔的一项研究成果“Drug-coated balloon angioplasty with rescue stenting versus intended stenting for the treatment of patients with de novo coronary artery lesions (REC-CAGEFREE Ⅰ): an open label, randomised, non-inferiority trial”发表在顶级期刊Lancet上，该研究旨在评估DCB联合补救性支架植入对比直接使用DES在治疗新发、非复杂冠状动脉病变患者中的非劣效性。 REC-CAGEFREE Ⅰ是一项在中国43个研究中心进行的开放标签、随机、非劣效性试验。成功进行病变预扩张后，年龄在18岁及以上的新发、非复杂冠状动脉疾病患者（无论目标血管直径如何）且有经皮冠状动脉介入治疗（PCI）指征的患者被随机分配（1:1），通过基于网络的集中系统进行区组随机化（区组大小为2、4或6），并按研究中心分层，患者接受紫杉醇涂层球囊血管成形术并可在结果不满意时选择补救性支架植入（DCB组）或计划植入第二代薄支架西罗莫司洗脱支架（DES组）。 主要结局指标是在意向治疗（ITT）人群（即随机分配到治疗中的所有参与者）中，评估24个月时以器械为导向的复合终点（DoCE），包括心血管死亡、靶血管心肌梗死以及临床和生理学指示的靶病变血运重建。如果绝对风险差的单侧95%置信区间上限小于2.68%，则认为非劣效性成立。安全性评估在ITT人群中进行。该研究已在ClinicalTrials.gov注册，编号为NCT04561739。目前该研究已停止招募新患者，正在进行延长随访。 结果显示，从2021年2月5日至2022年5月1日，共有2272名患者被随机分配至DCB组（1133名[50%]）或DES组（1139名[50%]）。随机分配时的中位年龄为62岁，2272名患者中有1574名（69.3%）为男性，698名（30.7%）为女性，所有患者均为华裔。DCB组中106名（9.4%）患者在DCB血管成形术后因结果不满意而接受了补救性DES植入。数据截止日期（2024年5月1日），中位随访时间为734天（IQR 731-739）。 在24个月时，DCB组1133名患者中有72名（6.4%）发生了DoCE，而DES组1139名患者中有38名（3.4%）发生了DoCE，累积事件率的风险差为3.04%（单侧95%置信区间上限为4.52；p非劣效性=0.65；双侧95%置信区间1.27-4.81；p=0.0008）；非劣效性标准未达到。在干预过程中，DCB组未发生急性血管闭塞，而DES组中有1名（0.1%）患者发生了急性血管闭塞。围手术期心肌梗死在DCB组1133名患者中有10名（0.9%）发生，在DES组中有9名（0.8%）发生。 总之，对于新发、非复杂冠状动脉疾病患者（无论血管直径如何），采用DCB血管成形术加补救性支架植入策略在2年内DoCE方面未能达到相对于计划DES植入的非劣效性，这表明DES应继续作为此类患者的首选治疗方法。临床医生在选择治疗方法时，需要综合考虑患者的个体情况、病变特点以及长期预后来做出最佳决策。尽管本次研究未能证明DCB在2年内的非劣效性，但并不排除DCB在未来其他应用场景中的潜力。未来的研究可以进一步探索DCB在特定患者群体中的适用性。此外，随着技术的进步，新一代的DCB可能会在药物传输效率、生物相容性和临床应用范围等方面取得突破，从而进一步提升其在冠状动脉疾病治疗中的地位。 原始出处 Gao, Chao et al.Drug-coated balloon angioplasty with rescue stenting versus intended stenting for the treatment of patients with de novo coronary artery lesions (REC-CAGEFREE I): an open-label, randomised, non-inferiority trial.The Lancet, Volume 0, Issue 0.https://www.thelancet.com/action/showCitFormats?doi=10.1016%2FS0140-6736%2824%2901594-0&pii=S0140-6736%2824%2901594-0 撰文 | 梅斯医学 编辑 | 阿拉斯加宝 ●热议！医生吐槽：高价引进的博士有啥用，走个过场拿到钱就溜了，真正干活的还是老员工！博士能代表一个医院的水平吗？凭啥博士就能高工资 ●太重磅！国家卫健委：5年内三明医改经验要全部覆盖！医生平均年薪已达19.56万！推广全国后，不创收了，医生的工资谁来发？ ●长寿饮食来了！最新研究：这么吃，中国人能延寿6.2-6.3年！ 版权说明：梅斯医学（MedSci）是国内领先的医学科研与学术服务平台，致力于医疗质量的改进，为临床实践提供智慧、精准的决策支持，让医生与患者受益。欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。 点击下方「阅读原文」 立刻下载梅斯医学APP！

本次大会的主题为“砥砺深耕·笃行致远”，热情邀请全国相关领域专家、学者、科研骨干、企业代表与会交流。 致癌性试验的目的是在动物中识别潜在致癌作用，从而评价人体中的相关风险。实验室研究、动物毒理学试验和人体数据中出现的任何担忧因素，均可能导致需要进行致癌性试验。对于预期在患者一生中大部分时间连续使用的药物，通常会要求采用啮齿类动物进行致癌性试验。这些试验的设计和结果解释出现在目前已有的测试潜在遗传毒性的大多数技术和评估系统暴露量的最新技术之前。这些研究也出现在我们目前对非遗传毒性物质致癌性的认识之前。 现在遗传毒性试验、毒代动力学和机制研究的结果已被常规用于临床前安全性评价。这些新增数据不仅有助于判断是否需要进行致癌性试验，而且对解释研究结果与人体安全性的相关性也是十分重要的。由于致癌性试验耗时耗力，只有当人体暴露情况确实需要动物终生给药研究信息来评价其潜在致癌性时，才进行致癌性试验。 (本推文致癌研究内容章节由于较多，将分2个章节介绍。) 二乙基己烯雌酚（DES）于 1938 年首次合成，是一种合成形式的雌激素，从 20 世纪 40 年代开始被用于孕妇（尤其是美国、英国等欧洲国家和澳大利亚的孕妇），以预防流产。然而，直到 1971 年，《新英格兰医学杂志》上发表了一篇具有里程碑意义的文章，将母亲在怀孕期间服用 DES 的妇女在子宫内接触 DES 与一种罕见的阴道肿瘤联系起来。这一发现促使美国和欧洲的监管机构分别于1971年（美国）和1978年（欧洲）建议不再向孕妇开具DES处方。如今，DES 已被国际癌症研究机构（IARC）列为 1 类致癌物（即对人类具有致癌性），世界各地已基本停止使用该药物。 DES 的故事对药品开发商和监管机构都是一个重要的警示故事。尽管自DES问世以来，药物开发已经发生了广泛的变化，首先是监管机构将安全性测试的重任转移给了申办者，最近又出现了全球统一的测试要求，但致癌性测试仍然远远不只是 固定程序。近年来，随着一系列新型药物产品类别的推出，这一事实得到了进一步强调，这也带来了独特的测试挑战。例如，先进的细胞和基因疗法尽管前景广阔，但也引起了人们对病毒整合的长期影响和干细胞群意外扩增的担忧。随着这些技术和其他技术逐渐成熟，成为可行并可广泛使用的疗法，监管专业人员需要做好准备，在与监管机构沟通时，证明开发过程中使用的各种测试策略是合理的。 本章旨在概括介绍适用于致癌性研究的全球监管要求的现状。在阅读本章时，应结合前一章的遗传毒性评估（见第 7 章），因为这些评估通常先于致癌性测试计划，并为其提供某些支持信息，在对致癌可能性进行总体评估时也可加以利用。讨论将首先简要介绍与监管决策有关的致癌机制背景。随后将介绍与致癌性测试的进行和解释有关的全球监管要求和豁免的现状，这些要求和豁免主要来自国际人用药品技术要求协调理事会 (ICH)。最后，将介绍与模型选择和研究设计有关的具体考虑因素，然后讨论应如何在向全球监管机构提交的营销和上市前呈件中提交致癌性数据。 1 癌症和致癌性 世界卫生组织（WHO）将癌症定义为由 "异常细胞快速增殖引起的一组疾病"，"异常细胞的生长超出其正常边界，然后侵入身体的邻近部位，扩散到其他器官"，这一过程被称为 "转移"。最初的生长或肿胀被称为肿瘤或新生物。重要的是，虽然肿瘤可被定义为恶性或良性或（即癌或不癌），但监管科学历来将导致良性病变在统计上显著增加的药物也纳入 "致癌物 "的定义中。这一决定是切实可行的，因为良性病变会阻塞附近的组织，导致疼痛和其他病症，从而增加不可接受的风险。以下内容旨在概述从监管角度理解致癌性测试要求所必需的几个重要概念。如果读者希望对这一主题有更全面的了解，我们建议他们从现有的众多优秀文献22-24中选择一本进行阅读。 1 基因毒性和非基因毒性致癌物质 除了将肿瘤定义为良性或恶性外，致癌物质还可根据其作用机制分为基因毒性、非基因毒性或两者兼有。直接与脱氧核糖核酸（DNA）发生作用从而对其造成损害的药物被认为具有基因毒性，而通过间接机制致癌的药物则被认为具有非基因毒性。 • 基因毒性致癌物是指对 DNA 有致突变作用并有可能成为 "完全致癌物"（即能够诱发、促进和发展癌症，详见下一节）的致癌物。虽然这些药物在某些情况下可能存在 "安全 "剂量阈值（如秋水仙碱等无性繁殖化合物），但默认的监管假设是，这些药物具有低剂量线性风险与反应曲线（见图 8-1），因此即使少量也能造成直接的 DNA 损伤，最终导致癌症。 • 与此相反，非遗传毒性致癌物是表观遗传的，通过改造微环境使细胞更容易受到DNA损伤而起作用。这通常是通过增加各种浓度依赖性的细胞信号传导过程来实现的(例如，基因转录，或影响参与生长和增殖的各种受体)。因此，这些化合物的剂量-反应曲线假定有一个“安全”剂量阈值，低于该阈值，这些过程不会启动(图8-1)。 2 致癌过程的各个阶段 虽然致癌可能源于对细胞维持和生长的正常细胞过程的许多不同干扰因素，但将整个致癌过程视为一个多阶段过程是有帮助的，特定的致癌物质会在一个或所有阶段发挥作用（即 "完全致癌物"）。这些阶段被称为起始阶段、促进阶段和进展阶段（initiation, promotion, and progression）。 3 启动 启动涉及细胞 DNA 序列中不可逆转、可遗传的变化（包括突变和缺失）。由于起始剂具有诱变作用，因此也被认为具有基因毒性。大多数在起始阶段引起致癌变化的药物都是促基因毒性物质，因为它们需要经过一定程度的内部活化或生物转化（见第 6 章）后才能与DNA发生作用。因此，早期遗传毒性评估（见第 7 章）通常包括 S9 微粒体部分，因为这种混合物含有重要的肝酶，可在细胞（即体外）系统中形成药物的直接作用毒性代谢物。重要的是，起始事件本身并不能保证一定会导致癌症。在许多情况下，这些变化只是使细胞失去活力或无法增殖。但是，如果起始事件的影响是可持续的，那么癌变的下一步就是促进。 4 促进 促进是启动细胞进行克隆扩增以产生癌前病变的一般过程。这个阶段的致癌性通常是非遗传毒性的，通过无数的表观遗传机制起作用，包括激素调节、刺激和炎症、免疫抑制和细胞信号通路抑制。 鉴于其影响的间接性，如前所述，假定促进致癌过程阶段的致癌物具有“安全”阈值。此外，与开始和进步相反，促进通常被认为是可逆的。本章开头提到的致癌物二乙基己烯雌酚（DES）主要通过诱导雌激素受体介导的细胞增殖增加而起肿瘤启动子的作用。29 5 进展 癌变的最后阶段称为进展期。在这一阶段，连续的基因毒性变化导致单个肿瘤细胞内积累更多的突变。这些过程最终会选择出最具侵袭性（如增殖）的克隆，进而导致肿瘤不可逆转的发展。与起始制剂类似，针对肿瘤进展的制剂通常具有基因毒性，因此被认为没有“安全”的使用阈值。 2 监管概况 自美国国家癌症研究所 (NCI) 于 20 世纪 70 年代中期提出 两年啮齿类动物致癌性生物测定的概念以来，该方法已成为估算新药致癌可能性的黄金标准（the 2-year rodent bioassay for carcinogenicity has become the gold standard for estimating the carcinogenic potential for new drug products）。尽管在 20 世纪 90 年代制定 ICH 致癌研究指南时，ICH 的创始成员地区（即美国、欧盟国家和日本）已经制定了长期研究的要求，但这些指南在全球范围内的采用使得测定的许多特定方面得以统一。 这些方面包括高剂量选择（以前欧盟和日本允许使用每公斤毫克大于 100 倍的高剂量倍数来替代最大耐受剂量 (MTD)，但美国不允许），以及证明长期研究合理性的最短临床暴露时间（以前美国为 3 个月，欧盟和日本为 6 个月）。ICH S1 指导原则 通过统一这些预期和其他预期，力求减少全球药物开发过程中的冗余。 尽管如此，“两年检测”现在和过去都不是一项简单的工作。它的设计有几个方面有别于非临床试验中的许多传统试验。特别是，进行两项为期两年的传统啮齿类动物致癌性研究（通常在大鼠和小鼠模型中进行）需要较长的持续时间和较多的动物数量（即每组至少有 50 只雌雄动物），这使其具有独特的资源密集性，因此对申办者来说成本较高。 构思 ICH S1 指南时，我们认识到必须让监管期望与业界对癌症本身的认识同步发展。该附录描述了综合证据权重 (WoE) 评估，以帮助申办者确定为期 两年的啮齿类动物致癌性研究是否可能为整体致癌性测试方法带来附加值。如果不能增加价值，申办者现在可以寻求监管咨询，以支持完全豁免两年期研究的决定。 如表 8-1 所示，ICH 成员国几乎普遍实施了致癌性测试的相关指南。许多 ICH 观察员国和非成员国的监管机构也广泛推荐使用该指南。 1 致癌性测试要求 ICH S1B(R1)指南概述的一般要求是进行一项长期研究（通常是在大鼠体内进行为期两年的研究），以及第二项长期研究（通常是在小鼠体内进行）或一项短期或中期的体内（即动物）研究。最常用的较短时间研究包括啮齿动物癌症诱发和促进模型，以及使用转基因（如 p53+/-、Tg.AC、Tg.rasH2 和 Xpa 缺失）和新生啮齿动物进行研究。 2 考虑因素 从历史上看，暴露持续时间是决定是否需要进行研究的主要因素，对于打算服用 六个月以上或长期间歇性服用的产品，需要进行研究。 具体的 "关注原因 "是另一个重要的考虑因素。根据 ICH 指导原则 S1A，引起关注的原因可能包括： 1.先前证明与人类相关的产品类别具有致癌性、 2.结构-活性关系表明有致癌风险、 3.重复给药毒理试验中出现肿瘤前病变的证据，以及 4.母体化合物或代谢物在组织中长期滞留，导致局部组织反应或其他病理生理反应。 值得注意的是，虽然延长给药时间超过两个月被视为需要进行致癌性研究的理由，但根据 ICH 指南，这本身并不被视为 "值得关注的原因 "。 3 补充机理研究 虽然不是一项具体要求，但可能有必要进行额外的机理研究，以了解从致癌性测试中获得的任何结果。此类研究可侧重于各种终点，包括 • 细胞变化（如细胞凋亡或增殖） • 生化变化（如生长因子和特定激素的血浆水平） • 当标准组合检测结果为阴性且无法确定表观遗传机制时，进行额外的遗传毒性评估；以及 • 其他修改方案，以进一步确定效应的特征（如可逆性、用药中断等）。 这些额外机理研究的主要目的是更好地描述药物的作用机理及其与潜在人体风险的关系。例如，虽然已知激动过氧化物酶体增殖激活受体 α 的药物可诱发某些啮齿类动物癌症，但这一机制已被证明与评估人类癌症风险无关。 4 开发计划中的时间安排 致癌试验应在遗传毒性试验之后进行，如 ICH S2(R1) 所述。同时还应考虑到预期的患者人群和给药方案，以及早期药代动力学和药效学分析结果（见第 6 章）和重复给药毒理试验结果（包括必要的单独开展的剂量探索试验；见第 8 章）。 这些信息不仅对确定是否存在肿瘤前病变或其他重要变化（如免疫抑制或细胞增殖），而且对了解任何研究结果的机理基础，包括是否与人类癌症发展相关，都极具价值。假设没有 "令人担忧的原因"，对致癌性研究的一般期望是在申请上市批准之前完成，但不一定在启动大规模（即III期）临床试验之前完成。 5 监管要求预期的潜在例外情况 一般监管要求有多种例外情况。这些例外可能是基于目前对特定产品或产品类别的科学理解；或基于对偏离正常时间表、数据预期或两者可能产生的任何风险的审慎评估，同时考虑到任何潜在的益处。 6 “明确的”基因毒性药物 人们可能会认为，要从遗传毒性研究中获得明确的阳性结果（即基于一整套测试而非单一测试的结果），必然需要进行长期的致癌性研究，但事实并非如此。 S1B(R1) 指南指出，"无论是在没有遗传毒性风险的情况下，还是在有明确遗传毒性风险的情况下，为期 两年的大鼠研究都不太可能有价值。"换句话说，如果已经有足够的信息可以得出遗传毒性的结论，那么就可以推定该药物是一种跨物种致癌物，不太可能需要进行耗费大量资源开展两年的致癌试验“a “2-year rat study is less likely to be of value either in cases whether there is no genotoxicity risk, or in cases with unequivocal genotoxicity risk.” In other words, where already sufficient information exists to draw a conclusion regarding genotoxicity, the drug is presumed to be a transspecies carcinogen and a resource-intensive 2-year study is not likely to be warranted”。 7 抗癌产品和预期寿命有限的适应症 根据 ICH S918 和 ICH S1A，用于治疗晚期癌症的药物通常不需要进行致癌性研究；预期寿命短于两至三 年的其他严重适应症也可能不需要进行致癌性研究。 对于抗癌药物来说，这种例外情况似乎很奇怪；但这是基于这样一种认识，即许多癌症治疗方法也是 "癌症诱导剂"，下面举例说明。 • 放射治疗（如使用高能 X 射线、伽马射线或其他带电粒子）通过诱导 DNA 链断裂而起作用，这更有可能导致快速分裂的细胞死亡。不过，放疗也会增加将来罹患其他癌症的风险，这一点已得到公认。 • 烷化剂（如环磷酰胺、顺铂和丁硫胺）通过烷基的化学附着破坏癌细胞的 DNA，阻止细胞分裂，导致受影响细胞死亡。不过，这种治疗也会影响正常细胞（尽管影响程度较小），并可能在日后导致继发性癌症。 • 如果这种疗法能立即治疗现有的癌症，而且几乎没有或根本没有其他疗法可供选择，那么这些疗法和其他疗法增加的未来癌症风险通常被认为是可以接受的。但是，这种例外情况并不包括对无肿瘤患者使用的新辅助药物进行致癌性测试，也不包括对非癌症患者使用的新辅助药物进行致癌性测试。 对于仍需进行研究的严重疾病，致癌性研究通常可在药物获得上市批准后完成。同样，由于需要加快获得挽救生命或延长生命的疗法，延迟进行此类研究会略微增加风险。 8 组合产品 如果产品的单个成分已经分别进行了致癌和遗传毒性风险评估，且不存在新的令人担忧的原因，则一般不建议在临床试验或批准上市前对复合产品进行致癌和遗传毒性研究。 9 替代疗法 如果替代疗法（如胰岛素）的化学结构和生物活性与 "天然 "（‘natural’）对应物相当，而且在正常生理水平下使用，特别是类似产品已被确定为安全时，通常不需要进行额外的致癌试验。当新药偏离这些参数时，应评估是否需要进行额外研究。 10 配方和生产变更 微小的生产和配方变更需要逐案评估，以确定是否需要进行新的致癌性测试。不过，根据 ICH S1A 指南，如果现有测试支持当前制剂的安全性，且药代动力学、药效学或毒性没有发生重大变化，无需进行额外的衔接研究，则可能不需要进行额外的研究（additional bridging studies）。 11 儿科研究 ICH M3(R2)12阐述了在将儿科人群纳入临床试验之前进行额外研究的必要性。就致癌性研究而言，预计在开始长期研究之前将确定是否需要进行此类研究，但除非根据一般毒性、遗传毒性或机理研究的结果存在令人担忧的原因，否则没有必要进行此类研究。 12 生物技术产品 ICH S6(R1) 13 中讨论了生物技术产品临床前安全性评估指南。该文件指出，除非因接触时间长短、患病人群或生物作用机理而有必要，否则通常不适合对生物技术产品进行致癌性测试。后者非常重要，因为生物技术产品的毒性通常是由引人注目的药理作用而非 "脱靶 "毒性引起的（results from exaggerated pharmacology rather than ‘off-target’ toxicity）。例如，有意抑制免疫功能或促进细胞增殖的产品，如果反应过度，可能会致癌。如果潜在的疾病状态使病人对这些影响更加敏感，情况就更是如此。 如果担心有致癌性，则应进行WoE评估。评估的输入信息应包括已公布的有关一般药物类别的信息、相关实验室报告（例如，使用转基因动物或靶标缺陷动物）、靶标的生物学特性、作用机制，以及申办者可参考的任何可用细胞或动物模型数据。同样，如果评估结果支持该结论，也不需要进行额外的研究，在这种情况下，指南建议将重点转移到产品标签和风险管理方法上。当评估结果不明确时，可能需要在特征明确的细胞和动物模型中进行额外研究，以了解并在可能的情况下管理任何基于机制的问题。 假定该产品在啮齿类动物中无免疫原性且具有生物活性，在某些有限的情况下，申办者仍可考虑在相关动物物种或品系中进行单项研究。但是，不建议对同类产品进行研究，因为研究结果可能与人体使用无关。在这种情况下，阳性数据会给所有相关人员（包括监管审查人员）带来问题，而且进行该研究可能会占用申办者的宝贵资源，而更多的机理研究可以更好地促进整体风险评估。 13 有限的全身暴露 如果局部（如皮肤或眼部）使用的产品导致全身暴露程度较低，且施用部位不存在致癌活性问题（如光致癌性），则可能不需要进行广泛的测试。 14 光致癌性 根据ICH S10.19所述，在门诊研究之前应进行光毒性潜在评估，考虑的要点包括药物是否: 1.吸收自然光(290- 700nm)范围内的光 2.吸收紫外线-可见光后产生反应物质 3.充分分布于暴露于光下的组织(如皮肤、眼睛) 在发现潜在风险的情况下，ICH S10 还指出，现有啮齿动物模型的光致癌性测试不足以评估药物对人体的风险。相反，ICH M3(R2)建议在试验过程中采取保护措施（如在标签上和患者同意过程中发出适当警告、使用皮质类固醇和其他干预措施等）来控制任何潜在的光毒性风险。(本章较长，未完待续) 英文版原文 一、Chapter 8 Carcinogenicity Studies First synthesized in 1938, Diethylstilbestrol (DES) is a synthetic form of estrogen that was prescribed to pregnant women (especially in the US, European countries such as the UK, and Australia) beginning in the 1940s to prevent miscarriage. It was not until 1971, however, that a landmark article published in the New England Journal of Medicine linked in utero DES exposure to a rare type of vaginal tumor in women whose mothers had received the drug during their pregnancy. This finding led US and European regulators to recommended that DES no longer be prescribed to pregnant women in 1971 (US), and 1978 (Europe), respectively. Today, DES is classed as a Group 1 carcinogen (i.e., carcinogenic to humans) by the International Agency for Research on Cancer (IARC), and its use has largely been phased out around the world. The story of DES is an important cautionary tale for both drug developers and regulators alike. Although drug development has evolved extensively since DES was introduced, first by shifting the burden of safety testing from regulators to sponsors, and more recently with the advent and global harmonization of testing requirements, carcinogenicity testing is still considerably more than just a ‘box-checking’ exercise. This fact has been further highlighted in recent years with the introduction of a host of novel drug product classes, which have brought unique testing challenges. For example, despite their great promise, advanced cell and gene therapies have raised concerns regarding the longterm impacts of viral integration and the unintended expansion of stem cell populations. As these and other technologies mature into viable and widely available therapies, regulatory professionals will need to be ready to justify the various testing strategies that have been used for their development in their communications with regulators. This chapter is intended to provide a broad overview of the current state of global regulatory requirements as they apply to carcinogenicity studies. It should be read in concert with the preceding chapter on assessing genotoxicity (see Chapter 7) since these assessments generally precede and inform the carcinogenicity testing plan and are leveraged in making overall assessments regarding carcinogenic potential. The discussion will start with a brief background on mechanisms of carcinogenicity as they relate to regulatory decision making. This will be followed by an introduction to the current state of global regulatory requirements and exemptions pertaining to the conduct and interpretation of carcinogenicity testing, largely from the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH).9–20 Finally, specific considerations related to model choice and study design are presented, followed by a discussion of how carcinogenicity data should be presented in marketing and premarket submissions to global regulatory bodies. 01 Cancer and Carcinogenicity The World Health Organization (WHO) defines cancer as a group of diseases caused by the rapid proliferation “of abnormal cells that grow beyond their usual boundaries, and which can then invade adjoining parts of the body to spread to other organs” in a process known as “metastasis”. The initial growth or swelling is referred to as a tumor or neoplasm. Importantly, while neoplasms may be defined as being either malignant or benign or (i.e., cancerous or not cancerous), regulatory science has historically included drugs that cause a statistically significant increase in benign lesions within the definition of a “carcinogen” as well. This decision is practical since such growths can cause an unacceptable increase in risk through their ability to obstruct nearby tissues, resulting in pain and other medical conditions. The following is meant to provide an overview of several important concepts that are necessary for understanding carcinogenicity testing requirements from a regulatory perspective. Readers interested in a more holistic treatment of the topic are encouraged to seek out one of the many excellent texts that are available on the subject. （1）Genotoxic and Nongenotoxic Carcinogens In addition to defining neoplasms as benign or malignant, carcinogens can be classified as being genotoxic, nongenotoxic, or both dependent upon their mechanism(s) of action. Drugs that interact directly with DNA to cause damage to it are considered to be genotoxic, while drugs that cause cancer through indirect mechanisms are considered to be nongenotoxic. • Genotoxic carcinogens are those which are mutagenic to DNA and have the potential to be ‘complete carcinogens’ (i.e., capable of initiation, promotion, and progression of cancer as described in the next section). Although a ‘safe’ dose threshold may exist for these drugs in some cases (e.g., aneugenic compounds, like colchicine),22,25 the default regulatory assumption is that they have a low-dose linear risk vs response curve (see Figure 8-1), such that even small amounts are capable of causing direct DNA damage that can culminate in cancer. • In contrast, nongenotoxic carcinogens are epigenetic and act by engineering a microenvironment that makes cells more susceptible to DNA damage. This is generally accomplished by augmenting various concentration-dependent, cellular signaling processes (e.g., gene transcription, or affecting various receptors involved in growth and proliferation). As a result, the dose-response curve for these compounds is assumed to have a ‘safe’ dose threshold below which these processes are not initiated (Figure 8-1). （2）Stages of Carcinogenesis While carcinogenicity can arise from many different perturbations of normal cellular processes involved in the maintenance and growth of cells, it is helpful to think of carcinogenesis overall as a multi-phase process, with specific carcinogens contributing at one, or all stages (i.e., a ‘complete carcinogen’). These stages are known as initiation, promotion, and progression. （3）Initiation Initiation involves irreversible, heritable changes (including mutations and deletions) in the DNA sequence of cells. As initiating agents are mutagenic, they are also considered to be genotoxic. The majority of drugs that cause carcinogenic changes at the initiation stage are pro-genotoxins because they require some amount of internal activation or biotransformation (see Chapter 6) before they can interact with DNA. For this reason, early genotoxicity assessments (see Chapter 7) often include an S9 microsomal fraction as this mixture contains important liver enzymes that allow the formation of the direct-acting toxic metabolite of the drug in cellular (i.e., in vitro) systems. Importantly, initiating events in themselves are not guaranteed to result in cancer. In many cases,these changes just make the cell non-viable or otherwise unable to proliferate. But presuming that the initiating event’s effect is sustainable, the next step in carcinogenesis is promotion. （4）Promotion Promotion is the general process by which the initiated cells undergo clonal expansion to produce a preneoplastic lesion. Carcinogenicity at this stage is generally nongenotoxic, acting through a myriad of epigenetic mechanisms including hormone modulation, irritation and inflammation, immunosuppression, and inhibition of cellular communication pathways.27,28 Given the indirect nature of their effects, carcinogens that encourage the promotion phase of the carcinogenic process are assumed to have a ‘safe’ threshold as described earlier. Furthermore, in contrast to initiation and progression, promotion is generally thought to be reversible.22,26 The carcinogen DES, which was mentioned at the beginning of this chapter, primarily acts as a tumor promoter by inducing estrogen receptor mediated increases in cellular proliferation.29 （5）Progression The final stage of carcinogenesis is known as progression. During this stage, successive genotoxic changes result in accumulation of additional mutations within individual tumor cells. These processes ultimately select for clones with the most aggressive traits (e.g., proliferation), and this in turn culminates in the irreversible development of a neoplasm. Similar to initiating agents, agents that target progression are typically genotoxic, and thus, are assumed to not have a ‘safe’ threshold for their use. 22 02 Overview of Regulatory Landscape Since it was initially conceived by the National Cancer Institute (NCI) in the mid-1970s, the 2-year rodent bioassay for carcinogenicity has become the gold standard for estimating the carcinogenic potential for new drug products.30 Although requirements for long-term studies were already in place in founding member regions of the ICH (i.e., the US, EU countries, and Japan) by the time the ICH guidelines for carcinogenicity studies were developed in the 1990s, global adoption of these guidance enabled alignment on many specific aspects of the assay. These aspects included high dose selection (which previously allowed use of high dosage multiples of greater than 100 times on a milligram per kilogram basis as an alternative to the maximum tolerated dose(MTD) in the EU and Japan, but not the US), and the minimum duration of clinical exposure to justify long-term studies (previously 3 months in the US versus 6 months in the EU and Japan). Through harmonization of these and other expectations, the ICH S1 guidances9 sought to reduce redundancies in the global drug development process. This alignment notwithstanding, the 2-year assay is not now, nor has it ever been, a simple undertaking. There are several aspects of its design that set it apart from many of the traditional tests in the nonclinical testing battery. In particular, the long duration and high number of animals (i.e., at least 50 animals of each sex per group) required for performing two, traditional, 2-year rodent carcinogenicity studies (typically in rat and mouse models) make them uniquely resource intensive, and therefore costly for sponsors. The ICH S1 guidance was conceived with the understanding that regulatory expectations must be allowed to evolve alongside the industry’s understanding of cancer itself. Perhaps the most dramatic update in recent years has been the finalization of the ICH S1B(R1) addendum.10 This addendum describes an integrated weight of evidence (WoE) assessment to aid sponsors in determining whether a 2-year rodent carcinogenicity study is likely to add value to the overall carcinogenicity testing approach. When it does not add value, the sponsor can now seek regulatory consultation to support the decision to exclude 2-year studies entirely. As outlined in Table 8-1, relevant guidance for carcinogenicity testing has been implemented almost universally by ICH member countries. It is also widely recommended by regulators in numerous ICH observer and non-member countries. （1）Requirements for Carcinogenicity Testing The general expectations outlined in the ICH S1B(R1) guidance10 are for one long-term study (typically a 2-year study in rats), and either a second long-term study (typically in mice) or a short or medium length in vivo (i.e., animal) study. The most commonly used shorter length studies include rodent models of initiation and promotion of cancer, as well as studies using transgenic (e.g., p53+/-, the Tg.AC, Tg.rasH2, and Xpa-deficient) and neonatal rodents. （2）Factors for Consideration Historically, exposure duration has been the primary determinant of whether  studies are required, with studies being needed for products that are intended to be taken for longer than 6 months, or intermittently for an extended period of time. Specific ‘cause for concern’ is another important consideration. According to ICH guideline S1A,9 causes for concern may include: 1.Previous demonstration of carcinogenic potential in the product class that is considered relevant to humans, 2.Structure-activity relationship suggesting carcinogenic risk, 3.Evidence of preneoplastic lesions in repeated dose toxicity studies, and 4.Long-term tissue retention of parent compound or metabolite(s) resulting in local tissue reactions or other pathophysiological responses. Notably, while extended dosing beyond 6 months is considered to be justification for requiring carcinogenicity studies, it is not considered to be a ‘cause for concern’ in itself per ICH guidance.9 （3）Additional Mechanistic Studies While not a specific requirement, additional mechanistic studies may be necessary to understand any results obtained from carcinogenicity testing. Such studies may focus on various endpoints, including: • Cellular changes (e.g., apoptosis or proliferation), • Biochemical changes (e.g., growth factors and plasma levelsof specific hormones), • Additional genotoxicity assessments when the standard battery is negative and an epigenetic mechanism cannot be discerned, and • Other modified protocols to further characterize an effect (e.g., reversibility, dosing interruptions, etc.). The primary goal of these additional mechanistic studies is to better characterize a drug’s mechanism of action and its relationship with potential human risk. For example, while drugs that agonize the peroxisome proliferator-activated receptor α are known to induce cancer in some rodents, this mechanism has been shown to be irrelevant for assessing human cancer risk.31 （4）Timing in a Development Program Carcinogenicity testing should follow genotoxicity testing as discussed in ICH S2(R1).11 It should also take the intended patient population and dosing regimen into consideration, as well as the results of early pharmacokinetic and pharmacodynamic analyses (see Chapter 6), and repeat-dose toxicity testing results (including independent dose-range finding studies as needed; see Chapter 8). This information can be extremely valuable for not only determining if preneoplastic lesions or other important changes (e.g., immunosuppression or cellular proliferation) are present, but also for understanding the mechanistic basis of any findings, including whether they are relevant for cancer development in humans. Assuming there is no ‘cause for concern,’ the general expectation for carcinogenicity studies is that they be completed before applying for marketing approval, but not necessarily before initiating large-scale (i.e., Phase 3) clinical trials.9,12 （5）Potential Exceptions to Regulatory Requirement Expectations There are multiple exceptions to the general regulatory requirements. These may be based on current scientific understanding of specific products or product classes; or on careful assessment of any risks that may occur with deviation from the normal timeline,data expectations, or both, in light of any potential benefits. （6）‘Unequivocally’ Genotoxic Drugs While it might be expected that obtaining unequivocally positive results (i.e., based on the findings of an entire battery of tests rather than a single test) from genotoxicity studies would inevitably require long-term carcinogenicity studies, this is not the case. The S1B(R1) guidance,10 states that a “2-year rat study is less likely to be of value either in cases whether there is no genotoxicity risk, or in cases with unequivocal genotoxicity risk.” In other words, where already sufficient information exists to draw a conclusion regarding genotoxicity, the drug is presumed to be a transspecies carcinogen and a resource-intensive 2-year study is not likely to be warranted. （7）Anti-Cancer Products and Indications with Limited Life Expectancy According to ICH S918 and ICH S1A,9 carcinogenicity studies are not typically required for drugs being developed to treat advanced cancers; they may also not be required for other serious indications where the life expectancy is shorter than 2 to 3 years. This exception may seem strange in the case of anti-cancer drugs; however, it is based on the understanding that many cancer treatments are also ‘cancer inducers’, as explained in the following examples. • Radiation therapy (e.g., using high-energy X-rays, gamma rays, or other charged particles) works by inducing strand breaks in DNA, which is more likely to cause death in rapidly dividing cells. However, it is well-established that radiation therapy also increases the risk of developing other cancers in the future.32 • Alkylating agents (e.g., cyclophosphamide, cisplatin and busulfan) damage DNA in cancer cells by the chemical attachment of an alkyl group, preventing cell division and resulting in the death of the affected cells. Such treatment can affect normal cells (albeit to a lesser extent), however, and may result in secondary cancers at a later date. • The increase in future cancer risk for these and other therapies is often considered acceptable if the treatment provides an immediate benefit for the existing cancer, and where there are few or no other therapeutic options available. However, this exception does not extend to carcinogenicity testing of new adjuvant drugs for use in tumor-free patients, or usage for noncancer conditions. For serious conditions where studies are still needed, carcinogenicity studies can often be completed after a drug has obtained marketing approval. Again, the slight increase in risk associated with the delay in performing such studies is offset by the need to expedite access to lifesaving or life extending therapies. （8）Combination Products Carcinogenicity and genotoxicity studies are not generally recommended for combination products prior to clinical trials or marketing approval if the individual components of the products have already been assessed for these risks separately, and where no new cause for concern exists. （9）Replacement Therapies Additional carcinogenetic testing is typically not needed for replacement therapies (e.g., insulin) when there is a comparable chemical structure and biological activity to the ‘natural’ counterpart, and when the therapy is given within normal physiological levels, especially when similar products have already been determined to be safe. The need for additional study should be assessed when a new drug deviates from these parameters. （10）Formulation and Manufacturing Changes Minor manufacturing and formulation changes need to be assessed on a case-by-case basis to determine if new carcinogenicity testing is needed. However, as per the ICH S1A guidance,9 additional studies may not be needed where existing testing supports the safety of the current formulation, and where no significant changes in pharmacokinetics, pharmacodynamics, or toxicity exist that would necessitate additional bridging studies. （11）Pediatric Studies ICH M3(R2)12 addresses the need for performing additional studies before including pediatric populations in clinical trials. In terms of carcinogenicity studies, the expectation is that their need will be determined before beginning long-term studies, but that they are not necessary unless there is cause for concern based on the results of general toxicity, genotoxicity, or mechanistic studies. （12）Biotechnology Products Guidance on the preclinical safety evaluation of biotechnology products is discussed in ICH S6(R1).13 The document states that carcinogenicity testing is usually not appropriate for biotechnology products unless necessitated by duration of exposure, disease population, or biological mechanism of action. The latter is important because toxicity with biotechnology products often results from exaggerated pharmacology rather than ‘off-target’ toxicity. For example, products that intentionally suppress immune function or promote cellular proliferation could cause carcinogenesis if these responses are excessive. This is particularly true in cases where the underlying disease state makes patients more sensitive to such effects. A WoE assessment should be carried out if there are concerns about carcinogenicity. Inputs for the assessment should include published information regarding the general drug class, relevant laboratory reports (e.g., using transgenic or target-deficient animals), the biology of the target, the mechanism of action, and any available cell or animal model data the sponsor can reference.Additional nonclinical work is generally not needed if the WoE does not support a finding of carcinogenicity. Similarly, additional studies are not warranted if the assessments support that finding, in which case guidance recommends the focus shift to product labelling and risk management approaches. When the outcome of the assessment is unclear, additional studies in well-characterized cell and animal models may be appropriate to understand and possibly manage any mechanism-based concerns. Presuming that the product is non-immunogenic and is biologically active in a rodent species, the sponsor might still consider conducting a single study in a relevant animal species or strain in some limited circumstances. However, studies with homologous products are not recommended as the results are not likely to be relevant to human use. Positive data in this scenario would be problematic for all involved (including regulatory reviewers), and performing the study would potentially divert valuable sponsor resources from more mechanistic studies that could better contribute to the overall risk assessment. （13）Limited Systemic Exposure Broad testing may not be needed in cases where a topically (e.g., dermal or ocular) administered product results in poor systemic exposure and there is no concern for carcinogenic activity at the application site (e.g., photocarcinogenicity). （14）Photocarcinogenicity An evaluation of phototoxic potential should be performed before outpatient studies as outlined in ICH S10.19 Points for consideration include whether the drug: 1.Absorbs light within the range of natural sunlight (290-700 nm) 2.Generates a reaction species following absorption of ultraviolet-visible light 3.Distributes sufficiently to light-exposed tissues (e.g., skin, eye) In cases where a potential risk is identified, ICH S10 also states that photocarcinogenicity testing in available rodent models is not adequate enough for assessing the risk of drugs in humans.19 Instead, ICH M3(R2) recommends that any potential phototoxicity risk be managed during trials by protective measures (e.g., appropriate warnings on the label and during patient consent, treatment with corticosteroids and other interventions, etc.) 参考文献： 22. Klaassen CD, ed. Casarett & Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons. 9th ed. McGraw-Hill Education; 2019. Verified October 2022. 23. Graziano M, Jacobson-Kram D, ed. Genotoxicity and Carcinogenicity Testing of Pharmaceuticals. Springer International Publishing AG; 2015. Verified 24 October 2022. 24. Weinberg, RA. The Biology of Cancer. 2nd ed. W.W. Norton & Company Inc.;2013. Verified 24 October 2022. 声明：原英文原文版权归美国法规事务协会（RAPS）所有，本译文供参考，如有任何建议，请联系我们。 更多优质内容，欢迎关注↓↓↓