Ketamine Hydrochloride

还在为精神疾病老药新用发愁？这篇Translational Psychiatry新文甩出scPsyDrug——首个专为精神障碍设计的单细胞互作驱动药物重定位工具，用MDD、SCZ、PD患者snRNA-seq数据验证，Top100里抓出21种已获批抗抑郁药；更在Zbtb18⁺/⁻焦虑小鼠模型中，精准筛出Forskolin、Chlorpropamide和Osthole并完成行为学挽救，连中药成分都不放过！ 福利大放送！！！关注回复“资料”2字，即可免费领取生信资料，包括数据集、绘图代码、图表复现、思路总结、参考文献......0代码鼠标点一点，就能轻松完成5—10分生信SCI全文复现!（持续关注我们，每天为您解读最新见刊的文献!） 新鲜出炉！今天给大家深度剖析一篇 2026年6月23日 发表在《Translational Psychiatry》上的文章，题目为：基于细胞类型特异性互作的神经精神疾病药物重定位方法 The cell-type specific interaction based drug repurposing for psychiatric disorders. 本研究开发了首个面向精神障碍的单细胞分辨率药物重定位计算流程scPsyDrug，整合单细胞转录组、蛋白互作网络、药物靶点关系及精神疾病风险基因，构建细胞类型特异性互作网络与种子基因模块，通过网络邻近度算法对药物进行优先级排序；在MDD、SCZ、PD患者snRNA-seq数据中成功富集大量已获批药物与临床试验化合物，并在Zbtb18⁺/⁻焦虑样小鼠模型中筛选并实验验证了Forskolin、Chlorpropamide和Osthole的干预效果。 影响因子：6.2 发表期刊：Translational Psychiatry 团队成员合影（位于上海陆家嘴中心，可随时预约参观） 向下滑动查看更多 CNSknowall 平台 Pubmed+AI 快速提炼研究亮点·研究思路·研究结果·研究结论 研究亮点 1.首个专为精神障碍定制的单细胞药物重定位工具： scPsyDrug是首个系统整合单细胞转录组、蛋白-蛋白互作（PPI）、药物-靶点互作及精神疾病风险基因（PSD genes）的计算流程，填补该领域专用软件空白。 2.严格限定中枢神经系统相关性： 通过admetSAR 3.0评估血脑屏障（BBB）通透性（阈值≥0.7），仅保留具脑部作用潜力的化合物；已获批精神科药物豁免此筛选。 3.多层级数据资源全面覆盖： 整合4148个PSD风险基因、15931蛋白/217016互作对的PPI网络、DrugBank（3614化合物/17624靶点对）与HERB（191中药/6205靶点对）数据库，涵盖西药与中药成分。 4.跨疾病验证稳健可靠： 在MDD（GSE144136）、SCZ（Zenodo DOI:10.5281/zenodo.6583332）及PD（GSE272760）患者前额叶皮层snRNA-seq数据中，scPsyDrug在Top100/60/40候选药物中分别检出21种获批抗抑郁药+34种临床试验化合物、16种获批抗精神病药+9种临床候选药、14种获批PD药+16种临床候选药。 5.细胞类型分辨率带来显著增益： 相比全细胞池化分析（仅检出6种MDD药），在兴奋性神经元L4亚群（ExN L4）中检出19种MDD相关药物；且ExN L4与L2中靶点网络邻近度显著高于其他细胞类型（p<0.001）。 核心创新点 1.提出“细胞类型特异性互作网络”建模范式： 基于scRNA-seq数据，在参考PPI网络中按细胞类型过滤互作边，再结合该类型差异表达的PSD基因为种子基因，通过超几何检验识别显著富集种子基因的功能模块，避免组织水平平均导致的信号稀释。 2.设计加权网络邻近度评分（DRScore）： 综合药物靶点与种子基因模块间最短路径距离，引入靶点权重（PSD基因且差异表达=1；仅PSD基因=0.5；均不满足=0），并经Z-score标准化，使评分更具生物学可解释性与跨模块可比性。 3.首次实现中药活性成分的系统性重定位： 利用HERB数据库将传统中药成分纳入分析框架，在Zbtb18⁺/⁻小鼠前额叶L2/3/4 CTX神经元中优先筛选出Osthole（靶向Parp1），并通过行为学实验证实其抗焦虑效应。 4.建立从计算预测到动物验证的闭环范式： 在Zbtb18⁺/⁻焦虑样小鼠模型中开展snRNA-seq，识别海马DG区（Adcy1/Kcnn2靶点）与前额叶L2/3/4 CTX区（Abcc8/Parp1靶点）的细胞类型特异性失调，据此筛选Forskolin、Chlorpropamide与Osthole，并完成口服给药（14天）及光暗箱、旷场行为学挽救实验。 5.揭示精神障碍中靶点功能的细胞背景依赖性： CHRM1（毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1）在ExN L4中富集调控多种获批MDD药物（如阿米替林、氯胺酮）；CALY与CHRM1分别在SCZ兴奋性神经元亚群中驱动Clozapine与DAS-431 IV的优先排序；PD相关药物则集中于CHRM1中心网络。 研究背景 精神障碍全球患病率持续攀升，但新型精神类药物研发进展缓慢、周期长、成本高、失败率高。药物重定位成为加速疗法发现的重要策略。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术揭示精神疾病存在高度细胞类型特异性的转录病理特征，然而现有基于scRNA-seq的重定位方法缺乏专用软件支持，且未系统整合蛋白互作网络与疾病风险基因，难以精准锚定细胞微环境中的关键靶点。 研究思路 1.资源整合与预处理： 收集4148个精神障碍风险基因（PSD genes）、15931蛋白/217016互作对的PPI网络、DrugBank与HERB数据库的药物-靶点关系，并利用admetSAR 3.0筛选BBB通透性≥0.7的化合物。 2.scPsyDrug流程构建： 输入疾病与对照组scRNA-seq数据，按细胞类型过滤PPI网络，以该类型差异表达的PSD基因为种子基因，通过超几何检验识别富集模块；计算药物所有靶点至各模块种子基因的加权网络邻近度，取均值得DRScore并Z-score标准化排序。 3.公共数据集验证： 应用scPsyDrug于MDD、SCZ、PD患者snRNA-seq数据，评估其对已知获批药物与临床试验化合物的Top排名能力，并与WebCMap、metaLINCS、ConnectivityMap等signature-reversal工具对比MeanRank。 4.小鼠模型驱动筛选与验证： 对Zbtb18⁺/⁻焦虑样小鼠海马与前额叶进行snRNA-seq，识别各细胞类型DEGs，输入scPsyDrug筛选候选药物；开展Forskolin、Chlorpropamide、Osthole口服干预（14天），通过光暗箱与旷场实验评估行为学挽救效果。 5.靶点机制解析： 对筛选出的靶点（Adcy1、Abcc8、Parp1）构建互作网络，进行KEGG与GO富集分析，结合qPCR验证其在Zbtb18⁺/⁻小鼠中的表达变化及药物干预后响应。 研究结果 1.scPsyDrug性能优越： 在MDD、SCZ、PD患者snRNA-seq数据中，scPsyDrug在Top100/60/40内检出的已获批药物与临床试验化合物数量及MeanRank均优于其他signature-reversal工具；单细胞数据表现优于bulk RNA-seq。 2.细胞类型特异性显著： 全细胞池化分析仅检出6种MDD药，而ExN L4与ExN L2分别检出19与12种；靶点网络邻近度在ExN L4中显著高于其他类型（p<0.001）；CHRM1、CALY、CHRM1分别驱动MDD、SCZ、PD药物在特定兴奋性神经元亚群中富集。 3.Zbtb18⁺/⁻小鼠表型明确： 该模型呈现脑长宽减小、体重与脑重下降，光暗箱测试显示进入明室次数、明室停留时间与穿梭次数显著减少，旷场测试显示中心区活动距离占比、进入次数与停留时间显著降低，确证焦虑样行为。 4.snRNA-seq揭示细胞类型特异性失调： Zbtb18⁺/⁻小鼠海马DG区检出2242个DEGs，前额叶L2/3/4 CTX区检出1463个DEGs；scPsyDrug据此在DG区Top3筛出Forskolin（靶Adcy1/Kcnn2），在L2/3/4 CTX区Top5筛出Chlorpropamide（靶Abcc8）、Top位筛出Osthole（靶Parp1）。 5.药物干预有效挽救行为异常： Forskolin治疗显著恢复Zbtb18⁺/⁻小鼠光暗箱总距离、明室距离、明室进入次数与穿梭次数，以及旷场中心区活动距离占比、进入次数、停留时间与总距离；Chlorpropamide与Osthole亦显著改善光暗箱各项指标，Osthole部分改善旷场指标。 研究结论与讨论 结论：scPsyDrug成功建立了首个面向精神障碍的细胞类型特异性药物重定位框架，其核心在于将单细胞转录病理、蛋白互作拓扑、药物靶点知识与疾病遗传风险四维信息在细胞分辨率上耦合，从而突破传统组织水平分析的局限。该工具不仅在MDD、SCZ、PD患者数据中高效召回已知疗法，更在Zbtb18⁺/⁻小鼠模型中实现了从计算预测（Forskolin靶Adcy1/cAMP通路、Chlorpropamide靶Abcc8/K_ATP通道、Osthole靶Parp1/DNA损伤响应）到行为学验证的完整闭环。研究同时指出，当前方法受限于药物靶点注释完整性、scRNA-seq数据质量与深度，且优先级排序结果需结合临床前证据进一步筛选，尚不能直接用于临床决策。 具体研究结果  1. scPsyDrug 有效优先排序精神疾病治疗化合物 通过系统整合已整理的资源，我们收集了包含 4,148 个 PSD 基因的综合目录（图 2A，表 S2）以及由 15,931 种蛋白质和 217,016 个相互作用组成的人类 PPI 网络（图 2A，表 S1），作为我们整个分析中的参考种子基因和 PPI 网络。药物-靶点对来自 DrugBank（3,614 种化合物和 17,624 个相互作用对）和 HERB（191 种中药及 6,205 个相互作用对）数据库。在 DrugBank 衍生的数据集中，我们进一步鉴定了 43 种 FDA 批准用于重度抑郁症（MDD）的药物和 109 种处于临床开发阶段的化合物（图 2A，表 S4）、32 种 FDA 批准的抗精神病药物和 80 种精神分裂症（SCZ）的临床阶段候选药物（图 2A，表 S5），以及 25 种 FDA 批准的帕金森病（PD）药物和 55 种在研药物（图 2A，表 S6）。 随后，我们将 scPsyDrug 应用于源自 MDD 患者前额叶皮层的 snRNA-seq 数据集，发现在排名前 100 的药物中，scPsyDrug 成功捕获了 21 种 FDA 批准的抗抑郁药和 34 种处于 MDD 临床试验阶段的化合物（图 2B）， 其中第 4 层兴奋性神经元（ExN L4）贡献了最多的候选药物：分别为 14 种获批药物和 5 种临床阶段化合物（图 S1）。类似地，在排名前 60 的候选药物中，scPsyDrug 检索到 16 种 FDA 批准的抗精神病药和 9 种 SCZ 的在研化合物（图 2C，图 S3）。此外，我们将 scPsyDrug 应用于源自 PD 患者前额叶皮层的 snRNA-seq 数据集。在 PD 队列中，排名前 40 的药物中，该算法检索到 14 种 FDA 批准的 PD 药物和 16 种在研化合物（图 2D，图 S5）。此外，我们将 scPsyDrug 与单细胞特征逆转方法进行了比较，结果表明 scPsyDrug 鉴定出的 FDA 批准药物和在研化合物的 MeanRank 显著低于其他方法鉴定出的药物（图 S1A、图 S2C 和图 S4C），表明 scPsyDrug 在基于单细胞的药物重定位方面表现优异。 2. scPsyDrug 实现精神疾病的细胞类型解析优先排序 为探究 scPsyDrug 产生的优先排序评分是否表现出细胞类型依赖性差异，我们首先将所有细胞合并进行药物重定位，但在排名前 80 的药物中仅检索到 6 种 MDD 适应症药物。相比之下，当分析在细胞类型特异性层面进行时，scPsyDrug 分别在 ExN L4 和 ExN L2 中识别出 19 种和 12 种 MDD 药物（图 3A 和 3B）。除合并所有细胞外，我们还比较了 scRNA-seq 与 bulk RNA-seq 数据在药物优先排序中的表现，结果表明单细胞数据在药物重定位中表现更佳（图 S4E）。值得注意的是，我们观察到大量获批和在研的 MDD 药物通过毒蕈碱型乙酰胆碱受体 CHRM1 在 ExN L4 中被选择性优先排序（图 3C，表 S7），该受体主要在前额叶区域表达，介导兴奋性胆碱能神经传递 [35]。其中，FDA 批准的抗抑郁药阿米替林（Amitriptyline）和氯胺酮（Ketamine）——一种用于治疗难治性 MDD 患者的快速抗抑郁剂 [36]——也被优先排序。 除兴奋性神经元外，我们还研究了小胶质细胞群体，并优先排序了一些与 MDD 相关的化合物（图 3D，表 S7）。例如，scPsyDrug 发现了丙咪嗪（Imipramine）（表 S7），一种典型的三环类抗抑郁药，其潜在靶点为 KCND2（Kv4.2）[37]；同时，靶向 APP 的姜黄素（Curcumin）也被优先排序。在一项纳入 56 名 MDD 患者的随机、双盲、安慰剂对照临床试验中，Lopresti 等人证明姜黄素在改善情绪症状方面优于安慰剂，从而凸显其作为 MDD 治疗候选药物的潜力 [38]。为进一步证明 scPsyDrug 内在的细胞类型特异性，我们在所有细胞群体中评估了 ExN L4 中排名前 20 的靶点（按 DRScore 排序）。结果显示，这些靶点在 ExN L4 中的绝对网络邻近度显著高于其他细胞类型（ExN L2 除外）（图 3E），这与在 ExN L4 和 ExN L2 中检测到的药物数量更多一致。此外，氯氮平（Clozapine）通过 CHRM1 被识别，而临床试验化合物 DAS-431 IV 则通过 CALY 在 SCZ 的兴奋性神经元亚群（ExN L2 和 ExN L4）中被检出（图 S2A-B、图 S3、表 S8）。同样，在 PD 神经元亚型（ExN 1、ExN 2）中，以 CHRM1 为中心的网络背景促进了 FDA 批准的 PD 药物苯托品（Benzatropine）、比哌立登（Biperiden）和普罗吩胺（Profenamine），以及临床阶段药物卡马西平（Caramiphen）、环己丙醇（Cycrimine）、多塞拉敏（Doxylamine）和美替辛（Metixene）的选择性优先排序（图 S4A-B、图 S5、表 S9）。 3. 在 Zbtb18 +/−小鼠模型中筛选潜在重定位药物 接下来，我们使用 scPsyDrug 在 Zbtb18 单倍体不足（Zbtb18 +/−）小鼠（一种类焦虑小鼠模型）中进行计算药物筛选，随后进行实验验证。在本研究中，我们发现与 Zbtb18 +/+ 对照组相比，Zbtb18 +/− 小鼠表现出明显的解剖学缺陷，包括脑长和宽减小，以及体重和脑重降低（图 4A，图 S6A）。行为学测试进一步揭示了类焦虑表型：在明暗箱测试中，Zbtb18 +/− 小鼠总运动距离呈减少趋势，并且在明室中移动距离显著减少、进入明室次数减少、明暗室间穿梭次数减少（图 4B、4C）。同样，在旷场测试中，Zbtb18 +/− 小鼠在中央区域移动距离占比减少、进入中心次数减少、在中心停留时间减少（图 4D、4E）。综合来看，这些测试表明 Zbtb18 +/− 小鼠表现出类焦虑行为。 为利用 scPsyDrug 在该小鼠模型中进行药物重定位，我们对源自 Zbtb18+/− 和 Zbtb18+/+ 小鼠的海马体和前额叶皮层进行了 snRNA-seq。在海马体中，我们共获得 60,448 个细胞，其中 28,684 个来自 Zbtb18+/+ 小鼠，31,764 个来自 Zbtb18+/− 对照组，随后聚类并注释为 9 个细胞群体。在前额叶皮层中，snRNA-seq 共获得 93,957 个细胞，其中 46,968 个和 46,989 个分别来自 Zbtb18+/+ 和 Zbtb18+/− 小鼠。这些细胞随后被分为 9 个细胞群体（图 4F）。在海马体中，我们在海马 CA 区锥体神经元（CA）中鉴定出 2,242 个差异表达基因（DEGs），在 GABA 能神经元（GABA）中鉴定出 1,473 个 DEGs，在齿状回（DG）颗粒神经元中鉴定出 1,087 个 DEGs，在星形胶质细胞（Astro）中鉴定出 701 个 DEGs，在少突胶质细胞（Oligo）中鉴定出 183 个 DEGs，在下托神经元（SUB）中鉴定出 169 个 DEGs，在小胶质细胞（Micro）中鉴定出 18 个 DEGs（图 S6B）。在前额叶皮层中，我们在 L2/3/4 CTX 神经元中鉴定出 1,463 个 DEGs，在 L5/6 CTX 神经元中鉴定出 966 个 DEGs，在星形胶质细胞（Astro）中鉴定出 309 个 DEGs，在 GABA 能神经元（GABA）中鉴定出 280 个 DEGs，在少突胶质细胞（Oligo）中鉴定出 192 个 DEGs，在小胶质细胞（Micro）中鉴定出 15 个 DEGs（图 S6B）。这些细胞类型特异性的 DEGs 随后被用于 scPsyDrug 筛选针对 Zbtb18+/− 小鼠的潜在化合物。 4. 佛司可林（Forskolin）挽救了 Zbtb18 +/− 小鼠的异常行为 在海马体 DG 群体中，scPsyDrug 将佛司可林列为 DrugBank 来源所有化合物中的前 3 名（图 5A-5C），其靶点为 Adcy1 和 Kcnn2。佛司可林是一种二萜类化合物，提取自唇形科植物毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii）的根部，长期以来被认为是腺苷酸环化酶（AC）家族的直接激动剂之一。通过直接作用于 AC 的催化亚基，佛司可林可增强 ATP 向 cAMP 的转化，从而快速且持续地提高细胞内 cAMP 水平 [39-41]。与此药理特性一致，围绕种子基因 Adcy1 和 Kcnn2 构建的相互作用网络（图 5D）显著富集于 cAMP 信号通路（图 S8A）。此外，AC 家族成员 Adcy1 在 Zbtb18+/− 小鼠的 DG 中显著下调（图 S10A-B）。随后，我们通过每日灌胃连续 14 天给予 Zbtb18+/− 小鼠佛司可林，以 5% DMSO 作为溶剂对照。经佛司可林干预后，Zbtb18+/− 小鼠在明暗箱测试中表现出行为恢复，包括总移动距离、明室移动距离、进入明室次数以及两室间穿梭次数的恢复（图 5E）。同样，在旷场测试中，佛司可林挽救了总运动活性、中央区域移动距离占比、进入中心次数以及在中心停留时间（图 5F）。 5. 氯磺丙脲（Chlorpropamide）部分挽救了 Zbtb18 +/小鼠的异常行为 在前额叶皮层的 L2/3/4 CTX 中，scPsyDrug 将 FDA 批准的氯磺丙脲列为 DrugBank 来源所有候选药物中的前 5 名 （图 6A，图 S7A-B），其靶点为 Abcc8。氯磺丙脲是一种第一代磺酰脲类降糖药，通过结合 ATP 敏感性钾通道（K\ATP）的调节亚基——由 Abcc8/ABCC8 基因编码的磺酰脲受体 1（SUR1）来治疗糖尿病。在我们的数据中，围绕 Abcc8 及其种子基因构建的相互作用网络（图 S7C）显著富集于突触传递、谷氨酸能、神经发生调控和神经元凋亡过程等通路（图 S8B），表明在 L2/3/4 CTX 中观察到的 Abcc8 异常上调（图 S10C-D）可能与这些过程存在机制关联。随后，我们通过每日灌胃连续 14 天给予 Zbtb18 +/− 小鼠氯磺丙脲，以玉米油作为溶剂对照。经氯磺丙脲干预后，Zbtb18 +/− 小鼠在明暗箱测试中表现出行为恢复，包括总移动距离、明室移动距离、进入明室次数以及两室间穿梭次数的恢复（图 6C，图 S9A）。 6. 蛇床子素（Osthole）部分挽救了 Zbtb18 +/−小鼠的异常行为 接下来，我们筛选中药活性成分以挽救 Zbtb18+/− 小鼠的异常行为，展示了 scPsyDrug 在中药成分重定位中的应用。通过使用 HERB（v2.0）数据库，scPsyDrug 在 L2/3/4 CTX 中优先排序了蛇床子素（图 6B，图 S7D-E），其靶点为 Parp1。聚（ADP-核糖）聚合酶 1（Parp1）催化自身及多种蛋白底物的翻译后修饰，参与多种细胞过程 [42]。围绕 Parp1 及其种子基因构建的相互作用网络（图 S7F）显著富集于神经退行性疾病、兴奋性突触、钙信号通路和 FoxO 信号通路相关通路（图 S8C），表明在 L2/3/4 CTX 中观察到的 Parp1 异常上调（图 S10E-F）可能与这些信号通路耦合。受此启发，我们通过每日灌胃连续 14 天给予 Zbtb18+/− 小鼠蛇床子素，以玉米油作为溶剂对照。结果显示，蛇床子素治疗挽救了 Zbtb18+/− 小鼠在明暗箱测试中的行为，包括总移动距离、明室移动距离、进入明室次数以及两室间穿梭次数（图 6C）。旷场测试中的异常行为也部分被蛇床子素挽救（图 S9B）。 总结 本研究开发了scPsyDrug——首个专为精神障碍设计的细胞类型特异性互作驱动药物重定位计算流程，整合单细胞转录组、蛋白互作网络、药物-靶点关系及精神疾病风险基因，通过加权网络邻近度算法实现药物优先级排序；在MDD、SCZ、PD患者snRNA-seq数据中验证其高效召回已获批药物能力，并在Zbtb18⁺/⁻焦虑样小鼠模型中成功筛选并实验验证Forskolin、Chlorpropamide和Osthole的抗焦虑效应，同时拓展至中药活性成分Osthole的系统性重定位。 更多结果和补充图表: PMID：42374032 DOI：10.1038/s41398-026-04226-9 不想做实验，没数据，还想要快速发表文章，没问题的！公共数据库就是我们的数据宝藏！没思路不用担心，作为专业的生信团队，我们很乐意为您效劳，提供研究路线设计和数据挖掘分析，扫码联系我们吧！ 长按二维码关注我们，用最短的时间和最高的效率学习更多数据分析方法! 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📑 文章目录 Basic Information英文标题：A multi-agent system for automating scientific discovery中文标题：一种用于自动化科学发现的多智能体系统发表日期：19 May 2026文章类型：Article所属期刊：Nature文章作者：Ali E. Ghareeb | Samuel G. Rodriques文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10652-yAbstractPara_01科学发现由观察、假设生成、实验和数据分析的迭代过程所驱动。尽管近年来人工智能在生物学中的应用取得了进展，但尚未有系统能够自动化完成所有这些阶段。在此我们介绍Robin，这是一种多智能体系统，能够完全自动化实验生物学中的假设生成和数据分析。通过将文献检索智能体与数据分析智能体相结合，Robin能够生成假设、提出实验方案、解释实验结果并生成更新后的假设，从而实现半自主的科学发现方法。通过应用该系统，我们成功识别出针对干性年龄相关性黄斑变性的潜在治疗候选药物，这种疾病是发达国家致盲的主要原因。Robin提出增强视网膜色素上皮细胞的吞噬作用作为治疗策略，并在体外识别和验证了ripasudil和KL001的有效性。Ripasudil是一种临床使用的Rho激酶抑制剂，据我们所知，此前从未被提出用于治疗干性年龄相关性黄斑变性。为了阐明ripasudil诱导吞噬作用上调的机制，Robin进一步提出并分析了一项后续的RNA测序实验，结果显示ABCA1表达上调，该基因编码一种脂质外排泵，可能代表一个新的潜在治疗靶点。本报告正文中的所有假设、实验方向、数据分析和数据图表均由Robin生成。作为首批在闭环迭代实验框架中自主发现并验证新型治疗候选药物的人工智能系统之一，Robin确立了人工智能驱动科学发现的新范式。Inline RecommendationsSimilar content being viewed by others 其他人正在查看的相似内容发现一种用于罕见遗传病ROSAH综合征的选择性alpha-激酶1抑制剂整合机器学习和基于结构的方法，重新利用强效的酪氨酸蛋白激酶Src抑制剂治疗炎症性疾病固定组合的利帕舒地尔和溴莫尼定对小鼠房水动力学的影响MainPara_01我们测量、干预和模拟生物系统的能力不断进步，使得科学知识总量迅速增长。然而，用于解释、综合这些知识并从中生成假设的配套技术却相对滞后。基于大语言模型的人工智能系统在自动化知识整合过程、加速科学发现方面展现出巨大潜力。由于生物医学研究的主要目标是开发疾病的新疗法，因此我们在新药研发方面的能力可能是这些方法最终受益的关键领域。药物开发高度依赖于生物学、临床学和药学专业知识的融合，并受限于专家整合科学文献的速度。Para_02现有药物用于新适应症的再利用为大型语言模型系统提供了一个有前景的应用空间。药物再利用的历史常常呈现出一种模式：尽管科学文献中早已存在相关见解，但这些知识往往需要经过较长时间的延迟才最终形成新的治疗方法。例如，达拉非尼是一种用于治疗多种伴有BRAF促分裂突变癌症的BRAF激酶抑制剂，目前正在被重新用于预防听力损失。尽管其分子作用在2010年就已被充分表征，但达拉非尼的耳保护效应直到十年后才通过无偏见的高通量筛选被发现。这种发现的延迟发生，尽管达拉非尼的耳保护效应正是其已知的BRAF抑制作用的直接结果，表明通过逻辑性地连接文献中现有的生物学见解，可能可以识别出更多的药物再利用机会。医学领域中的其他案例，从氯胺酮（延迟22年）到亚叶酸钙（延迟5年），再到KarXT（延迟13年），进一步凸显了核心见解被记录多年后才实现再利用的普遍现象。将已有见解与新的治疗应用相连接所存在的延迟，突显了整合分散科学知识的挑战。大型语言模型训练数据涵盖多个领域，能够存储和回忆各种科学主题的信息，从而超越个体人类知识的局限。先前的研究表明，经过微调的大型语言模型和专门的检索增强生成系统在从科学文献中检索和总结信息方面的表现可超过人类。这些进展使得大型语言模型系统可用于新颖假设生成的可能性得以提升。Para_03最近已开发出多个大型语言模型系统，用于实现假设生成的自动化。还开发了专门化的系统，用于自动化药物发现中的特定任务，例如药理学特性和安全性的预测。这些系统已证明能够通过采用多智能体架构，将科学推理分解为离散且可管理的子任务，结合领域特定的微调、外部工具的集成以及人类反馈的引入，从而生成合理的假设。然而，这些系统中尚无一个能够实现科学过程所有关键智力步骤的自动化，包括假设和实验策略的生成、实验室实验结果的分析，以及根据新数据对假设进行修正。Para_04本文介绍了Robin，这是一种用于生物学发现的多智能体系统，它将新假设的生成与实验数据分析整合到一个连续的工作流程中（图1a,b）。Robin利用专门的语言智能体进行文献检索（Crow和Falcon）和数据分析（Finch），以实现半自主的科学发现（图1c）。尽管该系统可应用于跨学科的科学发现，但本文重点探讨其在治疗学领域的潜力。在向Robin提供一种目标疾病后，Robin自动识别出能够模拟关键疾病机制的相关体外实验，并提出可在这些实验模型中评估的特定药物候选分子。随后，我们开展了这些实验，并将获得的数据提供给Robin进行自主分析。Robin随后根据分析结果解释数据，并生成新一轮的治疗候选方案。通过这一过程，Robin推动了一个迭代的治疗开发循环，在此过程中，假设根据实验结果不断被提出、验证、分析和优化。因此，科学方法中的关键思维步骤得以自动化，同时在整个实验循环中与科研人员保持协作。Robin是首个将基于文献的假设生成与生物实验数据的自主分析相结合，形成连续反馈系统的系统之一。 Fig. 1: Architecture and workflow of the Robin system. - 图片说明 ◉ 当提供目标疾病的名称时，Robin会生成假设并选择最佳的治疗候选方案进行实验验证。Robin能够自主分析这些实验的原始数据，以合成科学见解并生成更新的治疗假设。◉ Robin与语言代理交互，以生成假设并分析实验数据。◉ Crow和Falcon分别用于进行简洁和深入的文献检索，以收集信息来指导假设的生成。Finch负责对实验数据进行分析，Robin利用这些分析结果获得见解，以指导下一轮假设的生成。Para_05为了展示Robin生成和优化新颖治疗假设的能力，我们尝试确定干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）的潜在新疗法。dAMD是发达国家不可逆视力丧失的主要原因，但目前可用的治疗选择有限。仅在美国，就有150万人患有威胁视力的dAMD，其中60万人因AMD而被法律认定为盲人，由于人口老龄化，这一数字预计到2050年将几乎增加至三倍。通过应用Robin来发现dAMD的新型治疗候选方案，这项工作代表了人工智能在科学研究中实现自动生成发现的重要一步。Robin: a multi-agent system for scientific discovery Robin：一个用于科学发现的多智能体系统Para_01Robin通过将多个语言智能体整合到一个结构化的工作流程中，为特定疾病生成治疗候选方案（图1a、b）。Crow和Falcon是基于PaperQA2的文献检索智能体，分别进行简明和深入的文献综述。PaperQA2在信息检索与摘要生成方面达到专家水平，能够访问科学文献、临床试验报告以及Open Targets平台。Finch是一个科学数据分析智能体，用于分析来自实验检测的实验数据，例如RNA测序（RNA-seq）和流式细胞术（图1c）。通过协调这些智能体以识别新颖且易于实验室验证的治疗策略，我们利用Robin构建了一个实验引导的系统，推动科学发现过程。Robin假设生成工作流程的一个示例见补充图1。在本文描述的工作流程中，Robin用30分钟分析了551篇论文，而人类完成相同任务预计需要294小时。根据已发表调查得出的估算，我们估计手动完成整个科研工作流程所需时间减少了约200倍（表1）。 Table 1 Estimated time-on-task comparison: human versus Robin-assisted discovery 表1 任务耗时估计比较：人工 versus Robin辅助发现 Therapeutic hypothesis generation 治疗假设生成Para_01当提供感兴趣的疾病（dAMD）时，Robin提出了关于该疾病病理的一系列一般性问题，并要求Crow回答每个问题。利用Crow提供的报告作为背景，Robin随后确定了十种潜在的致病机制。针对每种机制，Robin调用Crow撰写一份详细报告，描述可用于测试药物有效性的体外疾病模型。然后，Robin使用一个大语言模型评审员对这些报告进行两两比较，进而计算出它们的相对排名（见方法部分）。Robin采用排名最高的体外模型来确定治疗候选假设生成的实验策略。Para_02选定一种体外模型后，Robin 进行了类似的文献综述和假设生成步骤，提出30种候选治疗药物用于实验测试。随后，Robin 查询 Falcon 生成详细报告，以评估每种候选药物。这些报告既包含每种药物适用于缓解该体外模型所代表疾病机制的理由，也包括药物可能存在的潜在局限性。候选药物由大语言模型通过评判比赛方式进行排序，依据是科学推理的强度、药理学特征以及支持性文献的研究方法学质量。随后，人类科学家对排序结果进行审阅，并根据 Robin 建议的检测方法，按照人工设计的实验方案在实验室中对排名靠前的候选药物进行了测试。Experimental data analysis 实验数据分析Para_01实验完成后，我们上传了原始或半处理的数据（在本例中为流式细胞术的.FCS文件或RNA-seq的基因计数），并向Robin提出期望的分析方法，例如‘流式细胞术’或‘差异表达分析’。随后，Robin调用Finch来执行所需的分析。由于生物数据解释本身具有模糊性，这一分析步骤带来了独特的挑战。例如，流式细胞术分析中的设门选择或RNA-seq分析中使用的过滤条件在不同科研人员之间可能不同，并可能影响最终结论。同样，即使接收相同的提示和数据，由于语言代理的随机性，Finch的分析结果在不同运行之间也可能存在差异。为了利用这种多样性，我们将Robin配置为启动八条独立的Finch分析路径，每条路径均独立分析实验数据。在每条路径中，Finch在Jupyter笔记本中执行分析代码，并提供对其发现的可解释且可重复的总结。在所有路径完成后，通过一次元分析将所有输出整合为基于共识的结论。通过这种方式，Finch探索了多种分析路径，同时基于共识得出高度一致的最终结果（见方法部分）Para_02最后，Robin 从这些经过处理的实验结果中提炼出可操作的科学见解。Robin 还具备提出有针对性的后续实验以探索或确认重要或意外发现的能力。这些实验见解被用于指导下一周期的治疗假设生成。该循环持续进行，直到人类获得满意的候选药物。Robin expedites hypothesis generation Robin 加快了假设生成的速度Para_01我们应用Robin生成干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）的治疗候选方案，作为初步的概念验证（图2a和补充图1-11）。Robin通过识别和审阅151篇论文，启动了治疗假设生成的工作流程，并提出了10种具有生物学意义的dAMD机制用于检测。在对疾病机制及相应的实验策略进行排序后，Robin建议通过增强视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬作用来治疗dAMD，并建议通过流式细胞术检测药物在多大程度上提高患者来源或干细胞来源的RPE细胞的吞噬能力。 Fig. 2: Robin generates therapeutic candidate hypotheses for dAMD and analyses experimental data from in vitro experiments. - 图片说明 ◉ a，Robin提出了几种实验方法，最终决定采用RPE吞噬功能增强实验。Robin将这一策略整合为一个总体目标，随后生成了多个新型治疗候选物以增强RPE的吞噬功能。TEER代表跨上皮电阻。图a中的文字由Robin生成。◉ b，吞噬实验的示意图。RPE细胞在加入pHrodo标记的微珠或ROS之前，先与药物孵育1小时。细胞与微珠或ROS共同孵育3小时后，通过流式细胞术测量吞噬活性。该示意图使用BioRender绘制；Ghareeb, A. https://biorender.com/yf9q8b1 (2026)。◉ c–f，Finch流式细胞术分析流程中的示例图，经人类整理以提高出版可读性。c，Finch通过前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）图进行设门，排除碎片。◉ d，Finch通过前向散射高度（FSC-H）对FSC-A图筛选单细胞群体。◉ c、d中的红色轮廓区域表示细胞群。◉ e，Finch识别4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）信号，并排除死细胞。◉ f，Finch对候选药物与DMSO对照组进行统计学检验，并绘制结果。该柱状图显示相对于DMSO对照组的平均荧光强度变化倍数（FC MFI）（n = 3个孔；误差线表示标准误；显著性通过Dunnett检验确定：*P < 0.05）。Para_02随后，Robin调用Crow（补充图4）对约400篇与RPE吞噬作用及干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）治疗领域相关的文献进行了综述，并综合研究结果提出了30种现有药物候选分子，用于吞噬功能实验检测。Robin调用Falcon为这些分子生成了全面的评估报告（补充图9），并由大语言模型评判进行排序，形成排名结果。Para_03我们计算了在论文中运行的相同配置下Robin工作流的成本：num_queries = 5，num_assays = 10，num_candidates = 30。该配置将产生45次Crow调用和30次Falcon调用，平均成本分别为4.33美元和6.43美元，总计每次运行成本为10.76美元。Para_04我们对任务耗时的分析（表1）表明，Robin框架将一个发现周期的总体认知劳动从估计的359至424个人工小时减少到不到2小时。值得注意的是，该系统在大约30分钟内综合了约551篇参考文献，而根据学术阅读的既有文献基准，这一任务若由人工完成则大约需要294小时。ROCK inhibitor enhances phagocytosis ROCK抑制剂增强吞噬作用Para_01然后，我们从该排名中选出前五名候选药物进行实验测试：艾塞那肽-4、芬戈莫德、MFGE8、Y-27632以及5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）与牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的组合。MFGE8已知可增加培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬作用，因此我们将其作为阳性对照纳入实验。尽管Robin建议使用荧光标记的感光细胞外节段作为RPE吞噬作用的底物，但我们最初因可获得性原因决定使用pHrodo微球。此外，Robin建议使用原代或干细胞来源的RPE细胞，但为了加快对Robin提出的假设的评估，我们在初步药物筛选中使用了ARPE-19细胞。pHrodo微球在溶酶体的低pH环境中会被荧光激活，从而可通过流式细胞术检测单个细胞的吞噬作用（图2b；显微镜验证见补充图12）。在RPE吞噬功能检测中测试这些候选治疗药物后，我们将原始流式细胞术数据、相关元数据以及分析指令上传至Robin。Robin调用了名为Finch的数据分析代理，该代理生成了一个Jupyter笔记本，通过对流式数据设门并进行统计检验，以量化每种化合物对RPE吞噬作用的影响。图2c–e展示了来自一个代表性Finch分析路径的图表结果。这些结果经由人工对该相同数据的分析得到了确认（补充表3和补充图13）。临床前模型已证明Y-27632能够恢复RPE细胞的吞噬效率，这证实了Robin基于文献提出该候选药物的合理性。Automated RNA-seq analysis 自动化RNA测序分析Para_01在分析了最初的流式细胞术结果后，Robin建议对经Y-27632处理的RPE细胞进行RNA测序，以研究ROCK抑制对转录的影响（图3a）。我们开展了第二次RPE吞噬实验，并使用Y-27632处理样本，随后通过批量RNA测序对样本进行了分析。Finch进行了差异基因表达（DGE）分析，并将结果汇总在火山图中（图3b）。尽管先前的研究表明Y-27632通过F-肌动蛋白动态的翻译后调控来增强吞噬杯的形成，但Finch的DGE分析显示，Y-27632处理还在吞噬过程中诱导了RPE细胞快速的转录变化。Finch的共识分析表明，在超过50%的轨迹中，Finch识别出相同的基因显著差异表达（图3c）。随后，Finch进行了基因本体富集分析，发现Y-27632在吞噬作用后显著改变了参与肌动蛋白丝组织、小GTP酶介导的信号转导以及自噬通路相关基因的表达（图3d）。这些结果表明，Y-27632可能通过细胞骨架重排促进吞噬作用的初始摄取阶段，并通过调控自噬相关基因的转录促进内化物质的清除；然而，仍需进一步研究来验证其对自噬的具体影响。该分析的人源版本与Finch的结果类似，见补充图14。 Fig. 3: RNA-seq analysis of ARPE-19 cells treated with the ROCK inhibitor Y-27632. - 图片说明 ◉ a，Robin 解读了第一次实验的结果，并提出了后续的检测方案。图 a 中的文字由 Robin 生成。◉ b–d，Finch 进行的 RNA-seq 分析示例图表，经人工调整格式以提高出版物中的可读性。◉ b，由 Finch 生成的火山图，显示吞噬作用后经 Y-27632 处理的细胞与野生型（WT）细胞之间差异表达的基因。◉ c，基于八条 RNA-seq 分析路径的 Finch 共识结果，显示识别出相同基因持续上调或下调的分析所占的百分比。◉ d，由 Finch 生成的差异表达基因的基因本体（Gene Ontology）术语富集分析；n = 3 个孔。Para_02DGE分析发现，在Y-27632处理的细胞中，编码关键脂质外排泵的ABCA1表达上调了三倍（校正后P值 = 2.13 × 10−83）。ROCK抑制剂诱导吞噬作用后ABCA1的差异表达对干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）具有潜在意义，因为ABCA1对视网膜色素上皮（RPE）的正常功能至关重要。ABCA1介导胆固醇和磷脂从质膜主动转运至受体蛋白，随后将其排出细胞。进一步将这些发现与dAMD的病理机制联系起来，载脂蛋白E作为ABCA1的脂质受体，已在多项研究中被确认为黄斑变性的遗传易感等位基因。Para_03这些机制性见解源于Robin提出并由Finch分析的实验，展示了人工智能驱动的科学发现不仅能加速候选治疗化合物的体外数据生成，还能揭示疾病通路中可能原本未被探索的新型分子靶点。A repurposed drug for dAMD 一种用于dAMD的再利用药物Para_01除了建议对Y-27632进行RNA-seq分析外，Robin还开展了后续一轮的候选药物假说研究（图4a）我们通过实验测试了其中的十种药物，并将数据提供给Finch进行分析Finch的分析显示，ripasudil（一种在日本获批用于治疗青光眼的ROCK抑制剂）的表现优于Y-27632，与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，RPE细胞吞噬作用提高了1.89倍（人类样本分析显示提高了1.75倍；见补充表4和补充图15）在ARPE-19细胞中进行的剂量-反应实验进一步证实了ripasudil比Y-27632具有更强的效力（图4c）此外，作为一种已获批的药物，ripasudil具有明确的安全性特征，这使其在临床转化方面相较于作为研究用化合物的Y-27632更具优势 Fig. 4: Ripasudil and KL001 enhance RPE phagocytosis. - 图片说明 ◉ a，Robin关于ripasudil的提案摘录。根据第一轮实验分析的结果，Robin提出将ripasudil作为治疗dAMD的候选药物。在结果解读方面，由LLM从Finch结果生成JSON格式的输出（参见Robin GitHub仓库中prompts.py内的实验洞察应用ENDAGE；见代码可用性）。NECA：5′-N-乙基羧酰胺腺苷。图a中的文字由Robin生成。◉ b，在第二轮ARPE-19细胞实验中分析得到的流式细胞术数据表明，ripasudil能显著增强吞噬作用（n = 3个孔）。◉ c，ARPE-19细胞中ripasudil和Y-27632的剂量-反应曲线。在刺激ARPE-19细胞吞噬作用方面，ripasudil比Y-27632更具效力（n = 3个孔）。虚线水平线表示ripasudil（紫色）和Y-27632（蓝色）的半数最大有效浓度（EC50）。◉ d，在老年原代人视网膜色素上皮细胞（RPE-SCs）中对ripasudil进行验证，结果重现了Y-27632和ripasudil增强吞噬作用的效果（n = 4个孔）。◉ e，在RPE-SCs中，ripasudil的作用强于Y-27632（n = 4个孔）。带灰色阴影的虚线水平线表示DMSO对照组的MFI。所有图表中的误差线表示标准误（s.e.m.）。显著性通过Dunnett检验确定：*P < 0.05。Validation in primary human RPE cells 在原代人RPE细胞中进行验证Para_01RPE干细胞（RPE-SCs）是人类视网膜色素上皮细胞中的一个亚群，具有有限的有丝分裂潜能，可在体外进行培养。当扩增形成融合的单层并允许在体外成熟时，RPE-SCs能够表达典型的RPE基因，维持极化的屏障功能，并在形态上类似于天然的人类RPE细胞。此外，与诱导多能干细胞来源的RPE细胞不同，在RPE-SCs的培养过程中不需要使用ROCK抑制剂。我们从视力恢复眼库（纽约）获得了来自一位60岁以上患者的RPE-SCs，并将其扩增为融合的单层细胞。我们通过典型RPE标志物和吞噬机制的免疫细胞化学染色验证了其RPE表型（扩展数据图1和2）。Para_02我们重新筛选了Robin建议的所有药物，这次使用RPE-SCs替代ARPE-19细胞，并用荧光标记的牛视杆外节段（ROSs）替代微珠。再次确认ripasudil和Y-27632为有效化合物，其中ripasudil仍表现出更高的效力（图4d；另见补充表5中的人类分析和补充图16）。两种ROCK抑制剂均表现出剂量依赖性的吞噬作用增强，且ripasudil的效力高于Y-27632（图4e）。对该剂量反应实验的上清液进行了细胞毒性检测。Y-27632的剂量与RPE-SCs释放的乳酸脱氢酶（LDH）之间无相关性。ripasudil则显示出与LDH释放呈负相关关系，即药物浓度越高，LDH释放越少（扩展数据图3）。Para_03KL001是一种通过阻止CRY蛋白的泛素依赖性降解来调节生物钟的小分子化合物，也在RPE-SCs筛选中被识别为有效化合物。Robin基于RPE吞噬作用的昼夜节律调控提出了这种药物，据我们所知，此前尚无人提出KL001可作为吞噬作用的增强剂。Para_04为了进一步验证ABCA1的发现，我们对使用ripasudil或溶剂对照处理的RPE-SCs进行了RNA-seq分析（有或无ROSs）。在有或无ROSs的情况下，暴露于ripasudil的RPE-SCs中ABCA1的表达也上调（补充图17）Para_05尽管需要进行体内验证才能对这两种药物进行最终比较，但在此体外实验中，ripasudil相较于Y-27632初始表现出更优的性能，表明Robin能够通过迭代实验和反馈逐步优化治疗假设。Validation of the Robin architecture Robin架构的验证Para_01我们首先去除了文献检索代理Crow和Falcon，将其替换为对OpenAI的o4-mini的调用。随后，我们通过让野生型Robin及其去功能版本各自生成50个针对dAMD的药物候选方案，并对这些方案中的部分样本进行质量评估，来比较两者的性能。Para_02我们通过人工参考核查手动评估了它们的质量。结果如预期所示，剔除Falcon或同时剔除Crow和Falcon会导致虚构参考文献数量显著增加，而单独剔除Crow则不会出现这种情况（分别见扩展数据图4a和补充表6–8）。（Crow负责生成文献检索，以指导Falcon生成最终的候选药物报告，因此在Crow文献检索阶段产生的任何虚构参考文献都可能被Falcon在其最终报告中纠正。）为了确认Falcon确实在仅剔除Crow的实验中掩盖了由大语言模型生成的虚构参考文献，我们从野生型和剔除了Crow的Robin中分别生成了15份检测方案建议（由Crow而非Falcon生成最终的检测报告；见补充图1）。随后我们进行了人工参考核查，结果如预期，Crow未产生任何虚构参考文献，而o4-mini生成的参考文献中有44.5 ± 6.37%（均值±标准误，n = 15份检测方案建议）为虚构内容（见扩展数据图4b和补充表9）。Para_03为了探究Crow和Falcon文献检索是否比o4-mini生成的提案质量更高，我们通过LLM裁判（Claude Sonnet 3.7；参见补充图11中的裁判提示）进行了一对一的对比实验，比较了50个野生型和50个消融型提案。消除Crow、Falcon或同时消除Crow和Falcon始终导致最终药物提案的质量下降（扩展数据图4c）。Para_04接下来，我们评估了Finch在第二轮dAMD药物筛选中进行的流式细胞术和RNA测序任务中的表现。Finch被赋予了针对第二轮任务的具体提示和数据，并通过评估其遵循专家制定的评分标准的程度来衡量其表现（补充图18和19）。Finch在RNA测序任务中表现出稳定的结果（86 ± 0%（均值 ± 标准误）；n = 3次运行），在流式细胞术任务中表现同样优异（100 ± 0%（均值 ± 标准误）；n = 3次运行；扩展数据图5a）。Para_05为了探究Finch在一系列更复杂的数据分析任务中的失败模式，且不采用Robin工作流中针对特定任务的多步提示方法，我们从BixBench中整理了一个由专家生成的包含170个问答对的测试集，涵盖与药物发现相关的生物信息学和统计学任务（扩展数据图5b和补充表10）。Finch的整体表现达到22.8 ± 1.7%，相比之下，在没有代理框架的情况下单独使用Sonnet 3.7的表现仅为1.6 ± 1.2%（均值 ± 标准误，n = 3；扩展数据图5c,d）。Finch在统计学子集上的表现优于生物信息学子集，分别为47.9 ± 1.5%和15.3 ± 2.0%。通常情况下，生物信息学子集需要执行对参数设置敏感的多步骤分析流程，而生物统计学问题则只需对干净的表格数据进行单步计算。这些结果表明，Finch等代理框架通过为大语言模型配备与数据源交互所必需的工具，展现出明确的应用价值，同时也指出了在处理多步问题时仍有巨大的性能提升空间。Para_06为了确认Robin在吞噬作用实验中鉴定出的ROCK抑制剂无法通过基于通用大语言模型的代理轻易重现，我们将相同的候选生成提示（补充图8）提交给了OpenAI开发的Deep Research代理，该代理旨在对复杂任务进行多步研究。与Robin一样，我们要求Deep Research生成19种新的药物候选物（等于Robin在第一轮和第二轮中生成的药物候选物总数），随后我们在RPE-SCs中对这些候选物进行了筛选。Deep Research生成了17种独特的候选物（其中有2种药物候选物重复）。Deep Research所提出的药物中无一在该实验中表现出活性，值得注意的是，Deep Research并未提出通过ROCK抑制来增强RPE吞噬作用的策略（扩展数据图6）。DiscussionPara_01在本报告中，我们提出了Robin，这是一个集成了自动化假设生成和实验数据分析的多智能体系统，用于科学发现。当被赋予识别dAMD新型治疗药物的任务时，Robin提出增强吞噬作用作为治疗dAMD的策略，并通过迭代的实验室闭环发现循环，在测试化合物中鉴定出ripasudil和KL001可增强RPE细胞的吞噬作用。ripasudil已确立的安全性特征及其在眼科应用中的临床批准为其药物再利用提供了良好前景，而据我们所知，KL001代表了一种在RPE细胞中增强吞噬作用的新方法。Para_02值得注意的是，尽管ROCK抑制剂此前已被建议用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）及其他血管新生性视网膜疾病，但Robin是最早提出通过增强吞噬作用机制将其应用于干性AMD治疗的人之一。这一假说已获得多方面证据的支持。视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬功能障碍不仅在正常衰老过程中被观察到，而且在AMD患者中表现更为显著。此外，ROCK抑制能够增强RPE细胞吞噬能力的作用已有研究证实。当然，该假说需要在合适的疾病模型中进行验证，并最终通过随机、安慰剂对照的临床试验来确认其临床有效性。Para_03这些结果共同表明，Robin 能够通过整合科学文献中已有的见解，有效生成新的、可检验的假设。通过聚焦于“组合合成”（即识别不同领域之间非显而易见的联系），Robin 能够有效地针对那些由于科学知识的割裂化而被人类专家忽视的“低垂果实”。这种可靠且基于文献的综合范式不仅适用于药物再利用，还可轻松扩展到材料科学等领域。Para_04除了dAMD的具体应用外，Robin还解决了一个更广泛的治疗开发挑战。在过去十年中，美国食品药品监督管理局每年批准的新药数量一直停滞在大约50种左右，因此迫切需要新的方法来扩大药物发现的规模。作为首个能够自动进行文献支持的假设生成和实验生物学数据分析的系统之一，与传统方法相比，Robin有望加快药物发现的速度。Para_05鉴于自动化发现系统有可能识别出强效的生物制剂，我们已在Robin框架内实施了防护措施。首先，该系统优先选择具有已知安全性的候选物质，并搜索其已知的毒性或脱靶相互作用。其次，作为实验室介入循环的系统，Robin的输出被视为治疗假设，必须经过标准的临床前验证，以确保在进入临床应用前，通过传统的体外和体内安全筛选发现任何潜在的毒性。关于双重用途的担忧，Robin使用的是经过广泛安全对齐的现成大语言模型（通过红队测试和基于人类反馈的强化学习），以防止生成恶意的生物实验方案。此外，所有对我们平台的查询都会通过一个大语言模型分类器进行检测，以筛查涉及不安全主题的内容。Para_06在当前的实现中，Robin 仍有多个可以持续发展的方向。例如，尽管 Robin 能够生成实验大纲，但它尚不能产生精确且可执行的实验方案；未来的版本旨在提供详细的实验方法，使其几乎无需人工转换即可用于实验室操作。Finch 数据分析代理也依赖领域专家进行提示工程，以获得可靠的分析结果。若能使 Finch 能够自主生成或调整适用于特定数据模态的提示，则可实现更自主的科学发现流程。最后，尽管本文中的结果依赖于2025年初可用的前沿大语言模型，但 Robin 的模型无关架构确保其能力将随着底层基础模型的进步而同步提升。尽管通用编码代理的基础能力正在快速进步，可能在标准计算任务上达到与 Finch 等专用框架相当的水平，但面向特定领域的架构对于严格实施实验约束以及可靠地协调专业生物信息学工具链仍然至关重要。Para_07通过在一个集成系统中自动进行假设生成、实验规划和数据分析，Robin代表了一种由人工智能驱动科学发现的强大新范式。这种方法不仅可以重塑治疗手段的开发，还能从根本上加速科学进程，推动对自然世界更深入的理解。MethodsRobin implementation Robin 的实现Para_01Robin 是通过 Aviary 框架实现的一个 Jupyter notebook，用于实例化和调用智能体。Robin 利用 OpenAI 的 o4-mini 模型综合文献并生成假设，并使用 Anthropic 公司的 Claude 3.7 Sonnet 模型作为评判者，通过成对比较对假设进行排序。在 Robin 中用于智能体及调用的大语言模型的提示词如补充图 2–11 所示。Para_02值得注意的是，尽管本文中的实验是通过Robin的智能体实现方式进行的，但我们观察到Robin几乎总是以相同的顺序调用工具，从而形成了一种确定性的工作流程。因此，我们将Robin转换为一个简化的Jupyter笔记本，以提高稳定性和易用性。Para_03假设的排序通过一系列由大型语言模型（LLM）裁判裁决的成对比较计算得出。在对25个或更少的假设进行排序时，采用循环赛方式比较所有可能的配对。当考虑超过25个假设时，则随机选取300组成对比较，以便在合理的计算和时间限制内实现全面评估。这些比较的结果被用于通过布拉德利–特里–卢斯（BTL）模型估计各假设的强度参数，进而确定每个假设的相对排名。尽管目前对于基于LLM裁判的排序尚无公认的最优策略，但我们选择成对比较而非逐项评分。一些研究表明，成对比较比逐项评分更具鲁棒性，因为逐项评分可能无法区分相似项目之间的细微差异。成对比较中的位置偏差通过采用高度分布式的比赛结构结合BTL模型来缓解，而不是依赖简单的胜负统计，后者极易受到位置偏差的影响。为了生成该LLM裁判的提示语，我们邀请领域专家在Robin系统中对治疗候选假设进行成对比较。这些专家评估的结果被提供给Google的Gemini 2.5 Pro预览版模型，以生成Robin系统中LLM裁判所使用的提示语。这一方法旨在使LLM裁判的决策与专家的偏好和评判标准保持一致。Para_04在比较LLM评判者与专家的偏好时，LLM评判者与专家的偏好表现出高度的一致性，其前十项假设中平均有7.25项与专家前十项假设相匹配（补充图20a）。这种一致性是随机选择预期结果的两倍以上。此外，LLM评判者表现出比人类专家更高的内部一致性（补充图20b）。在面对相同的成对比较时，LLM评判者在88%的比较中选择了相同的假设，而人类专家的选择一致率为61%。Finch implementation Finch 实现Para_01Finch 是一个自主的、原生支持 Jupyter 的数据分析代理，使用 Aviary 框架设计而成。Finch 根据提供的数据集和研究问题，系统地处理生物信息学工作流程，例如 RNA-seq 差异表达分析或流式细胞术。Para_02该智能体并非从代码库中检索静态模板，而是作为生成式推理引擎，实时逐行编写原创的、可执行的 Python 或 R 代码，确保分析逻辑能够动态适应数据分布，而不受硬编码子程序的限制。该智能体在 Aviary 框架提供的结构化执行环境中运行，Aviary 是一个专为语言智能体评估和迭代问题解决而设计的可扩展环境。选择 Aviary 框架主要基于其受控环境，该环境通过标准化的软件环境、一致的工具访问权限以及结构化的多步推理支持可重复的评估。Para_03Finch采用了一种基于ReAct方法的代理提示策略，有效平衡了逻辑推理与实际执行。每个Finch的执行轨迹都在一个预构建的Docker容器（BixBench-env:v1.0）中展开，该容器包含了大量面向生物信息学的Python、R和Bash库。这一标准化容器确保了结果的可重复性，并将评估严格限定在Finch的分析能力上，而非软件安装或依赖管理。尽管如此，Finch在需要时能够安装新的依赖项，并且能够熟练地完成这一过程。Tools and environment 工具和环境Para_01Finch 仅通过 Aviary 框架提供的两种工具进行交互edit_cell：代理可以选择、修改并执行 Jupyter 笔记本中的单元格。submit_answer：代理最终确定并提交分析结论。Para_02为了优化Finch的初始指令，我们对其提示工程进行了深入探索，并在补充图10中提供了示例。所有Finch的轨迹均可通过FutureHouse平台获取。Finch evaluation  Finch评估Para_01我们评估了 Finch 及其基础模型（Claude 3.7 Sonnet）在不具备代理能力的情况下，对来自 BixBench 生物信息学基准测试中与药物发现相关的 170 个问题的表现。在排除了低质量类别以及与人类药物发现无关的类别后，保留了涵盖 38 个数据胶囊的 170 个问题，并将其分为两类：生物信息学（共 131 道问题），包括 RNA-seq、基因组学、表观基因组学、功能富集和序列分析任务；以及生物统计学（共 39 道问题），包括图像分析任务和一般统计分析任务。为避免多标签分配中的重复计数，每个问题被归入其在 BixBench 类别映射中列出的第一个类别。Finch 和基础大语言模型均进行了三次重复运行。每种类别在每次重复中的平均准确率被计算出来，误差线表示三次重复间的平均值标准误。在失败模式分析中，每一个 Finch 的错误回答被分类为：错误答案（代理生成了特定的错误值）、干扰项匹配（回答与提供的干扰项一致）、格式错误（正确数值但格式不正确）、不确定（代理拒绝作答）或无响应/失败（未产生任何回应），并在这三次重复中进行汇总。Para_02每个 BixBench 问题包含一个自然语言提示，该提示引用封装在胶囊包（ZIP 压缩文件）中的数据文件，同时提供一个预期答案、三个干扰选项以及指定的评估方法。Finch 模型会同时接收问题和对胶囊包中数据的访问权限，并可以在最多十个步骤内编写并执行代码（Python 或 R）来生成答案。基础大语言模型仅接收问题文本，无法访问数据或执行代码。回答的评估采用每道题指定的三种方法之一：精确匹配（字符串或数值相等）、范围匹配（数值落在指定区间内）或大模型裁判（由另一个模型判断自由文本回答的语义等价性）。只有通过指定评估方式的回答才被视为正确；所有其他情况，包括分析过程合理但结果错误、格式不匹配以及拒绝作答，均记为错误。Robin validation Robin 验证Crow and Falcon ablation experiments 乌鸦和猎鹰消融实验Para_01对 FutureHouse 平台代理 Crow 和 Falcon 的调用已被替换为通过 OpenAI API 调用 o4-mini，系统提示和用户提示保持不变。在人工参考检查中，一位对来源不知情的科学家被提供了十条从野生型和消融版 Robin 中随机选出的提案。每当科学家在提案中遇到引用或参考文献时，会尝试在线查找原始文章。如果无法根据引用或参考文献（包括提案中提供的上下文）明确识别出原始文章，则该参考文献被标记为虚构；否则，标记为合法。Para_02对于LLM裁判比较，将50个野生型和50个消融型提案提交给由Claude Sonnet 3.7裁决的两两对决锦标赛，并利用这些比较结果通过BTL模型（在Robin内部排名系统中实现）生成提案排名。采用置换检验评估各组之间平均排名差异的统计显著性。观测到的检验统计量为消融组与野生型组之间的平均排名之差（消融组的平均排名减去野生型的平均排名）。在假设两组间无差异的零假设下，通过随机置换组标签10,000次并对每次置换重新计算检验统计量，从而生成零分布。P值计算为置换所得差异中大于或等于观测差异的比例（单尾检验）。所有分析均使用Python（v3.12.10）结合NumPy和pandas完成。Comparison with OpenAI’s Deep Research 与OpenAI的深度研究进行比较Para_01为了与Deep Research进行比较，通过ChatGPT用户界面向Deep Research提供了系统提示和用户提示，如补充图8所示。在这些查询提交给Deep Research时（2025年6月），Deep Research通常会在用户提示之后跟进2到3个问题，目的是澄清和明确搜索查询的内容。针对每个查询，我们都尽可能有帮助地回答了这些问题。当我们完成18个完整查询后，便订购了相应的药物并配制了药物储备液，具体细节见补充表1。吞噬作用实验是在RPE-SCs上进行的，该实验与我们验证Robin发现的实验为同一实验。Cost analysis 成本分析Para_01我们通过litellm（https://docs.litellm.ai/docs/providers/github）跟踪了大语言模型调用的成本，并计算了Crow和Falcon的平均成本（分别为0.0963美元和0.2142美元；n = 52次运行）。一次典型的Robin运行成本CRobin是通过假设包含45次Crow运行和30次Falcon运行来估算的。Para_02Finch 被排除在此估计之外，因为它每个迭代仅运行一次，其成本贡献可忽略不计。Cell culture 细胞培养Para_01ARPE-19细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，编号CRL-2302），经三次传代扩增后分装冷冻保存。本研究中所有ARPE-19实验均使用这些分装细胞。在培养过程中，ARPE-19细胞在DMEM/F12培养基（15-090-CV，Corning）中培养，添加10%胎牛血清（FBS；10082-147，Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（25030-081，Gibco）、1 mM丙酮酸钠（11360-070，Gibco）和1%青霉素-链霉素（15140-122，Gibco），于37°C、5% CO2条件下培养。进行吞噬功能检测时，将细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔组织培养板（10861-666，VWR）中，每孔加入100 µL完全培养基。细胞培养至融合后，继续孵育7天，期间不更换培养基。此时细胞已形成单层，并表现出分化特征（如黑色素颗粒表达和鹅卵石样形态）。Para_02原代RPE-SCs来自一位年龄超过60岁、无已知眼部疾病的单一供体，由 Sight Restoration 眼库提供。RPE-SCs 解冻后按照先前描述的方案进行接种和培养。简而言之，患者来源的 RPE-SCs 在收到后立即解冻，并接种于涂有 Synthemax II 的24孔组织培养板（3470，Corning）中，在含有10%热灭活FBS的细胞培养基中培养5小时。7天后，将培养基更换为含2%热灭活FBS的培养基。作为对 Fernandes 等人方案的一项改进，培养基在每周一、三、五更换三次，每次移除三分之二的旧培养基并补充等量的新鲜培养基。细胞在接种4周后被传代至96孔板或transwell小室（3470，Corning），再继续成熟培养4周，随后进行ELISA检测。Para_03RPE-SC培养基的基础培养基为DMEM/F12（D8062，Sigma-Aldrich）和αMEM（M4526，Sigma-Aldrich）按1:1比例混合而成。培养基中添加了1X青霉素-链霉素（15140-163，Life Technologies）、1X Glutamax（35050-079，Life Technologies）、1X非必需氨基酸（11140-076，Life Technologies）和1X丙酮酸钠（11360-070，Life Technologies）。额外添加的成分包括2%或10%（v/v）热灭活胎牛血清（F4135，Sigma-Aldrich）、10 mM烟酰胺（N5535，Sigma-Aldrich）、N1培养基添加剂（使用浓度为厂家推荐浓度的50%，N6530，Sigma-Aldrich）、0.25 mg ml−1牛磺酸（T0625，Sigma-Aldrich）、0.02 µg ml−1氢化可的松（H4001，Sigma-Aldrich）以及0.013 ng ml−1 3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T5516，Sigma-Aldrich）。所有细胞系均检测为支原体污染阴性。Phagocytosis drug screen 吞噬作用药物筛选Drug library preparation 药物库制备Para_01在文献中找到了Robin提出的药物在细胞培养中的最佳浓度，如果提出了多个浓度，则选择最高的浓度用于吞噬实验。在进行吞噬实验的当天，使用药物储备液在完全培养基中配制工作液，浓度为2倍工作浓度。pHrodo bead preparation pHrodo 微球制备Para_01为了特异性检测被吞噬的颗粒，我们使用了pHrodo珠子（A10010，Thermo Fisher），这种珠子只有在溶酶体的低pH环境下才会产生荧光。深红色大肠杆菌pHrodo珠子按照制造商的说明解冻，并重悬于2 ml PBS中。将重悬后的珠子在室温下于水浴中超声处理10分钟，然后加入细胞培养板中。Bovine ROS preparation 牛活性氧制备Para_01在RPE-SC验证实验中，使用牛视杆外节段（ROSs）替代了pHrodo珠子。牛视杆外节段来自Invision BioResources（98740），以冷冻沉淀物的形式接收。将该沉淀物用冰冷的无菌PBS重悬，浓度为每100 µl含1 × 10^7个ROSs，并分装后储存在−80 °C。实验当天，将ROS分装样品在冰上解冻，并与pHrodo red dye SE（P36600，Thermo Fisher）进行偶联。根据制造商说明，将pHrodo red染料用DMSO溶解至10 mM浓度。ROSs在4 °C、6,500g条件下离心7分钟，然后重悬于无菌冷偶联缓冲液（0.2 mM碳酸氢钠缓冲液，pH 9.2）中，使浓度达到每100 µl含1 × 10^6个ROSs（即原分装液十倍稀释）。对于每100 µl稀释后的ROSs（1 × 10^6个ROSs），加入1 µl的10 mM pHrodo SE，并通过移液混合均匀。随后将ROSs置于黑暗环境中，在21 °C、500 rpm的振荡培养箱中孵育。孵育结束后，通过离心并用冰冷无菌PBS重悬的方式洗涤pHrodo red标记的ROSs，以去除多余的染料。在将偶联后的ROSs加入细胞前，将其用细胞培养基重悬至每100 µl含1 × 10^7个ROSs的浓度，并向96孔板的每个孔中加入4 µl（相当于每个细胞10个ROSs）。通过移液使ROSs在孔内分布均匀，并进行肉眼检查以确保覆盖均匀。Phagocytosis assay 吞噬作用测定Para_01在进行吞噬作用实验时，在加入微珠之前，细胞在37°C、5% CO2条件下，用测试化合物或对照溶剂（0.5% DMSO）处理60分钟，通过向细胞中加入100 µl含2倍浓度药物的完全培养基实现。在孵育60分钟时，向每孔加入10 µl浓度为1 µg/µl的pHrodo微珠。加入微珠后，将培养板在37°C继续孵育3小时。然后使用TrypLE Express（12604-013, Gibco）将细胞重悬10分钟，并用FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白（BSA）以及500 ng/ml 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或5 µM Hoechst 33342，溶于无钙镁PBS缓冲液中）稀释，以获得适合流式细胞术分析的细胞悬液。Para_02在RPE-SC验证实验中，我们用pHrodo Red SE（Thermo Fisher）标记的牛视网膜外节段（Invision BioResources）替代了pHrodo微球，并用Hoechst 33342（BP-42012，BroadPharm）替代了DAPI。此外，在将视网膜外节段加入细胞前，将其重新悬浮于细胞培养基中。由于有额外的供体细胞可用，我们进行了四次技术重复的RPE-SC筛选（比ARPE-19筛选多一次）。除此之外，RPE-SC药物筛选的操作方式与ARPE-19筛选相同。Flow cytometry 流式细胞术Para_01悬浮在96孔细胞培养板FACS缓冲液中的ARPE-19或RPE-SCs立即被转移至配备自动进样器的Attune NxT流式细胞仪（A24858，Thermo Fisher）。在ARPE19实验中，使用637 nm和405 nm激光分别激发pHrodo珠子和DAPI的荧光，并使用670/14和450/40滤光片分别检测。在RPE-SC实验中，使用532 nm和405 nm激光分别激发pHrodo红色染料和Hoechst 33342，并使用585/16和450/40滤光片分别检测。根据预实验孔界定细胞群体，然后使用细胞门控将每个孔的细胞群体事件数限定为5000个。这是必要的，因为检测到的大多数事件属于牛视杆外节。RNA-seq RNA测序Para_01ARPE-19细胞以每组三个重复的方式接种于24孔组织培养板中，按照生产商的指导说明，使用Maxwell RSC 48（AS8500，Promega）和Maxwell RSC SimplyTissue试剂盒（AS1340，Promega）进行细胞裂解并提取RNA。使用Qubit仪器（Q33327，Thermo Fisher）和Qubit高灵敏度RNA试剂盒（Q10210，Thermo Fisher）对总RNA进行定量。以1 µg总RNA作为起始材料，利用NEBNext Poly(A) mRNA磁性分离模块（E7490，New England Biolabs）分离带有polyA尾的mRNA，随后使用NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina，E7760，New England Biolabs）制备测序样品。使用Agilent Bioanalyzer进行质量控制。文库加入1% PhiX后，采用P3流动槽在Illumina NextSeq 2000平台上进行测序，读长为75个碱基的双端测序。Immunocytochemistry 免疫细胞化学Para_01细胞在室温下用4%多聚甲醛固定25分钟，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。通过将细胞与封闭缓冲液（1% BSA和22.52 mg ml−1甘氨酸溶于PBST（PBS + 0.1% Tween 20））孵育30分钟，以阻断非特异性抗体结合。然后将细胞在4°C下与用1% BSA配制的PBST稀释的一抗溶液孵育过夜。接着，细胞在室温避光条件下用含1% BSA的二抗溶液孵育1小时，最后用DAPI染色，并进行最终的洗涤步骤。补充表2列出了本研究中使用的所有抗体。ELISA 酶联免疫吸附测定Para_01将RPE-SCs以每插入物15,000个细胞的密度接种在6.5毫米的Transwell插入物上，该插入物带有0.4微米孔径的聚酯膜（3470，Corning），并继续培养4周。使用Invitrogen Novex VEGF Human ELISA试剂盒（KHG0111，Thermo Fisher）进行VEGF ELISA检测。在更换培养基48小时后，分别采集顶腔和底腔的细胞培养基，并用样本稀释缓冲液按1:10比例稀释，然后按照制造商的说明进行ELISA检测。LDH assay LDH检测Para_01RPE-SC剂量反应实验的上清液在实验结束后立即于−80°C保存。乳酸脱氢酶（LDH）检测按照制造商的说明，使用Promega公司的LDH-Glo细胞毒性检测试剂盒（J2381）进行。为了测量最大LDH活性，通过Triton X-100（X100，Sigma-Aldrich）裂解细胞建立阳性对照，以用于计算相对细胞毒性。Data analysis 数据分析Flow cytometry 流式细胞术Para_01Finch 是一个数据分析代理，对我们的流式细胞术数据进行了端到端分析。根据前向散射和侧向散射参数，排除了碎片和细胞聚集体。通常情况下，Finch 使用 R 语言的 flowMeans 包对前向散射与侧向散射图进行 k 均值聚类，然后选择最可能包含主要细胞群的聚类。对于后续的设门，Finch 生成散点图，并利用这些图来定义门控区域。单个细胞根据脉冲宽度和面积参数进行设门。通过量化每孔 pHrodo 信号的平均荧光强度，评估吞噬作用的程度。Para_02流式细胞术数据还由一位人类科学家进行了分析（补充图13、15和16）。人类对流式细胞术数据的分析过程与Finch的方法类似，不同之处在于人类分析额外增加了使用无珠对照来去除Alexa 647通道背景信号的步骤，而该背景信号被证明极小。人类分析首先通过前向散射与侧向散射图确定主要的细胞群体。接着识别出单细胞群体。然后利用DAPI通道去除死细胞。最后使用无珠对照去除Alexa 647通道的背景信号。RNA-seq RNA测序Para_01由人工完成读段的解复用和比对，随后的差异基因表达分析由Finch完成（代码可在Robin的GitHub仓库获取；参见代码可用性说明）。Read alignment and processing 读段比对与处理Para_01对12个样本（包括Y27632处理组、溶剂对照组和珠子处理组）的原始双端RNA-seq测序数据（2 × 150 bp）使用自定义的Bash流程进行处理。从FASTQ目录中获取测序文件（_R1_001.fastq.gz和_R2_001.fastq.gz），并使用HISAT2将每个文件单独比对到GRCh38人类参考基因组（基于GENCODE v44构建的HISAT2索引），采用–dta参数以保留剪接位点信息，用于下游转录组组装。比对过程使用八个CPU线程（-p 8）执行，并以SAM格式输出结果。每个SAM文件通过samtools view -bS转换为BAM格式，随后进行排序（samtools sort）和索引（samtools index），生成压缩的、按坐标排序的BAM文件。为节省磁盘空间，删除了中间产生的SAM文件及未排序的BAM文件。该流程确保所有比对结果均经过统一处理，可用于后续定量分析。Gene-level quantification 基因水平的定量Para_01使用Subread软件包中的featureCounts工具，并结合GENCODE v44 GTF注释文件获取基因计数。指定双端模式（-p）以正确处理片段计数，并使用八个线程（-T 8）加速处理过程。所有已建立索引并排序的BAM文件被同时提供，并根据提供的外显子特征将读段分配给基因。生成的原始基因水平计数矩阵被写入gene_counts.txt文件，作为后续标准化和差异表达分析的输入数据。该工作流程为从原始测序数据到基因水平定量的高通量RNA-seq数据分析提供了可重复的框架。Differential gene expression analysis 差异基因表达分析Para_01将原始基因计数数据导入R（v4.2.0）并进行过滤，以去除非计数列，得到包含六个样本、对应两种条件（Y-27632和未处理）的矩阵。将计数矩阵和元数据封装到DESeqDataSet对象中（DESeq2 v1.36.0）。通过标准化、离散估计和Wald检验来检测差异表达。使用biomaRt将转录本标识符映射到基因符号，并定义一个成对比较（Y-27632与未处理）。结果按校正后的P值排序，导出为CSV文件，并使用EnhancedVolcano（v1.14.0）生成火山图，设定阈值为|log2倍数变化| > 1且校正后P < 0.05。RPE-SC RNA-seq validation RPE-SC RNA-seq 验证Para_01本实验旨在验证ARPE-19细胞RNA测序实验中发现的ABCA1结果，使用Maxwell RSC simplyRNA Cells试剂盒（AS1390，Promega）提取总RNA，并送至Plasmidsaurus（plasmidsaurus.com）进行文库构建和测序，采用其超快速RNA测序服务。文库构建采用高通量的3′端计数策略，靶向多聚腺苷酸化转录本。简而言之，从总RNA样本中捕获polyA+ mRNA，并使用含有样本特异性条形码、唯一分子标识符和Illumina Read 1序列的oligo-dT引物将其逆转录为cDNA。在完成第二链合成后，cDNA经过标签片段化处理，同时实现分子片段化并引入Read 2序列。通过扩增反应连接P5/P7接头以及独特的双端索引（i5和i7），完成文库构建。测序在Illumina平台上进行，每个样本的去重后测序深度约为1000万条（原始数据约2000万条）。原始测序读段通过聚类唯一分子标识符序列以去除PCR重复，基因计数由去重后比对成功的读段生成。Reporting summary 报告摘要Data availabilityPara_01本研究生成的原始RNA-seq数据已存入NCBI序列读取档案库，BioProject登录编号为PRJNA1464762。Code availabilityPara_01Robin 的示例轨迹和代码（https://github.com/Future-House/robin）以及 Finch 的代码（https://github.com/Future-House/finch）均可在 GitHub 上获取。