Idebenone

2月8日，美国食品药品 监督管理局（FDA）将迎来一个密集的审批窗口期—— 三款新药，同一天等待放行：一款基因疗法、一款线粒体疾病药物、一款罕见病生长激素。 它们针对的疾病各不相同：Hunter综合征、Leber遗传性视神经病变、软骨发育不全。但它们共享同一个底层逻辑： 以RNA为靶点或工具，改写疾病的“源代码”。 就在这同一天，大洋彼岸的中国，国家自然科学基金委员会刚刚发布了一项重大研究计划—— “赋能药物创新的RNA基础研究” ，拟资助40-45个项目，总资助强度数千万元。 官方通告里有一句话，值得全文抄录： “RNA药物具有靶向性强、成药靶点多、治疗效益高和开发周期短等优势，是引领下一代药物研发的主角。” 这不是展望，是正在发生的产业现实。 一、2月8日，三款药物等待FDA审批 我们先看这三款即将决定命运的药物。 1. 针对Hunter综合征的一次性基因疗法 药物名称 ：clemidsogene lanparvovec（代号RGX-121） 研发公司 ：日本新药（Nippon Shinyaku）与Regenxbio 适应症 ：黏多糖贮积症II型（Hunter综合征） Hunter综合征是一种罕见的X连锁隐性遗传病，几乎只影响男孩。患者体内缺乏一种叫做“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”的酶，导致糖胺聚糖在体内堆积，损害多个器官系统——气道、心脏、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、骨骼和关节，无一幸免。 传统的酶替代疗法需要每周输注，且难以跨越血脑屏障，对神经系统病变束手无策。 RGX-121的思路完全不同： 一次性给药，永久修复。 这是一款基因疗法，通过一次脑池内注射，将编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的基因递送到中枢神经系统。CAMPSIITE临床试验的中期数据显示： 10名患者中有8名达到了替代终点——脑脊液中的D2S6水平显著下降 。 如果获批，这将是全球首个治疗Hunter综合征的基因疗法。FDA已授予其快速通道、孤儿药、罕见儿科疾病、再生医学先进疗法四项认定，并给予优先审评资格。 2. 一款“曲折”的线粒体药物 药物名称 ：艾地苯醌（Idebenone） 适应症 ：Leber遗传性视神经病变（LHON） 这是一款命运多舛的药物。 艾地苯醌是一种短链苯醌，作用是保护、修复和激活视网膜神经节细胞功能。LHON是一种线粒体遗传病，会导致患者快速、严重的视力丧失，通常在青壮年时期发病。 它的临床试验之路并不平坦： 早期的RHODOS双盲安慰剂对照试验， 未达到主要终点 （24周最佳视力恢复）。但在关键的次要终点（最佳视力变化）上，观察到了统计学显著改善。 随后的LEROS开放标签试验给出了更有力的证据：在症状出现一年内开始使用艾地苯醌的LHON患者中， 42.3%的眼睛获得了临床意义上的视力改善 ，而自然病程对照组仅有20.7%（比值比2.29，p=0.002）。这一获益持续到24个月。 这是一个典型的“柳暗花明”案例——主要终点未达成，但次要终点和后续试验提供了足够有力的证据。如今，它带着孤儿药认定和优先审评资格，等待FDA的最后裁决。 3. 一周一次vs一天一次：罕见病生长激素的竞争 药物名称 ：navepegritide（TransCon CNP） 研发公司 ：Ascendis Pharma 适应症 ：软骨发育不全 软骨发育不全是最常见的遗传性侏儒症，由FGFR3基因突变导致软骨内骨化障碍。 目前市面上已有一种药物——伏索利肽（Voxzogo），每日一次皮下注射，通过激活C型利钠肽受体促进骨骼生长。 navepegritide是它的竞品，但有一个巨大优势： 一周一次 。 这是一款C型利钠肽的前药，采用TransCon技术实现长效化。ApproaCH临床试验显示：52周时，navepegritide组的年化生长速度显著优于安慰剂组（ 5.89厘米/年 vs 4.41厘米/年 ，p<0.0001）。 如果获批，这将是美国市场第二款用于软骨发育不全的C型利钠肽类药物，为患儿家庭提供一周一次的便捷选择。 二、2月8日的中国：国家自然科学基金委的“RNA宣言” 就在这三款药物等待FDA审批的同一天（2月8日），中国首都医科大学官网转载了一份重要文件——国家自然科学基金委员会1月26日发布的 “赋能药物创新的RNA基础研究”重大研究计划2026年度项目指南 。 这份指南的措辞，透露出国家层面对RNA药物赛道的战略判断。 第一句话就定调： “核糖核酸（RNA）是生命起源的最初分子形式，多维度参与并调控重要生命过程。” 这是从生命科学的最底层讲起——RNA不仅是信使，不仅是“中间人”，它本身就是生命的起点。 第二句话指出现状： “RNA研究在广度和深度上不断革新对生命活动基本规律的认知，已成为生命健康领域发展最为迅速的研究前沿。” 这不是夸张。过去十年，mRNA疫苗在新冠疫情中一战封神，siRNA药物从罕见病走向慢病，CRISPR基因编辑正在进入临床——这些技术的核心，都是RNA。 第三句话最具分量： “RNA科学突破具有巨大的应用前景，特别是RNA药物新兴产业正成为新质生产力的重要组成部分。RNA药物具有靶向性强、成药靶点多、治疗效益高和开发周期短等优势，是引领下一代药物研发的主角。” “ 引领下一代药物研发的主角 ”——这是官方文件对一个新兴赛道的最高评价。 第四句话点出问题： “由于对RNA复杂动态特性及其调控规律研究不足，RNA药物创制的底层使能技术缺乏，制约了RNA药物创新。” 这是当前全球RNA药物研发的核心瓶颈：我们知道了RNA能干什么，但对RNA“怎么动”“怎么变”“怎么在细胞里找到正确位置”知之甚少。递送系统、修饰策略、稳定性优化——这些“使能技术”才是卡脖子的地方。 第五句话给出目标： “本重大研究计划针对RNA药物研发的瓶颈问题，立足RNA基础研究和技术创新，赋能RNA药物创制。本计划的前瞻性部署实施将为我国RNA生物医药发展提供新机遇，确立我国在RNA研究领域的国际引领地位。” “ 确立我国在RNA研究领域的国际引领地位 ”——这不是谦虚的“追赶”，而是直白的“引领”。 三、2026年拟资助：40-45个项目，聚焦三大科学问题 这份重大研究计划的资助力度相当可观： 培育项目 ：40-45项，每项约60万元，资助期限3年 重点支持项目 ：5-7项，每项约280万元，资助期限4年 申请提交时间为2026年3月1日至3月20日。 核心科学问题有三个： 问题一：RNA复杂动态特性的规律解析与功能阐释 RNA不是静态的线型分子。它会折叠成复杂的三维结构，会被化学修饰（如m6A），会在不同细胞状态下被编辑、被剪切、被降解。要把它做成药，先得把它“看透”。 指南明确要求： “从多学科视角揭示RNA的转录、加工、代谢、翻译等全生命周期的新规律及新机制。” 问题二：基于RNA的疾病精准诊疗与原创靶点发现 目前可成药的靶点大约700个，不到人类基因组的3%。RNA药物理论上可以靶向任何致病基因——但前提是，你得知道哪个基因在哪个疾病里是“元凶”。 指南要求： “阐明RNA调控异常的致病机理，发现重要标志物及原创靶点。” 问题三：突破RNA药物创新瓶颈的底层使能技术 这是最“硬核”的部分。递送系统怎么突破肝外靶向？RNA修饰怎么提升稳定性？免疫原性怎么控制？这些问题不解决，实验室里的“神药”就成不了患者手里的“好药”。 指南要求： “开发高效解析和精准调控RNA分子的共性技术，发展RNA药物设计、靶向递送、生物利用的创新方案。” 四、两条战线，同一个战场 把2月8日发生在大洋两岸的两件事放在一起看，脉络异常清晰： 美国那边 ，是产品端的冲刺——三款药物在同一天等待FDA放行，每一款都是“首个”或“同类最佳”。 中国这边 ，是基础端的布局——数十个研究项目即将获得资助，目标直指RNA药物创制的底层技术。 这不是偶然的巧合。这是全球生物科技竞赛的必然节奏： 产品在市场上厮杀，技术在实验室孕育。 小核酸赛道，中国已占全球管线的24%；CAR-T领域，中国与美国并驾齐驱；mRNA疫苗，中国在疫情后建立了完整的产业体系。而在RNA基础研究这个“最底层”的战场上，中国刚刚投入了数千万资金，瞄准一个目标： 从“跟踪者”变成“引领者”。 尾声：答案在3月20日之后 2月8日，三款药物仍在等待FDA的最终裁决。如果获批，它们将为罕见病患者带来新的希望。 2月8日，一份重大研究计划的指南正在中国各大高校和科研院所流传。3月1日到20日，数十份申请书将陆续提交。三年后、四年后，这些项目产出的专利、论文、技术平台，将构成中国RNA药物创新的“底层土壤”。 FDA的审批结果是确定的——获批或不获批，一周之内就有答案。 而中国那40-45个项目的走向，充满无限可能。 这或许就是生物科技最迷人的地方：当你盯着产品新闻时，别忘了技术还在实验室里进化。 （本文基于公开科学研究报道，不构成任何医疗建议。科普内容，非诊疗指南。） 参考文献 [1] Prime Therapeutics. FDA Decisions Expected: February 2026. 2026-01-14. [2] 国家自然科学基金委员会. 赋能药物创新的RNA基础研究重大研究计划2026年度项目指南. 2026-01-26.

点击上方蓝字 关注我们 这里是研之有理 专注医学核心期刊文献深度解析，为临床医师、医学生、科研工作者筛选前沿成果、拆解研究逻辑、提炼实用结论。每天5分钟，高效吸收期刊精华，助力学术积累与临床实践。 大家好，今天分享的文章是2025年由南方医科大学的罗飘、陈俊辉、安业海等人发布于Advanced Science的一篇研究论文。论文主要讲述了顺铂（CDDP）虽然是高效的化疗药物，但其引起的肾毒性严重限制了临床应用。研究团队利用单细胞测序和化学蛋白质组学技术发现，顺铂通过直接结合线粒体蛋白导致代谢功能障碍和炎症反应，从而引发肾损伤。研究证实，中药单体艾地苯醌（ICA）能够通过恢复线粒体代谢稳态、抑制NF-κB炎症通路来缓解肾毒性，同时还能协同增强顺铂的抗肿瘤效果，为优化顺铂化疗方案提供了新策略。 原文标题： Icaritin Alleviates Cisplatin-Induced Mitochondrial Metabolic Dysfunction-Associated Nephrotoxicity and Synergistically Enhances Its Anticancer Efficacy DOI号：  10.1002/advs.202405123  原文链接：  https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202405123 摘要 顺铂（CDDP）是一种疗效显著、临床应用广泛的化疗药物。然而，其治疗应用受到脱靶毒性——尤其是肾毒性的严重限制。尽管如此，CDDP诱导肾损伤的分子机制仍未完全阐明。为此，本研究采用整合的多组学方法，深入解析了CDDP肾毒性的病理生理过程，并发现CDDP可直接与线粒体蛋白结合，导致代谢功能障碍并损害线粒体呼吸。此外，CDDP还会引发线粒体活性氧的生成，进而激活核因子κB。(NF-𝜿B)信号通路及下游炎症效应因子。scRNA-seq分析揭示了肾脏对CDDP暴露反应中显著的细胞异质性。从机制上讲，已确定——CDDP结合蛋白主要定位于近端小管（PT）细胞。配体-受体分析表明，CDDP损伤的PT细胞会招募并激活肿瘤小鼠的肾内免疫细胞，从而加重肾脏损伤。值得注意的是，异黄酮（ICA）能够有效减轻CDDP诱导的活性氧（ROS）蓄积，抑制NF-𝜿B的活化及炎症反应，并恢复代谢稳态。与ICA联合治疗不仅可改善CDDP所致的肾毒性，还能增强了其抗癌疗效。综上所述，这些发现为顺铂肾毒性提供了全新的机制见解，并提出了一种双功能治疗策略，以优化基于顺铂的癌症疗法，同时……最大限度地减少肾脏损伤。 一、引言 顺铂是一种高效化疗药物，广泛用于多种恶性肿瘤的治疗。[1,2] 顺铂需在细胞内经生物活化后才能发挥作用，其活化过程涉及氯离子被水分子所取代。[3] 这一活化过程会产生高反应性物质，与DNA结合，从而在肿瘤组织中引发细胞毒性损伤。[4] 然而，顺铂在体内不必要的蓄积也可能对健康组织产生细胞毒性作用。事实上，顺铂的临床应用受到组织毒性的限制，尤其是肾毒性。[5] 顺铂主要通过凋亡和线粒体功能障碍等机制，导致近端小管细胞的损伤和死亡。[6,7] 除了DNA损伤外，研究还发现，一种由炎症反应和氧化应激参与的正反馈回路，是顺铂诱导肾毒性的关键机制之一。[8] 尽管顺铂以其能够与DNA结合并造成细胞损伤而为人所熟知，但目前尚不清楚顺铂是否直接与蛋白质相互作用从而引发肾毒性。因此，顺铂诱导肾毒性的潜在机制需要进一步探索，以指导治疗策略。 多组学整合策略的最新进展已在药理学和毒理学研究中得到广泛应用，使我们能够系统、全面且准确地阐明药物的作用机制。[9-11] 单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术近年来迅猛发展，为解析肾脏细胞类型及其在损伤与治疗干预过程中的动态状态提供了有力工具。 同时，化学生物组学被视为一种强大的工具，可直接发现生物活性分子的靶标，从而显著推动对作用机制的深入理解及新药研发。 基于这些方法学，单细胞靶标分析（STEP）应运而生，实现了scRNA-seq与化学生物组学数据集的整合。 之前，我们曾综合运用化学生物组学、scRNA-seq和STEP技术，揭示了马兜铃酸诱导的肝肾毒性中直接靶标及细胞异质性。此项方法有望以单细胞分辨率全面解析肿瘤小鼠肾脏中顺铂结合蛋白的全局图谱，从而为开发肾保护策略及协同治疗方案奠定理论基础。 尽管临床前研究已确定了一些潜在的候选药物，它们能够在维持顺铂抗肿瘤疗效的同时减轻其引起的肾毒性，但目前临床上预防顺铂肾毒性的主要手段仍以非特异性干预措施为主。值得注意的是，高达35%的患者会经历顺铂所致的肾毒性，往往需要降低剂量或暂停治疗，这显著影响了患者的治疗效果。这一现状凸显了临床上迫切需要开发既能减轻顺铂肾毒性又不损害其抗肿瘤疗效的策略。伊卡亭（ICA）是一种从淫羊藿属植物地上部分分离得到的活性黄酮类化合物，具有明确的抗氧化、抗炎、肝肾保护及抗癌作用。作为中国一类二类创新中药制剂，ICA胶囊已被确立为晚期肝细胞癌（HCC）的一种治疗选择。然而，ICA是否能在荷瘤小鼠模型中减轻顺铂所致的肾毒性并增强其抗肿瘤疗效，目前尚无任何研究进行探讨。 在此，我们整合了单细胞转录组测序（scRNA-seq）、化学蛋白质组学和STEP技术流程，以单细胞分辨率表征了在经顺铂治疗的荷瘤小鼠中与顺铂结合的蛋白质。我们的研究结果表明，顺铂可直接与线粒体蛋白结合，诱导线粒体活性氧（Mi-toROS）的产生。这一过程触发了NF-κB转录因子向细胞核的易位，进而激活了一条炎症级联反应，最终导致近端肾小管（PT）细胞损伤。尤为重要的是，我们证明了ICA能够减轻顺铂所致的肾毒性，同时增强其化疗疗效。这些发现不仅深化了我们对顺铂诱导肾毒性的机制理解，也为基于顺铂的联合治疗方案的临床转化奠定了理论基础。 二、结果 2.1. 顺铂诱导荷瘤小鼠出现肾毒性 为了系统评估顺铂处理后肾细胞群体的分子肾毒性特征，我们对携带肿瘤且接受或未接受顺铂治疗（CDDP）的小鼠的野生型（Sham）和顺铂处理组（CDDP）肾脏组织进行了单细胞RNA测序和化学蛋白质组学分析（图 1A,B）。首先，为验证通过给予顺铂所建立模型的可靠性，我们开展了预实验以优化治疗方案（图 S1A–C，支持信息）。结果显示，CDDP 10 mg/kg−1剂量组能够有效抑制肿瘤生长（图 1C；图 S1D,E，支持信息），并降低肿瘤细胞增殖速率（图 1D；图 S1F，支持信息）。然而，该药物的给药也导致小鼠体重轻微下降（<20%）（图 1E）。从肾脏的宏观外观及病理染色结果来看，与Sham组相比，CDDP组的肾脏表现出明显的病理损伤（图 1F；图 S1G，支持信息）。此外，我们的数据表明，CDDP显著提高了肾脏与体重的比值（图 1G），并使血液中多项生化指标升高，尤其是尿酸（UA）、肌酐（CREA）和尿素（UREA）（图 1H–J），提示CDDP具有明显的肾毒性作用。同时，CDDP还导致肝脏与体重的比值升高，并使血液中肝功能相关生化指标水平上升（图 S1H–J，支持信息），表明CDDP在一定程度上也造成了肝损伤。综上所述，尽管CDDP具有强大的抗癌疗效，但同时也伴随显著的副作用，其中肾毒性尤为突出。 2.2. 顺铂通过与线粒体蛋白结合引发肾毒性。 已证实，顺铂可直接与DNA结合，引发DNA损伤并发挥其抗癌作用。然而，令人矛盾的是，正是这种与DNA结合的机制导致了其对多器官的毒性。值得注意的是，顺铂是否直接与靶蛋白相互作用仍尚不明确。因此，我们旨在利用化学生物组学技术，鉴定顺铂与蛋白质靶标之间的结合情况。 2.3 单细胞转录组分析揭示了 顺铂暴露后显著的细胞异质性 尽管已证实CDDP可直接与线粒体相关蛋白结合，但其对肾脏微环境及细胞异质性的影响仍不清楚。我们采用了与我们先前研究中类似的单细胞RNA测序技术。 先前的研究旨在阐明顺铂（CDDP）对对照组（假手术组，Sham）和顺铂处理组（CDDP组）肾脏微环境及细胞异质性的影响（图3A）。我们获得了假手术组和顺铂处理组的单细胞数据集，并对其进行处理，以揭示顺铂处理后肾脏细胞的图谱。经过质量控制与筛选后，我们在18,092个顺铂处理细胞中鉴定出32,725个高质量细胞，在14,633个假手术组细胞中鉴定出相应数量的高质量细胞（图3D；图S3A-C，支持信息）。我们利用基因表达标记对不同细胞类型进行了注释——细胞类型：Lrp2+Slc27a2+ PTs、Slc12a3+Slc8a1+ DCT细胞以及Sat1+DCT_CNT细胞，Aqp1+Bst1+ DTL细胞，Slc12a1+Umod+ALOH，Atp6v1g3+Atp6v0d2+ CD-IC细胞，和Aqp2+Fxyd4+ CD-PC细胞，Ncam 1+PEC细胞，Nphs1+Wt1+足细胞，Myh11+周细胞，Col1a2+Dcn+成纤维细胞，Kdr+Flt1+内皮细胞，Lyz2+巨噬细胞，S100a8+中性粒细胞，Cd3d+Nkg7+ T/NK细胞以及Cd79a+Ighm+B细胞（图3B,C；图S3D,E，支持信息）。因此，大部分肾单位细胞和内皮细胞主要来源于CDDP处理过的样本中，免疫细胞主要来源于假手术样本（图3E）。总体而言，小鼠肾脏单细胞数据集揭示了假手术组与顺铂处理组细胞之间异质的转录组微环境。 2.4. 顺铂选择性地使近曲小管 细胞中的生物通路失活 上述研究证实，CDDP能特异性地与靶蛋白结合，并在单细胞水平上阐明了其对细胞异质性的影响（图 2,3）。幸运的是，我们之前的研究引入了STEP，以促进在单细胞分辨率下对靶点进行全面评估。在此，我们通过STEP整合了CDDP靶向蛋白和scRNA-seq数据集，从而实现了细胞靶点的特征分析，并揭示了CDDP影响的生物通路机制（图 4A）。首先，我们在化学蛋白质组学数据中筛选出差异蛋白（CDDP-P vs. Comp组），共鉴定出215种蛋白，其中106种可能为潜在靶点，其p值< 0.05且倍数变化> 1.2（CDDP-P vs. Comp）（图 4B）。随后，我们将化学蛋白质组学中鉴定的潜在靶点与scRNA-seq数据集整合，以评估细胞靶点的表达情况（图 4C,D）。此外，我们还以单细胞分辨率描绘了蛋白靶点的分布情况（图 4E）。这些发现表明，PT细胞相对于其他细胞类型具有最高的靶点富集度，这与先前报道一致，即PT细胞是肾脏中CDDP的主要作用靶点。对于PT细胞中CDDP的蛋白靶点，基因本体论（GO）富集分析显示，CDDP对多种生物学过程产生了差异性影响，主要涉及线粒体代谢紊乱与呼吸、氧化应激以及ATP合酶和电子传递活性（图 4F,G；图 S4A,B，支持信息），这与此前的研究结果高度吻合。重要的是，我们通过Seahorse实验进一步证实，CDDP能够抑制线粒体呼吸、ADP生成及电子传递活性。这些发现与我们的分析结果一致（图 4H–J；图 S4C,D，支持信息）。此外，流式细胞术验证了CDDP可诱导线粒体中ROS的积累（图 4K；图 S4E，支持信息）。另外，我们发现CDDP靶向特异性抑制剂显著降低了HK-2细胞中的ATP生成（图 S4F,G，支持信息），从而表现出与CDDP类似的线粒体能量代谢抑制效果。综上所述，这些发现表明，CDDP通过与线粒体相关蛋白相互作用，选择性地靶向并损伤PT细胞，最终导致线粒体代谢紊乱和损伤，进而引发肾毒性。 2.5. 顺铂通过激活NF-κB和线粒体 应激通路诱导近端小管细胞损伤 近曲小管作为肾单位中最易受损的段落，其特点是线粒体丰富且具有活跃的转运能力。证据表明它们的功能紧密偶联，其中转运活性的障碍会影响线粒体形态。在本研究中，对近端小管细胞进行无监督聚类分析，鉴定了三个健康的PT亚群（对应于S1–S3），以及一个混合亚簇（S3/损伤），该亚簇同时包含S3段细胞（Slc5a2+）和损伤应答细胞（Plin2+ Hspa1a+）（图 5A–C）。此外，两个受损的PT亚簇被注释为损伤-S1（Havcr1+）和损伤-S2（Krt20+）（图 5C）。处于损伤状态的PT细胞表现出健康PT标志物的下调，包括溶质载体（Slc5a12+、Slc7a13+），这表明细胞发生了分化。此外，功能分析揭示了这些PT细胞的独特特征。PT-损伤-S2细胞显著上调了对内质网应激、氧化应激和线粒体功能障碍相关通路的反应（例如，线粒体自噬）。此外，PT-损伤-S1细胞表现出毒素转运和蛋白质从细胞核向外输出的活性。值得注意的是，损伤-S1和损伤-S2亚群均介导了线粒体中细胞色素c的释放及凋亡信号传导（图 S5A，支持信息）。在应激诱导条件下或特定病理状态下，细胞色素c可从正常的线粒体内膜间隙重新分布到细胞核、细胞质和细胞外空间，从而调节活性氧动态并启动细胞凋亡。此外，我们观察到所有PT细胞在假手术组与顺铂组之间的分布明显异质性（图 5D）。PT-S3亚簇细胞在假手术组和顺铂组中均占多数。我们的结果还显示，顺铂处理后受损的PT亚簇增加（图 5D），且与假手术组相比，顺铂处理组的损伤评分显著升高，损伤程度也更为严重（图 S5B,C，支持信息）。为了探究肾损伤背后的转录调控机制，我们进一步进行了转录因子（TF）活性分析，发现促炎和与凋亡相关的转录因子活性增强，包括Nf𝜅b1、Nf𝜅b2、Zbtb7b、Hoxb9和Bcl3（图 5E）。图 S5D（支持信息）显示，损伤相关PT细胞中对NF-𝜅B信号的响应出现了表达变化。此外，GSVA分析结果显示，损伤PT（S1、S2）表现出促炎和活性氧信号通路的上调（图 S5E，支持信息）。这些发现提示，顺铂可能通过激活NF-𝜅B及ROS信号通路来诱导PT细胞损伤。总之，我们推测顺铂可能通过损伤线粒体引发氧化应激，激活NF-𝜅B以启动炎症反应，并加重肾毒性。 为验证上述假设，我们开展了相关分子生化实验。首先，细胞研究显示，CDDP可诱导细胞凋亡（图 5F,G）。我们观察到， N-乙酰半胱氨酸（NAC）可逆转CDDP诱导的HK-2细胞内ROS积累（图 S5F,G，支持信息）。此外，我们发现，NAC能够抑制CDDP诱导的p-p65表达，从而阻断NF-𝜅B的转录激活（图 5I,J），继而降低其下游效应因子TNF-𝛼（图 5K,L）。此外，线粒体靶向抗氧化剂（Mito-TEMPO）能有效清除CDDP引发的线粒体ROS，进一步验证了氧化应激在此通路中的作用（图 5H；图 S5H，支持信息）。NF-κB抑制剂（JSH23）可有效抑制CDDP诱导的PT细胞中NF-κB的核转位（图S5I，支持信息）。这些结果表明，CDDP可能引发细胞内活性氧的积累、NF-κB的磷酸化以及随后的炎症反应。 2.6. 顺铂显著诱导巨噬细胞的浸润与活化 为阐明假手术组与顺铂组中免疫细胞与近曲小管上皮细胞之间细胞间相互作用的变化，我们采用了CellChat进行交叉对话分析。与假手术组相比，顺铂组中肾上皮细胞与巨噬细胞之间的细胞间相互作用的权重/强度均有所增强（图6A、B）。随后，我们比较了假手术组与顺铂组推断信号网络中按相对贡献排序的前10对配体-受体（LR）对。值得注意的是，与巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通路相关的若干LR对（Mif-Cd74/Cd44、Mif-Cd74/Cxcr4以及Mif-Ackr3）在顺铂组中的相对贡献排名下降，而与SPP1通路相关的LR对（Spp1-Itgav/Itgb6）则排名上升（图S6A，支持信息）。此外，作为MIF相关基因的Cd74，在巨噬细胞中表现出高表达水平（图S6B，支持信息）。我们进一步专门考察了假手术组与顺铂组之间MIF通讯网络的变化，发现顺铂处理显著增强了近曲小管上皮细胞与巨噬细胞之间MIF信号的交叉对话（图6C、D）。尽管MIF信号传统上被认为具有抑制巨噬细胞迁移的作用，但它同时也可促进白细胞的定向迁移和募集。[38] 因此，我们扩展了分析范围，对巨噬细胞进行了深入研究。通过对假手术组与顺铂组巨噬细胞进行无监督聚类分析，我们鉴定了五个不同的亚群（Mp1-Mp5）（图6E）。巨噬细胞群体包含四个 distinct 亚群：其中，Mp1亚群（Cd81+C1qa+）主要表达与常驻巨噬细胞相关的基因；Mp2亚群（Cd68+Cd209a+）既表现出促炎特征，又具有类似于树突状细胞的特征，[39] Mp2样巨噬细胞（Mo3：Fn1+Folr2+Mrcl+Cd163+）、增殖性巨噬细胞（Mp5：Mki67+Top2a+）以及浸润性巨噬细胞（Mp4：Plac8+Chil3+）（图6F；图S6C，支持信息）。在这些亚群中，浸润性巨噬细胞表现出较高水平的与M1极化及促炎因子（Il1b、Socs3、Cd86和Tlr2）相关的基因表达。此外，我们的研究还表明，与假手术组相比，顺铂处理组中浸润性Mp4细胞的分布明显扩大，提示顺铂暴露可能促进了巨噬细胞的浸润与极化（图6E、F；图S6D，支持信息）。与此一致，GO通路分析显示，Mp4亚群中与巨噬细胞迁移和活化相关的通路显著上调（图S6E，支持信息）。此外，Mp3亚群（M2样巨噬细胞）也会下调CDDP中促炎反应（图S6F，支持信息）。 为进一步探究巨噬细胞（THP-1细胞）对近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）的影响，我们开展了共培养实验。共培养体系分为两组：对照组（生理盐水）和CDDP组（图6G）。结果表明，CDDP处理组可激活巨噬细胞，并上调IL-1β和IL-6的表达水平（图6H、I）。共培养O-C实验显示，巨噬细胞被CDDP损伤的HK-2细胞培养上清液所激活（图6J）。此外，共培养体系还分为两组：一组为静息状态的巨噬细胞（THP-1细胞）与经CDDP处理的HK-2细胞共培养；另一组为活化状态的巨噬细胞（aTHP-1细胞）与经CDDP孵育的HK-2细胞共培养（图6K）。结果表明，巨噬细胞的活化加重了CDDP对HK-2细胞的毒性作用（图6L、M）。综上所述，这些结果提示，CDDP诱导的近端肾小管上皮细胞损伤可能通过MIF信号通路招募并激活巨噬细胞。随后，浸润并活化的巨噬细胞进一步加剧了CDDP对近端肾小管上皮细胞的损伤。 2.7. ICA通过调节线粒体代谢和NF-κB通路， 改善CDDP所致肾毒性，同时协同增强抗癌疗效 目前，迫切需要研发既能减轻顺铂（CDDP）相关毒性，又能增强其抗癌疗效的药物。淫羊藿提取物ICA具有显著的抗氧化、抗炎和抗癌特性，尤其对肝细胞癌（HCC）效果明显。[26,27] ICA目前正在中国开展针对晚期肝细胞癌的临床试验。[41] 本研究旨在探讨ICA是否能够缓解顺铂所致的肾毒性，以及它在治疗肝细胞癌时是否具有协同作用。为探究ICA能否改善顺铂引起的肾毒性并同时协同增强抗癌疗效，研究人员将携带肝细胞癌肿瘤的小鼠分为三组：模型组、顺铂组以及顺铂联合ICA治疗组（ICA组）（图7A）。模型组的数据在此未予展示。 最初，在给予CDDP（10毫克/千克）或ICA（70毫克/千克）后，对携带肝细胞癌肿瘤的小鼠的肾脏和肿瘤进行解剖，并随后开展了病理学检测。研究结果显示，与仅使用CDDP组相比，CDDP与ICA联合治疗能够有效抑制肿瘤生长（图7B；支持信息中的图S7A）并降低肿瘤细胞增殖速率（图7C；支持信息中的图S7B）。此外，与CDDP组相比，这种联合治疗方案还逆转了小鼠的体重减轻现象（图7D；支持信息中的图S7C）。肾脏的外观及病理染色结果表明：与CDDP组相比，ICA组表现出显著的改善（图7E）。此外，我们的数据表明，ICA显著改善了肾脏与体重的比值（图7F），以及血液生化指标，特别是尿酸（UA）、血肌酐（CREA）和尿素氮（UREA）（图7G-I），这提示ICA能够显著减轻CDDP所致的肾毒性。同时，ICA还降低了肝脏与体重的比值，以及天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）等生化标志物的水平（图S7D-F，支持信息），表明ICA在一定程度上改善了肝损伤。体外研究显示，ICA显著缓解了CDDP诱导的细胞凋亡（图7J；图S7G，支持信息）。此外，我们观察到ICA能够抑制CDDP诱导的IL-6和IL-1β表达（图7K；图S7H，支持信息）。尤为重要的是，通过海马实验，我们证实ICA能够减轻CDDP对线粒体呼吸、ADP生成及电子传递活性的抑制作用（图7L；图S7I-L，支持信息）。因此，ICA可能在减轻CDDP所致肾毒性的同时，协同增强其在肝细胞癌荷瘤小鼠中的抗癌疗效。 为进一步探究ICA减轻CDDP诱导肾毒性的潜在机制，我们对三个实验组——假手术组、CDDP组和ICA组——进行了RNA测序（RNA-seq）。相关性分析显示，组内重复样本之间的相关性高于组间比较（图S7M,N，支持信息），表明测序数据具有极高的可重复性。随后，差异表达分析揭示了ICA与CDDP组之间存在大量差异表达基因（1750个DEGs），以及CDDP组与假手术组之间存在987个DEGs。具体而言，CDDP与假手术组的比较鉴定出266个上调基因和721个下调基因，而ICA与CDDP组的比较则鉴定出906个上调基因和844个下调基因（图7M,N）。这些DEGs的表达模式在组内表现出高度一致性，进一步证实了数据的可靠性（图S7O,P，支持信息）。为了深入探讨这些DEGs的功能意义及ICA治疗的生物学效应，我们开展了功能富集分析。CDDP与假手术组的DEGs主要富集于与炎症反应、细胞外基质组织、脂肪酸代谢、ATP代谢过程、脂肪酸氧化和糖酵解过程等密切相关的关键通路（图S7Q，支持信息）。相比之下，ICA与CDDP组的DEGs则主要富集于脂肪酸代谢过程、凋亡信号通路的调控以及自噬的调节等生物过程。此外，与NF-κB信号传导、线粒体转运与呼吸链、氧化磷酸化等相关的通路也显著富集（图7O）。这些发现表明，线粒体代谢参与了CDDP诱导的肾毒性及其对ICA的治疗作用。与上述结果一致，我们的实验数据显示，CDDP抑制了线粒体的基础呼吸和ADP的生成，而ICA则改善了这一损伤（图4I、J，图7L；图S7I-L，支持信息）。通路分析表明，CDDP抑制了与线粒体代谢相关的各项过程，包括氧化磷酸化、脂肪酸β氧化、三羧酸循环以及ATP转运链，同时激活了炎症通路，如NF-κB信号通路和肿瘤坏死因子信号通路（图S7R-W，支持信息）。值得注意的是，ICA处理有效改善了这些通路的活性（图7P-R；图S8A，支持信息）。 为进一步探究ICA是否通过阻断与CDDP结合的靶蛋白来减轻CDDP引起的副作用，我们针对重组PC、MCCC1、PCCA和SDHC蛋白的结合域开展了CDDP-P探针标记相关实验。结果显示，经ICA处理组中CDDP与蛋白质的结合水平未见显著变化（图S8B，支持信息）；这表明ICA的保护作用可能并非通过阻断CDDP的结合实现，而是通过缓解其他下游应激反应来发挥作用。此外，我们发现ICA显著降低了CDDP诱导的线粒体活性氧（MitoROS）积累（图7T；图S8C，支持信息），并显著挽救了CDDP抑制的ATP生成（图S8D，支持信息）。同时，ICA还显著抑制了CDDP诱导的NF-κB磷酸化及其下游炎症反应（图7Q-S；图S8E、F，图S9A，支持信息）。综上所述，ICA并未直接阻断与CDDP结合的蛋白质；相反，它通过改善CDDP引发的炎症反应和线粒体功能障碍，从而减轻CDDP所致的肾毒性，并且在协同作用下进一步增强了顺铂的抗癌疗效。 2.8. 整合转录组学与代谢组学揭示ICA可缓解 CDDP诱导的炎症反应和线粒体功能紊乱 我们的实验发现和RNA-seq分析表明，CDDP抑制了肾脏中与线粒体相关的代谢过程，而ICA则重塑了线粒体的代谢微环境。值得注意的是，CDDP主要作用于柠檬酸循环和氧化磷酸化，而ICA通过调节相关通路，有效改善了这些功能障碍（图2、7P；图S8A，支持信息）。具体而言，ICA上调了参与某些代谢过程的关键靶基因的表达水平（图8A）。为了验证这些发现，我们开展了代谢组学分析，以检测与代谢相关的通路变化。在正负模式下，质量控制（QC）样本均表现出高度相关性（图S9B、C，支持信息），主成分分析（PCA）也清晰地将QC样本与假手术组（Sham）区分开来。对照组、CDDP组和ICA组（图S9D、E，支持信息），表明数据具有可靠性和稳定性。正交偏最小二乘判别分析（Ortho PLS-DA）进一步区分了假手术组、CDDP处理组和ICA治疗组（图8B）。随后，我们通过合并正负模式下鉴定的代谢物，开展了差异代谢物分析。CDDP处理导致346种代谢物发生显著变化（log2倍数变化|>0.26，p<0.05；图S9F，支持信息），而ICA治疗减轻CDDP诱导的肾毒性则使182种代谢物出现显著变化（图8C）。差异代谢物表达模式在各组内表现出高度一致性，其中ICA治疗组的整体代谢谱与假手术组相似，提示ICA能够有效缓解CDDP引起的代谢紊乱（图S9G，支持信息）。为进一步探究所涉及的生物通路，我们对CDDP与假手术组以及ICA与CDDP组比较中的代谢物进行了KEGG富集分析。CDDP与假手术组的代谢物在精氨酸和脯氨酸代谢、天冬氨酸代谢、尿素循环等通路中显著富集，同时还涉及谷胱甘肽代谢和支链脂肪酸氧化（图S9H，支持信息）。ICA与CDDP组比较的代谢物除富集于谷胱甘肽代谢外，还富集于柠檬酸循环（图8D）。基于上述结果及发现，我们重点聚焦于脂肪酸β氧化和柠檬酸循环通路，以评估相关基因的表达变化：这些基因在CDDP处理组中受到抑制，但在ICA治疗后得以重新激活（图8E）。柠檬酸循环中的差异代谢物呈现多样化变化：CDDP处理使柠檬酸和黄素腺嘌呤二核苷酸积累增加，同时降低了延胡索酸和硫辛酰胺的水平；而ICA治疗则有效纠正了这些代谢失衡（图8F）。为全面展示这一过程，我们将改变的代谢物和基因映射到三羧酸循环及脂肪酸β氧化的经典通路中（图8G）。综合来看，这些结果表明，ICA能够靶向线粒体代谢相关基因，激活其表达，从而恢复CDDP诱导的代谢紊乱，特别是在脂肪酸β氧化和柠檬酸循环通路中尤为明显。 三、讨论 顺铂广泛用于多种癌症的治疗；然而，其应用可能因对健康组织产生严重不良反应而受限，尤其是肾毒性，约三分之一接受治疗的患者会受到这一副作用的影响。[25,42-44] 确定顺铂的结合靶点，以在不降低肿瘤控制效果的前提下减轻这些毒性，仍是一项重大的临床挑战。此外，理想的治疗方案还应与顺铂协同作用，促进肿瘤消退，保护正常组织的同时影响肾脏及其他生理功能。在本研究中，我们发现顺铂可直接与靶蛋白结合，从而引发肾毒性；随后，我们整合了化学蛋白质组学和单细胞RNA测序数据集，以阐明其背后的毒性机制。此外，我们还提供了证据，表明给予异甘草酸苷能够有效预防顺铂诱导的肿瘤小鼠肾毒性。这些有益作用与顺铂抗癌活性的协同增强效应并存。 化学生物组学研究表明，顺铂可直接与线粒体蛋白结合，包括PCCA、PC、ATP5F1C、SLC25A5和SDHC。随后，基于STEP的分析方法[19]证实，顺铂选择性地与PT细胞中的线粒体相关蛋白相互作用，最终导致线粒体呼吸与代谢紊乱、细胞内活性氧（ROS）积累、炎症反应及细胞凋亡。这些发现与先前针对顺铂诱导肾毒性的单核RNA测序研究结果一致，后者揭示了潜在PT损伤机制中的转录组变化，包括炎症和脂质代谢通路等。其他研究也表明，顺铂的细胞毒性机制涉及ROS介导的氧化应激、线粒体功能障碍以及DNA加合物的形成，这些最终均会导致细胞凋亡。与以往通过蛋白质组学、大规模转录组学和代谢分析探讨顺铂诱导肾毒性的研究不同[49,50]，我们的研究全面阐明了顺铂通过多条途径靶向PT细胞并引发损伤的分子机制，最终导致严重的肾毒性。 在顺铂组的近端肾小管细胞中，我们发现NFKB2、NFKB1、IRF1和FOXI1等翻译因子被激活，同时NF-κB及IL-6/JAK/STAT3信号通路也出现上调。受损的近端肾小管细胞通过激活NF-κB信号通路，引发了炎症反应。这些变化可能促进炎症因子的合成与释放，从而导致肾毒性。此外，一种涉及肾近端肾小管细胞分泌炎症因子、NF-κB激活以及线粒体功能障碍的正反馈回路，可能会进一步加重顺铂治疗后的肾损伤。综上所述，我们的研究结果提示，顺铂可能通过触发与炎症反应相关的NF-κB信号通路，诱导线粒体功能障碍，最终导致近端肾小管细胞损伤。 为应对顺铂诱导肾毒性这一重大临床难题，同时又不损害其抗癌疗效，我们从传统中医药和天然产物中筛选出若干潜在候选药物，这些药物可能有助于减轻顺铂所致的肾毒性。我们发现，一种天然抗肿瘤剂——ICA凝胶，已在中国被用作晚期肝细胞癌的临床治疗手段，在临床应用中表现出良好的安全性和有效性。 值得注意的是，ICA的给药可在体内和体外均减轻CDDP对PT细胞造成的损伤。研究表明，ICA能够增强线粒体呼吸，并减少细胞内活性氧（ROS）的积累。线粒体呼吸是PT细胞生成ATP的关键能量来源。]近期的研究表明，线粒体呼吸功能受损会导致氧化还原失衡和炎症反应，而这些因素至关重要。 在肾毒性发病机制中起重要作用。顺铂可促进PT细胞线粒体内的活性氧（ROS）积累，干扰线粒体电子传递，降低抗氧化能力，最终导致PT细胞发生ROS介导的损伤和细胞死亡。配体-受体对分析揭示了巨噬细胞与PT细胞之间至关重要的细胞间通讯，凸显了这种相互作用在损伤过程中的关键作用——CDDP诱导的炎症反应，提示了一条潜在的巨噬细胞募集与活化的途径。总体而言，我们的研究结果表明，ICA能够有效逆转CDDP所引起的线粒体呼吸失衡、细胞内活性氧（ROS）积累以及巨噬细胞浸润。此外，ICA似乎还能与CDDP协同作用，发挥抗癌效果。 此外，我们整合了转录组学和代谢组学分析，以进一步阐明ICA在CDDP诱导的肾损伤中发挥保护作用的机制。转录组学结果显示，ICA显著抑制了CDDP诱导的线粒体损伤及NF-κB的激活。先前研究探讨CDDP肾毒性解毒机制时，也报道了类似发现[6,65]。与此同时，代谢组学分析表明，ICA能够缓解CDDP引起的线粒体代谢紊乱，尤其是与三羧酸循环、柠檬酸循环以及氧化磷酸化相关的代谢异常。 本研究存在若干局限性。首先，尽管我们在初步剂量范围试验的基础上采用了10毫克/千克体重的顺铂方案，但这一剂量已超出通常公认的治疗窗范围。在今后的研究中，我们计划探索采用低剂量、长疗程的给药方案，或使用临床相关剂量，以进一步提高模型的稳健性和不同研究间的可比性。其次，尽管本研究鉴定了顺铂的直接结合靶点，但仍需开展更多研究，以深入阐明这些靶蛋白的结合机制及其与线粒体相关的生物学功能。此外，鉴于顺铂可通过多靶点、多途径机制引发线粒体损伤，后续研究应采用多种协同验证方法，系统考察顺铂介导的靶点如何影响线粒体功能。另外，ICA减轻顺铂所致肾毒性的机制尚需进一步深入探究。最后，有必要开展更多研究，以揭示ICA协同增强顺铂化疗疗效的分子机制。 四、结论 总之，我们的研究表明，ICA能够减轻顺铂所致的肾毒性，同时增强其抗肿瘤疗效。鉴于ICA在中国已证实具有良好的安全性和有效性，我们的发现提示ICA有望用于接受顺铂治疗的癌症患者。此外，我们还发现，与顺铂结合的分子靶标会引发线粒体功能障碍，从而导致肾毒性，这为深入理解顺铂所致肾毒性的机制提供了重要见解。这也凸显了潜在解毒剂在临床筛选或研发中的重要性，以缓解化疗带来的全球负担。 五、 实验 材料与试剂： 顺铂（CDDP）和ICA购自美国圣路易斯的Sigma公司。N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自美国AbMole Bio-Science公司。用于点击化学反应的试剂，包括TAMRA叠氮化物、THPTA和生物素叠氮化物，均来自美国Click Chemistry Tools公司。NaVc和CuSO4购自美国Sigma Aldrich公司（圣路易斯）。Mito-TEMPO和JSH23购自美国MedChem-express公司。部分用于检测AST、ALT、尿酸（UA）、肌酐（CREA）和尿素（UREA）的试剂盒，所用蛋白片段均来自以下供应商：重组PC（货号PDB0897）、PCCA（货号PDB0602）、MCCC1（货号PT13556）和SDHC（货号PT8057）均购自上海启明生物科技有限公司。线粒体应激检测试剂盒由美国加利福尼亚州安捷伦公司提供。一抗包括：NF-kB p65（货号10745-1-AP）、NF-kB p-p65（货号82335-1-RR）、TNF-α（货号17590-1-AP）、IL-6（货号21865-1-AP）、PCCA（货号21988-1-AP）、PC（货号16588-1-AP）、MCCC1（货号14861-1-AP）、SLC25A5（货号17796-1-AP）、ATP5F1C（货号10910-1-AP）、组蛋白H3（货号17168-1-AP）以及β-肌动蛋白（货号66009-1-lg），以上抗体均购自美国芝加哥Proteintech公司。Atpenin A5和苯甲酮则购自圣克鲁斯生物技术公司。 所用蛋白片段均来自以下供应商：重组PC（货号PDB0897）、PCCA（货号PDB0602）、MCCC1（货号PT13556）和SDHC（货号PT8057）均购自上海启明生物科技有限公司。线粒体应激检测试剂盒由美国加利福尼亚州安捷伦公司提供。一抗包括：NF-kB p65（货号10745-1-AP）、NF-kB p-p65（货号82335-1-RR）、TNF-α（货号17590-1-AP）、IL-6（货号21865-1-AP）、PCCA（货号21988-1-AP）、PC（货号16588-1-AP）、MCCC1（货号14861-1-AP）、SLC25A5（货号17796-1-AP）、ATP5F1C（货号10910-1-AP）、组蛋白H3（货号17168-1-AP）以及β-肌动蛋白（货号66009-1-lg），以上抗体均购自美国芝加哥Proteintech公司。Atpenin A5和苯甲酮则购自圣克鲁斯生物技术公司。 荷瘤小鼠实验模型： 为验证采用顺铂（CDDP）给药所建立模型的可靠性，我们开展了初步实验以优化治疗方案。所有动物实验操作均已获得本机构动物护理与福利委员会的批准。（伦理审批编号：AUP-230714-WJG-619-01）实验所用动物为雄性C57Bl6/J小鼠（8周龄），购自维泰尔河公司（中国广州）。小鼠饲喂标准实验室饲料，并在恒定的环境条件下饲养。荷瘤小鼠的制备采用Hepa1-6细胞。7天后，当肿瘤体积达到约50-100 mm³时，将带瘤小鼠随机分为三组。各组小鼠分别接受以下处理：正常生理盐水（假手术组）、顺铂（CDDP，10 mg/kg，腹腔注射，i.p.，CDDP组），或CDDP（10 mg/kg，每周一次腹腔注射）与ICA（70 mg/kg，每日一次胃内给药，ICA组）联合用药，总疗程为16天。治疗结束后，对小鼠实施安乐死，并采集肾脏和肿瘤组织。部分组织经4%多聚甲醛固定后用于H&E染色；另一部分则冷冻于-80 ℃冰箱中保存。通过免疫组织化学染色法评估肿瘤生长情况。图像采用明场光学显微镜获取。 血清生化分析： 采用商品化试剂盒，并配合自动生化分析仪（日本东芝TBA-120FR）测定AST、ALT、尿酸、尿素和肌酐。 体外荧光标记实验： 对于荧光标记实验，[18,68,69] 制备了Plki肾组织裂解液，并将其与DDp.p（CDDP-P，浓度为12.5至100 µmol/L）或溶剂（生理盐水）共同孵育3小时。随后，将样品与点击化学混合物（NaVc、THPTA、CuSO4和TAMRA-叠氮化物）进行反应。之后，利用预冷丙酮沉淀蛋白质，并用SDS-PAGE凝胶重新溶解于上样缓冲液中进行分离。最后，采用激光扫描仪进行荧光扫描以实现可视化。凝胶经考马斯亮蓝（CBB）染色后观察。 对于竞争性荧光标记实验，先将肾裂解液与CDDP或溶剂预孵育，随后再加入CDDP-P进行处理。其余步骤与上述实验一致。 对于重组蛋白的荧光标记，先将蛋白质与CDDP-P孵育，随后采用点击反应试剂盒进行点击反应。样品经SDS-PAGE分离后，采用上述相同方法进行可视化检测。在竞争性实验中，样品在加入探针之前先与ICA预孵育，之后按照上述相同步骤进行处理。 利用LC/MS/MS技术进行下拉靶标鉴定与数据分析：针对LC/MS/MS所获得的靶标谱图，[31,70]采用CDDP或溶剂对照处理肾组织裂解液，随后再加入CDDP-P继续孵育2小时。随后，在室温下进行点击反应2小时。之后，对样品进行沉淀、重悬，并重新溶解于含SDS的磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后用链霉亲和素磁珠进行捕获。磁珠经一系列缓冲液温和洗涤后，将结合了蛋白质的磁珠进行还原、烷基化处理，并用胰蛋白酶进行酶解。最后，使用串联质谱(TMT) 试剂（美国赛默飞世尔科技）对样品进行标记，随后采用液相色谱/质谱/质谱法（美国赛默飞世尔科技）进行分析。 根据CDDP-P组与CDDP-P+CDDP（Comp）组的TMT信号，采用此前确立的方法，通过Student's t检验计算了p值（CDDP-P/Comp）。根据绝对倍数变化大于1.2且p值小于0.05的标准，筛选出目标蛋白。随后，利用R语言中的“clusterProfiler”包对所筛选的蛋白进行了GO富集分析。 单细胞悬液与scRNA测序： 新鲜肾组织经采集后切成小碎片，随后对这些肾组织碎片进行消化处理。消化完成后，对样本进行过滤、离心并重悬，以去除红细胞，获得单细胞悬液。根据10x Genomics官方方案，利用单细胞悬液采用Single Cell 3' Reagent Kit v3.1（10x Genomics）制备测序文库。随后，所制备的文库在Illumina NovaSeq 6000平台（美国圣地亚哥，Illumina公司）上进行测序。 scRNA-seq数据集分析：采用Seurat软件包，以默认参数识别各细胞类型的差异表达基因。符合log2(FC)绝对值≥0.25且校正后p值<0.05标准的基因被归为差异表达基因。利用clusterProfiler软件包（版本4.0.0）对差异表达基因进行功能富集分析，并采用Benjamini-Hochberg方法校正多重假设检验。 细胞蛋白靶标分析： 在Seurat中，使用了AverageExpression功能，为单细胞RNA测序数据集中所有细胞类型中经化学生物组学鉴定的靶标生成了平均特征表达矩阵。随后，对平均特征表达矩阵进行了原始尺度标准化处理，以实现不同细胞类型间平均特征表达值的跨类型比较。对于每个靶标，若某一细胞类型相对于其他类型表现出最高的标准化值，则将该蛋白靶标标记为与特定细胞类型相关。在遍历所有候选靶标后，获得了各靶标在细胞背景下的分布特征图谱。 生物功能分析： 采用“clus-terProfiler”R软件包（版本3.18.1）对细胞靶标特征进行GO分析。p值通过超几何检验计算，并经Benjamini-Hochberg (BH)校正以控制多重比较的影响。选取“生物过程”（BP）类别来表征功能特征，通过富集蛋白的数量及校正后的p值进行可视化。利用compareCluster函数在scRNA-seq数据集中构建功能特征的比较基因簇，同时借助cnetplot函数可视化一致与差异的功能通路及其相关蛋白靶标。此外，还基于bulk RNA-seq中CDDP组与假手术组比较所得的全部差异表达基因（DEGs）谱，开展了基因集富集分析（GSEA）。另外，针对肾细胞中CDDP组与假手术组之间的DEGs谱，进一步评估了这些通路的富集得分。 细胞间互作网络与基因调控网络分析：利用CellChat软件包，通过配体-受体相互作用对细胞间的串话进行了系统性分析。具体而言，采用了netVisual_aggregate和netVisual_chord_gene函数，以评估PT细胞与免疫细胞之间的串话。此外，借助PySCENIC软件包对肝细胞中的基因调控网络进行了分析。转录因子的调控活性则通过pheatmap函数进行了可视化展示。 海马分析： 采用Mito Stress Test试剂盒，在溶剂对照或CDDP处理的HK-2细胞中测定OCR检测。后续实验严格遵循制造商的实验方案。数据处理使用Seahorse XFe Wave软件进行分析。 流式细胞术检测活性氧（ROS）、 线粒体活性氧（MitoROS）或细胞凋亡： 对于ROS和MitoROS的检测，用溶剂、顺铂（CDDP），或顺铂与ICA、NAC或线粒体TEMPO联合处理过的HK-2细胞，先轻轻洗涤，随后在含有ROS或MitoROS染料的结合缓冲液中孵育。孵育结束后，采用流式细胞术对样品进行分析。 对于细胞凋亡检测，将HK-2细胞分别用溶剂、CDDP或CDDP与ICA或NAC的组合处理，并在含有膜联蛋白V和碘化丙啶染料的结合缓冲液中孵育。孵育结束后，样品在1小时内采用流式细胞术进行分析。 Western印迹分析： 从肾组织或HK-2细胞中提取可溶性蛋白，随后将其加载至SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，并转膜至聚偏氟乙烯膜上。之后，将样品与一抗和二抗分别孵育。最后，通过酶联化学发光法显影蛋白信号，并利用Image软件进行分析。 对于CETSA-WB，将经顺铂预处理的可溶性蛋白裂解液分装至试管中，然后在指定温度下加热。离心后，取上清液进行Western blot分析。 定量实时PCR（OPCR）分析：从样本中提取总RNA，随后将其逆转录为互补DNA。采用合成引物和SYBR Green Master Mix（来自中国耶森公司）进行QPCR检测。IL-1β和IL-6的引物序列详见支持信息表S1。 批量RNA测序分析： 从肾脏样本（假手术组、顺铂组和ICA组）中提取总RNA，并采用聚腺苷酸尾选法富集带poly(A)尾的转录本。将富集的RNA逆转录为cDNA，并制备测序文库，随后在Illumina NovaSeq 6000平台上以PE150（双端150 bp）模式进行RNA测序。利用fastp对原始测序数据进行处理，过滤掉低质量读段，仅保留高质量读段用于后续分析。然后，使用HISAT2（v2.1.0）将过滤后的读段比对到参考基因组。采用FeatureCounts对每个样本的转录本进行定量分析，并对所得数据进行标准化处理，再利用R包edgeR进行差异表达分析。符合以下标准的基因被鉴定为差异表达基因（DEGs）：|log2倍数变化| > 1且校正多重检验后的p值 < 0.05。最后，借助R包clusterProfiler对DEGs进行功能富集分析，以识别富集的生物通路和生物学过程。 代谢组学分析： 肾组织样本的制备及代谢物提取均依据先前的实验方案进行。代谢物采用液相色谱/质谱联用技术（LC/MS/MS）进行分析。原始代谢物数据经由Compound Discoverer 3.1软件处理，代谢物相对定量基于峰面积测定。样本数据采用R包MetNormalizer进行归一化处理。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）则利用R包ropls（v1.30.0）进行分析。各组均值间比较采用t检验，并通过p.adjust函数对多重假设检验进行校正。差异代谢物的富集分析采用Metabo-Analyst 6.0完成。 分子对接模型： 蛋白质晶体来源于蛋白质数据库（PDB）。在对接过程中，首先利用Discovery Studio Client对蛋白质进行脱水和氢化处理。随后，采用Pyrx-0.8软件进行分子对接，并借助PyMOL进行可视化与绘图分析。 统计分析： 首先对原始数据的完整性和质量进行了评估。对于单细胞RNA测序数据，采用了对数正态化处理。根据每个细胞中特征RNA数量及总RNA计数的分布情况，剔除了异常值。对于批量RNA测序数据，则采用修剪均值M值法进行标准化处理。代谢组学数据的标准化采用了MetaX软件中提供的概率商标准化方法。数据以均值±标准差（SD）表示。采用Wilcoxon秩和检验、精确检验以及独立双尾Student t检验，对两组数据的统计学显著性进行分析。为校正多重比较带来的假阳性风险，p值分别通过错误发现率（FDR）或Bonferroni校正方法进行了调整。统计分析使用GraphPad Prism 8.0和R（v4.2.0）软件完成，示意图则借助BioRender.com生成。 本期期刊精华已送达～ 若觉得内容对你的学术研究或临床工作有启发，欢迎点赞、留言，或者转发给身边的伙伴，让优质文献惠及更多医学人！下期将聚焦「医学科技前沿」，记得星标关注，不错过前沿干货～ ---往期热点合集--- science advance IF=11.7丨鉴定一种靶向 ACSL4 抑制剂，以治疗铁死亡相关疾病 Nature Metabolism (IF=19.2)|人类肠道微生物芳香族氨基酸及其相关代谢物通过肠道免疫控制预防肥胖 Nature Communications（IF=15.7）|通过抑制FXR破坏胆汁酸代谢会导致YAP激活诱导的肝细胞癌 Redox Biology IF=10.7丨色氨酸代谢产物3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)通过抑制铁死亡缓解支气管肺发育不良 Mol Cell（14.5）| OPA1通过增强线粒体 ROS 和抑制综合应激反应来促进铁死亡 science advance IF=13.6丨脂肪酸过氧化和 cGAS-STING 激活抑制 ACLY 克服癌症免疫治疗耐药性 Journal of Hepatology（IF=26.8）|人肝星状细胞的多模式分析确定了MASLD的新治疗靶点 Journal of Hepatology（IF=26.8）|通过调节肝脏昼夜节律钟来恢复 TGF-β 信号传导从而改善纤维化 Nature Metabolism（IF=19.2）丨骨骼肌中 Kdm2a 的抑制改善肥胖中的代谢活性 Cancer Res（IF=12.8）｜莲心碱通过 AMPK-HIF-1α 重编程代谢，重塑免疫微环境并增强肝细胞癌的免疫治疗 END~ 点击蓝字 关注我们