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-01- 引言 几十年来，抗体偶联药物（ADC）和生物偶联物的进步彻底改变了各种疾病的靶向治疗。与传统的化疗不同，ADC选择性地靶向肿瘤细胞，同时保留正常细胞，使其非常适合癌症治疗。目前，全球市场上已有17种ADC获得不同国家监管机构的批准。临床试验中有超过200多个ADC正在探索，预计未来几年还有更多ADC商业化，使癌症患者受益。 ADC设计中的多种因素影响其成功，包括抗体、接头、有效载荷选择、药物附着位点和药物抗体比（DAR），所有这些因素都起着重要作用。药物附着在抗体上的方法至关重要；药物连接的位置和方式会影响ADC的稳定性、疗效和药代动力学（PK）。 偶联方法传统上分为两类：随机偶联和位点特异性偶联。进一步，可以将这些技术分为三类。第一类是随机偶联（例如随机赖氨酸）。第二类是位点特异性的，但不是位点选择性的，因为这些位点受到所使用的偶联技术的限制。这一类别包括酶、聚糖、亲和肽偶联和“随机”链间半胱氨酸偶联。第三类是位点特异性和位点选择性，修饰氨基酸序列，如工程半胱氨酸或非天然氨基酸，提供各种结合位点。关于CMC，随机偶联和链间半胱氨酸偶联通常更简单。位点特异性和位点选择性偶联技术提供了更好的同质性，但可能会遇到更多的CMC挑战，包括蛋白质表达问题（如非天然氨基酸）、去除杂质所需的额外纯化步骤（如酶）以及额外的分析和质量控制挑战（如DAR分布）。 -02- 一、随机偶联 赖氨酸偶联是一种成熟的生产ADC的技术，利用赖氨酸残基上约40个溶剂可及的NH2基团，这些基团在中性溶液中具有高度的亲核性。亲电试剂主要针对这些氨基，允许接头有效载荷附着而不改变抗体本身。迄今为止，五种市售ADC证明了赖氨酸偶联的功效。受到这一成功的鼓舞，已经开发了一系列更广泛的连接子，包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及其类似物、苯甲酰氟、异硫氰酸酯和方酸甲酯。  然而，由于这些连接子与杂原子具有高度反应性，因此它们也可以在水中淬灭。事实上，NHS酯的水解是影响赖氨酸偶联中linker-payload（LP）当量的关键因素之一。此外，反应性较低的连接子可以在温和的条件下与半胱氨酸的-SH残基反应，在这种条件下，与赖氨酸的反应很慢。 总的来说，赖氨酸偶联仍然是生产ADC的可靠方法，可以产生化学稳定和可重复的产品。此外，位点特异性结合技术的发展继续增强了其更好的同质性的潜力。 -03- 二、位点特异性但非位点选择性偶联 链间半胱氨酸偶联 通常，IgG1抗体在溶剂暴露区域含有四对链间二硫键。使用还原剂如三（2-羧乙基）膦（TCEP）和DL-二硫苏糖醇（DTT）还原后，可以获得八种游离硫醇。与赖氨酸残基上的SN2反应相比，硫醇作为亲核试剂更柔软，更容易发生迈克尔加成反应。这种特性允许马来酰亚胺及其类似物用作连接子，从而能够形成清洁且几乎定量的巯基丁二酰亚胺。这种生物正交化学非常适合抗体修饰，产生具有0、2、4、6和8个有效载荷的变体。 由于巯基较少，半胱氨酸介导的ADC异质性远低于赖氨酸方法。与其他偶联方法相比，马来酰亚胺偶联物因其简单、可控条件和高产率而脱颖而出。迄今为止，马来酰亚胺与减少的链间二硫化物结合仍然是ADC构建的主要方法。在15个具有强效毒性有效载荷的商业化ADC中，有10个以及大多数处于临床阶段的ADC都使用了马来酰亚胺偶联技术。 马来酰亚胺-硫醇偶联物易于逆转迈克尔加成反应，导致通过血清蛋白相互作用过早释放有效载荷。这种逆迈克尔加成反应会影响ADC在血浆中的稳定性，降低其有效性和安全性。为了解决这个问题，科学家们探索了几种策略，包括通过引入额外的基团如N-芳基和邻氨基来催化马来酰亚胺的水解，或者用开环马来酰亚胺甲酯代替马来酰亚胺，以避免逆迈克尔加成反应。此外，新型连接体如KTHIOL™、P5™和溴乙酰氨基癸酰基已显示出增强的硫醇选择性和对逆迈克尔加成反应的抗性。 酶标签偶联 酶偶联涉及通过利用识别特定氨基酸序列的酶将有效载荷直接附着到抗体上。该技术在ADC中提供了高均一性，展示了其作为有效偶联方法的潜力。许多酶需要序列工程和抗体等底物的结构适应性。临床上使用的酶包括Sortase A（SrtA），这是一种30 kDa的转肽酶，可以切割LPXTG序列形成硫酯酰基酶中间体，使肽LPXT转移到底物的N端。值得注意的例子包括NBE-002（SMAC Technology™），目前处于1/2期试验阶段。 另一个是甲酰甘氨酸生成酶，它附着在CXPXR序列上，将半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸，使用这种偶联方法的ADC如TRPH-222（SMARtag™），目前处于1期临床阶段。法尼烷基转移酶通过在CaaX标签内的半胱氨酸残基上添加类异戊二烯基团来修饰抗体，这类的ADC如FS-1502（ConjuAll™）目前处于III期临床阶段。还有一些酶，如微生物转谷氨酰胺酶（mTG），靶向抗体上的天然位点，如Q295位点，催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺与有效载荷的游离胺基之间形成酰胺键，代表性分子如DP303，目前处于III期临床。此外，一些处于临床前研究阶段的ADC使用的酶包括肽天冬酰胺基连接酶、微管蛋白酪氨酸连接酶、胰蛋白酶、磷酸泛乙烯基转移酶、SpyLigase和O6烷基胍DNA烷基转移酶。 酶偶联过程通常比传统技术更复杂，需要更广泛的材料和更复杂的步骤，这会显著影响生产成本和成功的可能性。此外，与传统的偶联相比，酶偶联引入了额外的成分，如结合酶、辅因子和表达相关杂质，所有这些都具有潜在的免疫原性。需要采取额外的措施来消除最终产品中的催化酶和污染物。总的来说，酶偶联是一种强大的位点特异性技术，在临床前和临床阶段取得了许多成功。下一代酶偶联技术可以通过技术更新和优化CMC工艺来提高产品的均一性。 聚糖重塑偶联 近十年来，糖偶联引起了学术界和工业界的极大兴趣。虽然大多数乙二醇偶联方法仍然依赖于酶来促进偶联过程，但它们不需要氨基酸序列工程。早期的技术涉及使用高碘酸钠（NaIO4）氧化聚糖上的顺式二醇，为随后的修饰创造醛基。最近的策略强调聚糖重塑，其中天然聚糖（附着在N297位点）被修饰或替换为新的聚糖，然后可以与功能性连接子或连接子-载荷复合物连接。 Synaffix的GlycoConnect™技术使用内切糖苷酶来修剪天然聚糖异构体，然后添加叠氮修饰的半乳糖残基和半乳糖基转移酶。然后，这种修饰的聚糖通过带有兼容手柄的点击化学与有效载荷偶联。这种方法在ADC开发中得到了广泛的应用，有六个活跃的临床阶段项目使用了这种方法，包括IBI-343。然而，这个过程涉及至少两种酶和三个偶联步骤，这可能会使开发复杂化，降低产量，并增加CMC成本。 此外，从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，这些酶能够水解IgG的N-聚糖，从而使水解后的残基成为生物偶联的有效位点，使靶分子能够在一个偶联步骤中附着到N297位点。这种方法有助于使单抗的聚糖结构均匀化，同时它也适用于任何IgG亚型。尽管尚未经过临床验证，但endo-S2方法因其降低的CMC成本而极具吸引力。 亲和肽偶联 亲和定向偶联使用来自蛋白A或G IgG结合位点的亲和肽。该肽选择性结合Fc区的特定位点，使其更接近某些赖氨酸残基，并提高连接子和-NH2基团之间的反应速度。为了防止与其他反应性-NH2基团发生副反应，应使用温和的连接子。典型的结合位点位于Fc区的K248/K288或K337残基附近；虽然亲和肽的序列修饰可以将结合位点转移到Fab区，但这通常会导致结合效率降低。一些开创性的方法涉及用稳定的共价键将连接子偶联到亲和肽上，然后共价连接到抗体上形成ADC。然而，大型非天然肽可能通过阻碍FcRn结合来干扰Fc功能，从而可能减少ADC内化。 -04- 三、位点特异性和位点选择性偶联 工程化半胱氨酸 随机半胱氨酸偶联和重桥接是利用抗体结构内天然存在的半胱氨酸残基的技术。与它们不同的是，硫单抗技术通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰。一般来说，半胱氨酸突变的设计是为了促进细胞毒性有效载荷偶联的同时，保持单克隆抗体的稳定性、亲和力和最小化ADC聚集。为了确定突变的最佳位置，通常采用几种技术，包括计算建模、模型系统筛选和高通量扫描。 Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC-A114C），工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应。合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出效力，在大鼠和食蟹猴中表现出高剂量耐受性，这个发现建立了硫单抗偶联策略的一般性方法。 下表详细列出了临床阶段ADC中使用的工程化半胱氨酸位点。 非标准氨基酸 除了硫单抗技术外，非标准氨基酸（ncAA）的加入为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用含有独特化学结构的氨基酸，从而能够以化学选择性的方式引入连接子-有效载荷复合物。该技术需要对抗体序列重组，利用与宿主细胞内所有内源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于响应未赋值密码子将ncAA带入蛋白质。通常，ncAA在发酵过程中被添加到培养基中。选择非天然氨基酸是很重要的，因为它们可能激发免疫原性。常用的ncAA是具有独特基团的天然氨基酸的类似物，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。 已有研究将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗体中。有效载荷Auristin通过肟连接与抗体有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内表现出良好的体外活性和完全清除肺肿瘤的作用。 由于肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种选择是加入含ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）可在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应，利用这种策略成功地在抗CD74抗体上偶联糖皮质激素有效载荷。除了pAcF技术外，还成功地将含叠氮的赖氨酸类似物（AzK）带入到抗体中，以产生具有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。 此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及自然发生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合进入抗体中。所产生的ADC表现出良好的稳定性、选择性以及体外和体内活性。 -05- 结语 由于偶联技术对ADC特性的广泛影响，确定特定抗体/连接子-有效载荷组合的最佳偶联位点和化学物质仍然是一个重大挑战。这些影响包括结合、内化、有效载荷释放、PK、效应器功能等。尽管一些新兴的偶联技术通常表现出更好的疗效和安全性，但临床前和临床研究之间的转化经常存在差距。此外，即使整个过程看起来更简单，新的偶联技术也会在CMC过程中带来意想不到的挑战。随着我们对ADC复杂性的理解加深，以及我们从更多采用先进偶联方法的ADC中积累临床数据，预计将出现新的、更合适的偶联技术。这些技术进步将进一步解决未满足的临床需求。 参考资料： 1.The Chemistry Behind ADCs.Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442 2. A review of conjugation technologies for antibody drug conjugates. Antib Ther.2025 Apr 17;8(2):157-170. 精选PPT下载链接： 欢迎加入我的知识星球，可免费下载每次直播和其余精选PPT，小药邀请你到知识星球一起学习！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

FDA decision will enable Iksuda to expand its ongoing clinical trial in the US, Australia and Singapore Preliminary data from an ongoing dose-escalation study of IKS014 has shown meaningful clinical activity across multiple tumour types NEWCASTLE, UK I June 30, 2025 I Iksuda Therapeutics (Iksuda), the developer of class-leading antibody drug conjugates (ADCs) with clinically validated tumour-selective payload release formats, today announces that the U.S. Food and Drug Administration (FDA) has cleared its Investigational New Drug (IND) application for IKS014, a human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) ADC targeting patients with advanced HER2+ solid tumours, enabling the expansion of ongoing clinical trials. IKS014 is currently being investigated in an open-label phase 1 dose-escalation study ( https://clinicaltrials.gov/study/NCT05872295 ) designed to evaluate the safety and tolerability of increasing dose levels of IKS014 and establish a recommended phase 2 dose. Preliminary data from this study has demonstrated promising clinical activity across multiple tumour types, including breast, ovarian, gallbladder, and oesophageal cancers, and including patients who have relapsed after prior treatment with Enhertu. Gaining access to U.S. centres for the dose expansion stage of this phase 1 trial will enable efficient confirmation of the role of IKS014 in this important patient sub-set. Dr Dave Simpson, Chief Executive Officer, Iksuda Therapeutics, said: “The FDA clearance of our IND application for IKS014 represents a significant milestone in our mission to address the critical unmet needs of patients with HER2-positive cancers, particularly those who have exhausted current standard-of-care options. Early clinical data has been extremely encouraging, and we are excited to expand our program to reach more patients. “The early efficacy signals that have been observed, particularly in patients that have relapsed after receiving prior treatments of Kadcyla and Enhertu, suggest IKS014 could potentially offer a new treatment option for patients who currently have limited alternatives. We look forward to working with our clinical partners to further evaluate the potential of IKS014.” The first stage of this phase 1 trial, to determine the recommended phase 2 dose for dose expansion, is nearing completion. The expansion phase will assess several patient cohorts including those with HER2-positive breast cancer who are refractory to or cannot tolerate Enhertu, patients with HER2-low breast cancer and patients with HER2-positive positive gastric cancer. The IND clearance will allow Iksuda to access patients across sites in the United States, alongside sites in Australia, New Zealand, and Singapore. The phase 1 trial is expected to complete in 2H 2026. About IKS014 IKS014 is a potential best-in-class antibody drug conjugate, benefiting from tumour selective activation and release of the cytotoxic agent monomethyl auristatin F (MMAF). In preclinical trials, it displayed impressive activity in high- and low-HER2 expressing tumours with a favourable Therapeutic Index vs other HER2-directed drugs. Iksuda gained exclusive world-wide rights (excluding Greater China and South Korea) to IKS014 from LigaChem Biosciences ( https://iksuda.com/2022/01/iksuda-deepens-clinical-pipeline/ ). About Iksuda Therapeutics : www.iksuda.com Iksuda Therapeutics is a clinical stage, UK-based biotechnology company focussed on the development of class leading antibody drug conjugates (ADCs) targeting difficult-to-treat haematological and solid tumours. Iksuda’s pipeline of ADCs is centred on a portfolio of prodrug DNA and protein alkylating payloads in combination with stable conjugation chemistries including its proprietary PermaLink ® platform. The Company’s design concepts for ADCs are now clinically validated to significantly improve the therapeutic index of this important modality and improve the outcomes for patients living with cancer. SOURCE: Iksuda Therapeutics