Rituximab-Pvvr

蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC,Proteolysis Targeting Chimeras) 是一类新型双功能分子，旨在选择性降解致病蛋白。PROTAC 通常由三个部分组成：结合目标蛋白 (POI) 的配体、募集 E3 泛素连接酶的配体以及连接两者的连接体。 这种结构能够利用人体自身的泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 来标记和降解目标蛋白，从而为药物研发提供了一种极具前景的新方法。目前， 虽然尚未有基于 PROTAC 的疗法上市，但超过 ５0 种 PROTAC 候选药物正在临床试验中评估。这些在研疗法靶向多种蛋白质，包括雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、Bruton酪氨酸激酶(BTK)和白细胞介素-1 受体相关激酶 4(IRAK4)。其潜在应用涵盖多种疾病，例如血液系统恶性肿瘤、实体瘤和自身免疫性疾病。表 1. PROTAC 在疾病临床试验中的应用3 款代表性III 期临床的 PROTACs三种 PROTAC 已进入 3 期临床试验： Arvinas/Pfizer 的 ARV-471（ER）、百时美施贵宝的 BMS-986365（AR）和百济神州的 BGB-16673（BTK）。1，Vepdegestrant（ARV-471）Vepdegestrant (ARV-471) 是全球首个进入 III 期临床试验的口服 PROTAC 分子。Vepdegestrant 被开发为一种潜在的首创口服 PROTAC 降解剂，旨在利用人体天然的蛋白质处理系统，特异性降解雌激素受体 (ER)。2024 年 2 月，美国 FDA授予 Vepdegestrant 快速通道资格，用于单药治疗 ER+/HER2- 晚期或转移性乳腺癌成人患者，且该患者此前已接受过内分泌治疗。2025 年 3 月，Arvinas 和辉瑞最近分享了 III 期 VERITAC-2 临床试验 (NCT05654623) 的结果，该试验比较了Vepdegestrant单药治疗与氟维司群在 ER 阳性、HER2 阴性晚期或转移性乳腺癌成人患者中的疗效，这些患者在接受 CDK4/6 抑制剂和内分泌治疗后病情出现进展。该试验在携带 ESR1 突变的患者中达到了其主要终点，与氟维司群相比，其无进展生存期 (PFS) 显著改善，且具有临床意义。该组结果超过了 0.60 的目标风险比。然而，该试验在总体意向治疗 (ITT) 人群中未达到统计学意义。在分析时，总生存期 (OS) 数据尚不成熟，记录的事件数不足所需事件数的 25%。将继续追踪 OS，将其作为关键的次要终点。鉴于 VERITAC-2 III 期临床试验结果好坏参半，Arvinas 在其第一季度业绩中更新了vepdegestrant 项目。作为战略转变的一部分，Arvinas 和辉瑞已决定取消两项计划中的 III 期临床试验——一项是评估Vepdegestrant与辉瑞在研 CDK4 抑制剂阿替莫西利 (atirmociclib) 作为一线治疗的疗效，另一项是探索Vepdegestrant与 CDK4/6 抑制剂作为二线治疗的疗效。尽管存在这些变化，合作伙伴仍在推进计划，在今年下半年提交 vepdegestrant 作为二线单一疗法的审批。Arvinas 天塌了，首款 PROTAC (ARV-471) 三期临床不及预期，股价腰斩2，BMS-986365（CC-94676）近日，美国临床试验注册平台 ClinicalTrials.gov 宣布，百时美施贵宝（BMS）旗下子公司 Celgene 正式启动其在研药物 BMS-986365（又名 CC-94676）的 III 期临床试验。这标志着全球第二个进入 III 期临床试验的 PROTAC 药物，也是首个进入该阶段的靶向 AR 的 PROTAC 药物。BMS-986365 是一种强效的配体导向降解剂 (LDD，ligand-directed degrader)，可促进 CRL4-CRBN E3 泛素连接酶依赖的雄激素受体 (AR) 泛素化和降解。它能有效诱导细胞质和细胞核中野生型和突变型 AR 的快速深度降解。与 AR 拮抗剂恩杂鲁胺相比，BMS-986365 在抑制 AR 驱动的基因转录方面的效力高出约 100 倍，在抑制各种前列腺癌细胞系中的 AR 依赖性增殖方面的效力高出 10 至 120 倍。2024 年 1 月，BMS 在 ASCO 泌尿生殖系统癌症研讨会（ASCO GU 2024）上公布了 BMS-986365 用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）的 I 期临床数据。结果显示，在每日两次 400-900 mg 剂量下，达到 PSA 水平下降≥30%（PSA30，PSA 是测量血液中前列腺特异性抗原（PSA）的含量）的患者比例呈剂量依赖性增加。在全剂量组中，34%（23/68）的患者达到 PSA30。在接受每日两次 900 mg剂量的患者中，55%（11/20）的患者达到 PSA30，35%（7/20）的患者达到 PSA50，10%（2/20）的患者达到 PSA90。此外，该组中 45%（9/20）的患者在 6 个月时未出现疾病进展。2025 年 1 月，BMS 发布了同一项研究的更新分析。在 60 例接受 400-900 mg 每日两次治疗的患者中，32%（19/60）达到 PSA50，其中包括 10 例来自 900 mg组的患者。总体中位放射学无进展生存期（rPFS）为 6.3 个月，900 mg组为 8.3 个月。值得注意的是，初治患者的中位 rPFS 比既往接受过治疗的患者更长（16.5 个月 vs 5.5 个月）。图 1. 接受每日两次剂量治疗的患者的 rPFS。3，BGB-16673（百济神州）2025 年 4 月，ClinicalTrials.gov 网站列出了百济神州开发的靶向 BTK 的 PROTAC BGB-16673 的首个 III 期临床试验的启动。这标志着首个进入 III 期的 BTK PROTAC，也是全球第三个进入该阶段的 PROTAC 分子。这项正在进行的随机、开放标签 III 期临床试验（n=250）旨在评估 BGB-16673 对比研究者选择的疗法（Idelalisib联合利妥昔单抗、Bendamustine 联合利妥昔单抗或venetoclax联合利妥昔单抗再治疗）在既往接受过 BTK 和 BCL-2 抑制剂治疗的慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 患者中的疗效和安全性。主要终点是评估的 36 个月无进展生存期 (PFS)。在 2024 年美国血液学与血液学学会（ASH）年会上，百济神州分享了 CaDAnCe-101 治疗复发/难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）的 I 期研究数据。在 49 例接受治疗的患者中，总体缓解率（ORR）达到 78%（38/49），其中 200 毫克剂量组的 ORR 达到 94%。BGB-16673 在其他血液系统恶性肿瘤治疗中也显示出良好的前景。在 I 期试验中：•华氏巨球蛋白血症：21名患者ORR 为90%;• 滤泡性淋巴瘤：8 名患者ORR为 50%;• 边缘区淋巴瘤：8名患者ORR为 67%;这些结果突显了 BGB-16673 是一种潜在的FIC BTK 降解剂，对 B 细胞恶性肿瘤具有广泛的活性。PROTAC 的概念提出至今已有 20 多年。作为一种新兴的药物研发技术，PROTAC 因其能够靶向此前“不可成药”的蛋白质并克服耐药性的潜力，受到了学术界和制药行业的广泛关注。然而，尽管 PROTAC 药物前景光明，其开发也面临着巨大的挑战。许多 PROTAC 分子分子量较大，难以结晶、溶解性差、渗透性差。此外，一些候选药物的口服生物利用度仍然较低，这给临床转化和商业成功带来了进一步的障碍。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

摘要：抗体的定点化学偶联仍然是抗体-药物偶联物（ADC）界非常感兴趣和积极努力的领域。我们之前报道了一种独特的位点修饰，它使用一类免疫球蛋白-G（IgG）Fc亲和试剂建立了天然抗体的多功能、简化和位点选择性偶联，以提高所得ADC的治疗指数。这种方法被称为“AJICAP”，成功修饰了天然抗体的Lys248，以产生比美国食品和药物管理局批准的ADCKadcyla具有更宽治疗指数的位点特异性ADC。然而，长反应序列，包括还原-氧化（redox）处理，增加了聚集水平。本文章旨在提出一种更新的Fc亲和力介导的位点特异性偶联技术，名为“AJICAP第二代”，无需使用“one-pot”抗体修饰反应进行氧化还原处理。由于结构优化，Fc亲和试剂的稳定性得到提高，能够生产各种ADC而不会聚集。除了Lys248偶联外，使用具有适当间隔键的不同Fc亲和肽试剂生产药抗比均匀为2的Lys288偶联ADC。这两种偶联技术用于从抗体和药物接头的多种组合中生产20多种ADC。还比较了Lys248和Lys288偶联ADC的体内曲线。此外，还实现了非传统ADC生产，例如抗体-蛋白质偶联物和抗体-寡核苷酸偶联物。这些结果强烈表明，这种Fc亲和偶联方法是一种很有前途的策略，可用于在没有抗体工程的情况下制造位点特异性抗体偶联物。【NO.1】介绍：     在过去的十年中，用于产生位点特异性抗体-药物偶联物（ADC）的化学偶联在肿瘤学领域受到了相当大的关注。第一三共采用高药物抗体比（DAR）技术，采用高药物抗体比（DAR）技术，然后巯基-马来酰亚胺与其原始药物接头（deruxutecan）偶联，这是美国食品药品监督管理局批准的定点特异性ADC的第一个例子。由于该技术裂解所有链间二硫键，因此其特点是能够获得近乎均匀的ADC。这种优雅的解决方案，即使所得ADC包含一些较低的DAR物质，能够生产DAR=8的近乎均相的ADC，而不会聚集和抗体特性的丧失，例如抗原结合。然而，这项技术受到相容药物接头的限制。例如，市场上常用的ADC药物接头MC-VC-MMAE，不能应用于这种高DAR技术，因为疏水性会导致聚集，从而降低ADC的物理和生物特性。此外，高DARADC可能不是每个ADC的理想分子形式。第一三共的偶联技术在临床阶段使用deruxutecan制造的另一种ADC的DAR低于8，这支持必须根据靶点的药理学和/或ADC的毒性特征调整适当的DAR。SeattleGenetics（现为Seagen）小组发表了色谱纯化的DAR=2、DAR=4和DAR=8ADC之间的体内药代动力学（PK）和疗效比较研究，表明较低的DAR，尤其是DAR=2，具有理想的生物学特征。据报道，通过降低高DARADC的疏水性来改善PK曲线；然而，DAR=2ADC仍然是一种很有前途的ADC格式，因为它的结构简单，不需要亲水接头。    由于高DAR技术的局限性和DAR=2生产的潜在要求，研究小组2年前开始开发利用Fc亲和肽试剂的位点特异性偶联技术。概念验证研究表明，这种亲和引导的方法能够修饰各种抗体（包括免疫球蛋白-G（IgG）1、IgG2和IgG4）的Fc区的特异性赖氨酸，以产生均匀的DAR=2ADC。该位点占用率通过多项分析得到证明，包括胰蛋白酶消化肽图分析，该分析显示所得ADC的偶联位点仅为Lys248。Fc区是每种抗体的恒定结构域；因此，这种称为AJICAP的Fc亲和偶联技术（理论上）无需复杂的反应优化即可应用所有抗体。此外，由细胞毒性单甲基auristatinE（MMAE）组成的位点特异性AJICAP-ADC的生物学评估表明，与基于随机半胱氨酸的ADC相比，AJICAP第一代技术提高了治疗指数。在不同的有效载荷（maytansinoid）病例中也观察到体内谱的这种改善。由美登素类化合物组成的定点特异性AJICAP-ADC表现出比Kadcyla更高的体内疗效和耐受性，美国食品药品监督管理局批准的临床ADC。这些结果表明AJICAP技术在生产下一代ADC方面具有巨大潜力。     尽管AJICAP第一代技术是制造特定地点ADC的一种很有前途的方法，但仍然存在一些挑战（图1a）。以前的方法需要三（2-羧乙基）-盐酸膦（TCEP）还原以裂解抗体和AJICAP肽试剂之间的键，从而在特定赖氨酸上安装巯基。然而，这种还原也会裂解抗体中链间半胱氨酸的二硫键。因此，必须在再氧化步骤后使用脱氢抗坏血酸重建二硫化物。这种氧化还原处理也用于THIOMAB偶联技术；但是，它可能导致二硫键加扰。这种方法中更关键的问题是聚集的风险。在使用AJICAP第一代技术生产的ADC中发现了少量聚集体（5-10%）。此外，从化学生产控制的角度来看，由较少反应步骤组成的更简化的制造序列是首选。图1.AJICAP第一代和第二项技术的比较：（a）AJICAP第一代技术，包括氧化还原处理（步骤2和3）。（b）AJICAP第二代，包括一锅法肽或接头切割反应。（c）AJICAP第一代和第二代试剂的比较。（d）用于Lys248和Lys288偶联的AJICAP试剂的结构。     本文研究小组进行了优化研究，以简化偶联反应序列以克服这些问题（图1b）。这种改进的技术被称为“AJICAP第二代”，能够生产位点特异性ADC，同时利用硫酯化学防止由于选择性切割反应而导致的聚集。AJICAP肽试剂在缓冲溶液中的稳定性得到改善，对靶标赖氨酸的选择性更高，ADC的DAR值更高。这种基于硫酯的策略提供了两种不同的AJICAP肽试剂，以访问两个不同的偶联位点（Lys248和Lys288）。基于Lys248和Lys288的ADC的体内生物学研究揭示了相当的疗效和耐受性。此外，还研究了偶联化学在非传统ADC生产中的应用。【NO.2】结果与讨论2.1.AJICAP试剂设计和抗体修饰     改进AJICAP肽试剂有两个主要挑战（图1c）：（1）用抗体中赖氨酸的胺基取代不稳定的N-琥珀酰亚胺（NHS）基团，以及（2）在ADC合成方案中替换需要氧化还原处理的AJICAP试剂中的二硫键。     考虑到保质期和反应性平衡，选择噻吩酯基团作为抗体修饰的反应性基团。硫酚基团比NHS基团具有更高的稳定性和略低的反应性。然而，我们预计Fc亲和肽的邻近效应会增强抗体修饰的反应性。此外，与NHS酯相比，噻吩酯在反应缓冲溶液中的保质期更长，从而提高了修饰产量和位点特异性。选择烷基硫酯键来替代AJICAP第一代试剂中的二硫键。烷基硫酯是众所周知的硫醇保护基团。N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸酯是一种广泛用于蛋白质功能化的烷基硫酯试剂。使用N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸酯修饰蛋白质赖氨酸，然后使用羟胺进行特异性脱保护，可以在赖氨酸残基上形成巯基。由这些硫酯（烷基和苯基）生产优化的AJICAP试剂（1b）（图1d;支持信息（SI），图S1-S3）。此外，设计了另一种具有不同亲和肽序列的AJICAP肽试剂（6b）来修饰抗体的Lys288（SI，图S4和S5）。在以前的研究中，Lys288的修饰产量低于Lys248;因此，我们安装了刚性架构(18)使AJICAP试剂的反应性噻吩酯基团在缓冲条件下接近Lys288。    曲妥珠单抗和利妥昔单抗用于证明噻吩酯化学（表1）表1.位点特异性肽偶联     通过使用四极杆飞行时间质谱法（Q-TOFMS）测量肽抗体比（PAR）来计算抗体到偶联物的转化率（SI，图S6-S10)和疏水作用色谱（HIC）-HPLC（SI，图S11-S21）。    在之前的Lys248偶联中，AJICAP试剂（1a）提供更高的PAR（条目1）；然而，由噻吩基团组成的AJICAP试剂（1b）实现了进一步的反应性优化，以满足目标PAR并提高了PAR=2选择性（条目2）。在Lys288偶联的情况下，需要进一步的优化研究。在以前的研究中，第一代AJICAP试剂（6a）提供的PAR不足（条目3(10)).为了了解这种现象，我们对试剂6a和6b的碱肽（称为Z34C）与Fc蛋白的复合物进行了结构分析;(20,21)从Z34C肽到抗体Lys288的预测距离比从FcIII样肽的预测距离远到Lys248（SI，图S22）。这些结果表明，用于Lys288修饰的AJICAP试剂需要比用于Lys248修饰的AJICAP试剂更长的接头（SI，图S5、S8和S14）。因此，我们调整了肽试剂的连接子长度。几个小组报道了独特的亲和引导蛋白质修饰技术；在某些情况下，刚性结构，如哌嗪和proline在接头部分，是到达反应性基团以靶向氨基酸的强大工具，提高了转化率。这些报道促使我们筛选接头以提高Lys288的修饰效率，发现芳香环是一个合适的键。肽偶联步骤中的缓冲液pH值取决于AJICAP试剂的肽部分的结合亲和力;在Lys248偶联的情况下，FcIII样肽在酸性缓冲液（pH值约为5.5）中显示出最高的结合亲和力。另一方面，用于Lys288偶联的Z34C在微碱性条件下（pH值约为8.0，数据未显示）显示出良好的亲和力。     在两种试剂（1b和6b）中，使用羟胺完成了以下接头切割（SI，图S15、S16、S20和S21），表明噻吩基团与抗体中的赖氨酸反应，而在肽偶联过程中没有通过烷基硫酯发生副反应。2.2. AJICAP技术的能力     通过HIC-HPLC分析评估了使用多种抗体的这种偶联化学试剂的兼容性（SI，图S23-S44）。在传统的半胱氨酸偶联情况下，抗体特性会影响所得ADC的反应性和DAR；因此，使用具有不同等电点（PI）的多个ADC进行共轭检查(26)旨在了解AJICAP第二代技术的反应耐受性。除了曲妥珠单抗（PI=8.8，条目1和2）和利妥昔单抗（PI=9.1，条目3和4）、英夫利昔单抗（PI=7.6，条目5和6）、西妥昔单抗（PI=8.7，条目7和8）、地诺单抗（PI=8.9，IgG2，条目9和10）和pembrolizumab（PI=8.7，IgG4，条目11和12）进行了评估。在所有情况下，AJICAP试剂（1b和6b）都与这些mAb充分反应，产生PAR=2.0的偶联物，表明这种偶联不依赖于PI差异或IgG亚型。这些AJICAP试剂还修饰了Fc蛋白（条目13和14，使用Q-TOF分析证实（SI，图S45和S46）），证明了这种Fc修饰技术在Fc融合蛋白生产中的潜在用途。Fc-Fusion是一种常用的技术，用于延长中小分子的体内半衰期。此外，这种强大的偶联技术能够修饰多克隆抗体（从人血清中纯化的全IgG）（条目15和16）。使用过量当量的羟胺进行连续接头切割能够释放亲和肽部分，从而提供位点特异性巯基掺入抗体。在所有反应情况下，使用体积排阻色谱（SEC）分析的聚集百分比在偶联或接头切割后保留（SI，图S47-S62）。    此外，我们成功地省略了AJICAP肽偶联后的纯化步骤。如表2所述，肽偶联后接头切割的一锅反应修饰了所有抗体，具有与逐步转化相同的效率和聚集曲线。这种简化的流程适用于ADC制造。表2.从天然mAb到Antibody-Thiol的逐步和"one-pot"转换（4）2.3.ADC合成     合成了20多种ADC，以证明AJICAP第二代技术生产的抗体硫醇（4）的相容性（表3）。表3.ADC合成     目前ADC领域有多种药物接头，每一种都具有独特的疏水性和反应性。因此，我们评估了五种药物接头（MCC-maytansinoid、MC-VC-PAB-MMAE、MC-MMAF、Tesirine和MC-GGFG-Dxd;SI中的图S63显示了它们的结构）。从曲妥珠单抗-Lys248-硫醇、曲妥珠单抗-Lys288-硫醇、利妥昔单抗-Lys248-硫醇和利妥昔单抗-Lys288-硫醇转化的所有ADC的DAR值都高于先前报道的DAR值（AJICAP第一代生产）。使用两种不同的分析方法（Q-TOFMS和HIC-HPLC）测定DAR（SI，图S64-S83和S84-S103）。从两种不同分析得出的平均DAR值无法区分。测得的差异归因于方法灵敏度、准确度或线性。所有ADC的聚集百分比均小于3.0%（SI，图S104-S123），与裸抗体（曲妥珠单抗和利妥昔单抗）无显著差异。这些结果表明，与第一代的AJICAP技术相比，这种改进的技术可能是一种更实用的各种ADC生产方法。2.4. 偶联位点测定     使用肽图分析确定这些曲妥珠单抗-硫醇（源自1b的4a和源自6b的4b）的偶联位点（图2）。在我们之前的肽图分析中，由于单一酶（胰蛋白酶）消化，序列覆盖率约为80%。为了增加这一覆盖率，使用胰蛋白酶和Lys-C进行双酶消化。(33)此外，我们优化了HPLC条件，包括长梯度和新构建的HPLC系统，以提高峰分辨率（参见实验部分）。因此，序列覆盖率提高到95%以上。将硫醇加合物与结果进行比较，并指出AJICAP抗体硫醇（Lys248和Lys288）的靶标特异性修饰（图3）。在检测到的赖氨酸中，靶位点（分别为Lys248和Lys288）特异性受到3-（2-氨基-2-氧代-乙基）磺酰丙酸酯修饰。事实上，对于AJICAP-Lys248-硫醇样品，我们检测到一个肽片段，包括两个候选残基Lys246和Lys248（THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK246PK248DTLMISR）进行修改。在该分析中，使用Lys-C和胰蛋白酶进行消化;因此，赖氨酸和精氨酸（后跟脯氨酸除外）被识别和裂解。Lys246位于脯氨酸后面，受到酶切割的抑制，而Lys248应该被酶裂解。从这些考虑中，我们得出结论Lys248是经过专门修饰的。同样，对于AJICAP-Lys288-硫醇，我们鉴定了FNWYVDGVEVHNAK288TK290PR，具有两个赖氨酸Lys288和Lys290。我们得出结论，出于同样的原因，AJICAP-Lys288-thiol在Lys288位点实现了特异性修饰。支持两种抗体硫醇（Lys248和Lys288）位点特异性的详细提取离子色谱图（XIC）和MS/MS结果如SI所示，如图S124和S125所示。图2.BioPharma Finder的赖氨酸残基搜索摘要：（a）曲妥珠单抗-Lys248-硫醇分析（4a）;（b）曲妥珠单抗-Lys288-硫醇分析（4b）。每个结果都显示了AJICAP反应的高特异性。图3.Lys248-ADC和Lys288-ADC之间的体内疗效比较：（a）抗HER2曲妥珠单抗-Lys248-MMAE（5a）在NCI-N87异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。（b）抗HER2曲妥珠单抗-Lys288-MMAE（5b）在NCI-N87异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。2.5.体内研究AJICAP-ADC的生物学评价     在以前的研究中，我们的研究小组揭示了使用AJICAP偶联技术的治疗指数比随机偶联ADC更高。(13,14)在这些评估之后，我们检查了使用第二代方法生产的AJICAP-ADC的生物学评估（图3）。此外，还评估了Lys288偶联的ADC，以比较这两个偶联位点的体内功效。在这些生物学研究中选择了曲妥珠单抗-Lys248-MMAE（5a）和曲妥珠单抗-Lys288-MMAE（5b）。     首先，在HER2阳性NCI-N87胃癌异种移植模型中评估了两种不同剂量的曲妥珠单抗衍生的AJICAP-ADC（5a）（结合位点：Lys248，有效载荷：MMAE）（图4a）。剂量为5mg/kg的Lys248偶联ADC（5a）显示出显着的肿瘤消退，与之前使用AJICAP第一代技术生产的ADC相当。(13)另一个AJICAP-ADC（5b）（偶联位点：Lys288，有效载荷：MMAE）在5mg/kg剂量下也显示出显着的疗效（图4b）。这些结果表明，AJICAP偶联技术可以产生具有相当功效的ADC，这些ADC与偶联位点和生成无关。在以前的研究中，通过天然半胱氨酸偶联产生的随机DAR=4曲妥珠单抗-MMAEADC的最小有效剂量为2.5mg/kg。尽管存在DAR数量差异（随机ADC=4，AJICAP-ADC=2），但AJICAP-ADC的体内功效与随机ADC相当。图4.Lys248-ADC和Lys288-ADC之间的PK曲线比较：（a）使用ELISA测量的大鼠抗HER2曲妥珠单抗-Lys248-MMAE（5a）的总mAb（黑线）和总ADC（蓝线）的血浆浓度。（b）使用ELISA测量的大鼠mAb浓度（黑线）和曲妥珠单抗-Lys288-MMAE总ADC（蓝线）（5b）。     AJICAP偶联技术修饰了抗体的Fc区；因此，由于在FcRn结合位点附近偶联的有效载荷接头的空间干扰，所得ADC面临失去与FcRn结合亲和力的风险。然而，在2021年，我们的研究小组发现AJICAP-ADC（偶联位点：Lys248，有效载荷：MMAE）在偶联后保留了FcRn结合亲和力。考虑到在大鼠PK研究中测量的AJICAP-ADC的血浆稳定性，这些发现是合理的。在这项研究中，证实了使用第二代技术生产的两种不同AJICAP-ADC（5a和5b）（偶联位点：Lys248或Lys288，有效载荷：MMAE）的FcRn结合亲和力和PK谱。生物膜干涉分析与之前的研究一样揭示了两种ADC对固定化FcRn与裸曲妥珠单抗的结合强度相当（表4）。通过生物膜干涉测量法提供的两种不同ADC的这些亲和结果可以从它们的分子结构中合理化（SI，图S126）。Lys248和Lys288是FcRn结合的可接受位点，可避免由于偶联有效载荷接头引起的空间位阻。大鼠PK研究支持这种FcRn结合结果（图4）。来自两个AJICAP偶联的ADC（5a和5b）（偶联位点：Lys248或Lys288，有效载荷：MMAE）的总抗体水平表明其半衰期与未偶联抗体的半衰期相似。大鼠PK研究中的总ADC分析表明，这些AJICAP-ADC在血液循环中表现出足够的稳定性。相比之下，通过半胱氨酸偶联技术产生的随机ADC在大鼠中表现出足够的稳定性。此外，我们对AJICAP-ADC（5b）（偶联位点：Lys288，有效载荷：MMAE）进行了初步毒理学研究，结果表明该ADC在80mg/kg剂量下不会对大鼠的体重变化产生负面影响（单剂量，SI，图S127）。另一种ADC（5a）（偶联位点：Lys248，有效载荷：MMAE）已经在大鼠毒理学研究中进行了评估，结果表明最大耐受剂量为>80mg/kg。在以前的研究中，曲妥珠单抗随机MMAE的估计最大耐受剂量值约为10mg/kg（单剂量，先前报道。这些结果表明，两种AJICAP-ADC的耐受性明显优于传统的随机ADC。进一步的毒理学研究正在进行中，以确定Lys288偶联ADC的最大耐受剂量。表4.与人FcRn的结合动力学      基于这些体内疗效、PK和初步安全性研究，我们得出结论，AJICAP第二代技术能够生产出比传统随机ADC具有更高治疗指数的位点特异性ADC。      在这些体内数据集中，Lys248-ADC和Lys288-ADC没有观察到显著差异。在抗体开发过程中，报道了抗体Fc区的一些点突变以增强FcRn结合。他们的一些突变抗体可能会失去对AJICAP-Lys248肽试剂的亲和力。本文描述的与Lys288偶联的新型AJICAP-ADC的发现可能为使用Fc区域突变抗体进行AJICAP技术提供另一种选择。2.6.应用于新型抗体偶联物    最近，创新启发了肿瘤学或生物偶联界，并拓宽了研发领域，包括ADC替代抗体-寡核苷酸偶联物和抗体-蛋白质偶联物。使用模型偶联物进行可行性研究，以满足生产这些新型抗体偶联物的潜在要求（图5）。图5.合成新型抗体偶联物。抗体-SiRNA偶联物的产生（上图）；抗体-蛋白偶联物的产生（下图）     作为模型SiRNA化合物，我们使用了基因泰克小组报道的序列靶向肽基脯氨酰异构酶B（PPIB，cyclophilinB）的SiRNA化合物。根据他们的报告，具有C6胺接头的模型SiRNA通过酰胺化转化为马来酰亚胺偶联物。该马来酰亚胺标记的SiRNA与抗体-Lys248-硫醇（4a）偶联，通过硫醇-马来酰亚胺偶联得到抗体-SiRNA偶联物（详细信息见SI的实验部分）。使用制备型SEC-HPLC纯化所得偶联物，以从抗体偶联物组合物中去除过量的未反应SiRNA。该偶联物的SDS-PAGE分析揭示了相当大的转化率（SI，图S128）。选择溶菌酶作为蛋白质偶联物生产的模型化合物。使用叠氮化物-NHS试剂的随机赖氨酸偶联产生叠氮化物掺入的溶菌酶。抗体-DBCO从抗体-Lys248-硫醇（4a）转化，并与该叠氮化物-溶菌酶反应形成抗体-蛋白偶联物。对Q-TOFMS分析表明，这种偶联进展顺利（SI，图S129-131）。这些结果表明，AJICAP偶联策略可用于生产具有小细胞毒性分子的ADC和有效载荷为中等分子的ADC替代品。目前正在进行进一步的研究，包括DAR测定、工艺开发以及体外和体内评估。【NO.3】结论     本文的研究小组已经完成了AJICAP第二代的概念验证研究，并使用Fc亲和试剂改进了化学偶联技术。这种新颖的方法与各种抗体形式兼容，包括抗体片段和多克隆抗体。接头结构调整能够在新的偶联位点（Lys288）对天然IgG进行位点特异性修饰，且转化率高。这种偶联技术可以轻松地为每个天然抗体引入两个有效载荷接头，产生20多个位点特异性ADC，在反应过程中不会聚集。由这种化学位点特异性偶联技术产生的ADC的体内生物学研究（包括小鼠疗效、大鼠PK和毒理学研究）表明治疗指数扩大。     此外，还完成了应用于非传统ADC（包括抗体-寡核苷酸偶联物和抗体-蛋白质偶联物）的初步可行性研究。该技术能够快速、多功能、简化地与具有多种接头有效载荷（包括中等大小分子）的天然抗体进行位点特异性偶联，以产生下一代抗体偶联物。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。