Filgrastim biosimilar(Dong-A Pharmaceutical Co., Ltd.)

摘要：大肠杆菌（E. coli）作为重组蛋白生产的主力宿主，其包涵体（IBs）的生物工艺开发是提升生物药产率与活性的关键。本文系统综述了包涵体从上游表达至下游回收的全流程技术，包括发酵工艺优化、包涵体形成机制、溶解与复性策略及纯化技术创新。研究指出，通过优化诱导条件（如温度、pH、诱导剂浓度）和采用温和溶解剂（如低浓度尿素结合表面活性剂）可显著提升活性蛋白回收率，而色谱柱复性与微流控技术为工业化生产提供了新方向。一、大肠杆菌包涵体：生物制药的 “潜力宝库”大肠杆菌因高表达效率成为重组蛋白生产的首选宿主，但其表达的蛋白常以包涵体形式存在 —— 一种由错误折叠蛋白聚集形成的不溶性颗粒。尽管包涵体曾被视为 “生产障碍”，但其高稳定性、抗蛋白酶降解及低杂质污染的特性，反而成为规模化生产的优势。例如，通过优化发酵条件，包涵体可占细胞总蛋白的 30% 以上，且下游纯化步骤可简化（图 1）。当前，约 120 种获批生物药（如胰岛素、细胞因子）均通过包涵体工艺生产，凸显其在生物制药中的核心地位。二、上游工艺：从发酵到包涵体形成的关键调控2.1 发酵模式与参数优化分批补料发酵：相较于传统分批发酵，补料模式通过控制底物（如甘油、葡萄糖）添加，可避免乙酸积累导致的生长抑制。例如，补料发酵使羊生长激素产量从 60 mg/L 提升至 3.2 g/L（表 1）。诱导条件：温度：低温（18–25°C）抑制疏水聚集，形成更小、更易复性的包涵体；高温（42°C）导致淀粉样结构形成， solubility 下降（表 1）。pH 与渗透压：酸性环境（pH <5.5）促进包涵体形成，而中性 pH（如 7.4）减少聚集（图 1）。诱导剂：IPTG 浓度过高（>1 mM）会加剧细胞应激，推荐低浓度（0.1–0.8 mM）结合早期诱导策略。2.2 宿主与载体设计工程菌株：敲除硫氧还蛋白还原酶（trxB）和谷胱甘肽合成酶（gor）的菌株（如 SHuffle、Origami）可营造胞内氧化环境，促进二硫键正确形成。表达载体：新型载体（如 pAR-KanI、pCR2）无需抗生素筛选，稳定性高，适合工业化生产。T7 启动子虽转录效率高，但易导致蛋白错误折叠，需搭配分子伴侣共表达。三、下游工艺：从包涵体到活性蛋白的 “重生之路”3.1 分离与清洗细胞破碎：高压均质（French press）与超声破碎为常用方法，结合溶菌酶（1 mg/mL）可提升破碎效率。例如，超声破碎后通过离心（10,000 g）可有效分离高密度包涵体（密度 1.3 mg/mL）。清洗策略：使用低浓度尿素（2 M）或去污剂（Triton X-100）清洗 3–4 次，可去除膜碎片与宿主蛋白，获得纯度 > 90% 的包涵体。3.2 溶解与复性：平衡效率与活性的核心溶解剂选择：强变性剂：8 M 尿素或 6 M 盐酸胍可完全溶解包涵体，但需注意尿素分解产物对蛋白的毒性。温和方法：3 M 尿素结合 0.2% Sarkosyl（N - 月桂酰肌氨酸钠）可保留部分天然结构，直接稀释后复性效率提升 30%（表 3）。复性技术：色谱柱复性：利用尺寸排阻色谱（SEC）或离子交换色谱，在脱除变性剂的同时促进正确折叠，如 EGF 复性产率达 76%。微流控技术：通过微通道内的层流扩散精确控制变性剂浓度梯度，适用于难复性蛋白（如柠檬酸合酶），复性效率提升至 93.5%（表 4）。3.3 纯化与质量控制多模式色谱：结合电荷与疏水相互作用，可高效分离正确折叠蛋白与聚集体。例如，Ni-NTA 亲和层析在变性条件下结合目标蛋白，复性后洗脱纯度达 95% 以上。纳米纤维色谱：相较于传统膜层析，纳米纤维基质具有更高结合容量，适用于大规模纯化，如单克隆抗体片段纯化效率提升 15 倍。四、挑战与前沿技术4.1 现存挑战复性效率瓶颈：复杂蛋白（如多结构域抗体）复性产率常低于 50%，需依赖添加剂（如精氨酸、环糊精）抑制聚集（表4）。工艺放大难题：实验室规模的高效复性方法（如透析）难以直接放大，需开发连续流工艺（如错流过滤结合在线监测）。4.2 创新方向非经典包涵体（NCIBs）：通过基因工程调控形成易溶性包涵体，无需强变性剂即可提取活性蛋白。例如，NCIBs 结合聚乙二醇化技术，使 GCSF 药代动力学性能提升。智能化工艺设计：利用人工智能（AI）预测蛋白 - 溶剂相互作用，优化溶解 /复性参数。如 AlphaFold2 预测二硫键形成路径，指导 rhG-CSF 复性条件优化，活性回收率提升至 87%。五、工业化展望：从实验室到产线的关键考量成本优化：采用混合碳源（甘油 + 乳糖）补料发酵，降低 IPTG 使用成本的同时提升产率（如 β- 半乳糖苷酶产量提升 40%）。连续化生产：整合连续流发酵与在线层析，减少中间步骤损耗。例如，连续流工艺使胰岛素生产周期缩短 40%，产率提升至 92%。可持续性：开发可回收溶解剂（如可生物降解的尿素替代物）与低能耗破碎技术（如高压均质结合脉冲电场），降低环境负担。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

3月14日，正大天晴艾贝格司亭α（商品名：亿立舒）的一项“头对头”全球Ⅲ期研究（GC-627-05）数据发表于国际期刊《JCO Oncology Advances》。研究结果显示，艾贝格司亭α在预防化疗引起的中性粒细胞减少症（CIN）的临床试验中， 非劣效于培非格司亭，且在后续化疗周期中表现出更低的严重中性粒细胞减少发生率 [1] 。 给化疗系上“安全带” 化疗引起的中性粒细胞减少（CIN）是癌症患者接受骨髓抑制性化疗时常见的剂量限制性毒性反应。中性粒细胞减少不仅会增加感染风险，还可能导致化疗剂量减少或治疗延迟，严重时甚至危及患者生命。为了预防CIN，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）类药物被广泛使用，尤其是长效G-CSF，如培非格司亭。 艾贝格司亭α是全球首个第三代长效G-CSF-Fc融合蛋白。已有研究证实，艾贝格司亭α在预防CIN方面的疗效和安全性与短效G-CSF非格司亭相当 [2,3] 。 本研究旨在进一步评估艾贝格司亭α在乳腺癌患者中的有效性和安全性，特别是在多周期化疗中的表现。 本研究为全球多中心、随机、开放标签、阳性对照的非劣效Ⅲ期临床试验，在5个国家的41个研究中心进行。研究共纳入393例接受化疗（多西他赛+环磷酰胺）的Ⅰ-Ⅲ期乳腺癌患者，受试者按1:1的比例随机分配至艾贝格司亭α组或培非格司亭组。 长效预防潜力添新证 研究结果显示， 主要终点艾贝格司亭α组和培非格司亭组在第一个化疗周期内，4级中性粒细胞减少（ANC＜0.5×10 9 /L）的持续时间分别为0.2±0.51天和0.2±0.45天（95% CI: -0.1, 0.1; P=0.7074） ，证实了艾贝格司亭α非劣效于培非格司亭 [1] 。 在后续第三个和第四个化疗周期中，艾贝格司亭α组的4级中性粒细胞减少发生率分别为2.6%和1.6%，培非格司亭组分别为6.3%和5.3% [1] ，艾贝格司亭α组多周期预防潜力突出。 各化疗周期的4级中性粒细胞减少发生率 在安全性方面，两组的不良事件发生率相似，最常见的不良事件为骨痛、恶心和乏力，艾贝格司亭α组的骨痛均为轻度至中度。除了来自于化疗方案的不良事件（例如恶心、呕吐、腹泻、脱发、疲劳等），本研究未报告与药物相关的严重不良事件[1]。 参考文献： [1]John A. Glaspy, Igor Bondarenko, Sergei Tjulandin, et al. Efbemalenograstim Alfa, a Long-Acting Granulocyte Colony-Stimulating Factor Fusion Protein Without PEGylation, Versus Pegfilgrastim for Management of Chemotherapy-Induced Neutropenia in Patients With Breast Cancer: Results of a Phase III Randomized Noninferiority Trial. 2, e2400074(2025). [2]Qingyuan Zhang, Zhonghua Wang, et al. A randomized, multicenter phase III Study of once-per-cycle administration of efbemalenograstim alfa (F-627), a novel long-acting rhG-CSF, for prophylaxis of chemotherapy-induced neutropenia in patients with breast cancerl[J]. BMC Cancer, (2024) 24:1143. [3]Glaspy J, Bondarenko I, Burdaeva O, et al. Efbemalenograstim alfa, an Fc fusion protein, long-acting granulocyte-colony stimulating factor for reducing the risk of febrile neutropenia following chemotherapy: results of a phase III trial[J]. Supportive Care in Cancer, (2024) 32:34. 声明： 1.新闻稿旨在促进医药信息的沟通和交流，仅供医疗卫生专业人士参阅，非广告用途。 2.本公司不对任何药品和/或适应症作推荐。 3.本新闻稿中涉及的信息仅供参考，不能以任何方式取代专业的医疗指导，也不应被视为诊疗建议。若您想了解具体疾病诊疗信息，请遵从医生或其他医疗卫生专业人士的意见或指导。