Granulomatosis With Polyangiitis

2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 从Humira到Keytruda，不少畅销产品尽管机制、赛道不尽相同，但它们之所以成功，都能从开发策略上找到重合点——“药丸管线”（pipeline-in-a-pill，PiP）。 简言之，PiP战略指的是将一种药物用于多项适应症：它更多关注临床执行，而非寻找下一个“重磅炸弹”。通过将资源集中在少数产品上，药企一旦获得深入的数据支撑，该模式便会带来巨额回报（2023年Keytruda卖出了250.11亿美元）。 纵观近年的一些资产并购，也证明了PiP模式的吸引力。 例如2020年，BMS以131亿美元收购Myokardia，主要看中了后者心血管药物mavacamten；吉利德以49亿美元收购Forty Seven，也一度打算把CD47单抗magrolimab用于多种癌症治疗；强生65亿美元收购Momenta获得的FcRn抗体nipocalimab，目前正寻求上市批准。 考虑到MNC的“专利悬崖”危机，接下来，或许有更多的交易围绕PiP资产展开。然而，正如吉利德在magrolimab上的反复受挫一样，这种策略的挑战不可小觑。 他山之石，可以攻玉。本文将重点介绍9款PiP药物，以回应走上这条进攻型道路所需要的成功经验。 此外，如果PiP模式是一种风险与收益同样大的选择，那药企有什么其他方法，帮助天平向“重磅炸弹”一端倾斜？也就是说，除了药企可以同时准备哪些防守性的手牌，增加赢面？ 1 如何开发PiP药物？ 本文选择的9个案例，包括Soliris、Keytruda、Humira、Avastin、Rituxan、Avacopan、Advair、Neupogen和Revlimid。 整体上，它们能成为PiP药物，离不开几方面原因： • 广泛的作用机制（MoA）通常针对涉及多种途径和疾病的靶点——这或许是PiP药物最重要的特征，还可提供组合疗法潜力。 • 不同的剂量和给药方式，使药物在不同环境下治疗患者。例如，甲氨蝶呤在肿瘤中的应用（高剂量）和狼疮/类风湿性关节炎中的应用（低剂量）。 • 一个由基因决定的靶点，以降低临床项目的风险。这是所有药物开发人员的偏好。 • 长期安全性研究和更有效的试验设计，以便更快开展新的关键研究。 01 Soliris Soliris（依库珠单抗）是一种抗体补体抑制剂，它改变了罕见病患者的生活，使Alexion成为一家明星Biotech。 作为PiP药物，过去20多年间，Soliris有过4次大规模成功，也出现9次失败。 2007年，在4次暂停试验后，Soliris获批用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）；2011年，FDA批准Soliris治疗非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。在这两种极为罕见的适应症，Soliris都是首款疗法。 随着时间推移，Soliris后来还获批用于治疗成年全身性重症肌无力（MG）和视神经脊髓炎（NMO）患者。 Alexion在PiP模式之上，叠加了投资组合战略——开发其他补体抑制剂，同时仍尝试扩大Soliris在更多适应症中的使用。Soliris成功的核心是它专注于补体，而补体是许多免疫疾病的病理基础。 Alexion创始人不仅是验证超罕见病商业模式的先驱，还为如何将一种药物定位PiP树立了典范：通过专注在治疗质量低下或没有标准治疗的超罕见疾病，并在FDA的支持下进行更有效的临床试验，Alexion得以建立特许经营权。 02 Keytruda PD-1抗体Keytruda（帕博利珠单抗）是如今肿瘤免疫疗法当之无愧的代表，截至今年上半年，它在美国被用于40项适应症。 Keytruda最初由Organon无意中开发。2003年，该公司希望找到一种PD-1激动剂，用来治疗自身免疫性疾病。发现PD-1抑制剂后，因为另一种肿瘤免疫药物CTLA-4抑制剂备受关注，Organon决定将注意力转向癌症。 2007年，Organon被先灵葆雅收购，而先灵葆雅又于2009年被默沙东收购。经过两次交接，Keytruda被默沙东列入了出售名单。 直到2010年，BMS披露CTLA-4抑制剂Yervoy在难治性转移性黑色素瘤治疗中的III期阳性数据。有消息称，BMS开发的PD-1抑制剂Opdivo也显示出良好效果，因此，默沙东打消转让Keytruda的念头，并于2011年开始首次临床试验。 意识到在PD-1抑制剂研发方面落后于BMS约5年，默沙东做出一些关键决定，最终使Keytruda取得巨大成功： • 使用生物标记物。默沙东利用肿瘤中的PD-L1表达，来提高Keytruda的有效率。尽管生物标记物减少了可治疗的患者总数，并使开具处方变得更加困难，但默沙东还是选择采用这种方式，弥补失去的开发时间。 • 突破性疗法认定。2012年，FDA实施突破性疗法认定，增加药企与该机构会面的频率。默沙东利用这一监管变化，并为Keytruda获得该认定。 • 扩展I期临床试验。当观察到黑色素瘤患者对Keytruda反应良好时，I期临床被扩展，以增加更多晚期黑色素瘤和肺癌患者。该试验最终招募了上千名患者，成为有史以来规模最大的癌症I期研究。 • 专注于黑色素瘤。Keytruda针对黑色素瘤领域的早期研发，是由Yervoy在该适应症上的初步成功推动的。默沙东对晚期黑色素瘤患者的关注不仅是基于数据，而且希望避免可能拖慢临床试验进度的对照研究。 2014年，Keytruda获得FDA批准，用于治疗携带BRAF突变的晚期黑色素瘤患者。此后，它接连在其他癌肿取得成功。截至2023年，Keytruda为默沙东带来1016.7亿美元的收入。 03 Humira 从累计销量上看，Humira（阿达木单抗）目前是有史以来最畅销的药物——20余年间，共卖了超过2000亿美元，治疗范围覆盖类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病等多种自身免疫性疾病。 Humira的发现最早可追溯到20世纪90年代，得益于Cambridge Antibody Technology（CAT）的噬菌体展示技术——2018年，该公司创始人Gregory Winter还因此获得诺贝尔奖。从Knoll Pharmaceuticals筹集到资金后，CAT在两年内便找到一种候选药物。2000年，相关III期关键临床启动，雅培以69亿美元收购案强势入局。 2002年，FDA批准Humira用于治疗类风湿性关节炎。光是2003年底，该药就治疗了5万多名患者。尽管Humira是市场上第3种TNF-α靶向抗体，但它的给药时间更合理，耐受性更好。2006年，Humira自用注射器获得批准，优势进一步凸显。 凭借广泛的MoA，雅培看到Humira治疗更多疾病的价值。在每次新适应症批准推动下，Humira收入迅速增加。2013年，雅培将其药品业务分拆为艾伯维，Humira很快占据该公司一半以上的营收。 虽然Humira的核心美国专利于2016年到期，但因为生物仿制药的开发门槛较高，且艾伯维通过一系列外围专利布局和谈判，将Humira的生命周期大大延长。 Humira之所以能够成为一种PiP产品，原因如下： • 瞄准TNF这个对多种自身免疫性疾病有广泛影响的靶点。 • 与竞品相比，拥有更好的给药方案。 • 使用Humira自用注射器，更方便患者自行给药。 • 投资长期临床试验（为期8年的研究），全面衡量毒性和其他副作用。特别是对于TNF抑制剂，副作用是一个主要考虑因素，甚至可以对冲专利到期。 04 Avastin Avastin（贝伐单抗）是一种抗VEGF-A抗体，由基因泰克开发，获批用于治疗多种实体瘤，也可治疗湿性AMD。 1989年，在一个心血管疾病研究项目中，Napoleone Ferrara他及其在基因泰克的研究团队率先克隆出VEGF，该因子对血管生成（即新血管生长）至关重要。在基因泰克“科学至上”的文化熏陶下，他们开始探索抑制血管生成的抗癌作用。 过去的研究发现，血管发育与肿瘤生长之间存在联系。其中一个重要主题是，该团队将新技术（克隆和抗体）用于解决老问题（血管生成）。 1993年，他们发现一种抑制VEGF的抗体，后者可以减少小鼠模型中肿瘤的生长。该抗体的人源化版本研制成功后，Avastin就进入临床试验。 由于Avastin具有如此广泛的MoA，基因泰克开始将它用来测试多种癌症。2002年，该药在一项三线乳腺癌III期试验中未能达到主要终点。另一项针对转移性结直肠癌的关键III期试验显示，与标准疗法相比，Avastin可将无进展生存期延长5个月。2004年，即首次克隆出VEGF的15年后，该药获得治疗该疾病的批准。 基因泰克继续探索抑制血管生成在更多癌症中的应用，随后十余年，Avastin又多次获得新适应症批准。 Avastin成为一款PiP产品，主要有两个原因：其一，通过VEGF介导的广泛MoA，与多种实体瘤甚至眼疾有关。先发优势无疑也为基因泰克提供了帮助。其二，利用新技术探索老问题：血管形成在癌症生长中的作用。 05 Rituxan 作为首个获准用于癌症治疗的抗体疗法，Rituxan（利妥昔单抗）是基因泰克旗下另一个PiP产品的代表。 Rituxan靶向CD20，可治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿伴多血管炎、显微镜下多血管炎和寻常天疱疮患者。该药还经常在标签外，用于治疗原发性血小板减少症等多种疾病。 大约1975年，斯坦福大学教授Ronald Levy参与了一个项目，针对淋巴瘤细胞上的患者特异性表面抗体（Ig）开发疗法。1981年，从该项目中发现的抗体被用于治疗首例淋巴瘤患者，此后又治疗约50名患者。1985年，IDEC Pharmaceuticals成立，旨在将这项研究商业化。然而，该公司无法找到一种经济有效的方法来扩大个性化治疗，因此转向CD20这种更普遍的B细胞靶点。 随后，IDEC发现一种候选抗体（C2B8）。1992年，IDEC提交IND，并在1994年的I期试验中获得积极数据。然而，IDEC在筹集更多资金以开展临床试验方面举步维艰。它当时正在开发一种全新的模态——单克隆抗体，其适应症被认为是一个小市场，NHL每年发病约为4万例。 1995年，IDEC与基因泰克达成交易，为研究找到后续资金。经过成功的关键性试验，Rituxan在1997年首次获得FDA批准用于治疗NHL。随后的临床研究显示，Rituxan与化疗联合使用效果更佳，因此被用作一线疗法。 即使在开始首次试验近30年后的今天，Rituxan作为一种单一疗法、联合疗法和维持疗法，每年仍能为约50万患者提供治疗。 可以看到，Rituxan的成功，离不开以下几点： • 使用当时的新技术（单克隆抗体）比标准治疗方法更精确地治疗疾病。细胞疗法、基因疗法的机会现在相当。 • 追求进展相对较慢的适应症。这使Rituxan可用于维持治疗，并有更多机会与其他疗法相结合。 • B细胞耗竭对癌症和自身免疫都有相当广泛的影响，通过设计首个针对B细胞的抗体，Rituxan拥有了市场定位，可以观察其对由B细胞驱动的任何疾病的影响。 06 Avacopan 一个更近的有望成就PiP产品的案例，来自Chemo Centryx开发的Avacopan。2021年，该药物最先在日本获得批准，用于治疗肉芽肿性血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）。 作为一种补体受体C5aR拮抗剂，目前，Avacopan还在进行C3肾小球病和化脓性汗腺炎的临床试验。Avacopan的机制与Alexion的Soliris相似，具有治疗多种补体驱动疾病的潜力。 07 Advair Advair（沙美特罗替卡松）由GSK开发，是氟替卡松（类固醇）和沙美特罗（支气管扩张剂）的组合，用于治疗COPD和哮喘。该药物的作用是放松支气管平滑肌并减少整体炎症。GSK投入巨资进行试验以扩大Advair的使用范围，并且在标签外使用方面非常积极。 08 Neupogen 安进开发的Neupogen（非格司亭）也可被纳入PiP产品之列。 该药物是一种重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），1991年首次获批用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症，十多年来，该药物在再生障碍性贫血、骨髓移植等治疗领域也取得进展。 化疗和其他癌症治疗过程中，患者的免疫系统基本上被破坏，而Neupogen有助于刺激免疫细胞的生长，从而降低治疗期间感染导致的死亡率。在首次临床试验中，安进确定了Neupogen的安全性和强大的中性粒细胞恢复能力。这使该药物成为化疗患者的标准治疗药物。 09 Revlimid Revlimid（来那度胺）是另一个PiP模式案例。 在Celgene的推动下，2005年Revlimid首次获批用于治疗骨髓增生异常综合征。随后，Revlimid开启了PiP之路：2006年，获批用于治疗多发性骨髓瘤；2013年，获批用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤；2019年，获批用于治疗滤泡性或边缘区淋巴瘤。 该药源自Celgene在1990年代的免疫调节药物研究；有趣的是，Revlimid是从表型筛选中发现的，获批后才发现该药物能与E3连接酶结合，选择性降解IKZF1/3转录因子。 2 防守战略作为后手 上述9款药物，并非PiP战略的全部案例，却足以说明所能达到的业务规模。并且，药企还可以将该策略应用于其他适应症，例如神经退行性疾病、衰老和与年龄相关的疾病，以及呼吸系统疾病。 但本质上，这种将大部分资源押注在少数产品的选择，也埋下巨大的风险。所以，药企通常会做其他布局进行平衡。 与PiP战略互相补充的，可以是建立资产组合或平台——前者侧重于以多样化的产品组合作为护城河，后者侧重于以技术作为护城河。它们区别于PiP战略，即以临床成功的药物作为护城河。 如果说PiP战略是进攻，那么资产组合战略就是防守。 在特定的适应症中，一个跨越不同疾病阶段的药物组合，可以帮助公司在有新药进入的情况下，保持稳定的销售额。要建立药物组合，必须在研发和临床开发方面进行大量投资。从另一个角度看，一些公司的成立就是为了匹配这些产品组合，并在适当时候被收购。 对于渤健，公司通过合作、并购和内部开发，建立了以多发性硬化症为中心的产品组合。辉瑞在JAK抑制剂方面也采取了类似的做法：除了推出托法替尼（tofacitinib），还开发了具有不同剂量、配方和PK/PD特性的其他候选药物，以使公司的管线多样化。 总之，产品组合战略使药企能够更容易地适应不断变化的市场条件，并将产品与特定的患者群体相匹配。 至于平台技术战略，则是以新技术和科学专长为核心。 这种防守选择的主要优势，在于能够吸引合作机会，降低公司的融资成本，而且技术的稀缺性可以帮助公司获得更有利的交易条件，尤其是当合作伙伴认为自己在技术革命中被抛在后面时。 然而，药物开发仍然十分复杂，因此平台技术受限于我们对生物学和疾病的基本认识。 平台技术公司历来也很难长期保持相关性；但也有少数例外，如Adimab和再生元。临床概念验证数据是平台技术公司的一个重要里程碑，可以验证平台产生更有前途的候选药物的能力。在此过程中，平台技术公司能跟拥有更多资本和商业资源的巨头达成许可协议。 平台技术的例子，包括AAV、RNAi、mRNA、ADC和细胞疗法。打造平台技术公司的前提，是创建一个模板，生成一系列药物。从历史上看，专注于疾病遗传驱动因素的平台表现最好。 Seattle Genetics就是一个执行“攻守皆备”战略的例子，该公司不仅有机会推进PiP产品，而且拥有领先的ADC平台。 而Alnylam是RNAi领域的领导者，利用其平台开发了几种已获批准的药物，并且还有更多药物在研。RNAi尤其是ASO，适合作为平台技术，因为在设计和验证化学主链后，可以轻松互换目标序列。因此，ASO开发的前期投资可以在更多试验中分摊。 3 小结：各取所需 PiP战略，以及产品组合战略、平台技术战略，综观这三种选择，PiP战略通常会获得最大的收益成果。它降低临床成本，最大限度地发挥商业潜力，同时提高了商业化效率。 不过，基因组学、机器学习和合成生物学等新工具，也可以使药物设计更具可预测性，从而带来更大的赢面。 对于公司创始人来说，这些战略创造了三条主要路径：第一，开发具有PiP潜力的资产；第二，建立一家公司，以便被收购并整合到更大的投资组合中；第三，利用一个平台来开展合作，推动药物开发。 很少有公司能够找到一种方法来同时完成这三项工作。因此，药企必须根据自身背景，做出合适的选择。 参考文献： 1.Drugs that are their own pipelines；Life sciences strategy 2.当默沙东要跳出阴影；同写意 3.The Startling History Behind Merck's New Cancer Blockbuster；Forbes 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

摘要：本章将介绍抗体及其类似分子在治疗、诊断和研究中的广泛应用。在本章的第一部分，你将了解到一些选定的批准治疗性抗体的适应症、分子靶标和作用方式。第二章节将讨论抗体在疾病诊断中的应用，包括传染病（特别是结核病和HIV）的诊断，以及在癌症诊断中提到的批准和商业化测试套件。本章的最后一节描述了在生物医学研究中常用的基于抗体的技术和检测格式，如流式细胞术、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定（ELISA）。由于它们出色的特异性，许多基础和常规实验室应用都基于抗体与其相应抗原的相互作用。 1.抗体在治疗中的应用 在过去三十年中，单克隆抗体（mAbs）和类似抗体分子（如抗体片段或双特异性抗体，详见其他章节）在成为有效的人类治疗药物方面取得了巨大成功。第一个获批的单克隆抗体是1986年的穆罗莫纳布（Orthoclone OKT3®; Janssen-Cilag），针对CD3用于预防肾脏移植排斥。它与循环T细胞表面的CD3 epsilon链（T细胞受体复合体的一部分）结合，最终导致T细胞的无能和凋亡，从而保护移植体免受相应的免疫反应。这种分子仍然是完全小鼠源的，由于患者体内产生抗药物抗体，因此对患者构成了严重的免疫原性风险。1990年代分子生物学的重大进展以及基础生物医学科学向临床实践的转化，导致了第一个嵌合体（包含小鼠和人类区域）抗体利妥昔单抗（Rituxan®; Genentech）在1997年获批用于治疗低级别B细胞淋巴瘤。这项技术，随后是人源化和最终完全人类抗体，使得市场批准率大幅增加。第一个获批的完全人类抗体是2004年的阿达木单抗（Humira®; AbbVie），用于治疗类风湿性关节炎。现在大多数正在开发的治疗性抗体要么是人源化的，要么是完全人类。抗体目前也是临床试验中增长最快的生物技术衍生分子群体。2017年，全球单克隆抗体治疗药物市场估值约为950亿美元。目前大约有60种抗体获得FDA批准，并在临床试验的不同阶段用于治疗各种疾病和病症，包括癌症、慢性炎症性疾病、移植、传染病和心血管疾病。以下段落将概述治疗性抗体应用的不同适应症，并讨论一些突出的例子。 肿瘤学目前是治疗性抗体应用的最重要领域。最初仅作为致癌性受体酪氨酸激酶的拮抗剂使用，近年来其治疗应用已显著扩大，包括靶向递送化疗药物（所谓的ADCs—抗体药物偶联物—在本书的另一章中有详细描述）和操纵抗癌免疫反应。目前正在进行多项临床试验，研究这些靶向癌症疗法单独使用或与化疗或其他靶向疗法联合使用。 1.1.西妥昔单抗 受体酪氨酸激酶拮抗剂类别中的一个突出代表是西妥昔单抗（Erbitux®; Merck KGaA/Bristol-Myers Squibb），这是一种嵌合体人-小鼠单克隆IgG1抗体，针对EGFR（表皮生长因子受体）。它通过抑制内源性配体结合、细胞运动、侵袭性、转移和促进凋亡来发挥作用。西妥昔单抗获批用于头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）与放疗联合治疗局部或区域性晚期疾病，与基于铂的疗法联合治疗局部或转移性疾病，或作为单药治疗在基于铂的疗法后进展的复发或转移性疾病。它还获批用于与伊立替康联合治疗转移性结直肠癌，用于对基于伊立替康的化疗耐药的患者，或作为单药治疗在患者已经接受过伊立替康和奥沙利铂方案或对基于伊立替康的化疗不耐受的患者，以及与伊立替康、5-FU、亚叶酸联合治疗一线治疗。 1.2.曲妥珠单抗 针对受体酪氨酸激酶的高效单克隆抗体的另一个例子是曲妥珠单抗（Herceptin®; Genentech）。它与人类表皮生长因子受体2蛋白（HER2/neu）结合，并引起免疫介导的反应和HER2的内化和下调以及细胞周期抑制因子的上调。这最终导致抑制细胞增殖和诱导凋亡。曲妥珠单抗还通过诱导抗血管生成因子和抑制促血管生成因子来介导抗血管生成效应。它获批用于HER2过表达的阳性淋巴结乳腺癌的辅助治疗，作为包含阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇或多西他赛或与多西他赛和卡铂的方案的一部分，或作为单药治疗在多模式蒽环类基础治疗后。它也获批用于转移性乳腺癌，其中肿瘤过表达HER2蛋白，包括与紫杉醇联合的一线治疗和在患者已经接受过一种或多种化疗方案的转移性疾病的单药治疗。另一个适应症是转移性胃癌，用于一线治疗HER2过表达的胃癌或胃食管结合部腺癌患者，与顺铂和卡培他滨或5-氟尿嘧啶联合使用。 由曲妥珠单抗衍生的ADC药物ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®; Genentech）获批用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌患者。该分子由与细胞毒素DM1（emtansine）共价连接的曲妥珠单抗组成。 1.3.利妥昔单抗  除了受体酪氨酸激酶，CD（分化群）抗原也是治疗性抗体的常见靶标。属于这一类的一个突出例子是利妥昔单抗（MabThera®; Roche）。这是一种针对正常B细胞和大多数低级别以及一些高级别B细胞淋巴瘤上发现的CD20的嵌合体单克隆抗体。它的作用机制包括诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC），以及诱导凋亡。利妥昔单抗获批用于复发或难治性低级别或滤泡性CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）作为单药治疗，与一线化疗联合用于滤泡性CD20阳性B细胞NHL，以及在患者在接受利妥昔单抗联合化疗后取得完全或部分反应时作为单药维持治疗。其他适应症包括一线联合化疗后的非进展性低级别CD20阳性B细胞NHL作为单药治疗，以及与CHOP（环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin®, 强的松）或其他蒽环类基础化疗方案联合用于先前未治疗的弥漫性大B细胞CD20阳性NHL。它还获批用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）与氟达拉滨和环磷酰胺联合用于先前未治疗和先前治疗过的CD20阳性CLL，以及其他免疫性疾病，如类风湿性关节炎和肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎。 肿瘤学领域的一个重要最新发现是免疫检查点分子，这些分子抑制抗癌免疫反应。这些蛋白质包括程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）、其配体程序性死亡配体1（PD-L1）和2（PD-L2），以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），等等。已经开发出免疫检查点蛋白的抑制剂，以“解除”通常受阻的抗癌免疫反应的“刹车”。这种免疫检查点的调节成为治疗多种实体恶性肿瘤的一种手段，因为在许多患者中看到了持久的反应和与传统化疗药物相比改善的副作用概况。 1.4.伊匹单抗  伊匹单抗（Yervoy®; Bristol-Myers Squibb）是目前唯一获得FDA批准的抗CTLA-4抗体。这种完全人类抗体结合并阻断CTLA-4与其配体CD80/CD86的相互作用，导致T细胞的激活和增殖，因此被认为在维持对癌细胞的积极免疫反应中发挥关键作用。伊匹单抗获批用于无法切除或转移性黑色素瘤（2011年），以及与Opdivo联合用于晚期肾细胞癌和转移性结直肠癌（2018年）。 2012年报道了第一个研究抗PD-1抗体的第一阶段I试验，此后该领域有了显著增长。最广泛研究的PD-1抑制剂由nivolumab（Opdivo®; Bristol-Myers Squibb）和pembrolizumab（Keytruda®; Merck Sharp & Dohme）代表，尽管这个类别中还存在其他几种mAbs。nivolumab和pembrolizumab都属于IgG4亚类，但每种的表位结合区域不同。两者都对PD-1具有高亲和力和高特异性，并阻断PD-L1的结合。 1.5.Nivolumab Nivolumab于2014年12月首次获得FDA批准，用于治疗伊匹单抗失败后的无法切除/转移性黑色素瘤（如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂）。进一步的皮肤癌相关适应症包括与伊匹单抗联合治疗BRAF V600野生型、无法切除/转移性黑色素瘤和完全手术切除后的III期黑色素瘤的辅助治疗。2017年，nivolumab获得批准，作为二线单药治疗转移性或手术无法切除的尿路上皮癌，这些患者在先前接受至少一种基于铂的化疗方案后进展或复发。其他适应症包括转移性DNA错配修复缺陷/微卫星不稳定性高结直肠癌；在化疗后进展或复发的复发性SCCHN；在先前接受过血管内皮生长因子抑制剂治疗后失败的肝细胞癌（HCC）；在自体干细胞移植和移植后brentuximab vedotin后进展的经典霍奇金淋巴瘤（cHL）；在先前接受基于铂的化疗后进展的转移性鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）和非鳞状NSCLC；有先前抗血管生成治疗历史的晚期肾细胞癌（RCC）；与伊匹单抗联合用于先前未治疗的晚期肾细胞癌；在先前接受基于铂的化疗和另一种治疗线后疾病进展的小细胞肺癌（SCLC）。 1.6.Pembrolizumab Pembrolizumab于2014年9月首次获得FDA批准，用于治疗黑色素瘤。此后，适应症已扩大；包括在伊匹单抗治疗后疾病进展的转移性黑色素瘤，如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂，以及III期疾病切除后的辅助治疗。其他适应症包括作为二线治疗的宫颈鳞状细胞癌（CSCC）；在多种先前治疗后进展的复发性、晚期胃或胃食管结合部（GEJ）腺癌，已知肿瘤PD-L1表达；一线治疗转移性/不可切除复发性SCCHN，对于已知PD-L1表达的肿瘤单独使用和与基于铂的化疗和氟尿嘧啶联合使用；作为先前接受过索拉非尼治疗的患者的单药治疗的肝细胞癌（HCC）；在接受三线或更多线治疗后难治性或复发性cHL；成人和儿童局部晚期或转移性默克尔细胞癌（MCC）的一线治疗；已知肿瘤PD-L1表达的转移性NSCLC，在先前接受基于铂的化疗后进展；已知肿瘤PD-L1表达的转移性SCLC，在先前接受基于铂的化疗和至少一种其他治疗线后进展；在接受两线化疗后复发的复发性/难治性原发性纵隔B细胞淋巴瘤（rrPMBCL）；以及作为晚期疾病患者的一线治疗的肾细胞癌（RCC）。除此之外，FDA在2017年批准pembrolizumab作为第一个组织不可知的癌症治疗，用于表达MSI-H或dMMR的无法切除或转移性实体瘤，这标志着FDA首次基于生物标志物表达而非特定疾病进行批准。目前的批准适用于在治疗后进展且没有其他当前治疗选择的实体瘤。 1.7.Avelumab 虽然抗PD-1疗法为PD-1/PD-L1轴的调节铺平了道路，但针对PD-L1的mAbs研究紧随其后。Avelumab（Bavencio®; Merck/Pfizer）是一种治疗性抗PD-L1 mAb的例子。它于2017年3月首次获得FDA批准，用于治疗12岁及以上患者的转移性MCC，随后在2017年5月获得加速FDA批准，用于治疗对基于铂的化疗耐药12个月的转移性尿路上皮癌。它还于2019年5月获批与阿西替尼联合用于晚期RCC患者的一线治疗。 1.8.阿达木单抗 尽管肿瘤学显然是最重要的适应症，但治疗性抗体的临床应用领域并不仅限于此。治疗风湿性疾病的单克隆抗体中的一个突出例子是阿达木单抗（Humira®; AbbVie）。阿达木单抗是一种完全人类单克隆抗体，通过结合TNF-α并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，从而实现免疫抑制。它是FDA于2002年12月批准的第一种用于治疗中度至重度活动性成人类风湿关节炎的人类单克隆抗体。其他适应症包括银屑病性关节炎（2005年）、强直性脊柱炎（2006年）、克罗恩病（2007年）、幼年特发性关节炎（2008年）、慢性斑块状银屑病（2008年）、溃疡性结肠炎（2012年）和化脓性汗腺炎（2015年）。除了传统的单克隆抗体，人们对于开发双特异性抗体（BsAbs）用于治疗应用的兴趣日益增加。在过去十年中，致力于BsAbs的文章数量一直在稳步增加。《自然评论药物发现》杂志在2014年将BsAbs称为“下一代抗体”。双特异性抗体在本书的另一章中有详细讨论。然而，这里应简要提及两个临床应用中的BsAbs示例：blinatumomab（Blincyto®; Amgen）和emicizumab（Hemlibra®; Roche）。 1.9.Blinatumomab Blinatumomab（Blincyto®; Amgen）是一种双特异性CD19导向的CD3“T细胞引导器”。它结合在B细胞谱系来源的细胞和T细胞表面表达的CD19和CD3，分别导致内源性T细胞的激活和通过细胞毒性T细胞溶解CD19阳性的良性和恶性B细胞。它目前被批准用于B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）在第一次或第二次完全缓解中，最小残留疾病大于或等于0.1%，以及复发或难治性B细胞前体ALL。 1.10.Emicizumab Emicizumab（Hemlibra®; Roche）是一种双特异性抗体，它结合在激活的凝血因子IX和因子X上，从而介导后者的激活。这实际上是健康个体中凝血因子VIII的功能，但在血友病A患者中缺失。Emicizumab于2017年11月获得批准，用于治疗对其他治疗产生抵抗的血友病A患者，随后于2018年4月获得批准，用于尚未对其他治疗产生抵抗的患者。 上述讨论的治疗性抗体的额外概览也见于表1。 表 1 列出了选定并批准的治疗性单克隆抗体，并参考了各自的抗体类型、靶点、适应症和作用机制。 2.抗体在诊断中的应用 由于抗体显示出高亲和力和高抗原特异性，它们是疾病诊断和预后评估中非侵入性体内成像和体外免疫测定的理想候选物。抗体应用于肿瘤学、免疫学、微生物学、血液学和病理学等多个学科。此外，它们是识别通过病毒、细菌或寄生虫传播的传染病、诊断代谢紊乱和癌症成像的有用工具。 明确识别给定的传染病病原体不仅对特定患者重要，对公共卫生也很重要。在这方面，对国家卫生研究所来说，区分人类群体中的大流行和仅局部感染是至关重要的。及早识别大流行细菌株或病毒，特别是当感染可以无症状或潜伏时，有助于及时采取所需行动，防止疾病传播。例如，检测由结核分枝杆菌引起的结核病（TB）的一种经过验证的方法是使用商业测试套件Xpert® MTB/RIF（Cepheid）进行特定的嵌套PCR（聚合酶链反应）方法，或者培养细菌，这可能需要数周时间才能获得可靠的结果。Xpert® MTB/RIF测试是一种完全自动化的核酸扩增测试。它极大地促进了控制全球结核感染和降低疾病流行率的目标，因为它是一种快速且敏感的诊断工具。与培养细菌的过程相比，它可以快速提供结果，但成本较高，需要特殊的处理设备（GeneXpert, Cepheid）来提供结果。已经有改进的早期结核病检测方法可用，如Qiagen的QuantiFERON®-TB Gold-Plus（QTF-Plus）干扰素-γ释放测定。QTF-Plus是一种两步测定，包括在全血样本中进行干扰素ɣ（IFNɣ）体外刺激步骤，随后进行酶联免疫吸附测定（ELISA），使用小鼠单克隆抗-INFɣ抗体来量化与M. tuberculosis感染相关的IFNɣ释放量。QTF-Plus需要熟练的操作员和实验室基础设施才能应用。新开发的现场检测试验利用单特异性或双特异性抗体在夹心型、一步法测定中结合拭子或尿液样本中的分枝杆菌脂阿拉伯聚糖（LAM）。基于这种方法的商业免疫学测试套件包括，例如，Determine®-TB Alere（Abott）和FujiLAM（Fujifilm）（www.who.int）。 另一个例子是对患者进行呼吸道合胞病毒（RSV）感染的检测。RSV是一种常见的呼吸道病毒，它引起的症状通常较轻，但对于1岁以下的儿童来说可能会很严重，它是细支气管炎和肺炎的主要原因。除了使用实时PCR（RT-PCR）方法作为检测RSV感染的黄金标准之外，还有CerTest RSV（CerTest Biotec S.L.）这样的定性测试套件可用，它不那么复杂。这是一种一步式彩色色谱免疫分析，通过检测鼻拭子、鼻咽冲洗液或抽吸物样本中的RSV抗原，非常快速地提供关于个人感染状态的信息。尽管这种测试能够快速得到结果，但在特定患者亚群中其敏感性要低得多。CerTest基于色谱免疫分析方法，用于检测来自患者呼吸道分泌物样本的RSV抗原。这种技术以及上述描述的检测结核感染的测试如Determine®-TB Alere背后的技术被称为侧流免疫分析（LFIA）。LFIAs不仅在医疗应用中有用，还用于检测药物滥用、农业安全、动物健康和食品质量。最早的测试之一是检测女性尿液中的人类绒毛膜促性腺激素（hCG），以确认或排除妊娠。LFIA的一个优点是患者可以直接应用，技术简单、快速且成本低。该测试甚至可以在没有熟练人员或实验室设施的情况下进行，这使得它对于没有健全卫生基础设施的发展中国家具有吸引力。根据WHO的特点，LFIAs被描述为ASSURED：负担得起、敏感、特定、用户友好、快速和稳健、无需设备、可交付给最终用户。本节重点介绍使用抗体识别的LFIAs。也在开发利用核酸探针的测试（NALFIA，核酸侧流免疫分析）。对于NALFIA，分析物是通过PCR产生的扩增子，在分析测试条之前。使用特定的引物在扩增子上附加两个不同的标签，随后通过测试条上特定标签的单克隆抗体进行检测。与传统PCR分析相比，这种联合方法更快，因为扩增子不再需要通过电泳分离了。例如，PCR混合物中的扩增子可以通过特定引物用生物素和FITC标记，并在NALFIA的样品垫上添加后，被金纳米粒子标记的单克隆抗FITC抗体结合。这个复合物通过膜迁移并在测试线被固定的抗生物素单克隆抗体结合，金纳米粒子集中并产生与混合物中扩增子浓度成比例的颜色信号。Pecchia和Da Lio描述了这种方法，并将其用于检测土壤样本中的真菌病原体Macrophomina phaseolina。 LFIAs可以用来检测抗体和其他抗原，如激素、肽或毒素，从血液、血清或其他液体和复杂样本中。该方法依赖于色谱和免疫染色的结合。在LFIA技术的初期，测试被设计为只给出定性结果，如信号的出现或缺失，转化为是或否的结果。现在正在开发的测试可以提供半定量结果，并与自动化读取设备结合使用。图1显示了一个典型的测试条构造。测试条由许多不同的元素组成，通常比看上去更复杂。含有分析物的液体样本被施加到样品垫上，在那里它与重组缓冲液、盐和表面活性剂或其他液体混合。这一步对样本准备很重要，确保恒定的流速和样本向结合垫和测试控制线的控制分布，对抗原-抗体相互作用至关重要，因为蛋白质的溶解度受pH影响。许多抗体的等电点（pI）在pH 5.5和7.5之间。因此，pH 7.0和7.5之间可能是最佳的，缓冲条件应相应调整。另一方面，流速由膜本身的材料决定。硝酸纤维素是一种常用的材料。其他如聚偏氟乙烯、改性尼龙和聚醚砜。有利的膜材料具有优越的毛细作用力和恒定的流速，并允许在测试和控制线上容易结合和固定抗体。结合机制主要是静电和疏水相互作用。固定能力由聚合物表面积、孔隙度、厚度和材料本身的结构特征定义。在施加液体样本后，它迁移到结合垫。这持有检测复合物并将样本和检测复合物传递到膜和测试控制线。与胶体金纳米粒子结合的识别抗体是通常用于结合垫的检测复合物。纤维素纳米珠、乳胶珠、顺磁性珠或荧光分子也可以使用。选择识别/捕获抗体是设计特定LFIA中最重要的部分，因为结合特性如抗体的结合常数（KD）和特异性对测试灵敏度和背景信号有很大影响。信号在其最简单的形式是一个比色信号，它是由分析物相关联的聚集（夹心测定）或解聚（竞争测定）产生的。识别抗体被吸收到金颗粒上，并且可以结合到复杂样本中的分析物。其他标签可以是荧光染料、发光分子和量子点。使用这些标签可能会提高LFIA的灵敏度，但不能再由操作员直接用肉眼检测，并且需要额外的设备，如荧光读取器。Shi等人使用超顺磁性纳米粒子和磁性读取器，将测定灵敏度提高了十倍。通过应用酶信号放大反应可以增强比色信号。辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）在提高ELISA灵敏度方面都有很好的效果，尽管也用于LFIAs。测试条的末端有一个吸收垫。它的主要功能是吸收液体，从而增加分析样本的体积。 图1 展示了标准侧流测定（侧面视图）的示意图。测试条通常位于一个塑料外壳内，外壳有一个或在多重格式下有不同数量的开口用于样本管理，以及一个窗口用于观察测试和控制线的结果。液体样本通过样本端口被施加到样本垫上，在那里它与重组缓冲液组分和化学品如洗涤剂、表面活性剂或封闭剂以及其他根据测试的具体应用而变化的物质混合。样本迁移到重叠的结合垫上，检测复合物就位于那里。复合物被重组并且随着样本移动到膜上，在那里它通过测试和控制区域。在测试条的末端，吸收垫吸收液体并增强测试条的整体容量。吸附垫通过这种方式增加测定的灵敏度。在测试和控制线测定中，特定的捕获抗体被固定，它们捕获分析物-检测器或控制复合物。 总的来说，LFIAs可以分为直接和间接测定。激素和其他蛋白质和肽类分析物通常通过夹心测定进行分析，因为这类分析物通常具有多个表位，分析物可以被不同的抗体种类结合，这对于双重抗体夹心测定是必要的。半抗原和小化学物质如药物及其代谢产物通常通过竞争或抑制测定进行分析。因此，LFIAs像其他免疫测定格式一样被设计。与其他复杂格式如ELISA不同，它们是简单的基于纸张的分析测试，并且可以设计成微阵列和多重格式，提供快速结果，无需训练有素和熟练的操作员。尽管它们有缺点，如定量结果较少和灵敏度通常较低，但它们在临床护理和近患者诊断领域做出了巨大贡献。 酶联免疫吸附测定（ELISA）非常特异和灵敏，能够检测和定量简单或复杂样本中非常低的分析物浓度。其原理基于抗原和抗体之间非常特异的相互作用。它的应用在科学和诊断中有许多，例如，检测自身免疫疾病生物标志物。这些可能是患者血清样本中的自身抗体。通常使用三种类型的ELISA，如图2所示：间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。在间接ELISA中，含有分析物的样本（例如，患者的血清）被包被到微孔板的孔中。在阻断剩余结合位点之后，添加检测抗体和与初级检测抗体特异性结合的酶标记的二抗。添加底物后，可以使用特定的ELISA读取设备测量转化为有色产物的过程。也可以开发基于化学发光和荧光的报告分子，并可能提高测定灵敏度。在这方面需要特殊设备。信号强度与样本中分析物浓度直接相关，并与标准曲线进行比较。为了准备标准曲线，必须有纯化的分析物样本，以便同时分析标准曲线和样本稀释液。分析物浓度与信号强度之间的线性关系受到狭窄动态范围的限制。间接ELISA通常用于识别和定量如抗体或人血清样本中的细胞因子水平，例如，诊断内分泌疾病（人类IL-13 Quantikine ELISA KIT, R&D Systems, Inc.）。间接ELISA方法容易受到基质效应的影响，如果分析物是血或血清等复杂基质的一部分，可能会抑制完整分析物的恢复。通过稀释血清样本可以限制不利的基质效应。通过使用特定的捕获抗体将分析物固定在板孔表面，ELISA可以非常特异。在夹心ELISA中，固定的捕获抗体从基质中结合分析物，然后可以使用酶标记的检测抗体检测针对不同表位的初级抗体。剩余结合位点的阻断不充分或洗涤不充分会导致假阳性结果，因为分析物会非特异性地结合到孔表面，或者未结合的检测抗体残留在溶液中。酶标记的二级检测抗体结合捕获的分析物，并在添加底物后实现比色读出。分析物被夹在两种抗体之间。PerkinElmer, Inc.的Alliance HIV-1 p24 ELISA测试是检测血清、血液和细胞培养样本中病毒标志物衣壳蛋白p24的常用测试套件。感染初期p24水平非常低，以及感染者血液样本中游离p24抗原和抗p24抗体的复合物，可能导致检测到的感染不一致。常规ELISA测试很难检测到复合抗原。可以应用基于HRP的光化学信号放大方法，将该ELISA的灵敏度提高多达40倍。在竞争ELISA中，样本中检测抗体和结合抗原的复合物被添加到孔中，孔表面包被重组纯化抗原。样本中的分析物（分析物）和包被抗原竞争与抗体结合。在这种设置中，信号强度的降低与分析物浓度相关。 此外，抗体在识别肿瘤疾病中的异常细胞和识别起源细胞谱系方面也很有帮助，这对于癌症类型的诊断和后续治疗的确定至关重要。例如，抗体用于通过流式细胞术免疫表型分类从淋巴结细针抽吸物、组织样本和其他体液中的淋巴瘤亚型。在这种方法中，可以通过同时应用几种与不同荧光团结合的特定单克隆抗体，平行检测多个生物标志物，例如细胞表面的抗原。例如，可以通过检测这些抗原的表达模式的修改来识别恶性细胞。在流式细胞术中，含有待评估活细胞的患者样本预先与抗原特异性荧光标记的单克隆抗体一起孵育。在流式细胞仪中，细胞被分散，并以悬浮状态逐个通过激光束。被标记的细胞被激光激发，并发射与荧光团光谱相对应的特定波长的光，由探测器测量。使用一套合适的标记抗体和激光源，可以分析复杂人群中每个细胞的各种物理参数，这些参数产生关于表面抗原表达模式和细胞的粒度和大小的信息。这与IHC相反，IHC一次只能评估一个或两个标记。为了亚型化淋巴瘤，分析白细胞标志物的表型表达是有利的。这些标志物的表达模式可以通知细胞类型的起源和分化阶段，可以预测肿瘤细胞克隆在治疗中的反应。在这方面，流式细胞术使得可以同时、多参数和定量分析几个表面标志物，并有助于区分，例如，慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和更具侵略性的白血病类型。治疗后，流式细胞术用于分析在治疗期间未被消除的最小剩余恶性细胞的数量，这些细胞可以引发癌症复发。这称为最小残留病，是慢性淋巴细胞性白血病的可靠预后标志。 在治疗期间，监测治疗反应以及疾病进展和严重程度是有利的，通常也是必需的。一个重要的例子是乳腺癌肿瘤的分类。预后和治疗决策主要取决于肿瘤分期、肿瘤分级、激素受体状态和HER2状态。只有HER2阳性肿瘤才使用抗HER2抗体曲妥珠单抗进行治疗。通常使用两种不同的方法来分析乳腺癌肿瘤的HER2状态。FISH（荧光原位杂交）分析HER2基因扩增，而IHC（免疫组织化学）分析组织样本中HER2的表达和分布。HER2过表达通常与预后不良相关。FDA批准的测试套件包括，例如，HercepTest™ 、InSite® (BioGenex Laboratories Inc.)、Bond Oracle™ (Leica Biosystems)和Ventana HER2 Pathway® System (Ventana Medical Systems, Inc.) 。它使用兔单克隆抗HER2抗体（克隆4B5）和过氧化物酶结合的二抗，通过免疫组织化学测定半定量分析甲醛固定和石蜡包埋的乳腺癌组织样本的HER2状态。不幸的是，测试程序和样本处理中的变量会影响测试结果。这些是固定剂的类型、固定时间、石蜡块的存储和切片的厚度（手动 Agilent/DAKO）。甲醛处理通常对初级检测抗体的表位识别产生不利影响，这种影响可能对染色模式产生很大影响。事实证明，通过FISH分析HER2基因扩增是在这方面更可靠的诊断技术。 在免疫分析检测试剂的特殊类别中，双特异性抗体分子代表了一类。在诊断分析中使用双特异性抗体可以减少分析复杂性，通过减少程序步骤总数和提高单特异性抗体的灵敏度。这是通过它们固有的结合两个不同表位的能力实现的。在免疫分析中，双特异性检测抗体可以用一个臂结合分析物，用另一个臂结合报告分子。这种安排的优点是报告分子（例如，FITC（荧光素）或酶）和抗体不再彼此共价结合，这可能会对它们的功能产生不利影响。 免疫PET（基于免疫的正电子发射断层扫描）是癌症成像的应用之一。免疫PET用于分析体内肿瘤抗原的表达和分布，基于此，有助于选择最合适的靶向治疗。免疫PET探针通常由正电子发射放射性同位素标记的单克隆抗体组成，这些抗体特异性结合肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面分子或生物标志物，以及PET扫描仪。在这方面的一个关键方面是抗体分子的生物半衰期和放射性同位素的物理半衰期需要平衡。由于抗体由于其大尺寸（150 kDa）和FcRn（新生儿Fc受体）循环而在体内保留时间较长，它们与较小分子（如重组抗体片段）相比，肿瘤穿透性也较差。因此，它们需要与具有适当半衰期的放射性同位素耦合，因为成像通常在注射后1天进行，以实现探针的生物分布。抗体探针应用于循环中，并结合肿瘤相关抗原，对病变进行特异性标记。在那段时间里，患者会接触到一定量的辐射，这随着探针在体内的保留时间而增加。改进这种方法的一个例子是，将双特异性抗体的一个结合位点设计成对半抗原的特异性。半抗原本身被放射性同位素标记，例如，用68Ga或18F。另一个结合位点特异性结合肿瘤相关抗原CEA（癌胚抗原）。CEA 半抗原双特异性抗体显示出特异性肿瘤靶向和对CEA阴性组织的较小靶向。这种使用双特异性抗半抗原抗体的预靶向方法，从循环中更快地清除放射性同位素，没有非特异性标记，并且对肿瘤的可视化良好且快速。它减少了患者接触同位素的总体时间，这对患者可能是一个巨大的好处。另一种方法是使用较小的抗体片段，如F(ab)2或scFv片段，以提高靶向的清除率。 图2 展示了三种常用的ELISA格式，用于诊断应用。(a) 显示了直接ELISA的设置，其中感兴趣的抗原（分析物）被包被到ELISA板的孔表面。抗原通过酶标记的检测抗体结合，或者为了信号放大，通过检测抗体然后通过多克隆酶标记的二级抗体结合。在 (b) 中，以示意图形式展示了夹心型ELISA测定。分析物通过捕获抗体的结合附着到孔表面，并通过另一个表位被酶标记的检测抗体结合，或者再次通过使用多克隆酶标记的二级抗体进行信号放大。(c) 显示了竞争ELISA设置的一个例子。要检测的分析物被固定到孔表面，并且可以被酶标记的检测抗体结合。如果样本中分析物的浓度增加，检测抗体更有可能结合到可溶性分析物上，这转化为信号强度的降低。 3.抗体在科学中的应用  抗体对特定抗原的极高灵敏度和特异性也使它们成为许多研究应用的理想试剂。事实上，随着现代生物技术大规模生产的便利，抗体已经成为生物医学研究的主要工具。单克隆（均质同种型和抗原特异性）和多克隆（异质同种型和抗原特异性）抗体都可以从工业供应商那里获得。多克隆抗体是从免疫目标抗原的动物血清中分离出来的。它们包含针对同一抗原的不同表位的不同抗体的混合物，并且可能还含有针对不相关蛋白的抗体，这可能会影响测定结果。此外，多克隆抗体的供应依赖于来源动物，因此没有两批针对特定抗原的多克隆抗体是相同的。相比之下，单克隆抗体来自杂交瘤或通过表达载体重组制备，两者都确保了均质抗体的持续供应。 3.1.免疫沉淀  免疫沉淀（IP）是一种使用抗体从水溶液中沉淀或“拉下”其相应目标抗原的方法，例如细胞裂解物或生物流体。沉淀过程是通过使用特殊珠子来促进的，这些珠子与抗体的Fc区域结合（通常是通过抗Fc抗体或蛋白A/G的共价结合）。珠子本身通常由琼脂糖、琼脂糖或其他合成聚合物组成。通过离心、磁场力或其他机械方法实现珠子上抗体-抗原复合物的分离。IP测定通常用于许多生化、细胞或分子生物学应用。一个基本应用是简单地纯化目标蛋白以进行后续测定，如电泳或西方印迹（见下文）。IP也可以用来分析多种蛋白质的相互作用。在这些情况下，使用抗体沉淀目标蛋白，并使用后续测定（如质谱分析）来确定是否有其他蛋白被拉下复合物。 3.2.染色质免疫沉淀 染色质免疫沉淀（ChIP）是IP的一种特殊变体，用于分析蛋白质与核酸的相互作用。该方法最初是为评估RNA聚合酶II与其目标基因核苷酸序列而开发的。在这个过程中，细胞被固定以交联DNA与任何结合蛋白。在细胞裂解和DNA-蛋白质复合物裂解成100-300碱基对的片段后，使用针对感兴趣蛋白（例如，转录因子）的抗体按照标准IP协议进行免疫沉淀。DNA-蛋白质复合物最终通过解决交联来解离，并通过PCR扩增分析沉淀的DNA片段。ChIP也可以用来分析其他与DNA共沉淀的蛋白质，通过质谱分析。有时化学交联可能会改变抗原表位的结构，导致抗体结合的破坏。对于这种情况，可以进行NChIP，即省略交联步骤并在天然抗原上进行IP的ChIP变体。然而，这种策略仅限于与DNA强烈结合的目标蛋白。ChIP的最新进展是ChIP-chip，即基因组范围内的ChIP分离DNA的微阵列分析，以及ChIP-seq，即在免疫沉淀DNA后进行高通量测序。 3.3.西方印迹 西方印迹（WB）是一种方法，它将凝胶电泳的分辨率与抗体检测的特异性结合起来。在这个过程中，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后通过电荷转移到吸收性印迹膜上。对于那些在蛋白质变性后不识别其相应目标抗原的抗体，也可以应用原生PAGE（不含SDS）。蛋白质转移后，印迹膜被封闭以减少非特异性蛋白质结合，随后与目标蛋白特异性的初级抗体孵育。由于初级抗体通常没有标记，因此使用标记的二抗来检测，二抗特异性结合初级抗体的Fc部分。相应的标签通常是用于比色或化学发光反应的酶，或者是荧光团，这取决于后续分析的类型。WB可以用来检测抗原的存在和数量、其分子量以及抗原提取的效率。这种方法在处理不溶性、难以标记或容易降解的抗原时特别有用，因此不适合如免疫沉淀等程序。 3.4.酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA方法已在“抗体在诊断中的应用”部分描述，因为它是一种成熟且稳健的方法，用于检测和定量复杂生物样本（如人血清）中与疾病相关的极低量的分析物。一般来说，酶联免疫吸附测定是一种识别和分析流体中分子浓度的方法。它依赖于抗体与其特异性抗原的非常特异性和高亲和力的相互作用。用于ELISA的酶包括，例如，β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果添加了特定的可溶性底物，就会发生酶-底物反应，并产生在分光光度计上在400-600 nm处读取的比色产品信号，根据标准曲线通知分析物的浓度。ELISA通常用于肽和蛋白质分析。除了其他非常敏感和更现代的方法外，它仍然是一种稳健、简单且经常应用的测定系统，不需要太多的自动化。尽管如此，包含移液机器人、微孔板洗涤器和吸光度读数器的完整自动化系统是可用的（参见，例如，Hamilton公司）。在1975年Köhler和Milstein引入的杂交瘤技术用于单克隆抗体生产期间，ELISA用于分析免疫动物的血清抗体滴度。在抗体产生B细胞和不朽骨髓瘤细胞融合后，相应的杂交瘤细胞产生单克隆抗体。使用ELISA筛选细胞上清液，以识别产生抗体的杂交瘤细胞。在使用噬菌体展示进行重组抗体发现时，噬菌体-ELISA应用于筛选后富集噬菌体池的生化特征。 3.5.免疫组织化学/免疫细胞化学 免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）通常是用于原位检测组织和细胞内蛋白质存在和位置的方法。虽然ICC是在从周围细胞外基质中移除的完整细胞上进行的，但IHC是在固定的整个组织切片上进行的（图3）。这两种方法都使用单克隆或多克隆抗体来检测目标结构。然而，重要的是要考虑后者是识别多个表位的抗体的异质混合物，这也可能导致非特异性结合。染色可以通过直接标记初级抗体或使用标记的二抗来完成，二抗特异性结合初级抗体的恒定部分。根据后续检测方法的不同，可以使用不同的染色报告器。使用酶联抗体和比色底物的比色染色通常使用。这种方法相对容易，幻灯片可以通过标准显微镜分析。缺点是可能由于内源性酶活性而导致更高的信号背景，以及每个样本只能针对一个或两个抗原。另一种方法是使用荧光标记抗体（免疫荧光），这允许同时标记和检测多个抗原。这可以通过使用来自不同物种或亚类的初级抗体以及相应的标记二抗来实现IHC和ICC。对于高分辨率分析，也可以应用免疫金染色（IGS）。这种方法使用与不同大小的金颗粒链接的抗体，允许在单个样本中检测不同的抗原。样本分析最终在高分辨率的电子显微镜扫描中进行，具有高灵敏度，允许在细胞和组织内非常精确地定位目标抗原。IHC和ICC在基础研究中广泛用于理解生物标记物和不同细胞或生物组织部分中差异表达蛋白的分布和定位。 图3 展示了免疫组织化学程序的示意图。组织样本被安装在载玻片上（a）。组织样本与特异性初级抗体孵育（b）。组织样本与标记有报告分子的二级抗体孵育，该二级抗体特异性结合初级抗体的恒定区域（c）。 3.6.免疫PCR和邻近连接测定 免疫PCR是ELISA和聚合酶链反应（PCR）的结合。在这种情况下，检测抗体与DNA寡核苷酸链接，该寡核苷酸通过PCR扩增。扩增的DNA分子可以使用标准荧光方法检测。邻近连接测定（PLA）是一种技术，它扩展了经典免疫PCR的能力，以包括以高特异性和灵敏度检测蛋白质相互作用。该方法基于使用带有寡核苷酸标记的二抗（称为PLA探针）。这些抗体结合针对目标抗原的不同初级抗体的恒定区域。当PLA探针彼此靠近（大约20-40 nm，例如，当两个分析的目标抗原相互作用或形成蛋白质复合物的一部分时），寡核苷酸探针可以杂交并在添加两个“连接寡核苷酸”和DNA聚合酶后参与循环DNA合成。产生的扩增的圆形结构仍然共价连接到其中一个PLA探针上，并且可以通过标准荧光方法再次检测。 3.7.流式细胞术 流式细胞术是一种高度复杂的方法，用于分析单个细胞（包括细菌和微生物细胞）的多个物理参数，这些细胞来自含有大量细胞的样本，并具有高通量。也可以分析人工颗粒，如可以装载蛋白质和荧光分子的聚合物珠子。因此，该方法在临床中用于支持细胞水平的疾病诊断，例如免疫表型（见“抗体在诊断中的应用”），以及在科学中筛选大型肽和基于蛋白质的文库，用于定向进化。流式细胞术的原理是通过被分析的细胞和颗粒散射和发射光。给定细胞的形态结构和荧光团装载与光散射和荧光发射相关。流式细胞术设备的重要组件包括流体学、光学、探测器、光电倍增器和计算机。它们共同工作，将含有细胞的液流和激光束聚焦到流动室，使细胞逐一通过激光，通过探测器检测发射和散射的光。检测荧光信号需要特殊的滤光片，这些滤光片依赖于发射荧光的波长。探测器下游的光电倍增器将光信号转换为放大的电子信号。 对于科学应用来说，将流式细胞术与分选单元耦合的可能性特别吸引人。通常，使用特殊的FACS（荧光激活细胞分选）机器。FACS能够从大型异质细胞群体中分离出具有定义参数的单个细胞。通过使含有细胞的液滴通过由两个偏转板产生的强电场来偏转液滴，从而实现单个细胞的分选。在抗体工程领域的定向进化方法中，可以从在微生物细胞上展示的大型基于抗体的文库中分离出具有改进特性的结合物，例如特异性或结合常数（KD）。 流式细胞术的重要发现是量子点，它在光谱分辨率方面显示出优越的特性，并减少了传统荧光团（如FITC（荧光素）或PE（R-藻红蛋白））所知的重叠光谱问题。量子点不褪色且非常光稳定。尽管如此，它们尚未成功建立一个稳健的工具产品系列，因此在二级染色分子领域仍然由抗体-荧光团缀合物主导。 3.8.质谱 质谱（MS）是一种分析方法，用于测量离子的质量-电荷（m/z）比，以识别和定量简单和复杂基质中的分子。MS是蛋白质组学、药物发现、环境分析和生物医学研究等广泛科学领域的主要工具。然而，MS的一个常见问题是高丰度蛋白的存在，这些蛋白掩盖了一些感兴趣的蛋白。克服这个问题的策略是将MS与基于抗体的亲和方法结合。在基于免疫沉淀的质谱（IP-MS）中，使用IP捕获和隔离感兴趣的分子，然后通过MS分析。已经开发了几种定量和定性应用，通过将MS与基于抗体的免疫分析结合，提高了MS的灵敏度和特异性。2004年引入的稳定同位素标准和通过抗肽抗体捕获（SISCAPA）是一种方法，其中感兴趣的肽（在使用例如酶胰蛋白酶进行蛋白水解后）通过使用固定在流穿柱或磁性珠子上的抗肽抗体富集。通过选择仅在选定目标蛋白中出现的序列的目标肽，目标肽可以直接作为目标蛋白的定量替代品。将含有稳定同位素标签的合成目标肽以已知量添加到消化样品中，作为内部标准。由于目标肽和标准品由于稳定同位素标签的质量差异可以分别测量，它们的比率提供了目标肽量的所需定量估计。SISCAPA在蛋白质组学领域的多种研究中使用，以及在临床血液检测中，例如，用于验证和定量乳腺癌患者中的生物标志物，如人血清转铁蛋白受体（sTfR）。与SISCAPA类似的方法是免疫-MALDI（iMALDI），其中蛋白水解肽也用抗肽抗体捕获，但富集的样本随后点到特定基质上，最终通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MS分析。该方法已用于诊断不同病理，如高血压和阿尔茨海默病。另一种类似方法是免疫-MRM，将多反应监测质谱（MRM-MS）与基于抗体的肽混合物富集相结合。在MRM-MS中，串联质谱仪的第一阶段选择特定质量的离子，第二阶段选择前体离子的碎片反应的离子产物进行检测。质谱免疫分析（MSIA）是一种自上而下的基于MS的方法，结合了免疫亲和分离和质谱检测。针对目标蛋白的抗体附着在安装在移液器尖端入口的多孔微柱上，可直接从生物样本中进行蛋白亲和提取。亲和捕获后，蛋白可以直接洗脱到目标板上进行MALDI MS分析，或用少量洗脱溶液进行随后的液相色谱-MS（LC-ESI MS）分析。质谱细胞术是流式细胞术和元素质谱的融合。在这种方法中，细胞上的目标蛋白用与独特稳定重金属同位素缀合的抗体标记。随后将标记的细胞雾化，通过氩等离子体使金属缀合抗体离子化。然后通过飞行时间（TOF）质谱仪分析质量-电荷比。该方法克服了基于传统荧光团的宽发射光谱的流式细胞术中的光谱重叠限制。相反，元素质谱能够以高精度区分具有不同原子量的同位素。这一根本差异使得可以使用基于质量的平台同时检测更多的细胞特征。然而，质谱细胞术的当前限制是流速低和操作成本高（与传统流式细胞术相比）。 要点: 抗体是非常多功能的工具，已经成为治疗、诊断和生物医学科学中最重要的生物分子类别。 下章预告：双特异性抗体 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Strong balance sheet with successful completion of upsized $179.0 million initial public offering Treatment initiated in the first patient in an investigator-initiated basket trial of AlloNK® exploring multiple autoimmune indicationsTreated first patient in Artiva sponsored Phase 1/1b trial in patients with class III or IV lupus nephritis (LN) and expanded trial to include patients with systemic lupus erythematosus (SLE) without kidney involvement SAN DIEGO, Aug. 29, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Artiva Biotherapeutics, Inc. (Nasdaq: ARTV), a clinical-stage biotechnology company whose mission is to develop effective, safe, and accessible cell therapies for patients with devastating autoimmune diseases and cancers, today announced financial results for the second quarter ended June 30, 2024, and highlighted recent progress. “Artiva is at an inflection point as we advance AlloNK® in clinical development across multiple autoimmune indications and transition to a publicly traded company,” said Fred Aslan, M.D., Artiva’s Chief Executive Officer. “With two trials in autoimmunity underway, we are focused on the potential of AlloNK® in delivering effective, safe, and accessible cell therapies for patients with devastating autoimmune disease.” Recent Business Highlights AlloNK® Treatment initiated in the first patient in an investigator-initiated basket trial (IIT) exploring AlloNK® in combination with rituximab in patients with rheumatoid arthritis, pemphigus vulgaris, granulomatosis with polyangiitis/microscopic polyangiitis, and SLE. The trial is being conducted by Integral Rheumatology & Immunology Specialists (IRIS), a community rheumatology clinic, demonstrating the potential to bring AlloNK® to patients in a community setting in addition to academic and transplant centers. The study is assessing the safety, tolerability, and clinical activity of AlloNK® (also known as AB-101). Announced treatment of the first LN patient in Artiva sponsored Phase 1/1b trial in April 2024. To Artiva's knowledge, this marks the first patient to receive an allogeneic, off-the-shelf NK cell therapy in a U.S. clinical trial for treatment of an autoimmune disease. In the Phase 1/1b trial, AlloNK® will be administered in combination with rituximab or obinutuzumab. The trial was expanded to include patients with SLE without kidney involvement.Expect to report initial data on autoimmune indications from at least one of the Phase 1/1b trial or the basket IIT in the first half of 2025. Corporate and Financial Updates Significantly extended cash runway through the completion of Artiva’s initial public offering (IPO). Strengthened balance sheet with approximately $179.0 million in gross proceeds from the IPO in July 2024, which extends cash runway at least through the end of 2026 and through key clinical data milestones. Second Quarter 2024 Financial Results Cash, Cash Equivalents and Short-Term Investments. As of June 30, 2024, Artiva had cash, cash equivalents, and short-term investments of $46.6 million. In addition, Artiva completed its IPO in July 2024 in which it sold 14,920,000 shares of its common stock, including partial exercise of the overallotment option, for gross proceeds of $179.0 million. Collaboration Revenue. Collaboration revenue was $0 for the three months ended June 30, 2024, compared to $3.5 million for the three months ended June 30, 2023. Revenues in 2023 were related to the Merck Sharpe & Dohme Corp. collaboration which was terminated in October 2023. Research and Development Expenses. Research and development expenses were $12.3 million for the three months ended June 30, 2024, compared to $11.3 million for the three months ended June 30, 2023. General and Administrative Expenses. General and administrative expenses were $3.9 million for the three months ended June 30, 2024, compared to $4.1 million for the three months ended June 30, 2023.Other Income (Expense), net. Other expense, net, was $1.7 million for the three months ended June 30, 2024, compared to other income, net, of $0.5 million for the three months ended June 30, 2023. Other expense, net, for the three months ended June 30, 2024, includes a loss on change in fair value of simple agreements for future equity (SAFEs) of $2.4 million. Net Loss. Net loss totaled $17.8 million for the three months ending June 30, 2024, as compared to $11.3 million for the three months ending June 30, 2023, with non-cash stock-based compensation expense of $1.5 million and $2.5 million for the three months ended June 30, 2024 and 2023, respectively. About Artiva Biotherapeutics Artiva is a clinical-stage biotechnology company whose mission is to develop effective, safe and accessible cell therapies for patients with devastating autoimmune diseases and cancers. Artiva’s lead program, AlloNK®, is an allogeneic, off-the-shelf, non-genetically modified, cryopreserved NK cell therapy candidate designed to enhance the antibody-dependent cellular cytotoxicity effect of monoclonal antibodies to drive B-cell depletion. AlloNK® is currently in clinical trials for treatment of systemic lupus erythematosus, for patients with or without lupus nephritis, and in an investigator-initiated basket trial in multiple autoimmune indications. Artiva’s pipeline also includes CAR-NK candidates targeting both solid and hematologic cancers. Artiva was founded in 2019 as a spin out of GC Cell, formerly GC Lab Cell Corporation, a leading healthcare company in the Republic of Korea, pursuant to a strategic partnership granting Artiva exclusive worldwide rights (excluding Asia, Australia and New Zealand) to GC Cell’s NK cell manufacturing technology and programs. Artiva is headquartered in San Diego, California. For more information, please visit https://www.artivabio.com/. Forward-Looking StatementsThis press release contains forward-looking statements within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. Statements in this press release that are not statements of historical fact are forward-looking statements. Such forward-looking statements include, without limitation, statements regarding: expectations of Artiva Biotherapeutics, Inc. (the “Company”) regarding the potential benefits, accessibility, effectiveness and safety of AlloNK®; the Company’s expectations regarding timing and availability of data from the Phase 1/1b trial or the IIT; and the Company’s future results of operations and financial position, including cash runway. Words such as “believe,” “anticipate,” “plan,” “expect,” “intend,” “will,” “may,” “goal,” “potential” and similar expressions are intended to identify forward-looking statements, though not all forward-looking statements necessarily contain these identifying words. These forward-looking statements are based on the beliefs of the management of the Company as well as assumptions made by and information currently available to the Company. Such statements reflect the current views of the Company with respect to future events and are subject to known and unknown risks and uncertainties, including business, regulatory, economic and competitive risks and uncertainties about the Company, including, without limitation, risks inherent in developing product candidates, future results from the Company’s ongoing and planned clinical trials, risks related to conducting clinical trials, including delays in activation of clinical trial sites or in subject enrollment, the Company’s ability to obtain adequate financing to fund its planned clinical trials and other expenses, risks that future clinical trial results may not be consistent with interim, initial or preliminary results or results from prior preclinical studies or clinical trials, trends in the industry, the Company’s relationships with its existing and future collaboration partners, the legal and regulatory framework for the industry and future expenditures. In light of these risks and uncertainties, the events or circumstances referred to in the forward-looking statements may not occur. The actual results may vary from the anticipated results and the variations may be material. Other factors that may cause the Company’s actual results to differ from current expectations are discussed in the Company’s filings with the Securities and Exchange Commission (the “SEC”), including the section titled “Risk Factors” in the Company’s Quarterly Report on Form 10-Q for the quarter ended June 30, 2024. You are cautioned not to place undue reliance on these forward-looking statements, which speak only as of the date this press release is given. Except as required by law, the Company undertakes no obligation to publicly update any forward-looking statements, whether as a result of new information, future events or otherwise. Artiva Biotherapeutics, Inc.Condensed Balance Sheets(unaudited)(in thousands) June 30, 2024 December 31,2023Assets Cash, cash equivalents and short-term investments$46,556 $76,971 Property and equipment, net 7,315 8,096 Operating and financing lease right-of-use assets 15,420 16,547 Other assets 6,621 3,500 Total assets$75,912 $105,114 Liabilities, convertible preferred stock, and stockholders' deficit Accounts payable and accrued expenses$7,037 $8,631 Operating and financing lease liabilities 15,765 16,912 Simple agreements for future equity (SAFEs) 27,720 25,100 Other liabilities 74 73 Total liabilities 50,596 50,716 Convertible preferred stock 216,413 216,413 Stockholders' deficit (191,097) (162,015)Total liabilities, convertible preferred stock, and stockholders' deficit$75,912 $105,114 Artiva Biotherapeutics, Inc.Condensed Statements of Operation and Comprehensive Loss(unaudited)(in thousands, except share and per share data) Three Months Ended June 30, Six Months Ended June 30, 2024 2023 2024 2023 Revenue Collaboration revenue$— $3,497 $— $4,487 License and development support revenue — — 251 — Total revenue — 3,497 251 4,487 Operating expenses: Research and development 12,333 11,262 23,488 26,033 General and administrative 3,857 4,059 7,444 7,965 Total operating expenses 16,190 15,321 30,932 33,998 Loss from operations (16,190) (11,824) (30,681) (29,511)Other income (expense) Interest income 676 509 1,326 1,533 Change in fair value of SAFEs (2,352) — (2,620) — Other income (expense), net 23 31 169 (23)Total other income (expense) (1,653) 540 (1,125) 1,510 Net loss$(17,843) $(11,284) $(31,806) $(28,001)Net loss per share, basic and diluted$(22.00) $(14.09) $(39.24) $(35.12)Weighted-average common shares outstanding, basic and diluted 811,210 800,889 810,484 797,403 Comprehensive loss: Net Loss$(17,843) $(11,284) $(31,806) $(28,001)Other comprehensive income (loss) (86) 127 (187) 127 Comprehensive loss$(17,929) $(11,157) $(31,993) $(27,874) ContactsInvestors: Neha Krishnamohan, Artiva Biotherapeutics, ir@artivabio.comMedia: Jessica Yingling, Ph.D., Little Dog Communications Inc., jessica@litldog.com, +1.858.344.8091