KT-253

Kymera的转型和进阶：自从暂停两个肿瘤管线的临床开发KT-333和KT-253，专注自免领域以来，一次又一次交出亮眼的成绩。其前瞻性的视野和靶点选择值得后来者学习！   IRAK4 PROTAC KT-474的开发证明了PROTAC技术在自免领域的可行性，第二代产品KT-485的临床结果更是值得期待；     STAT6 PROTAC KT-621的问世更是惊人之作，探寻了小分子药效的无尽可能，没有最低只有更低，挑战单抗生物药的市场地位；    IRF5 PROTAC KT-579虽然还未有数据披露，但相信已被多家药企紧盯。     还有一款即将披露的管线，值得期待...... 下图是JPM上Kymera所公开，通过管线布局，将自免领域各个适应症均占领，可谓是野心勃勃！ 免责声明：本公众号仅代表个人观点，不构成任何学术观点和投资建议。欢迎互相交流学习和转载！欢迎留言讨论。

欢迎大家关注公众号和视频号！ 前言 虽然PROTAC的很多研发面临的挑战已经被充分介绍过了，包括现有临床上PROTAC分子的毒性问题、成药性缺陷、检测挑战等等。 但是今天读到A&Z团队撰写的这篇关于PROTAC临床转化的学到的教训的文章，还是很有共鸣！甚至这篇文章中一些不太起眼的地方都引起我深深的赞同，我也会想起之前的研发经验，也会和上周写的关于insilico的PTMYT1的PROTAC的文章进行比较，最终我总结成了今天的文章，希望对参与降解剂药物研发的同行来说有一些启迪作用。 1. 柔性linker在探索性PROTAC设计中的重要性 目前，临床上的PROTAC分子有超过50个甚至更多。绝大多数都用的刚性或者半刚性的linker。可以看出，刚性的linker对PROTAC的成药性以及口服F%的重要性。 但是在项目早期，柔性链长度的筛选仍然是一种首选的系统方法。linker的柔性允许PROTAC三元复合物存在大量的构象，因此，能增加降解的机会。在评估包含新颖E3和/或POI配体的PROTACs时，柔性linker是很很宝贵。 比如MDM2的AR降解剂的聚乙二醇（PEG）链，以及DDB1-CUL4相关因子1（DCAF1）利用的含溴结构域蛋白9（BRD9）PROTAC（DBr-1）的设计所示。 每个PROTAC在形成三元复合物时，E3连接酶与靶蛋白之间有其最佳的距离，linker太短或太长都不行。所以A&Z团队也建议早期要确定好这个linker的长度。当从Hit到Lead，linker会向更复杂的刚性linker过渡，选择成药性更好、三元复合物效率更高的linker用于后期开发。 2. Hook Effect与协同因子（α） Hook Effect是为数不多的区分单价还是双价分子的指标之一。大家都不想自己的分子带有很强的Hook Effect，以及Hook Effect的window最好比较大，50倍甚至100倍！其实反应Hook Effect的指标有一个公认的参数，叫协同因子α。α是PROTAC的二元与三元复合物解离常数之比（α=Kbinary/Kbinary）。通过优化优化PROTACs的α因子，可以帮助防止钩效应的表现，避免暴露效应关系的复杂性，其中α>1，且越大越好。在基于VHL的LRRK2降解剂（XL01134）的优化中证明了这一点，该降解剂具有Hook Effect。而在XL01134的linker中单个位置的手性异构产生了正协同的PROTAC（XL01126），该分子没有Hook Effect（图3a）。此外，XL01126是比XL01134更快和更有效的LRRK2降解剂，尽管XL01126对VHL的结合亲和力比XL01134低了十倍以上。这个例子体现了协同性的重要性以及linker调节可以产生的深远影响。 但是，话又说回来，Hook Effect虽然常常在体外试验中出现，也对其他试验产生影响，比如蛋白降解谱的条件设置，但是A&Z团队也认为Hook Effect很难在体内试验观察到，所以重要性要小一些。 讲到协同性，它不仅影响到Hook Effect，也影响到降解效率。含PEG的PROTAC 2通过引入苯环刚性化linker，得到了DC50和Dmax更优，更协同的化合物3（图3b,c）。总之，协同性是可以描述三元复合物形成效率的参数。 但是，修改PROTAC的协同性可能无意中影响溶解度和细胞渗透性，从而影响实验结果的判断。在A&Z团队的经验中，通常不直接优化协同性或动力学，而是优化细胞中的功能性降解效应，然后专注于理化性质的优化。怎么说呢？虽然协同性很重要，但是要求在有三元复合物结构的基础上优化，即便如此，三元复合物的构象不一定能真实反应降解的构象。所以，协同性适合用来解释PROTAC的降解活性，但不会用于设计。 3. PROTAC怎么设计Hit分子？ 之前给大家介绍过的英矽智能的PTMYT1 PROTAC文章时，给大家介绍过怎么选择warhead、linker和CRBN的binder。先选择和优化warhead，然后再用现成可用的linker和CRBN的binder去组装成PROTAC。 A&Z团队首先介绍了高通量实验（HTE）方法快速合成PROTAC Hit分子。利用由带有附加linker功能的E3配体组成的预形成的、多样化和多功能的中间体，与相关POI配体共轭合成PROTACs。考虑到药物发现过程中小分子的合成通常是项目进展的关键时间节点，A&Z团队在HTE探索上花了不少力气，不过国内貌似还没怎么用。 此外，A&Z还提到了DNA编码库（DEL）技术，但是这个费用太高了，一般biotech都不太会用。 当然，目前PROTAC的hit分子更喜欢用AI计算+药化设计的方式，更加接地气而且性价比更高。只是，这样也导致了一个PROTAC分子合成周期都很长。 4. PROTAC体内性质的优化 4.1 PROTAC给药剂量并不低 除了DC50和Dmax外，口服药物的体内性质还取决于吸收分数和内在清除率。文章没有提毒性、选择性以及DDI这些指标。重点还是在口服这部分的优化上。 作者提到一个观点与我很契合。在讨论PROTAC比传统小分子抑制剂的优势时，大家以往会提到其中一个优势：由于PROTAC是事件驱动，且胞内存在分子recycle的理论可能性，所以在降低给药剂量和给药频率上可能对小分子抑制剂有优势。但是，这只是大家在YY，目前来看，所有口服PROTAC几乎都是一天一次，只有iv给药的PROTAC考虑到依从性问题，采用QW给药频率，所以给药频率和小分子无异；而在降低给药剂量这个问题上，也没有明显差异。 例如，Arvinas的AR的PROTAC ARV-110（420 mg每日一次）和BMS-986365（300或400 mg每日两次）的剂量范围与直接拮抗剂（如apalutamide 240 mg每日一次、enzalutamide 160 mg每日一次、darolutamide 600 mg每日一次）相当。在靶向ER的PROTAC ARV-471案例中，其III期剂量（200 mg每日一次）高于选择性ER调节剂tamoxifen（通常20-40 mg每日一次）。尽管目前可比较的靶点有限，但考虑到PROTAC的高效降解效力及较低的靶标占有率需求相比，这一结果明显与预期不符。这些结果暗示PROTAC的高剂量需求可能源于吸收分数低和/或内在清除率高。另外，我还得加一句，高PPB也是导致临床给药剂量高的原因之一。 文章还提到，由于PROTAC分子的低溶解度和高非特异性结合（NSB）特点，体外常规筛选方法会面临挑战，需要我们注意试验条件，比如不同批次的血清、不同浓度血清，药物是否溶解，这都会影响游离药物浓度。这也是我们利用体外药效外推动物有效剂量时出现较大偏差的原因之一。 另外，计算的结果和实测结果往往也有一些偏差，比如PROTAC的理化性质（如总极性表面积tPSA和计算分配系数clogP）常显著偏离实验极性和脂溶性评估结果。这归因于分子量增大及分子内相互作用导致的构象集合复杂性，可能根据环境隐藏或暴露极性，这种现象被称为分子变色龙性。 总之，不能只依赖于计算！不然，最后你的分子可能会送你一个大大的惊喜。 4.2 PROTAC的溶解度问题 溶解性和渗透性筛选常作为药物筛选流程的早期环节。首先，有一个争议点是用动力学方法还是热力学方法去测溶解度。由于水溶性差，所以混悬液给药的方式很难用动力学溶解度的结果预测胃肠道的溶解情况，所以澄清溶液给药的方式更适合PROTAC，另外还需要考虑胃肠道析出的问题。 使用生物相关介质被视为更贴近口服吸收的模型系统，部分临床分子在模拟胃液和/或进食状态模拟肠液中的溶解度提升超100倍。这一溶解性增强与ARV-110和ARV-766在临床前及临床研究中观察到的食物促进吸收效应一致。 最后，在优化溶解性时，调节linker的质子化潜力是一种策略。例如，引入含氮杂环作为AR降解剂ARD-69开发中的增溶策略。 4.3 PROTAC的渗透性问题 PROTAC的渗透试验是迄今为止遇到的最难搞的试验之一，经常两侧的回收率很低，而且渗透系数测不准，被低估。我之前专门写过一篇文章讲过PROTAC的渗透性检测问题，感兴趣的可以去看看：Caco-2模型过时了！默克团队揭示PROTAC药物的口服吸收新模型这篇文章。 当然，A&Z他们也是知道PROTAC的渗透性检测问题的。比如PROTAC的低溶解度、NSB及固有低渗透率常阻碍PROTAC的表观渗透性（Papp）测量结果解读。针对脂溶性化合物的MDCK实验优化条件虽然已有报道，但其他团队指出PROTAC的Papp值与体内吸收相关性较差。类似地，针对NSB问题的改良方法（如接收室乙腈洗涤）未能提升预测价值。 当然，即便如此，大家还是依赖MDCK以及Caco-2去测，虽然渗透系数可能会低估，但是外排率还是准确的，你说搞不搞笑？当然，还有添加BSA和预孵育的方法都在上面提到的文章中阐述过了，效果不佳，像六脉神剑，时灵时不灵。 在缺乏有效渗透性测定方法时，基于理化性质的多参数评分（MPS）策略被探索用于PROTAC。例如，DeGoey团队提出的AB-MPS方法（基于计算logD、可旋转键数nROT和芳香环数nARO）适用于超越五规则（bRo5）化合物。Maurer团队则提出基于计算性质（分子量、tPSA、HBD/HBA、nROT/nARO）的MPS方法，虽基于小数据集但仍具预测价值。Baylon团队在BPI方法基础上引入最小最大分子内距离（SMID）参数以估算截面积，提升预测性。该参数考虑了PROTAC柔性linker在亲水或疏水环境中构象变化（球状至棒状）对渗透性的影响。计算SMID参数预测，在相同条件下，棒状PROTAC的渗透性和口服生物利用度更高。NMR和分子动力学模拟显示，VHL/CRBN靶向PROTAC的动态linker折叠与IMHB形成可增强PAMPA渗透性。 提到改善渗透性的策略，作者提到了几个方法。一种策略是通过减少构象灵活性并增强linker刚性。例如，VHL靶向BRD4降解剂中观察到的linker折叠可诱导更紧凑的构象集合，从而改善口服生物利用度。ARV-766（图5）展示了三种HBD类型： 变色龙HBD（红色阴影NH及方框）：增强水溶性和渗透性； 弱溶解性分子内HBD（紫色阴影NH及方框）：对溶解性和渗透性影响较小； 强溶解性分子内HBD（橙色阴影NH及方框）：降低渗透性但提高溶解度。临床口服PROTAC（如ARV-110、NX-5948、NX-2127）中变色龙HBD的普遍存在表明其作为性质调控策略的有效性。 外排转运体底物这部分偶尔会有人提到，这部分需要引起重视。虽然不一定会因为是转运体底物导致口服受到影响，但是透脑以及DDI的问题就有可能影响药效或者毒性。 4.4 PROTAC的linker的代谢问题 PROTAC的结构复杂，所以PROTAC的代谢特性反映的是分子整体特性而非组成配体的特性。即使引入代谢稳定性较差的配体，PROTAC整体未必表现出较差的代谢稳定性，因为脆弱位点可能被掩盖。 鉴于PROTAC通常比其对应的小分子POI配体具有更高的亲脂性，其代谢内源性清除率可能预期会升高。 尽管单个PROTAC可能呈现多种代谢途径，但linker的化学性质与长度已直接关联到代谢稳定性（目前研究多限于线性PEG和烷基链案例）。因此，刚性化策略被用于降低代谢风险。例如，在BTK抑制剂系列研究中，初始基于PEGlinker的先导化合物在小鼠肝微粒体中半衰期仅为1.3分钟，而优化后的类似物通过将PEGlinker替换为乙基连接的双哌啶结构，半衰期提升至>145分钟。 值得注意的是，PROTAC分子中的linker断裂还是可能发生的，如14C标记的ARV-110。通过linker断裂的代谢可能生成与母体分子高度相似的代谢物，且这些代谢物可能保留靶蛋白结合能力。此类代谢物可能通过竞争性结合靶蛋白或E3连接酶抑制PROTAC功能，减少三元复合物形成。同时，有药理活性的代谢产物也是有可能出现的，可能会导致pk/pd数据可能对不上。 所以，筛选可最小化linker断裂和固有代谢风险的linker选项，既能降低具有药理活性代谢物的复杂性，又可减少给药剂量。 5. PROTAC的linker的药化挑战 就算现在AI驱动药物设计的兴起，A&Z和我们大多数人的想法一致，PROTACs的优化通常是药化学家的经验性方法主导。 初始linker探索常采用全碳链、含醚链或聚乙二醇（PEG）链等柔性链，以确定最佳长度和连接位点。随后，对于CRBN基PROTACs，linker设计进一步趋向构象限制，常通过环状系统（如单亚甲基连接的哌啶、哌嗪或吡咯烷体系）减少柔性，从而提升效力、选择性和物理性质。引入碱性基团（通常通过取代基调节pKa值）是linker设计的另一个主题，旨在改善口服生物利用度，同时平衡水溶性与渗透性。 以哌啶、哌嗪和吡咯烷为代表的杂环刚性化策略在口服临床阶段PROTACs中广泛应用（如ARV-471、ARV-110、ARV-766、BGB-16673、NX-2127和NX-5948，见下图）。 类似策略使临床前BET蛋白降解剂在小鼠模型中表现出良好口服生物利用度，并为AR降解PROTACs提供了优异的体内药代动力学（PK）特性。随着PROTACs数据集的积累，Arvinas（基于计算吸收分数fa × fg，其中fa为肠道吸收分数，fg为肠道首过代谢逃逸分数）和阿斯利康（基于口服生物利用度）的研究揭示了PROTACs整体及个体理化性质对临床前物种口服吸收的关键影响。两项研究均表明，控制“未满足”或溶剂暴露的氢键供体（HBDs）数量（理想情况下≤2）是核心参数，这一标准严于Lipinski五规则（Ro5）的≤5 HBDs要求。该经验性发现解释了为何临床候选分子中CRBN基（1 HBD）E3配体占比高于VHL基（2-3 HBDs）配体。其他性质如暴露的氢键受体（HBAs）、极性表面积（ePSA）和亲脂性（正辛醇-水分配系数clogP）可能超出Ro5和韦伯极限（10 HBAs、140 Ų、clogP≤5.0）。 6. 临床中PROTACs的教训 针对使用CRBN作为E3的PROTACs，早期PROTACs采用基于IMiD（如来那度胺衍生的ARV-471或泊马度胺衍生的ARV-110）的基序，尽管存在潜在新底物降解活性、化学稳定性和差向异构化等挑战。随后开发了通过修饰连接子解决部分问题的谷氨酰亚胺类似物（如通过IMHB模拟IMID药效团结构的ARV-766、NX-5948，或含咪唑酮的KT-474、KT-253，以及含苯胺的BMS-986365、CFT-8634）。更近期，完全消除消旋化潜力的二氢尿嘧啶基序被引入（如BGB-16673、CFT-1946），反映了PROTACs适配连接酶的进化。 但是，对于大多数药企而言，度胺仍旧是一个简单实用的选择。 图7展示了临床PROTACs的选定案例，重点呈现linker变化如何推动其向临床候选药物发展。所使用的linker代表了各PROTAC项目化合物筛选的顶峰，可能经历了广泛优化，体现了性质的最佳平衡。 对于PROTAC而言，最难的仍旧是口服吸收的优化。构象刚性化、引入温和碱性氮原子、以及移除或屏蔽氢键供体（HBD），成为临床级PROTAC连接子设计的共性策略。然而，PROTAC的三个核心组分（POI配体、连接子、E3配体）通常需协同优化而非孤立调整，以实现整体性质的最佳平衡。 6.1 ER靶向PROTACs的临床进展 靶向ER的PROTAC ARV-471源自多轮ER和E3配体筛选，最终获得苯并噻吩衍生物8（图7Aa），其DC50和体内暴露数据表现优异。连接子优化包括将E3连接位点从6位取代改为5位取代，并移除一个HBD，得到聚乙烯链连接的降解剂9。由于脱靶降解GSPT1，需替换ER配体并在连接子中引入哌嗪，得到四氢萘衍生物10。该化合物在MCF-7异种移植模型中显示体内活性，但代谢特性欠佳。将正戊氧基链替换为构象受限的哌啶基团后，最终得到临床候选药物。值得注意的是，PROTAC的ER配体、E3连接位点及连接子组成在优化过程中均被调整。晶体和溶液NMR结构显示，刚性连接子显著限制了分子构象（图7Ab）。 6.2 BTK与BRAF靶向PROTACs的挑战 Nurix Therapeutics开发的NX-2127通过PROTAC和分子胶双重机制同时降解BTK和IKZF1/3（图7B）。先导化合物11源自BTK DEL命中与沙利度胺衍生的CRBN配体库的连接子组合。通过刚性化连接子并将连接位点移至CRBN的5位取代，得到细胞活性增强的NX-0492。然而，其口服生物利用度低，需进一步优化。最终通过保留优化后的连接子并移除脲基团，得到NX-2127，其口服生物利用度和体内活性显著提升。 6.3 BRAF-V600E降解剂的开发 BRAF突变（如V600E）导致激酶结构域持续活化，驱动MAPK通路异常。针对BRAF抑制剂耐药问题，C4 Therapeutics开发了选择性BRAF-V600E降解剂。从喹唑啉酮核心出发（优于初始的吲哚类先导化合物），通过三元复合物建模优化连接子刚性，最终得到CFT-1946（图7C）。其连接子进一步环化并引入炔烃，显著提升口服生物利用度。 6.4 IRAK4降解剂的创新设计 IRAK4通过myddosome复合物调控促炎信号，但其抑制剂面临选择性和疗效限制。KT-474是首个非肿瘤适应症口服PROTAC IRAK4降解剂，针对自身免疫疾病。为消除CRBN分子胶的脱靶降解风险，Kymera Therapeutics将芳环基团通过融合环脲基团靠近CRBN（图7D），同时保留关键谷氨酰亚胺相互作用。连接子优化中，13原子PEG链被证明最佳，引入环己胺基团后进一步改善渗透性，最终得到大鼠口服生物利用度12%的KT-474。当然，KT-474目前已经被淘汰了。 参考文献 1. Pike A, Lee ECY, Michaelides IN, Schade M, Sharma A, Scott JS, Srivastava A. Lessons learned in linking PROTACs from discovery to the clinic. Nat Rev Chem. 2025 Dec 12. doi: 10.1038/s41570-025-00784-6. Epub ahead of print. PMID: 41388140. 公众号合作CRO（火热招募中）： 蛋白降解选择性 惟妙生物 惟妙生物的蛋白组学平台在研究TPD药物（PROTAC、分子胶）在人和动物细胞上的蛋白降解谱上有丰富的经验。 了解平台详情，请点进下方图片进入超链接： 【深度技术解析】：定量蛋白质组学在降解剂中的应用】： 2025-11-13 CNS药效 1. 圣研生物 圣研（天津）生物科技有限公司具有多年神经类药物药效评估的经验，可提供模型鼠造模及繁育服务以及行为学研究、渐冻症、AD、PD、SMA动物药效学评价。 了解平台详情，请点进下方图片进入超链接： 如有测试需求，请联系高老师：15001299642 小鼠鞘内给药及滴鼻给药案例展示 2025-11-13 注：公众号持续招募药物研发领域的合作方，例如类器官平台、体外药效、毒理等合作伙伴，有意者请添加下方微信，欢迎大家和我合作。 加入读者交流群： 请大家加微信入群（需备注姓名+擅长领域+单位）： 公众号合作：产品宣传及软文插入，或者寻找项目（请有意者加我微信沟通：15210922780）