作者｜清风排版｜药研对于药物分析人员而言，HPLC方法的开发是一个难以回避的问题，是分析进程中的限速步骤，在确定了杂质谱，对待研究物质进行理化性质（pKa，logD等）进行预测后，便会面临色谱柱的选择，不同类型的色谱柱提供不同的选择性，根据分离度计算公式RS=（1/4）[k/(1+k)(α-1)N0.5]，选择性α与分离度成正相关，因此色谱柱的选择是方法开发至关重要的一环。面对市场上琳琅满目的色谱柱，你是否感到手足无措，不知该如何下手呢？不要急，本文将对Waters、Agilent、ThermoFisher三大厂家主流HPLC色谱柱进行系统对比，让你对色谱柱有一个更清晰的认识。（本文以硅胶颗粒及小分子分离分析为基础进行介绍。）首先呢，我们先来了解一下色谱柱的构造。色谱柱的填充主要包括固相载体（主要为硅胶颗粒）及附着在载体上的配合基（C8/C18/Phenyl/PFP等）。颗粒的特征主要分为类型、直径、孔径大小和表面积。一般来讲，表面积与保留时间、最大进样量成正比，与孔径成反比。颗粒类型主要分为完全多孔的硅胶颗粒、表面多孔颗粒、薄壳型颗粒、混合颗粒及灌注颗粒。几种颗粒类型特征如下表所示。由上表可知，适合小分子分离分析的颗粒主要为全多孔硅胶颗粒、表面多孔颗粒及混合颗粒，而三大厂商也是以此为依托进行不断的改良。其中，混合颗粒在1977年被Unger等人报道后，被Waters公司全力发展。Waters HPLC色谱柱有4大经典色谱柱系列和4大颗粒平台。4大经典色谱柱系列为Sunfire、Symmetry、Atlantis及XTerra系列。Sunfire、Symmetry系列主要采用高纯硅胶颗粒，是Waters公司早期系列色谱柱。Atlantis系列主要为解决大极性化合物保留设计的色谱柱，主要有Atlantis T3柱，Atlantis dC18柱及Atlantis HILIC柱。XTerra系列是第一代杂化颗粒色谱柱，而XTerra MS C18柱pH耐受范围可达1-12，温度耐受范围可达60℃，体现出了杂化颗粒的特性。4大颗粒平台为BEH（亚乙基桥杂化颗粒）、CSH XSelect（表面带电杂化颗粒）、CORTECS（表面多孔硅胶颗粒）及HSS XSelect（高强度全多孔硅胶颗粒）。BEH系列主要分为3种色谱柱——常规C8/C18柱，亲水柱（RP18\HILIC\Amide）及苯基柱。CSH XSelect系列提供碱性化合物的极佳峰形与载量，主要有C18柱、五氟苯基柱（PFP）及苯基柱。CORTECS系列主要分为4种色谱柱——常规C8/C18柱，C18+柱，亲水柱（RP18\HILIC\T3）及苯基柱，C18+柱表面带正电键合相，可在低pH条件下使碱性化合物获得优异的峰形。HSS XSelect系列主要分为常规柱（C18/SB C18）、亲水柱（T3）、五氟苯基柱（PFP）及氰基柱（CN）。Agilent HPLC色谱柱主要分为2大系列——ZORBAX系列及Poroshell 120系列，分别对应全多孔硅胶颗粒及表面多孔硅胶颗粒。根据工艺不同，ZORBAX系列可分为5个小系列——Eclipse plus、StableBond、Eclipse XDB、Extend C18及Bonus-RP。Eclipse plus系列是Agilent完全创新的新型柱，可以保证碱性、酸性和中性化合物的优异峰形、分离度和结果（见图2）。StableBond系列为pH值低至1的低pH应用提供了非常高的稳定性，且为未封端工艺。Eclipse XDB系列采用超密键合和双封端工艺，以尽可能多地覆盖活性硅醇基。Extend C18柱采用独特的双齿型键合和双封端工艺，使其能够在pH值高达11.5的高pH应用中提供高效率和高选择性优势。Bonus RP柱在C14烷基链中嵌入了酰胺基团，使其可以耐受100%水相。前文已经提到表面多孔硅胶颗粒的优势，因此Agilent开发了基于表面多孔硅胶颗粒的Poroshell 120系列色谱柱，以提供更高的通量和更高的分离度。图2 不同厂家、类型C18柱对嘧啶、苯酚峰形对比（图片来自Agilent）Thermo Scientific HPLC色谱柱主要分为3大系列——Hypersil GOLD、Syncronis及Accucore。Hypersil GOLD系列色谱柱采用改良的高纯硅胶颗粒，提供12种不同的化学键合相，Hypersil GOLD C18色谱柱通过专有的衍生技术和封端程序使其pH耐受范围可以达到1-11，可以与混合颗粒耐受范围相媲美。Syncronis系列色谱柱采用高纯硅胶颗粒，具有多种键合方式和封端的固定相（约7种）。Accucore系列色谱柱是Thermo Scientific基于表面多孔硅胶颗粒开发的系列色谱柱，提供了7种不同的键合相。具有表面多孔硅胶颗粒的优势。值得一提的是，Hypersil GOLD HILIC色谱柱和Syncronis HILIC色谱柱都有极性键合相，而Waters公司的BEH/CORTECS/Atlantis HILIC色谱柱及Agilent公司的ZORBAX/Poroshell 120 HILIC色谱柱均为未键合的硅胶颗粒，从而显示出不同的选择性。三大厂商常用色谱柱信息见表2。接下来，介绍一下色谱柱的评价系统。USP药典委员会给出了2种色谱柱评价方式——USP方法、PQRI方法。USP方法是由美国药典HPLC色谱柱工作组采用美国国家标准与技术研究院（NIST）标准物质870（SRM870）（尿嘧啶、甲苯、乙苯、奎札因及阿米替林混合物），在甲醇-磷酸盐缓冲液（pH7.0）（80：20）条件下对色谱柱进行评价的方法。该方法用乙苯的保留因子表征疏水性（Hy）；用奎札因的拖尾因子表征色谱柱残留金属离子的螯合作用（CTF）；用阿米替林的保留因子（CFA）及拖尾因子（TFA）表征硅醇基的活性。另外通过测定固定相的键合密度（BD）表征形状选择性（见图3）。目前该数据库共123根色谱柱信息。图3 色谱柱评价方式——USP方法PQRI方法是PQRI原料药技术委员会杂质工作小组联合Dr. Lloyd Snyder，采用一系列标准物质（见图4），在50%乙腈/缓冲液；pH2.8、7.0；柱温35℃条件下对色谱柱进行评价的方法。该方法分别用疏水性（H），空间选择性（S）,氢键酸性（A），氢键碱性（B），pH2.8及7.0条件下离子交换能力（C2.8\C7.0）表征色谱柱的能力（见图5）。目前该数据库共757根色谱柱信息。图6 色谱柱评价方式——Tanaka测试上述3种色谱柱评价系统互为补充，分析工作者可以根据需要选择性质相似的替换柱或用于方法开发的性质差异较大的色谱柱。------------THE END------------点击查看：投稿获丰厚稿费关注药研 一路同行药研论坛：始终以为药品研发一线人员提供高质量、高性价比培训为第一宗旨。自成立以来，累计举办近60期药品研发、注册领域研讨班。据统计，中国医药工业百强企业和研发百强企业均超过90%参加过药研收费类培训。截至2022年底，包括上海强生、辉瑞、阿斯利康、山德士、日本大冢、大鹏、卫材、小林制药、扬子江、恒瑞、正大天晴、东阳光、科伦、中科院等在内的2600余家企事业单位参加过药研线下收费培训，得到业界普遍认可与好评！药研学院：已同众多企业合作近百期直播课，全网观看突破100万+，药研直播课聚焦药品研发相关主题，平均观看人数行业领先。药研自媒体矩阵20万+：目前药研公众号研发领域关注用户约10万人！双直播平台10万人，微信社群5万人，其中制药企业和研发机构关注量4000+。商务合作：15911172616
