Praluzatamab ravtansine

点击蓝字 关注我们 摘要 尽管现有主流观点认为，抗体药物偶联物（ADCs）能够提高强效细胞毒性载荷的最大耐受剂量，同时降低其最低有效剂量，但越来越多的临床证据表明，ADCs的耐受剂量与相关小分子药物的耐受剂量并无显著差异。然而，当以接近或达到最大耐受剂量给药时，某些ADCs确实显示出更好的疗效。了解这类生物治疗药物所面临的挑战和机遇，将有助于改进下一代ADC的设计。 引言 ADC疗法在近几十年来发展迅速，全球已有12款产品获批上市，另有超过140种ADC正处于临床试验阶段。分析人士预计，到2030年，ADC市场规模将超过150亿美元，从而极大地推动该领域关注度的提升。ADC背后的理论简单而精妙：通过结合单克隆抗体的特异性与强效小分子药物的细胞毒性，ADC能够精准地将毒素递送至肿瘤，同时避免损伤正常组织，从而增加药物的治疗窗口。支持这一理念的临床前数据表明，将药物与抗体偶联后，可以降低该药物的最低有效剂量（MED），并提高其最大耐受剂量（MTD）。相反，临床数据却与这一观点并不一致。我们认为，在根据细胞毒性载荷含量进行标准化校正后，人类中 ADCs 及其相应小分子的 MTD 在细胞毒素含量归一化后大致相同。因此，几乎所有关于ADC的综述和文章中广泛传播的治疗窗口扩大概念（图1A）是不准确的。值得注意的是，当给药剂量接近或达到其MTD的剂量时，某些ADC在患者身上表现出的治疗应答显著优于未偶联的小分子药物。 ADC真的能比小分子药物达到更高的最大耐受剂量吗？ 药物的MTD是在无严重副作用（即剂量限制性毒性）所能耐受的最高剂量。从历史上看，确定MTD曾是肿瘤学I期临床试验的主要目标。而近年来，尤其是针对新型靶向药物（包括 ADC），重点在于确定推荐的 II 期推荐剂量（RP2D），因为后者能更好地反映经过多个治疗周期后出现的慢性毒性（例如水肿、积液、肺炎、眼部毒性），以及某些2级副作用（如腹泻、黏膜炎、血细胞减少、神经病变、严重疲劳），这些副作用可能随时间推移变得难以耐受。 目前获批或临床开发中的 ADC 使用的有效载荷与过去几十年发现的高细胞毒性小分子结构密切相关，其中许多此前曾作为独立化疗药物进行评估。比较小分子和 ADC 的临床剂量需要转换为统一单位，以考虑分子量和药物与抗体比（DAR）的差异。因此，考虑到该单元在广泛受众中熟悉，所有 MTD/RP2D 值均转换为细胞毒素含量的 mg/kg。 图 1B 汇总了 10 种已批准的 ADC（按偶联药物归一化）及与偶联药物密切相关的临床评估细胞毒性药物的 MTD/RP2D 值。图 1C 和表 1 对处于活跃临床开发阶段、并已确定 MTD/RP2D 值的 ADC 进行了全面分析，将 ADC 与小分子药物换算为同一单位后可表明，ADC 没有能够通过提高MTD来显著扩大治疗窗。ADC 并未显著提高其药物载荷的MTD这一认识，或许能为该领域现有的一些观察结果提供解释： (1) 采用通用药物连接子的ADC，往往会因有效载荷相关的平台毒性而出现相似的MTD，且这种毒性与靶抗原无关。这表明，大多数脱靶不良事件与抗体无关。 (2) 由于抗体与靶点在正常组织中的结合而导致的“非肿瘤靶向性毒性”较为常见。 在此情况下，其MTD可能低于采用相同药物连接子的其他ADC。例如，Dato-DXd（一种靶向 TROP2、DAR 为 4 的 DXd-ADC）无法达到与其他含 DXd 的 ADC（如 T-DXd、HER3-DXd、 B7H3-DXd、CDH6-DXd）同等水平的细胞毒性剂量，这很可能是由于正常组织中 TROP2 的表达导致了药物相关不良事件（如皮疹、口腔炎和黏膜炎）。在接受其他 TROP2 靶向 ADC 治疗的患者中，也观察到了类似的皮肤和口腔黏膜毒性反应。 (3) 旨在限制与健康组织结合的工程化 ADC（例如 CX-2009、CX-2029、BA3011、BA3021）在标准化MTD方面，并未优于采用相同药物连接子的经典 ADC。 (4) 在某些情况下，降低ADC的DAR虽会导致其耐受剂量大致成比例地增加，但在按细胞毒素量进行标准化后，改善效果微乎其微。例如，ALT-P7（DAR2 MMAE ADC）的标准化MTD与其他 DAR4 MMAE ADC相当。 同样，B7H3-DXd（DAR4）与其他 DAR8 DXd ADC之间也无显著差异。 尽管有些出人意料，ADC普遍被认为能扩大其有效载荷的治疗窗口，但临床数据明确显示，其最大耐受剂量并未增加。此前已注意到 T-DM1 及其相关小分子药物美登素在临床和临床前研究中的耐受性存在差异。这一十年前的开创性观察结果，如今已通过近 40 种活性 ADC 的临床数据得到了印证，这些 ADC 涵盖了七大类有效载荷（图1B 和 1C；表 1）。 图 1  临床 ADC 和小分子 MTD 分析促使对治疗窗口教条的修订 （A）常见的 ADC 治疗窗口示意图（红框）。ADC更宽治疗窗口的概念似乎基于临床前证据而非临床结局。ADC 治疗优势的修订表示（绿色框）。ADCs 并未显著提升耐受剂量，但在 MTDs/RP2Ds 下，其疗效优于相关的小分子游离药物。 （B）10 个经核准的 ADC 经细胞毒性归一化后，与相关小分子的人类 MTD/RP2D 值图示。 （C）通过细胞毒性含量（可获得的数值）与相关小分子进行比较，进行人类 MTD/RP2D 活跃临床开发中的人类 MTD/RP2D 值的图像表示。 为什么有效载荷和 ADC 的 MTD 值没有明显变化？ ADC 为何无法提高其有效载荷的MTD，其原因至今仍不明朗。 一种可能的解释在于，抗体在保护偶联药物免受清除和代谢方面发挥着关键作用。简而言之，“足量”的有效载荷会附着在抗体上，直到 ADC 通过靶向和非靶向介导的细胞摄取及代谢过程释放游离的有效载荷或其代谢物，而这些物质随后会通过常规的小分子代谢途径被清除。 ADC 的药物连接子还可在血浆中或肿瘤微环境中发生胞外裂解，从而在无需 ADC 先被内吞的情况下，为循环系统提供有效载荷的直接来源。尽管新一代 ADC 采用的连接子比早期一代更稳定，但一些有效的 ADC（包括已获批的 ADC）所使用的连接子在血浆中的半衰期相对较短。 例如，戈沙妥珠单抗（sacituzumab govitecan）含有一个不稳定的碳酸盐连接子，该连接子可在血浆中释放其有效载荷（SN-38），其半衰期约为 20 小时。 通过巯基-马来酰亚胺化学合成的 ADC（目前已获批或正在研发的 ADC 中绝大多数属于此类）可发生整个药物连接子与抗体的解偶联。这一过程被称为逆迈克尔反应，对于连接子中含有马来酰亚胺己酰（MC）基团的 ADC 尤为重要。 典型例子包括 T-DXd 及其他deruxtecan-ADC、vedotin-ADC，以及许多其他处于研发阶段的 ADC（见图 1C 中的“锚定基团”）。对于这些ADC，多达 50%–75%的药物连接子会在约7天内于血浆中脱偶联，而脱偶联的药物连接子会迅速与血浆中含巯基的分子（主要是白蛋白）反应，形成新的偶联物。白蛋白在人体内的半衰期较长，因为它与 IgG 一样，可通过与 FcRn 结合而被主动回收。 因此，有效载荷不会立即释放到循环系统中，而是会一直保留在血液中，直到白蛋白结合物被代谢。药物-连接子从ADC向白蛋白的转移，可能通过白蛋白结合物的非特异性分布以及延长有效载荷半衰期，导致某些毒性反应。相反，它也可能通过白蛋白结合物被肿瘤直接摄取，并且逐渐代谢以在循环系统中释放有效载荷，从而促进抗肿瘤疗效。由于白蛋白在临床前模型中的生物学特性与人体环境存在显著差异，因此目前仍难以准确评估白蛋白在与药物-连接子解偶联相关的毒性和/或疗效中的作用。 ADC是否比其搭载的载荷更加优异？ 迄今获批的 12 种 ADC 充分证明了这一类治疗药物的重要性，而 DESTINY-Breast03 和 DESTINY-Breast04 试验的最新数据则凸显了 T-DXd 改变乳腺癌治疗范式的潜力。 另一方面，超过 100 个已终止的 ADC 项目表明，要找到抗体、靶点、药物连接子、药物-抗体比（DAR）和适应症之间的正确组合以开发出成功的治疗药物，仍面临巨大挑战。 在肿瘤学临床试验中， MTD传统上被视为药理活性剂量的最相关替代指标，而MED则完全不予确定。疗效（而非 MED）是Ⅱ期和Ⅲ期临床试验的终点，在此阶段，患者接受的治疗方案是根据Ⅰ期试验确定的剂量方案进行的。 20 世纪 70 年代， FDA对抗癌药物的批准主要基于客观缓解率（ORR），但自 20 世纪 80 年代初以来，批准依据已转向更直接的临床获益证据，包括无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的改善。 这些参数仅针对单一方案（或极少数不同方案）确定，通常在MTD或推荐剂量（RP2D）下进行。尽管ORR并不总能预测生存获益，但肿瘤科医生普遍认可将肿瘤反应评估作为指导癌症治疗的依据，因为 ORR 可直接归因于药物效应。ORR 也是支持 FDA 加速批准的最常见替代终点。 鉴于 ORR 常被用作早期 ADC 试验的主要终点，且过去三到四十年间开发的小分子药物均有ORR 数据，我们对比了小分子药物和 ADC 在治疗类似患者群体时的 ORR（图 2）。 迄今为止，尚无直接将ADC与其载荷进行头对头比较的随机试验。最接近的示例来自DESTINY-Gastric01试验中的T-DXd（携带拓扑异构酶I抑制剂载荷DXd），该试验中医生自选药物对照组的大多数患者（约90%）接受了伊立替康治疗，后者与DXd同属拓扑异构酶I抑制剂类药物；T-DXd治疗组报告的ORR为42%，而医生选择组为12.5%。对于其他几种肿瘤类型，已有跨试验数据可用于定性比较ADC与相关小分子药物。在比较不同试验时，推论应谨慎对待；然而，已有足够的临床数据可以得出结论，即多种ADC显示出优于相关小分子疗法的客观缓解率（图2）。 图 2 ADC 相较于相关小分子显示出更高的疗效 （A）乳腺癌、（B）胃癌、（C）尿上皮癌和（D）非小细胞肺癌中，选定 ADC（蓝色）及相关小分子（粉色）的ORRs。ADC 部分响应，浅蓝色; ADC 完全响应，深蓝色; 小分子部分反应，浅粉色; 小分子完全反应，深粉色。 ADC的成功有哪些机制？ 小分子药物与抗体偶联后，其药代动力学（PK）特征发生了根本性改变。ADC延长了细胞毒素的半衰期，包括通过保护其免受肾脏清除而实现。另一方面，ADC也面临着与其他生物制剂类似的问题，这些问题限制了其在肿瘤中的穿透和蓄积。这些问题包括显著的靶向肿瘤但脱靶摄取和非特异性清除、经毛细血管壁外渗受限、因肿瘤间质液体压力升高导致在肿瘤团块内扩散困难，以及“结合位点屏障”现象（抗体与其靶点的结合速度快于其扩散速度，从而阻碍了更深层的穿透）。对于未偶联的抗体而言，部分障碍可通过增加给药剂量来克服，但这一策略不适用于ADC，因为偶联的细胞毒素决定了其最大耐受剂量。事实上，已有报道称，进入人体的ADC中不足1%能够到达肿瘤，其余部分可能导致非预期的毒性。因此，仅凭ADC的肿瘤靶向性可能不足以解释其相较于相关小分子药物在疗效上的改善。 Tarcsa及其合著者分析了已获批ADC的群体药代动力学模型，重点关注循环中游离载荷的作用。他们得出结论认为，ADC可能依赖其他机制来发挥疗效，包括载荷在循环中以有效水平持续释放。ADC载荷的血浆稳态浓度通常高于实验测定的游离药物半数最大有效浓度。抗原表达和ADC自身特性会影响ADC的药代动力学和分解代谢，进而调控载荷释放的速率和位置，继而影响游离载荷的血浆水平和肿瘤浓度。因此，载荷的旁观者效应程度、偶联化学技术（对去偶联的敏感性）以及连接子类型（可裂解或不可裂解）均是关键的设计参数。目前正在进行的针对已知抗原、但采用不同偶联方式或不同载荷的ADC临床试验，有助于揭示哪些ADC特征可在维持可接受耐受性的同时提高疗效。 疗效与表达之间的相关性提示了其他机制的存在。 近期来自不同肿瘤抗原表达水平患者的临床结果支持了以下观点：循环中的载荷可产生基线抗肿瘤效应。例如，许多ADC在肿瘤抗原表达较低甚至阴性的患者中均已显示出疗效。虽然不能排除不同肿瘤对载荷的敏感性差异、抗原定量不精确或某些数据集的样本量较小等因素可能是这一现象的其它来源，但对于某些ADC而言，循环中的载荷浓度足以引发治疗应答是合理的。抗体靶向组分（即ADC直接递送）可在游离细胞毒素提供的基线活性基础上增强疗效，尤其是在高抗原表达的肿瘤中。这一假设通过对HER2阳性乳腺癌脑转移患者中曲妥珠单抗、T-DM1和T-DXd试验数据的比较得到支持：在DESTINY-Breast03试验的亚组分析中，T-DXd和T-DM1的颅内ORR分别为64%和33%，而在独立试验中，曲妥珠单抗未产生客观缓解。完整的血脑屏障（BBB）可阻止抗体穿透，但根据小分子的理化性质，可能不会限制小分子通过。尽管其他因素也可能影响血脑屏障穿透，但循环中的T-DXd的细胞毒性代谢物（即DXd，具有穿透相容性）和T-DM1的代谢物（即DM1和Lys-MCC-DM1，穿透相容性较差）相较于曲妥珠单抗（无细胞毒性代谢物）在穿透能力上的倾向性，可能是观察到的脑转移灶活性差异的最佳解释。 即使仔细考虑了不同 ADC 的结构和特性，也很难理清相似但不同的 ADC 临床益处的起源。 结论与展望 日益增长的上市ADC产品清单表明，将合适的靶点、抗体、偶联方式、药物抗体比（DAR）、连接子、载荷和适应症相结合以生成临床有用药物是可行的。然而，尽管当前ADC在多种肿瘤疾病状态中具有广泛的多样性，但并未显著提高其偶联药物的最大耐受剂量。因此，仍有充分的机会去探索可能进一步提升疗效和耐受性的机制。以下是针对该领域的一些关键考量及其启示： (1) 如果载荷、连接子、药物抗体比（DAR）和偶联方式均未改变，那么该ADC的耐受剂量至多与其他采用相同技术平台制备的ADC相似（即平台毒性）。 (2) 在多类药物中观察到的ADC与相关小分子具有大致相当的MTD，这一现象直观上易于接受，但较难从机理上加以合理解释。尽管ADC与小分子药物的药代动力学存在巨大差异，但在耐受性的相似性上是否有其解释？ (3) 已有研究成功利用替代给药方案在维持ADC疗效的同时降低了安全性风险。这表明，深入开展药代动力学/药效学（PK/PD）分析对于优化ADC的临床给药策略至关重要。 (4) 更好地理解临床有效ADC的作用机制（抗体靶向递送、循环中持续的游离药物浓度、白蛋白转移，或多种机制的组合）以及ADC结构组分与其PK/PD之间的相互关系，对于指导下一代ADC的设计具有重要意义。 (5) 需要更具预测性的体外和体内模型，以提高临床转化能力。当前的工作流程可能会筛除掉那些本可成为成功药物的化合物，或选出性质欠佳的候选药物。 (6) 新型ADC偶联位点、偶联化学技术和连接子技术被寄予厚望，认为可提高MTD，其依据通常是更好的稳定性带来了临床前耐受性的提升，但这一点尚未得到临床证据的支持。这些新型ADC的临床试验结果将最终验证这些解决方案能否成功超越现有技术。 (7) 针对携带微管蛋白抑制剂的ADC中已明确认知的平台毒性，已有大量工作通过修饰偶联方式或载荷本身来加以改善。尽管这些策略在限制血液学毒性方面取得了一定成功，但由于出现了新的问题（包括眼毒性和肺毒性），未能显著提高MTD。理解并克服此类组织特异性损伤的根源，可能有助于进一步逐步提升MTD。 (8) 通过结构修饰改变载荷的效力，可能会改变药物的治疗窗口，但不一定能拓宽治疗窗口。探索具有更优“类药性”的载荷（如溶解性、通透性、代谢稳定性和转运体底物特征等），可能有助于改善ADC的临床淘汰率。 (9) 应根据肿瘤类型、定位以及相对于正常组织的抗原表达水平来匹配抗体与载荷，以使ADC能够以足够高的水平给药，从而克服非肿瘤组织对抗原的“汇入”效应（即抗原沉没）。 (10) 已开发出携带新型载荷类别的抗体偶联物，包括类固醇、PROTACs、TLR激动剂、STING激动剂、病毒肽和RNA。这些新型偶联物的临床数据有望拓宽抗体递送的应用范围。尽管前景可期，但脱靶效应也可能干扰这些新型药物模式。例如，携带TLR激动剂的免疫刺激抗体偶联物（ISACs）尚未达到预期，四种治疗候选药物中有三种已终止临床开发。 (11) 已有大量研究表明，多种ADC载荷可诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。这种免疫刺激现象是一个相对较新的研究领域，有望影响ADC领域的未来发展方向。然而，我们对载荷诱导ICD的理解仍是空白。 (12) ADC与免疫检查点抑制剂（ICIs）或其他细胞毒性药物的联合用药已成为热门趋势，因为这为患者提供了针对单一药物产生多种应答的可能性。尽管已观察到临床获益，但重要的是要明确该效应是由协同作用、叠加作用还是独立药物作用所致。迄今为止，尚无临床证据表明ICIs之间或ICIs与其他药物之间存在协同甚至叠加的相互作用，但更好的生物标志物和患者筛选可能有助于改进包括ADC在内的药物联合治疗策略。 Reference： Raffaele Colombo and Jamie R. Rich, Cancer Cell, 2022, 40: 1255-1263. The therapeutic window of antibody drug conjugates: A dogma in need of revision.

“ 点击蓝字 关注我们 张娟 中国药科大学教授、博士生导师，现任中国药科大学生命科学与技术学院生物药物系主 任。中国药科大学与英国帝国理工学院联合培养博士、美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）访问学者。先后入选江苏省教育厅“青蓝工程”中青年学术带头人、江苏省委组织部“333工程”第三层次培养对象。同时，担任江苏省生化与分子生物学学会理事、江苏省药学会生物技术与生物药物专委会委员、中国医药生物技术协会单克隆抗体专委会委员、中国生化制药工业协会重组药物分会委员，曾获中国药学会青年生物药物科学家奖等荣誉。张娟教授带领的抗体工程实验室深耕抗肿瘤抗体药物领域，主要开展单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物等药物的研究与开发工作；主持国家自然科学基金等多项国家及省部级项目，广泛开展多方位校企合作。以第一作者或通信作者身份在Cancer Res、APSB、Cancer Lett等SCI期刊发表论文60余篇，授权国家发明专利10余项。 抗体偶联药物中抗体组分对其治疗窗口的影响及工程改造策略 PPS  李英杰 ，崔子悦 ，谢家骏 ，张娟* （中国药科大学生命科学与技术学院抗体工程实验室，江苏 南京211198） [摘要] 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate ，ADC）以其高效精准靶向的优势成为抗肿瘤药物研发的热点。然而，ADC 的瘤外靶向结合、非特异性摄取等因素使其安全治疗窗口受限，多款 ADC 的研发进程止步于临床试验阶段。立足肿瘤治疗领域，阐述抗体组分对 ADC 治疗窗口的影响，并重点总结当前拓宽 ADC 治疗窗口的抗体工程改造策略，为新一代低毒高效 ADC 的研发提供参考。 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate ，ADC）是目前生物药物研发中最活跃的研究领域之一。其分子结构由抗体、连接子和毒素载荷构成 ，整合了抗体的靶向特异性与毒素载荷的高效杀伤性 ，相较于传统化疗药物具有增效减毒的显著优势。 2000 年 ，全球首款 ADC 吉妥单抗经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration ，FDA）批准上市 ，用于急性髓性白血病的治疗。此后 ，多款靶向不同靶点的 ADC 相继研发成功并获批上市。截至2025 年 12 月 ，全球已有 21 款 ADC 获批上市；据智慧芽新药情报库统计 ，另有 3 款 ADC 已提交上市申请 ，394 款 ADC 处于临床试验阶段。全球 ADC 市场规模亦呈持续增长态势 ，Vantage Market Research 分析报告显示 ，2024 年全球 ADC 市场估值达 94 亿美元，预计 2035 年将增至 212.7 亿美元[1]。 首款 ADC 吉妥单抗曾因安全性问题于 2010 年退市 ，后于 2017 年重新获批上市。随着 ADC 研发技术的不断进步，新一代 ADC 的成药潜力显著提升。抗体组分的人源化程度逐步提升，从尚无获批 ADC 产品的鼠源单克隆抗体（monoclonal antibody ，mAb），发展至免疫原性更低的嵌合抗体（如本妥昔单抗）和人源化抗体（如恩美曲妥珠单抗）； 连接子的体内稳定性持续增强 ，偶联方式从吉妥单抗所采用的、体循环中易解离的 pH 敏感连接子与抗体上赖氨酸残基随机偶联，发展为德曲妥珠单抗所采用的、稳定性更高的蛋白酶敏感连接子与抗体链间二硫键旁半胱氨酸残基定点偶联 ；毒素载荷的疏水性逐步降低 ，由吉妥单抗采用的高疏水性卡奇霉素类载荷 ，升级为德曲妥珠单抗所采用的低疏水性喜树碱类载荷[2]。尽管 ADC 在研发技术层面已取得上述突破 ，目前仍有部分 ADC 分子因治疗窗口过窄止步于临床试验阶段[3]。 抗体组分在 ADC 总分子量中占比通常高达90%以上，其不仅对 ADC 的体内分布与肿瘤摄取过程产生重要调控作用 ，还可影响毒素载荷的释放速率与释放位点 ，进而直接决定 ADC 的治疗窗口范围。mAb 药物通常通过阻断肿瘤驱动信号通路、激活先天免疫等途径发挥抗肿瘤活性，ADC 的作用机制则与之不同，毒素载荷的有效释放是其实现抗肿瘤作用的关键途径。基于该作用机制差异 ，直接将传统 mAb 作为 ADC 的抗体组分 ，未必能获得理想的治疗指数。 目前已上市及处于临床试验阶段的多数 ADC，其抗体组分均直接采用传统野生型免疫球蛋白 G1（immunoglobulin G1，IgG1）抗体 ，或仅对与偶联相关的氨基酸残基进行简单改造。但野生型 IgG1 抗体可通过多种途径被正常细胞非特异性摄取并清除，进而导致 ADC 毒素载荷的非靶向释放 ，引发脱靶毒性和副作用[4]。近年来 ，随着ADC 偶联技术的不断发展 ，多种高稳定性的偶联策略被相继开发 ，如 Thiomab 技术（代表性偶联位点包括HC-S239C[5]、LC-V205C[6]）以及马来酰亚胺接头开环策略[7]等 ，均可使毒素载荷在体循环中与抗体稳定结合。通过此类策略制备的 ADC 在血液循环中几乎无毒素载荷脱落 ，与传统马来酰亚胺-巯基反应随机偶联制备的 ADC 相比，其毒素载荷的释放途径与体内摄取清除过程的关联性显著增强 ， 因此对抗体组分介导的体内分布与肿瘤摄取的特异性提出了更高的潜在要求。 本文聚焦抗体组分对 ADC 治疗窗口的关键影响，着重阐述抗体组分通过调控 ADC 体内分布与肿瘤摄取过程影响其安全性和有效性的作用机制 ，并系统总结拓宽 ADC 治疗窗口的抗体工程改造策略。 1 抗体组分的体内分布对ADC治疗窗口的限制 1.1 抗体组分的体内分布限制 ADC 的有效性 抗体组分分子量约为150000，进而限制了ADC的组织渗透能力。在实体瘤多种物理屏障的共同阻碍下，每克肿瘤组织中 ADC 的摄取量通常低于给药剂量的 0.1%[8]。因此，ADC对实体瘤的治疗效果远不及血液系统肿瘤 ，临床试验中失败的ADC 分子，其适应证多为实体瘤，仅有少数为血液系统肿瘤[9]。实体瘤中抗体药物的渗透过程主要受 3 类屏障限制[10]：血管屏障、基质屏障和抗原/细胞屏障。 1.1.1 血管屏障  实体瘤的供血系统存在结构异常，新生血管表现出渗漏、迂曲、扩张、囊状形成及连接无序等特征。同时，肿瘤细胞快速增殖形成致密的高压肿瘤间质，对瘤内血管和淋巴管产生压迫，不仅阻碍瘤内血液循环，限制药物的血液运输效率，还会阻碍药物通过对流方式跨血管壁进入肿瘤组织[11]。 1.1.2  基质屏障  实体瘤的细胞外基质易发生纤维化改变，形成刚性物理屏障。纤维化的肿瘤间质与高压胞外微环境协同作用，共同阻碍药物在瘤内的扩散过程[12]。 1.1.3  抗原/细胞屏障  Fujimori 等[13]发现，抗体与靶抗原的结合会阻碍其向肿瘤组织内部渗透，并将该现象命名为结合位点屏障（binding site barrier，BSB）。该团队构建了整合多影响因素的偏微分方程模型，结合多来源的体内外实验数据，发现抗体亲和力与靶抗原密度越高，BSB 对抗体渗透的阻碍作用越显著；并推测存在适宜的抗体亲和力范围，可使抗体药物在瘤内实现最均匀的分布。数年后，该理论在豚鼠皮下瘤模型中得到实验验证[14]。此后，BSB 现象得到更多研究的证实，如 Lu 等[15] 发现，抑制抗体与靶抗原的结合可改善抗体偶联物在实体瘤中的渗透效果，实验显示：单独注射帕尼单抗-荧光染料偶联物时，该偶联物仅在肿瘤血管周围分布；若预先采用帕尼单抗竞争性阻断该偶联物与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的结合，其可在肿瘤组织中实现均匀分布。Singh 等[16]也证实，抑制 ADC 与靶抗原的结合可增强其在实体瘤中的渗透能力；在细胞来源异体移植瘤（cell line-derived xenograft ， CDX）模型中 ，该团队将曲妥珠单抗作为竞争性抑制剂，与恩美曲妥珠单抗联合给药，观察到恩美曲妥珠单抗的抗肿瘤疗效显著提升，且疗效提升的程度与肿瘤模型中靶抗原人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达丰度呈正相关。 1.2 抗体组分的体内分布限制 ADC 的安全性 抗体组分的分子量较大，难以向组织内渗透，致使 ADC 在体内主要分布于血液等细胞外液中。因此，ADC 的组织分布与组织供血量呈正相关 ，在心、肝、脾、肺、肾等供血丰富的组织中分布量较高[17] ；且与未偶联的裸抗相比，ADC 在肝脏中的分布量更高[18]。较高的组织分布量可促使 ADC 更易被上述组织摄取，进而引发毒性反应及相关不良反应，如临床中 ADC 相关的肝毒性（表现为转氨酶水平升高）较为常见（见表 1）。难以进入组织且在血液中大量蓄积的 ADC，可通过多种途径被血细胞摄取，进而释放毒素载荷，引发血液学毒性等化疗相关毒性[4]。 此外，目前已上市及处于临床试验阶段的ADC，最常用的偶联方式为基于巯基-马来酰亚胺迈克尔加成反应的随机偶联法。该方法制备的ADC在血液循环中，易与血清白蛋白发生逆迈克尔加成反应，导致毒素载荷脱落，给药7天后药物-抗体比下降约50%[19-20]。脱落的毒素载荷在血液循环中持续暴露，尤其单甲基澳瑞他汀E等毒素仅能通过排泄途径代谢[21]，这是此类ADC发生血液学毒性等多种化疗相关不良反应的重要原因。如德曲妥珠单抗的常见不良反应（见表1）即包含多种血液学不良反应，如中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、白细胞减少症等。 2 抗体组分的体内摄取对ADC治疗窗口的限制 2.1抗体靶向摄取引发的在靶毒性 诸多ADC的靶点在正常组织中均有不同程度的表达，细胞表面靶抗原与抗体组分相互作用介导细胞对ADC的摄取，因此靶向该类靶点的ADC在临床研究阶段常表现出不同程度的在靶毒性。例如，恩美曲妥珠单抗因存在严重肝毒性风险被FDA列入黑框警告，研究证实其肝毒性与其靶点HER2在正常肝细胞中的表达相关[22]；维恩妥尤单抗因潜在严重皮肤毒性被FDA黑框警告，其皮肤毒性与皮肤组织中靶点黏附分子4的表达有关[23]。体内模型存在固有局限性，导致ADC的在靶毒性难以在临床前阶段被精准评估，进而造成部分ADC的临床试验失败。例如，靶向滋养层细胞表面抗原2的ADC PF-06664178，因Ⅰ期临床试验中观察到严重的在靶皮肤毒性而终止研发[24]。 2.2抗体非特异性摄取引发的脱靶毒性 ADC的脱靶毒性是指其通过不依赖靶抗原的摄取途径对正常细胞造成的毒性损伤。目前，ADC在临床阶段观察到的剂量限制毒性主要为脱靶毒性[25]。体循环中，毒素载荷因连接方式不稳定从抗体组分上脱落，是ADC产生脱靶毒性的机制之一。近年来，研究者已开发出多种高稳定性偶联技术[5-7]，为解决该毒性诱因提供了有效策略。现有研究证实，ADC产生脱靶毒性的另一重要机制为，通过抗体组分介导的非特异性摄取途径被正常细胞内吞，如巨胞饮途径、甘露糖受体（mannose receptor，MR）和可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）γ受体（Fc gamma receptor，FcγR）介导的摄取等[4]。 2.2.1  巨胞饮途径介导的摄取  巨胞饮作用广泛存在于多种类型的细胞中，是细胞非选择性内吞胞外液体及溶质的生理过程。ADC的抗体组分、连接子、毒素载荷共同决定了其疏水性、电荷等理化性质，ADC的疏水性越强、所带净正电荷越高，越易通过巨胞饮途径被细胞摄取[25]。其中，高疏水性ADC易发生聚集，且易被肝细胞、巨噬细胞等正常细胞非特异性内吞；携带高正电荷的ADC则易通过静电作用与带负电的细胞膜结合。如Zhao等[25]发现，ADC被角膜上皮细胞通过巨胞饮途径非特异性摄取，是其引发眼毒性的潜在机制；被巨核细胞通过该途径非特异性摄取，是其诱发血小板减少症的潜在机制[26]。 2.2.2  MR介导的摄取  MR广泛表达于髓系免疫细胞、血管内皮细胞和肝脾窦内皮细胞等多类细胞的表面，在抗体等糖蛋白的体内清除过程中发挥重要作用。天冬酰胺297位（N297）是抗体重链保守的N-糖基化修饰位点，该位点N-糖基化修饰缺失末端半乳糖（G0F）抗体，在体循环中更易通过MR介导的途径被摄取与清除[27]。由于中国仓鼠卵巢细胞表达系统的糖基化修饰特征，目前工业生产的治疗性抗体药物中G0F为主要糖型[28]，因此这类抗体药物极易通过MR介导的途径被摄取。此外，ADC在肝脏中的分布丰度高于裸抗[18]，而肝脏中的巨噬细胞和肝脾窦细胞均高表达MR，MR和ADC在肝脏中的共定位可能进一步增强MR介导的非特异性摄取作用[29]。 2.2.3  FcγR介导的摄取  FcγR广泛表达于各类先天免疫细胞表面，IgG抗体的CH2结构域通过与FcγR结合，介导抗体依赖性细胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）等Fc段效应功能，进而引发先天免疫应答[30]。Uppal等[31]发现，FcγR介导的巨核细胞非特异性内吞是恩美曲妥珠单抗引发血小板减少症的潜在机制。该团队证实，恩美曲妥珠单抗不直接影响血小板的活化和聚集，而是通过FcγR依赖性途径被巨核细胞内化，进而释放美登素DM 1，抑制巨核细胞分化，最终导致血小板生成受阻。ADC因疏水性较高，在体内易发生聚集，Aoyama等[32]发现，FcγR在ADC聚集体诱发的脱靶毒性中发挥关键作用；聚集后的恩美曲妥珠单抗、德曲妥珠单抗均可通过FcγR依赖性途径被抗原阴性的正常细胞摄取，经内化后释放毒素载荷并杀伤正常细胞。 3 扩大 ADC 治疗窗口的抗体工程策略 3.1亲和力改造 目前治疗型mAb多具有高亲和力，对靶抗原表现出更优的结合及阻断活性。通过抗体可变区氨基酸突变等技术手段降低抗体对靶抗原的亲和力，可减弱BSB对ADC渗透实体瘤组织的阻力，进而改善ADC的瘤内分布并提高其肿瘤组织富集水平。 综合考虑抗体内化降解速率与肿瘤组织渗透能力，中等亲和力抗体可能是ADC抗体组分的最优选择。Rudnick等[33]发现，靶向HER2的中等亲和力mAb可兼具较高的内化、降解速率与实体瘤渗透能力。其在CDX模型中观察到，高亲和力mAb（Kd=0.56 nmol·L-1）仅有低水平肿瘤富集，且仅分布于瘤内血管周围（平均渗透深度仅约20.4μm）；将亲和力降低至中等水平（Kd=23 nmol·L-1），可显著提高肿瘤渗透深度（平均渗透深度提升至约59.7μm）；低亲和力mAb（Kd=270 nmol·L-1）虽具有最广泛的肿瘤组织分布（平均渗透深度约84.8μm），但内化、降解速率极低，将其亲和力提高至中等水平（Kd=23 nmol·L-1），可获得与高亲和力mAb（Kd=0.56 nmol·L-1）相近的高内化、降解速率。 Tsumura等[34]在靶向组织因子的ADC中也观察到相似现象，中等亲和力ADC的实体瘤内组织分布更均匀，抗肿瘤疗效更佳。其在CDX模型中观察到，亲和力对小体积（200 mm3）肿瘤中ADC的药效无明显影响，但在大体积（600 mm3）肿瘤中，将高亲和力ADC（Kd=0.54 nmol·L-1）的亲和力降低至中等水平（Kd=34.96 nmol·L-1），可显著增强其肿瘤渗透能力和抑瘤效果。 3.2减少抗体组分的非特异性摄取 如前文所述，抗体组分可通过巨胞饮途径、FcγR及MR介导的途径，介导正常细胞对ADC的非特异性摄取，进而限制ADC的安全性。根据目前的研究进展，可通过以下3种策略改善抗体组分介导的ADC非特异性摄取问题。 3.2.1  使用Fc沉默的IgG1亚型抗体或IgG4亚型抗体  使用Fc沉默的IgG1亚型抗体或IgG4亚型抗体，可显著降低抗体组分与FcγR的结合能力[35]，从而减少FcγR介导的ADC非特异性摄取。在IgG抗体的4种亚型中，IgG1可高亲和力结合FcγR，进而介导较强的ADCP、ADCC等Fc效应；IgG2易发生聚集，对ADC的药代动力学及体内活性产生负面影响；IgG3与新生儿Fc受体的结合活性较弱，导致其体内半衰期较短，药代动力学特性不佳；IgG4与大多数FcγR亚型的结合活性均较弱，但IgG4的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）灵活性较低，对抗体与抗原的结合存在一定负面影响，且存在Fab臂交换（Fab arm exchange，FAE）现象，在体内易形成双抗分子，限制了IgG4抗体的成药性[36]。铰链区突变（HC-S228P）可增强IgG4铰链区的稳定性，进而消除IgG4单抗药物的FAE现象[37]。但携带HC-S228P突变的IgG4抗体，在链间二硫键偶联载荷后，是否会导致铰链区稳定性下降，进而恢复IgG4亚型特有的FAE现象，目前尚未见相关报道。目前大多数ADC的抗体组分为IgG1亚型，获批上市的ADC中仅2款采用IgG4亚型（奥加伊妥珠单抗和吉妥单抗），且二者均采用赖氨酸随机偶联技术。 McDonagh等[38]研究发现，沉默Fc效应可使IgG1ADC的治疗指数提高约1倍；研究者将可变区序列相同的IgG1、IgG2、IgG4各亚型的CD70单抗与单甲基澳瑞他汀F进行偶联，并针对IgG1和IgG4亚型设计了Fc沉默突变的对照ADC，结果显示，IgG1（无论是否沉默Fc）和IgG2亚型ADC的体外抑瘤活性相近，而IgG4（无论是否沉默Fc）亚型ADC的体外活性是前两者的20%~50%；在裸鼠CDX模型中观察到，Fc沉默的IgG1ADC的总清除速率仅约为野生型IgG1ADC的一半，且在多种CDX模型中，Fc沉默的IgG1ADC均表现出最佳的抑瘤疗效。 但需注意，失去Fc效应对ADC的抗肿瘤活性可能产生潜在负面影响。尽管ADC的抗肿瘤活性主要由其毒素载荷提供，但失去Fc效应后，ADC无法通过ADCP、ADCC、补体依赖的细胞毒性等先天免疫效应杀伤靶细胞，同时可能在一定程度上削弱ADC在瘤内释放毒素的能力。Li等[39]研究发现，在FcγR介导下，ADC可被肿瘤相关巨噬细胞摄取，进而通过旁观者效应杀伤肿瘤细胞。 目前已有多款Fc沉默的IgG1ADC进入临床研究阶段，例如AZD9592、MEDI4276、LY4101174、Rina-S、IBI343等。 3.2.2  使用去糖基化抗体  抗体重链CH2结构域N297位的N-糖基化修饰，对抗体与FcγR的结合活性至关重要[40]，去糖基化处理可同时消除抗体与FcγR和MR的结合活性，进而可能减少抗体组分的非特异性摄取。Hristodorov等[41]研究发现，去糖基化对IgG1抗体的成药性仅产生低程度负面影响。研究者通过氨基酸突变（HC-N297A）去除6个IgG1单抗N297位的糖基化修饰后，观察到这些单抗的电荷异质性、溶解度、抗原亲和力及大鼠体内半衰期均与野生型单抗均保持一致，且在4℃保存28天或37℃保存21天的条件下均能保持稳定。但去糖基化会导致各单抗的热稳定性下降，且在低pH条件（pH3.0）下更易发生聚集。Yamazoe等[42]发现，在去糖基化抗体CH2区的C’E环位置偶联载荷，可恢复抗体的热稳定性，并推测其机制可能是载荷替代了N297位的糖基，起到了稳定CH2区空间结构的作用。 目前，去糖基化抗体在ADC领域的应用较少，但去糖基化抗体药物的成药性已通过临床验证。例如，采用重链N297A突变实现去糖基化的程序性死亡受体配体1抗体阿替利珠单抗[43]以及采用N297G突变实现去糖基化的CD3×CD20双抗莫妥珠单抗均已获批上市。 3.2.3  确保抗体具有低疏水性、低正电荷  抗体组分的疏水性、携带正电荷的强度与ADC通过巨胞饮途径被细胞非特异性摄取的速率呈正相关[26]，低疏水性、低净正电荷的抗体更不易通过巨胞饮途径介导ADC的非特异性摄取。靶向外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3的ADCAGS-16C3F在临床研究阶段观察到较强的角膜毒性，Zhao等[25]研究发现，其角膜毒性的潜在机制与巨胞饮作用相关；研究者通过突变该ADC抗体表面的正电荷残基（K16D），在保持其抗肿瘤活性的同时，使人角膜细胞对该ADC的耐受性提高了约一个数量级；通过在抗体表面赖氨酸残基偶联聚乙二醇以降低其疏水性，在维持其抗肿瘤活性不变的情况下，使人角膜细胞对该ADC的耐受性提高了约20倍。 3.3优化抗体的靶向能力 靶抗原在正常组织中的表达所引发的在靶毒性，限制了ADC的临床应用安全性；优化抗体的靶向能力以提升其肿瘤特异性，是改善ADC在靶毒性的关键途径。目前，优化ADC靶向能力的主要策略包括双特异性ADC（双抗ADC）、抗体前药偶联药物（probody-drug conjugate，PDC）。 3.3.1  双抗ADC  靶向2个不同肿瘤抗原的双抗ADC，通过双重靶向作用可降低单靶点阳性正常细胞对其的摄取水平，进而改善传统单特异性ADC的在靶毒性。例如，EGFR靶向疗法因EGFR在皮肤组织中的生理性表达，常伴随严重的在靶皮肤毒性[44]。Sellmann等[45]设计的EGFR×细胞间质上皮转化因子（cellular-mesenchymal-epithelial transition factor，c-MET）双抗ADC，与偶联相同毒素的EGFR单抗ADC相比，体外细胞毒性实验中展现出相近的抑瘤活性，而对表达EGFR的正常皮肤角质形成细胞毒性更低，提示双抗ADC对单一靶点阳性正常细胞可能具有更高的安全性。EGFR×HER3双抗ADC BL-B01D 1的临床研究显示，其EGFR相关不良反应的发生频率及严重程度均较低，皮肤相关疾病的发生率仅为21%，且绝大部分为3级以下[46]。处于临床阶段的EGFR×c-MET双抗ADC AZD9592，其研发团队[47]发现该药物的抗体部分较单价亲本单抗具有更快的内化速率；他们构建与AZD9592构型一致的2个单价亲本对照单抗（EGFR/IgG1、c-MET/IgG1），观察到双靶点阳性H 1975细胞中，AZD9592抗体部分的内化速率分别是2个单价对照单抗的10.98倍和4.70倍。 双抗ADC的设计除靶向2个不同靶抗原外，还可靶向同一靶抗原的2个不同表位，该设计亦被称为双表位ADC。此类设计可加速靶抗原介导的抗体内化与清除过程，进而提高ADC对靶抗原阳性细胞的杀伤效能[3]。 目前，多款双抗ADC已进入临床试验阶段，其中进展最快的BL-B01D 1正处于Ⅲ期临床试验（NCT06304974）。 3.3.2  PDC  抗体前药的概念最早由CytomX Therapeutics于2013年提出，其目标是改善部分靶抗原相关的在靶毒性。抗体前药的设计旨在使抗体仅在肿瘤微环境中具有抗原结合活性，以降低对靶抗原阳性正常组织的毒性。此外，PDC因抗原结合活性被掩蔽，可能削弱BSB对其渗透实体瘤的阻力，从而改善偶联物的瘤内分布[3]。 抗体前药的一种设计策略是通过一段可在肿瘤微环境中被特异性降解的连接子，将能够阻断抗体可变区结合活性的掩蔽肽连接于抗体N端。瘤外环境中，PDC因结合位点被屏蔽而降低靶抗原结合能力；进入肿瘤组织后，抗体前药的连接子被特异性切割，掩蔽肽脱落，PDC随即恢复靶抗原结合活性。采用该设计策略的临床阶段PDC包括CX-2009、CX-2029等。 抗体前药的另一种设计策略是赋予抗体靶向结合活性pH依赖性，使其在肿瘤组织弱酸性环境与生理pH环境下呈现不同空间构象——生理pH条件下丧失抗原结合活性，肿瘤微环境中则恢复该活性。例如，处于临床阶段的EGFR靶向PDC HTI-1511通过互补决定区氨基酸突变修饰，在肿瘤微环境弱酸性条件下的抗原结合能力较生理环境增强约10倍[3]。 CX-2009的临床前研究[48]表明，其掩蔽结构不会削弱体内抗肿瘤活性，CDX模型中其抗肿瘤活性与未掩蔽ADC相近。靶向CD71的PDC CX-2029，临床前研究[49]发现其在血液循环中超过80%保持掩蔽状态，且耐受剂量较未掩蔽ADC提高约10倍。然而，二者在临床试验中均未展现出理想的治疗窗口[50-51]，其设计仍需进一步优化。HTI-1511的临床前研究[52-53]显示，裸鼠模型中未观察到该药物与人包皮组织中表达的EGFR结合，且其肿瘤结合能力与EGFR靶向未掩蔽ADC相近；同时，研究者观察到HTI-1511在表皮癌、胰腺癌、头颈鳞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中均表现出良好的体内抗肿瘤活性，且在食蟹猴模型中展现出良好的耐受性。 4 总结与展望 ADC中的抗体组分虽然在一方面通过为毒素载荷提供靶向性、延长半衰期等途径为ADC提供了治疗窗口，然而其在另一方面又通过影响ADC的分布、摄取限制了ADC的治疗窗口。因此，采用抗体工程手段对ADC的抗体组分进行改造，以增强其实体瘤渗透能力、减少其瘤外摄取，是一种增强ADC成药潜力的有前景的策略。亲和力改造、IgG1Fc沉默或使用IgG4、去糖基化、双抗ADC、PDC等，均为已知扩大ADC治疗窗口的潜在抗体工程策略。 随着大量临床研究的开展，研究者们正在逐渐加深对限制ADC治疗窗口因素的认知，并针对这些因素对ADC进行优化改造。在不久的将来，ADC有望成为一种安全、高效且疗效可预测的疗法，为众多癌症患者带来福音。 参考文献： [1] Vantage 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