PROTAC是一种革命性的治疗模式，具有催化降解、克服耐药、靶向“不可成药”蛋白等优势，PROTAC分子通常由靶蛋白配体 + E3连接酶配体 + 连接链 三部分构成，本文简要讲述一下E3 连接酶的发展变化，希望对药化研究工作者有所帮助。
01
E3 连接酶在PROTAC分子中的重要性
1. 泛素化过程
PROTAC通过 “诱导接近—泛素化—降解—循环利用” 的催化机制，实现了 “事件驱动”的靶蛋白清除 ，突破了传统抑制剂对活性位点的依赖，为“不可成药”靶点提供了全新的干预策略。其机制的核心在于三元复合物的有效形成与周转 ，这受到配体亲和力、连接链设计、E3选择等多因素调控。
泛素化——由E1、E2、E3 三种不同类型的酶依次通过活化、结合、连接三步级联反应将泛素连接到底物上的过程:
1) 由E1 泛素活化酶 (E1 ubiquitin activating enzyme) 以ATP依赖的方式催化泛素C端甘氨酸残基（Gly）与E1 活性位点半胱氨酸残基之间形成硫酯键;
2) 活化的泛素从E1 转移到E2 泛素结合酶(E2 ubiquitin conjugating enzyme)的活性位点半胱氨酸上;
3) 由E3 泛素连接酶 (E3 ubiquitin ligase) 催化泛素通过其C端甘氨酸与底物靶蛋白赖氨酸残基之间形成的异肽键与之共价结合。
Note:
• E2 决定泛素链的长度和连接类型；
• E3 泛素连接酶通过识别目标底物, 并调控泛素从E2泛素结合酶转移到靶蛋白, 赋予泛素化反应底物特异性；
• E3 泛素连接酶的细胞定位、表达水平及催化效率决定了降解效能
2. 从靶向AR的PROTAC看E3 泛素连接酶变化
E3 ligase最早以沙利度胺， 来那度胺、泊马度胺类似物为主，逐渐被新型的CRBN配体如异吲哚啉酮、邻苯二甲酰亚胺和喹唑啉酮等取代。以下是4个进入临床的靶向AR的PROTAC分子，相同的靶点有着不同的E3 ligase.
ARV-110：第一个进入临床的PROTAC药物，最早开发是基于VHL配体；
ARV-766：结构改造六元环改成取代的四元环，左侧芳香环上氯原子替换成甲氧基，将氟取代的沙利度胺替换为氟取代的苯甲酰胺。这一类CRBN配体有选择性高和血浆稳定性高等优点。
相较于ARV-110， ARV-766 对H875Y和T878A等多种突变体亚型具有降解能力的同时，能够更有效地实现对AR L702H突变的覆盖。 ARV-776 具有更好的neosubstrate选择性以及血浆稳定性和对L702H突变的AR的降解效率。Arvinas将优先启动针对mCRPC的ARV-766的3期临床试验。
BMS-986365（CC-94676）
目前III期临床正在进行中，适应症为“ 转移性去势抵抗性前列腺癌 ”。
CC-94676是一种口服雄激素受体（AR）蛋白降解嵌合体，其作用机制：
· 双功能分子：一端结合 AR配体 结合域，另一端 募集CRBN E3 连接酶 ，诱导 AR 泛素化-蛋白酶体降解；同时本身还 保留 AR 拮抗活性 ，因此属于 “ 降解+抑制 ” 双重打击；
· 对野生型 AR 和临床常见 LBD（AR配体结合结构域）突变（T878A、H875Y等）均能实现 >90%的降解 ，可克服恩杂鲁胺/阿比特龙耐药。
GDC2992
由Genentech从Jemincare引进的GDC-2992（RO7656594，RG6537）是一种研究中的口服生物可利用小分子AR降解剂，目前正在进行针对晚期或转移性前列腺癌的I期临床试验。
采用与 ARV-766 完全不同的CRBN配体， 在临床前研究中，GDC-2992可诱导携带AR配体结合域（LBD）野生型（WT）及常见点突变（L702H、H875Y、T878A）的前列腺癌细胞系中的AR降解和抑制。
3. E3 ligases
1) E3 ligase按结构分类
• 人类基因组仅编码2 种E1,但预测至少有38种E2 和 600 种E3 存在
• 哺乳动物细胞内的E3主要有三大类，即含 HECT （homologous to E6-AP C-terminal)结构域的E3、含环指结构 ( RING finger /U-box)的E3，RBRs （Two RING domains and one in-between-RING domain）
Human E3 Ubiquitin Ligases database：
https://www.cellsignal.com/learn-and-support/reference-tables/ubiquitin-ligase-table
更详细的分类描述可查阅发表于《药学进展》2025年第 7 期的文献
2) 常用的 E3 连接酶类型
目前常用的 E3 连接酶类型、它们的比例以及可被基于 VHL 和 CRBN 的 PROTAC 降解的代表性靶标
• 鼠双微体 2 （murine double minute 2， MDM2）是一种通过降解抑癌蛋白p53在癌症中发挥作用的E3连接酶
• 细 胞 凋 亡 抑 制 蛋 白（cellular inhibitor of apoptosis protein, IAPs）是一个常在癌症中过表达的E3连接酶家族
• Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白是CRL2VHL E3连接酶复合物的底物识别亚基，可调控缺氧诱导因子1 α （HIF-1 α ）
• Cereblon（CRBN）配体的发展是PROTAC领域最具代表性和应用最广泛的突破之一。
CRBN与DNA损伤结合蛋白1（DNA damage-binding protein 1， DDB1）相互作用形成 Cul4- RING E3 泛素连接酶复合物。CRBN配体是免疫调节亚胺类药物（IMiDs），包括沙利度胺、来那度胺和泊马度胺等直接作用靶点。机制研究发现沙利度胺与CRBN结合并促进Ikaros家族转录因子的泛素化和降解，这种分子胶功能启发了使用沙利度胺类似物作为CRBN配体的PROTAC 的设计。后续开发的来那度胺（lenalidomide）和泊马度胺（pomalidomide）等沙利度胺类似物（IMiDs）通过增强CRBN结合力和改善药理特性，现已成为PROTAC设计的核心组件，可降解多种疾病相关蛋白。
3) PROTAC特异性E3连接酶
PROTAC技术发展的一个关键方向：从应用“通用”E3连接酶，转向利用具有特定生物学特征的“特异性”E3连接酶，以实现更精准、更安全的靶向蛋白降解。
E3连接酶的组织与疾病特异性分布：不同E3连接酶在身体不同部位或疾病状态下的富集情况有所差异。当前临床PROTAC主要依赖CRBN和VHL这两个在全身广泛表达的“通用型”E3连接酶。虽然验证了技术可行性，但也存在潜在的脱靶毒性和耐药风险。利用E3连接酶的差异表达谱可实现组织/细胞类型特异性降解，这是实现精准TPD的核心路径：
中枢神经系统富集型E3（如RNF182， TRIM9）：为开发能穿越血脑屏障、且活性局限于脑组织的神经退行性疾病疗法提供可能，从而规避系统性毒性。
肿瘤富集/依赖性E3（如DCAF2， MAGE家族）：其表达或功能对肿瘤细胞生存至关重要。基于此类E3设计的PROTAC，其降解活性富集于肿瘤微环境，并能降低肿瘤通过下调该E3而产生耐药的可能性。
组织限制性E3（如肌肉中的KLHL40/41）：为治疗组织特异性疾病（如肌肉病变）提供高选择性干预窗口。
表格建立了多维度的评估体系，为E3的筛选提供理性依据，关键参数包括：
肿瘤富集性：在肿瘤中是否高表达
肿瘤依赖性：是否为肿瘤细胞生存所必需
组织特异性：在正常组织中的表达是否受限
机制阐明度：其底物识别与泛素转移的分子机制是否清晰，这是理性设计配体的前提。
下一代PROTAC的成功将依赖于对E3连接酶生物学特性的深度挖掘与利用。选择策略应从单纯的“配体可获得性”转向综合权衡 “表达特异性”、“肿瘤依赖性”和“机制明确性” 。通过共价募集在特定病理环境下高表达且功能必需的E3连接酶，有望开发出 治疗指数更宽、耐药屏障更高 的精准降解疗法，这标志着TPD领域正从概念验证阶段迈向真正的精准医学应用 。
4) 发现可用于TPD的E3连接酶配体时间线
Timeline for the discovery of new ligandable E3 ligases.
E3连接酶配体发现时间表
CRBN配体因其分子量小、类药性好、口服生物利用度高及结构研究充分等优势备受青睐。特别是沙利度胺及其类似物与CRBN结合的晶体结构，为PROTAC用CRBN配体的理性优化提供了基础，CRBN配体有更好的理化性质：
02
CRBN 配体
分子胶和PROTAC成药技术的关键在于找到合适的E3泛素连接酶，其中CRBN是最成功的一类
分子胶和Protac
分子胶作为“粘合剂”，将E3泛素连接酶和靶蛋白连接，泛素化降解
Schematic presentation of the degradation of a protein of interest (POI) via the ubiquitin (Ub)−proteasome system using (A) a molecular glue or (B) a PROTAC bound to the E3 ubiquitin ligase CUL4−RBX1−DDB1−CRBN (CRL4CRBN) complex.
1. CRBN结构
CRBN 组成的 E3 泛素连接酶的全称是 Cullin-RING E3 泛素连接酶复合体 4（Cullin-Ring E3 Ubiquitin Ligase Complex 4，CRL4 ），也被称为 CRL4CRBN 泛素连接酶复合体，含 442 个氨基酸的蛋白质，主要包括四个部分：
① Cereblon（CRBN）：是该复合体的底物受体，负责识别特定的底物蛋白，也是泛素、分子胶结合的部分。
② Cullin 4A（Cul4A）：支架蛋白，为复合体提供结构支持。
③ Damaged DNA Binding Protein 1（DDB1）：能与 Cul4A 结合，并帮助 CRBN 连接到 Cul4A 上。
④ Ring Box Protein 1（RBX1，也称为 ROC1）：是一种锌指结构域蛋白，它与 Cul4A 结合，形成 E3 泛素连接酶的活性中心。
2. CRBN底物
CRBN底物涵盖转录因子、翻译调控因子、信号通路激酶等，广泛参与细胞分化、增殖、存活及免疫应答。
1) 转录因子类：IKZF1（Ikaros）与IKZF3（Aiolos）：锌指转录因子SALL4; IRF4
2) 翻译与蛋白质合成调控：GSPT1
3) 信号转导与通路调控：CK1α：丝氨酸/苏氨酸激酶
4) 潜在或研究中的底物：ZBTB16（PLZF转录抑制因子）MYC; NF-κB通路相关因子
基于沙利度胺的分子胶降解剂的作用机制 ：基于沙利度胺的分子胶与CRBN结合后，会诱导相应新底物的降解，进而产生图中所示的治疗效果。
Binding of thalidomide-based glue degraders to CRBN induces degradation of corresponding neosubstrates, resulting in the therapeutic effects shown in the figure.
Abbreviations: len, lenalidomide; Pom, pomalidomide; Ava, avadomide; Ibe, iberdomide; MM, multiple myeloma; MDS, myelodysplastic syndromes; AML, acute myeloid leukemia; APL, acute promyelocytic leukemia.
沙利度胺的致畸作用机制
Binding of thalidomide to CRBN in fetal development induces degradation of SALL4, TP63, PLZF, and possibly other unknown neosubstrates, resulting in the various defects shown in the figure.
3. 靶向CRBN的度胺类药物代表——沙利度胺 thalidomide
沙利度胺（thalidomide）最初于1950年代作为抗妊娠反应药物上市，后因致畸性被撤市。数十年后，该药物被重新开发为多发性骨髓瘤和B细胞恶性肿瘤的治疗药物。2010年研究发现，CRBN是沙利度胺的直接作用靶点，揭示了该药物通过劫持CRL4 E3连接酶的底物受体CRBN来降解SALL4等转录因子的机制。这一发现开创了E3连接酶介导新底物降解的研究范式。
主要作用机制：
沙利度胺 thalidomide：从“魔鬼”到“天使”
• 1957年10月，沙利度胺以商品名“反应停”正式投放市场，能有效减轻孕妇的恶心、呕吐、紧张和失眠等症状，由德国格兰泰制药（Chemie Grunenthal）开发，并号称没有任何副作用；
• 格兰泰制药的沙利度胺专利宣称已在人体经过测试（ 当时新药上市不必经过临床研究） 并做过动物实验证明无致突变及出生异常，但后来这些原始数据都神秘的消失了；
• 上市后不到1年，沙利度胺就风靡全球46个国家，并成为非处方药物，1959年，联邦德国就有超过l00万人服用过该药物；
• 沙利度胺的第一个受害者是1956年出生的一名没有耳朵的女婴，那时药品还未上市，女婴的父亲正是格兰泰制药的员工；上市5年内，世界各地前所未有地出生了大量四肢缺损的 先天性“海豹肢症（Phocomelia）婴儿约12000人，死亡6000人 ，禁用36周后不再出现新病例
• 1990年后，沙利度胺虽因致畸性被淘汰，但其具有免疫调节（如增强T/NK细胞活性）、抗血管生成及抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等潜在作用，使其在某些疾病（如多发性骨髓瘤、麻风结节性红斑ENL）中可能具有治疗价值。
• 1998年美国FDA批准沙利度胺其用于治疗结节性红斑麻风ENL，2006年批准与地塞米松联用治疗新发的多发性骨髓瘤。沙利度胺致畸性强，安全性更强的来那度胺被开发。来那度胺被证实在复发/难治性多发性骨髓瘤（MM）患者的临床效果更显著，且耐受性优于沙利度胺。
• 2005年12月，美国FDA批准来那度胺与地塞米松联用，用于治疗既往接受过至少一种治疗的复发/难治性多发性骨髓瘤患者。
S - 型对映体具有致畸性
沙利度胺含有一个手性碳，该手性碳结构不稳定，致使其两种对映异构体可同时存在，且这两种构型在体液及水环境中能够快速相互转化。其中一种对映异构体 —— S-型对映体具有致畸性。但由于该药物的两种对映异构体之间可发生构型转化（外消旋化），因此很难制备出性质稳定的非致畸剂型。此前上市的沙利度胺即为两种对映异构体的外消旋混合物。
免疫调节药物在人血浆中的消旋和消除
沙利度胺（Thalidomide）从一场公共卫生悲剧转变为现代药学史上的关键转折点，其“天使”一面深刻塑造了医药领域多个维度的发展：
1) 奠基现代药物安全监管体系：
其悲剧直接催生了1962年美国《科夫沃-哈里斯修正案》，强制要求新药上市前必须提供充分的安全性及有效性临床试验证据。此举奠定了现代药品监管的科学与法律基石，并促使FDA发展成为全球药品监管的权威机构，深刻影响了全球药物警戒理念与实践。
2) 确立生殖毒性评价标准：
事件促使监管科学发生根本性变革，明确要求生殖毒性研究必须在两种不同种属动物中进行，且必须在开展大规模临床研究前完成评估。这成为了非临床安全性评价中不可逾越的核心要求，极大提升了药物对人类生殖风险预测的可靠性。
3) 揭示多靶点作用机制，开拓治疗新领域：
对其作用机制的深入研究，揭示了其广泛的免疫调节、抗炎及抗血管生成等多重药理活性。这直接推动了来那度胺、泊马度胺等衍生药物的成功开发，并促进了免疫、抗肿瘤治疗等多个领域的药物发现。
4) 推动手性药物科学的全面发展：
沙利度胺异构体（R-与S-型）截然不同的毒性与疗效，成为手性药理学最著名的案例。它促使全球监管机构高度重视手性药物的立体化学纯度和质量控制，不仅改变了新药研发策略（如“老药手性拆分”成为新药发现途径），也反向刺激了不对称合成等手性技术的飞速进步。
5) 启发并引领靶向蛋白降解技术：
作为最早的分子胶水降解剂之一，沙利度胺能通过招募CRBN-E3泛素连接酶复合物选择性降解特定蛋白。这一机制直接启发了PROTAC技术，为靶向“不可成药”靶点、开发新型小分子疗法开辟了革命性的道路。
6) 催生巨大商业价值与产业成功：
基于沙利度胺机制研发的来那度胺等药物，构成了Celgene公司的核心产品线，创造了持续的超高额年销售额（如来那度胺年销售额逾120亿美元），并最终促成了生物医药史上标志性的巨额并购案（BMS以740亿美元收购Celgene），证明了其科学价值向产业价值的成功转化。
总结而言，沙利度胺的沉痛教训与后续的科学救赎，共同构成了医药发展史上一个不可或缺的辩证章节。它不仅以血的代价重塑了全球药品安全的底线，更以其独特的科学内涵，持续催生着从监管科学、基础研究到前沿技术与商业成功的全面进步，实现了从“魔鬼”到“天使”的惊人蜕变。
4. 度胺类药物
IMiD的抗癌机制
抗血管生成（抑制VEGF/bFGF）
免疫调节（增强T/NK细胞活性）
直接诱导肿瘤细胞凋亡（caspase依赖）
抑制骨髓基质细胞支持（降低IL-6/VEGF）
IMiD治疗MM的成功是多机制协同作用的结果：
直接细胞毒性 ：靶向MM细胞本身
免疫重编程 ：激活抗肿瘤免疫应答
微环境重塑 ：破坏支持MM生长的骨髓生态位
血管调控 ：抑制肿瘤相关的血管新生
这种多靶点作用机制解释了IMiD在难治/复发MM中的显著疗效，也为联合治疗策略的设计提供了科学依据。
E3 ligand 依赖 CRBN 的 PROTAC 面临两大瓶颈
其一， 实体瘤中 CRBN 的表达水平普遍低于血液肿瘤 ，导致降解效率较低。在非小细胞肺癌患者中，CRBN的mRNA表达量仅为多发性骨髓瘤患者的30%，这可能部分解释了ARV-471在实体瘤中的疗效差异
其二， 度胺类 E3泛素连接酶的脱靶效应
尽管应用广泛， 度胺类配体仍存在潜在脱靶效应——结合到CRBN蛋白C端的疏水口袋后，CRBN配体可作为分子胶在CRBN上诱导形态表面改变并导致招募、泛素化和随后被蛋白酶体降解一些neo-substrate，如 Ikaros(IKZF1)，Helios(IKZF2)、Aiolos(IKZF3)、SALL4和GSPT1等， 因此使用CRBN配体用于降解剂的常具有脱靶效应，缺少对靶蛋白的选择性 。
通过开发新型 CRBN 配体，优化降解剂的选择性，结合 CRBN 构象动态研究设计变构调节分子，或联合其他 E3 泛素连接酶构建双 E3 降解系统，有望突破现有局限性。
参考文献：
1.Lessons learned in linking PROTACs from discovery to the clinic. https://doi.org/10.1038/s41570-025-00784-6
2.泛素连接酶在靶向蛋白降解中的研究进展。吴丹，张贤，尤启冬，郭小可，姜正羽，《药学进展》2025年第 7 期
3.Chemistries of bifunctional PROTAC degraders https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/CS/D2CS00220E
4.Molecular Glues: The Adhesive Connecting Targeted Protein degradation to the Clinic. Biochemistry 2023, 62, 601−623
5.Discovery of CRBN as a target of thalidomide: a breakthrough for progress in the development of protein degraders Chem. Soc. Rev., 2022, 51, 6234
5.E3 ligase ligand optimization of Clinical PROTACs. DOI 10.3389/fchem.2023.1098331
6.MM-多发性骨髓瘤靶向药疗效对比 韦达快讯
7.Current advances of small molecule E3 ligands for proteolysis-targeting chimeras design. European Journal of Medicinal Chemistry 256 (2023) 115444
8.The evolution of thalidomide and its IMiD derivatives as anticancer agents. J. Blake Bartlett, Keith Dredge and Angus G. Dalgleish
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