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诺华研究人员通过生化高通量筛选发现了与 E3 连接酶 SMURF1 的催化半胱氨酸的隐蔽口袋的抑制剂。基于结构、生化分析、突变实验表明，抑制剂通过结合在保守的甘氨酸铰链上α螺旋来限制必要的催化运动。临床前数据证明 SMURF1 抑制阻止了 BMPR2 泛素化、BMP 信号正常化、恢复肺血管细胞稳态，并逆转了已建立的实验性肺动脉高压的病理模型。该系列抑制剂已进入临床2期研究，靶向治疗肺动脉高压。最后，作者利用该机制进行了虚拟筛选，以识别其他类型 HECT E3连接酶的抑制剂，并证实了甘氨酸铰链依赖性体外变构活性，开辟了一个新的成药空间。1. 背景介绍人类基因组编码 ∼650 个 E3 连接酶，每个连接酶泛素化有限数量的靶标，从而在系统内提供特异性。与 E1 泛素激活酶和去泛素化酶 （DUB） 不同，它们具有用于抑制的受限活性位点口袋，泛素 E2 偶联酶和 E3 连接酶的活性位点从蛋白质表面突出。这种活性位点口袋的缺失限制了小分子结合，并阻碍了识别抑制剂（图 1A）。图 1 E3 连接酶活性口袋。E3 连接酶种类和SMURF1 结构域。其中，HECT 家族成员 SMURF1，于 1999 年首次被发现，与多种疾病有关，包括癌症、骨、肺、和中枢神经系统疾病。在细胞水平上，SMURF1 充当骨形态发生蛋白 （BMP） 信号转导的负调节因子，调节细胞迁移、增殖和细胞凋亡。SMURF1 的结构是典型的 NEDD4 亚家族成员，具有用于细胞膜定位的 N 末端 C2 结构域、用于靶标识别的 WW 结构域，以及结合 E2 并通过表面突出的催化半胱氨酸介导靶标泛素化的催化 HECT 结构域。泛素转移需要由连接 HECT 结构域 N 叶和 C 叶的柔性铰链促进的运动（图 1B;视频 S1）。尽管进行了广泛的研究，但人们对促进或抑制这种关键运动的特征知之甚少。视频 S1. SMURF1 的结构重排。需要 SMURF1 的 N 叶和 C 叶围绕柔性铰链的运动，才能将泛素从 E2 的催化胱氨酸转移到蛋白质靶标。2. 高通量筛选策略为了克服缺乏已知的活性位点口袋，开发了一种基于时间分辨荧光共振能量转移 （TR-FRET） 的测定法，报告了 SMURF1 自我泛素化（图 S1A）。使用该系统，对 110 万种化合物进行了大规模、无偏差的高通量筛选 （HTS）。使用生化选择性和基于细胞的测定进一步筛选初级命中，这些测定旨在优先考虑和优化特定 SMURF1 抑制的分子（图 S1B 和 S1C）。这个过程揭示了具有良好药物样性质的三个化学系列：哌啶磺酰胺、吡唑啉酮和吡咯（图 S1D 和 S1E）。尽管 SMURF1 和 SMURF2 具有高度的蛋白质序列同源性 （86% 同一性），但确定了对 SMURF1 比 SMURF2 更具选择性的有效抑制剂（图 S1D 和 S1E），这在结构上与先前研究中报道的不同。图 S1 优先化学系列中先导化合物的 HTS 策略和活性。3.  抑制剂限制了 HECT 结构域内的关键甘氨酸铰链运动在没有和有SMURF1 抑制剂化合物 8 （Cpd-8） 的情况下结晶了 SMURF1 和 SMURF2 的 HECT 结构域的结构（图 1C、1D ）。在没有抑制剂的情况下，SMURF1 和 SMURF2 的 HECT 结构域采用高度相似的结构，包括由含甘氨酸的柔性铰链（残基 G634-D639）连接的 N 叶和 C 叶（图 1B-1D; 视频 S1）。围绕该铰链的 N 叶和 C 叶之间的运动对于泛素通过 HECT C 叶从 E2 转移到靶蛋白很重要。图 1 SMURF1 和 SMURF2 HECT 结构域：抑制剂复合物。在所有 28 个 HECT 结构域结构（包括 SMURF1）中，α螺旋 10 （αH10） 由两个半圈组成，末端是保守的甘氨酸，通过其对 φ/Ψ 二面角的高容忍度在 N 叶和 C 叶之间提供灵活性（图 1D）。在与 SMURF1 的复合物中，抑制剂被埋在 N 叶隐蔽腔中，仅暴露其表面的 2%。与未结合的 SMURF1 相比，SMURF1 抑制剂复合物的 αH10 比保守的甘氨酸 （G634） 拉长一圈半。这缩短了铰链（从 27.0 到 15.4 Å），并用赖氨酸 （K637） 取代了柔性铰链杆的 G634，赖氨酸 （K637） 是一种对 φ/Ψ 二面角耐受性较低的氨基酸（图 1D 和 1E）。与 SMURF1 相比，SMURF2 与 Cpd-8的结合并没有延长 SMURF2 αH10。有无抑制剂不影响G628的铰链（图 1F），SMURF2 活性并未因抑制剂结合而降低。基于这些结构，假设 SMURF1 活性受到抑制，因为抑制剂的变构活性诱导甘氨酸铰链的长度和柔韧性减少。4. SMURF1 突变体抵抗变构抑制为了验证 SMURF1 甘氨酸铰链的功能，构建了限制 φ/Ψ 二面角或缩短铰链长度的突变体。使用 Rpn10 测量 SMURF1 活性，Rpn10 是一种在体外被大多数 E3 连接酶有效泛素化的蛋白质，作为靶标（图 2A）。通过该CAT系统证实了甘氨酸铰链灵活性和长度的关键作用（图 2B）。图 2. SMURF1 的变构抑制报告系统。进一步的结构分析表明，D636、R686 和 N507 之间的非共价键网络稳定了化合物结合诱导的 SMURF1 的变构拉长 αH10（图 2G）。基于这一观察结果，模拟了 αH10 和甘氨酸铰链从未结合状态到化合物键态的转变（视频 S2）。分析表明，在未结合的 SMURF1 中，αH10 的 I631 以及附近的其他残基占据隐蔽腔，阻止小分子抑制剂结合。在 Cpd-8 存在下，αH10 被取代，诱导变构伸长。在这种改变的确认中，αH10 D636 和  R686 之间形成了静电键。R686 被 N507 进一步稳定，N507 在异构上向 R686 移动。SMAD1是 SMURF1 的已知靶标，在磷酸化后表现出增强的结合亲和力和特异性。使用分裂 CAT 系统，表达了磷酸模拟物-SMAD1 以进一步优化结合和特异性。独立突变 D636G、R686A 和 N507A 不会改变酶活性，但赋予对 Cpd-8 抑制的抵抗力，从而证明了 αH10 稳定 SMURF1 抑制形式的重要性。视频 S2. 变构抑制对 SMURF1 结构重排的影响。（A） 在未结合的 SMURF1 中，αH10（和其他附近的残基）的 I631 占据隐蔽腔，因此无法用于小分子抑制剂结合。（B） 在 Cpd-8 存在下，αH10 被推开，导致变构伸长。在这种改变的确认中，αH10 中的 D636 和位于 C 叶上的 R686 之间形成静电键。SMURF1 R686 在 SMURF2 中保守为 R680，但在 SMURF2 中被 G630 取代，这意味着在 SMURF1 中稳定拉长 αH10 的非共价键网络不能在 SMURF2 中形成。用 G630D 取代（命名为 SMURF1lation）设计了 SMURF2。G630D SMURF2 对模拟磷酸化 SMAD1 肽靶标的活性没有显着改变。然而，G630D SMURF2 易受 Cpd-8 的抑制（图 2I）。总之，甘氨酸铰链的柔韧性和长度对催化作用至关重要。SMURF2 对抑制的抵抗力可能是由 G630 赋予的，在化合物存在下，它不会形成锁定 αH10 所需的键网络。5. 吡唑啉酮和吡咯类化合物的机制变构机制是基于 Cpd-8与 SMURF1 和 SMURF2 的晶体结构提出的。接下来，研究了在无偏筛选中鉴定的三个化学系列中的每一个化合物是否通过相同的变构机制发挥作用。使用CAT 系统，发现 Cpd-3 （哌啶，piperidine） 、 Cpd-6 （吡唑啉酮，pyrazolones） 和 Cpd-8 （吡咯，pyrrole） 都抑制泛素化。然而，在旨在增加甘氨酸铰链的柔韧性和长度的 SMURF1 突变体中，只有 Cpd-6 和 Cpd-8 显示出降低的抑制作用。这证实了 Cpd-6 和 Cpd-8 通过已确定的变构机制发挥作用，而 Cpd-3 通过替代机制发挥作用（图 S3E）。Cpd-3 未产生与 SMRUF1 或 SMURF2 的共晶体。然而，获得了不含和含有 Cpd-2 的 SMURF2 的 HECT 结构域的晶体。Cpd-2 与 Cpd-8 结合 SMURF2 的 C 叶和 N 叶之间的隐蔽口袋。然而，与 Cpd-8 相反，Cpd-2 从口袋延伸出来，与 SMURF2 的 C 叶发生物理相互作用，阻止甘氨酸铰链的必要运动，而没有变构伸长 αH10。Cpd-3 同时抑制 SMURF1 和 SMURF2，而Cpd-6和Cpd-8 仅抑制 SMURF1。6. SMURF1 在 PAH 中过表达人类遗传研究表明 BMP 信号转导减少是 PAH 发作的起始因素。经典 BMP 信号转导由 BMP 受体复合物的配体结合启动，导致 SMAD1/5/8 磷酸化、SMAD4 核转位和 DNA 结合抑制剂 1 （ID1）表达增加（图 3A）。同时，在刺激下，TRIB3 从 BMP 受体复合物中释放出来，介导 SMURF1 的降解（降低 SMURF1 的水平）、SMAD1/5/8 的稳定和通路的增强。因此，BMP 信号转导增加，而 BMP 信号转导减少会降低通过 SMURF1 的下游信号转导介质的可用性。缺氧或 TGF-β 信号传导也增加了 SMURF1 表达，这两者都是血管重塑的核心驱动因素，进一步表明 SMURF1 是 BMP 信号减少的关键介质，随后在 PAH 中观察到血管重塑。图 3 SMURF1 在 PAH 中的表达。PAH 的特征是小肺动脉的内皮细胞和平滑肌细胞重塑，SMURF1 表达增加。与无 PAH 患者相比，PAH 患者所有样本中 SMURF1 在内皮细胞和平滑肌细胞中的表达显著增加（图 3C-D）。7. SMURF1 直接泛素化 SMAD1 和 BMPR2BMPR2 和 SMAD1 是 BMP 信号传导的关键介质，两者在患者中均减少（图 3A）。据报道，SMURF1 可直接泛素化 SMAD1，但研究表明，BMPR2 泛素化是通过 SMAD6 或 SMAD7 介导的。过度活跃的 SMURF1 增加了两个靶标的泛素化，而 C725A 催化失活突变体降低了泛素化（图 4B-C）。图 4 SMURF1 抑制剂恢复 BMP 信号传导和肺血管细胞稳态（Cpd-6）。抑制 SMURF1 会增加 SMAD1 和 BMPR2 的水平（图 4D-E）。这些数据证明了哺乳动物细胞中 SMURF1 的变构抑制，并通过其直接靶标 BMPR2 和 SMAD1 调节 BMPR2 通路中的两个关键点。8. SMURF1 抑制增强 BMP 信号传导用 BMP4 处理特发性和遗传性 PAH 患者的肺动脉平滑肌细胞 （PASMC），并在 SMURF1 抑制剂或载体存在下培养。与载体对照相比，SMURF1 的变构抑制导致 BMPR2 水平升高，未磷酸化的 SMAD1/5/8，磷酸化的 SMAD1/5/8 a 和 ID1，以及 BMP 反应元件的激活增加。这些发现表明，SMURF1 抑制增强了肺血管细胞中的 BMP 信号传导。9. SMURF1 抑制可逆转已建立的实验性 PAH 病理模型基于分子和细胞数据，施用变构 SMURF1 抑制剂会恢复 BMPR2 表达降低的动物 PAH 模型中的 BMP 信号传导。通过在缺氧条件下用野百合碱 （MCT） 或 SU5416 处理 Wistar Kyoto 大鼠诱导肺动脉高压（图 5A 和 5F）。MCT 给药后 21 天和在低氧条件下施用 SU5416 后 28 天（10% O2）、右心室收缩压和肺动脉重塑增加 （图 5B -H）。与 BMP 信号传导的增强一致，SMURF1 的变构抑制以剂量依赖性方式改善了右心室收缩压（图 5B、G）和肺动脉重塑（图 5D-J）。图 5.  SMURF1 治疗已建立的实验性 PAH 的抑制作用10. 利用 SMURF1 变构机制设计其他 HECT E3 连接酶抑制剂由于 SMURF1 抑制剂特异性抑制 HECT 结构域的 N 叶和 C 叶之间的保守、基本运动，作者假设类似的变构抑制可以用作计算机模拟方法的基础，以识别其他 HECT E3 连接酶的潜在抑制剂（图 6A）。为了模拟潜在的结合口袋，将 HECT 家族成员的氨基酸序列叠合处于抑制状态的 SMURF1 结构上（图 6B）。该模型的特征是穿过保守甘氨酸残基的细长 αH10、N 叶和 C 叶之间的缩短铰链以及 N 叶中的开放腔。然后，采用基于机器学习（ ML）的筛选来过滤大约 800 万个分子，选择得分最高的候选分子进行下游评估。图 6 E6AP 抑制剂的基于结构的鉴定。为了评估这种方法并证明其广泛的适用性，研究了原型 HECT E3 连接酶 E6AP。E6AP 调节关键细胞介质的水平，由人瘤病毒 E6 蛋白诱导的失调导致宫颈癌和口咽癌。E6AP 对神经发育也至关重要，活动增加或减少会导致人类疾病。E6AP （G738E） 的 αH10 中保守甘氨酸的突变会降低活性并导致天使综合征。异常表达、染色体重复或三倍体，或蛋白质降解减少都会增加 E6AP 水平和/或活性，从而导致自闭症（图 6C）。全长 E6AP 的 AlphaFold 模型表明，K466 在空间上对应于SMURF1 中的 K381。K466 突变与自闭症和口咽癌有关（E6AP-K466E），并且预计会组成性过度激活该酶。引入K466R 突变，它显着增加了连接酶活性（图 6E-F）。与天使综合征相关的突变 G738E/R74（对应于 SMURF1 G634）显著降低了CAT 系统中的 E6AP 活性（图 6F）。这两个突变体首次为与癌症、自闭症和 Angelman 综合征相关的 E6AP 突变提供了结构机制解释。E6AP 报告基因系统验证从计算机筛选结果中选择潜在的抑制剂。在检查的 32 种化合物中，3 种化合物的 E6AP 活性降低了 ≥39%（图 6H）。化合物 i-27 以剂量依赖性方式降低 E6AP 活性（图 6I-J），而不影响 E1、E2 或 CAT 活性，表明选择性抑制。说明还系列抑制剂的隐腔可能为发现其他变构抑制剂（包括 HECT 连接酶）提供有价值的策略。11. 讨论迄今为止，已有 3,000 种不同的药物被批准用于临床，然而，它们总共仅靶向 ∼20,000 种人类基因产物中的 3%（∼650 种蛋白质）。由于可成药口袋的可用性，激酶、磷酸二酯酶、离子通道、G 蛋白偶联受体和核激素受体等蛋白质类别占靶标的大部分。据估计，22% 的蛋白质组具有疾病修饰作用，因此存在扩大可成药空间和确定人类疾病新疗法的重要机会。28 种人 HECT E3 连接酶是有吸引力的治疗靶标，但局限于没有的可成药活性位点口袋。本研究提供了一种创新方法，解决了为没有明显活性位点口袋的蛋白质靶标开发抑制剂的关键挑战。大约 30% 的人类蛋白质包含一个铰链区，该铰链区可实现结构域之间的临界运动。铰链灵活性要求氨基酸残基对 Φ/Ψ 二面角（通常为甘氨酸和丝氨酸）具有高耐受性。在 HECT 结构域蛋白中，限制 N 叶和 C 叶之间的基本运动是酶活性的自然调节机制。不同的机制可以介导这种限制。鉴定利用天然变构机制限制铰链灵活性的 HECT 抑制剂为设计小分子提供了一个框架，这些小分子可调节依赖于铰链介导的柔韧性的其他蛋白质的功能，包括离子通道，免疫球蛋白，和连接蛋白。本研究的一个关键使能特征是 HTS 设计和靶标验证。为了简化 HTS 检测和下游评估，作者利用 SMURF1 自泛素化开发了一种基于泛素化 SMURF1 积累量化活性的方法，并使用SPLIT- CAT 系统提供简单、动态的酶活性读数，而无需对组分进行纯化或凝胶分离。总之，本研究意义包括：（1） 确定了特异性抑制 HECT E3 连接酶和可能的其他含甘氨酸铰链蛋白的新机制;（2）机制验证了通过特异性抑制 SMURF1促进 BMP 通路增强治疗PAH ;（3）对类似具有铰链结构域的靶标的抑制剂研发提供很好的解决方案。靶标SMURF1的药物进展SMURF1的药物包括小分子抑制剂和PROTAC降解剂，进展最快的即是诺华的LTP001分子属于吡唑啉酮类化合物。关于该抑制剂的优化文章可见早期的JMC文献(文中关键的化合物cpd-6, 即对应的优化化合物29，doi:10.1021/acs.jmedchem.3c00229)。参考:10.1016/j.cell.2025.03.001;                                                                            声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓