Resiquimod

近年来，过继细胞疗法彻底改变了肿瘤治疗的格局，CAR-T 细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中展现出卓越疗效，CAR 巨噬细胞、CAR 自然杀伤细胞等新疗法也在向更多适应症推进，但这类基于免疫细胞的治疗手段仍存在诸多难以突破的局限，比如体内持久性不足、细胞来源获取受限、基因组整合存在恶变风险，且在实体瘤中，肿瘤微环境的免疫抑制信号会严重削弱免疫细胞的功能及相互作用，最终限制局部和全身的抗肿瘤活性，这也让科研界开始将目光投向脱离传统免疫细胞谱系、具备独特生物学优势的新型细胞治疗平台，血小板就是其中的核心研究对象。血小板作为成熟巨核细胞的无核衍生物，在输血医学中已证实其安全性，其在止血和组织修复中的作用早已明确，而越来越多的研究发现，血小板与肿瘤生物学的多个方面存在双向相互作用，这也为其成为肿瘤治疗的工程化改造靶点奠定了基础，与此同时，单纯抑制或激活血小板活性的传统策略，因血小板在肿瘤中兼具促瘤和抑瘤的双重作用而效果受限，在此背景下，通过基因和化学工程手段对血小板进行重编程，开发工程化血小板的肿瘤治疗策略，成为肿瘤学和生物工程领域的研究热点，这类改造不仅能保留血小板对肿瘤治疗至关重要的天然特性，还能赋予其靶向递送、直接抑瘤的新功能，不过工程化血小板的临床转化，还面临着血小板稳定性与活化控制、规模化制备、严格安全性评估等一系列亟待解决的问题。 当前关于血小板与肿瘤的研究，核心科学问题集中在三个方面，其一为血小板在肿瘤进展中的作用具有高度的环境依赖性，其促瘤和抑瘤效应会随肿瘤类型、肿瘤微环境特征、疾病分期发生变化，如何解析不同场景下血小板与肿瘤细胞、肿瘤微环境的相互作用机制，是实现血小板精准工程化改造的前提；其二是现有肿瘤细胞治疗平台的局限性亟待突破，基于免疫细胞的疗法在实体瘤中效果不佳，而血小板具备天然的肿瘤归巢能力、更小的粒径、丰富且易获取的细胞来源，还能在自体和异基因场景中应用，如何利用这些优势，通过工程化手段将其改造为兼具靶向性和疗效的治疗载体或效应细胞，是研究的核心方向；其三则是工程化血小板从基础研究走向临床应用的转化难题，包括如何在改造过程中保留血小板的天然生物学功能、建立标准化的规模化制备工艺、制定完善的质量控制体系，以及如何规避工程化血小板的潜在风险，比如残留的促瘤活性、免疫相容性问题、非肿瘤部位的非特异性富集等，同时还需要适配的监管框架来支撑其临床推广。 血小板是血液中第二丰富的血细胞，每日机体可产生超 1000 亿个血小板，其循环寿命为 7-10 天，最终由脾和肝清除，结构上拥有复杂的细胞骨架和 α 颗粒、致密颗粒、溶酶体三类富含生物活性分子的颗粒，激活后会释放这些内容物介导止血、炎症和组织修复，还能通过表面受体感知生理刺激，借助血小板衍生细胞外囊泡实现细胞间通讯，是连接止血、炎症和组织修复的关键节点，而这样的生物学特性，也让血小板与肿瘤进展产生了紧密的联系。血小板的促瘤作用是目前研究较为充分的方向，临床研究发现，约 40% 的显著血小板增多症患者存在隐匿性恶性肿瘤，肺癌患者中血小板增多症的发生率约 38%，且血小板计数升高与多种肿瘤的不良预后相关，约 20% 的肿瘤患者会发生血栓栓塞事件，其背后的机制体现在多个维度：血小板可通过 P 选择素与肿瘤细胞结合并激活，释放的 TGFβ 会激活肿瘤细胞内的相关信号通路，促进上皮 - 间质转化和增殖，血小板衍生的 VEGF 还能发挥促血管生成作用，为肿瘤生长提供营养；循环肿瘤细胞会被血小板包裹，使其躲避剪切力和免疫监视，还能借助血小板的作用实现血管黏附和远处转移的外渗；血小板激活后释放的血小板衍生细胞外囊泡，会向肿瘤细胞传递整合素、RNA 分子等，强化肿瘤细胞的恶性表型，临床中转移性前列腺癌、晚期胃癌患者的血小板衍生微颗粒水平显著升高，且与不良预后相关。而在特定条件下，血小板也能发挥抑瘤效应，这一方向的研究虽尚处于起步阶段，但已发现多种作用机制：血小板激活后释放的血清素，能抑制黑色素瘤细胞增殖并在结直肠癌小鼠模型中抑制肿瘤进展；血小板衍生微颗粒可渗透实体瘤，向肿瘤细胞传递 miR-24、miR-126-3p 等微 RNA，诱导肿瘤细胞凋亡并发挥抗增殖、抗血管生成作用；在非酒精性脂肪肝相关肝细胞癌小鼠模型中，血小板可激活 CD8+T 细胞，实现对原发肿瘤生长的抑制。临床流行病学研究也印证了血小板作用的环境依赖性，香港的队列研究发现，低剂量阿司匹林持续使用 10 年能显著降低肝、胃、结肠等多种肿瘤的发生率，但会轻微增加乳腺癌风险，而在 70 岁以上老年人群中，长期使用低剂量阿司匹林反而与高分级肿瘤发生率升高、肿瘤相关死亡率增加相关，普拉格雷、沃拉帕沙等血小板靶向药物，也会增加冠心病患者的肿瘤发生风险，这也说明血小板与肿瘤的相互作用并非单向，而是复杂且受多种因素调控的。 基于血小板的生物学特性和与肿瘤的相互作用机制，科研人员开发了多种工程化血小板的改造策略，其中最成熟的方向是将其改造为肿瘤治疗的靶向递送载体，依托血小板天然的肿瘤归巢能力和对肿瘤微环境刺激的响应性，实现治疗药物的局部富集和可控释放，减少全身毒性，这类改造主要分为表面偶联药物的血小板和内部装载药物的血小板两类，同时血小板衍生物也被广泛应用于药物递送，成为工程化血小板递送体系的重要补充。表面偶联药物的血小板主要通过共价和非共价两种方式实现药物结合，共价偶联是利用血小板表面的胺基、巯基等官能团，通过 NHS - 胺基偶联、马来酰亚胺 - 巯基反应、点击化学等方式，将小分子药物、抗体、纳米颗粒等连接到血小板表面，比如通过 sulfo-SMCC 异双功能接头将抗 PD-L1 抗体偶联到血小板表面，在黑色素瘤和乳腺癌小鼠模型中，该工程化血小板能靶向术后瘤床的残留肿瘤细胞，有效抑制肿瘤复发，将其与血管破坏剂联合使用，还能增加肺转移灶中免疫检查点抑制剂的富集；代谢糖工程则能在血小板膜上引入叠氮基，通过无催化剂点击化学实现纳米凝胶的偶联，为药物递送提供更多可能。非共价偶联则避免了对血小板表面官能团的化学修饰，能更好保留其天然功能，主要通过脂质插入、静电吸附、受体 - 配体识别等方式实现药物结合，比如将葡萄糖修饰的磷脂插入血小板膜，借助肿瘤细胞表面高表达的葡萄糖转运蛋白 1 提升肿瘤内富集效率，带正电的氧化铁纳米颗粒通过静电吸附到带负电的血小板表面，在乳腺癌术后小鼠模型中，血小板激活后释放的纳米颗粒经激光照射产生光热效应，能杀伤残留肿瘤细胞并激发先天免疫。此外，科研人员还开发了体内 “搭便车” 策略，自组装超分子肽纳米纤维能以非受体依赖的方式在体内直接结合静息和激活的血小板，借助内源性血小板的归巢能力实现药物递送，避免了体外改造对血小板功能的损伤。内部装载药物的血小板则依据治疗药物的理化性质，采用不同的装载方式，小分子药物可通过被动扩散进入血小板，比如阿霉素通过简单孵育即可实现高效装载，在淋巴瘤小鼠模型中，阿霉素装载的血小板能在酸性肿瘤微环境中实现 pH 响应性释放，提升肿瘤细胞的药物摄取并显著降低阿霉素的心脏毒性，冷冻保存还能保留其体外功能和细胞毒性，效果优于脂质体阿霉素制剂；大分子药物和纳米颗粒则主要通过电穿孔、内吞作用、膜融合实现装载，电穿孔能将金纳米棒递送入血小板，在头颈部鳞癌小鼠模型中，金纳米棒的光热效应还能进一步促进血小板向肿瘤部位募集，血小板可通过内吞作用将 CXCL10、灭活仙台病毒等装载入 α 颗粒，在黑色素瘤模型中，凝血酶激活后释放的 CXCL10 能激活抗肿瘤免疫，而灭活仙台病毒则能募集多种免疫细胞至瘤床；膜融合策略则能实现高装载效率，将 IL-15 偶联的阿霉素脂质体与血小板融合，装载效率超 70%，在黑色素瘤转移模型中，该工程化血小板能靶向转移灶和术后出血部位，释放的阿霉素和 IL-15 实现协同抑瘤效果。无论哪种装载方式，药物的释放均依赖肿瘤微环境触发的血小板激活，肿瘤衍生信号、凝血酶、机械剪切力等均可诱导血小板脱颗粒、形态变形甚至破裂，实现治疗药物在肿瘤病灶的局部爆发式释放，这也是血小板递送体系的核心优势。 血小板衍生细胞外囊泡和仿生血小板，作为血小板的衍生物，凭借更优的生物相容性和靶向性，成为药物递送的重要载体，弥补了完整工程化血小板的部分不足。血小板衍生细胞外囊泡占外周血循环细胞外囊泡的一半以上，分为富含 CD63 的外泌体和高凝活性的血小板衍生微颗粒，其继承了血小板的 CD47 “别吃我” 信号，能有效逃避免疫清除，还能通过 P 选择素介导的相互作用主动靶向炎症和损伤组织，同时可通过膜融合或内吞作用将药物递送入肿瘤细胞，规避转运体介导的耐药性。血小板衍生细胞外囊泡可通过被动扩散装载紫杉醇、阿霉素等小分子药物，装载紫杉醇的血小板衍生细胞外囊泡能在体外抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，且对正常细胞毒性极低，装载阿霉素的血小板衍生细胞外囊泡对白血病细胞的毒性显著高于游离阿霉素，还能减少全身药物释放；对于大分子药物，可通过与载药脂质体膜融合实现装载，比如将氯过氧化物酶装载入血小板衍生细胞外囊泡，能在保留其肿瘤靶向能力的同时，实现大分子酶的有效递送，为联合治疗提供了可能。仿生血小板则是将血小板膜通过挤压、超声等技术包被到合成纳米颗粒表面形成的核 - 壳结构载体，其兼具血小板的天然靶向性和合成纳米颗粒的灵活设计性，既可以通过 P 选择素 - CD44 的相互作用实现主动靶向，又能借助增强的通透性和滞留效应实现被动靶向，大幅提升肿瘤富集效率。目前仿生血小板已被广泛应用于多种抗肿瘤药物的递送，比如 TRAIL 功能化的血小板膜包被纳米粒装载阿霉素，在 MDA-MB-231 乳腺癌小鼠模型中，能显著抑制肿瘤生长和转移，载有瑞喹莫德的血小板膜包被纳米制剂 CE120 已获得美国 FDA 的新药临床试验申请批准，在结直肠癌和乳腺癌小鼠模型中，该制剂单药即可诱导持久的抗肿瘤免疫。不过血小板衍生细胞外囊泡和仿生血小板均面临肿瘤穿透性不足的问题，二者在肿瘤中多停留于血管周围区域，未来需要通过结构优化提升其深层肿瘤穿透能力，或与手术、血管破坏剂等联合使用，进一步提升治疗效果。 除了作为药物递送载体，科研人员还通过基因工程和化学工程手段，将血小板直接改造为抗肿瘤的治疗效应细胞，同时也能通过改造血小板祖细胞，在体外或体内生成具备抑瘤功能的工程化血小板，这类改造让血小板从肿瘤进展的 “参与者” 转变为直接的 “抗肿瘤执行者”，进一步拓展了其在肿瘤治疗中的应用场景。直接改造天然血小板主要分为基因工程和化学工程两类，由于血小板无细胞核，DNA 水平的基因改造难以实现，因此 RNA 介导的基因工程成为主要方式，借助脂质纳米颗粒、脂质体等载体，将 mRNA、siRNA、微 RNA 递送入血小板，可实现血小板蛋白表达的调控，比如脂质纳米颗粒递送绿色荧光蛋白 mRNA 能在血小板中实现有效表达，递送 siRNA 可敲低血小板中的凝血因子 XIII、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶等蛋白，递送 miR-223-3p 则能在体外抑制血小板衍生微颗粒的形成，为调控血小板的促瘤功能提供了新途径。化学工程则是通过生化和物理化学方法对血小板进行修饰，赋予其新的治疗功能，比如用神经氨酸酶去除血小板表面的唾液酸残基，制备的去唾液酸化血小板输注后能诱导全身免疫抑制，为肿瘤免疫治疗提供预处理策略；用去垢剂提取血小板制备的血小板诱饵，能保留表面受体的结合能力但无法激活和聚集，在乳腺癌转移模型中，血小板诱饵能干扰天然血小板与肿瘤细胞的结合，有效抑制肿瘤的远处定植；配体导向共价标记则是更精准的化学改造策略，将热休克蛋白 90 配体和靶蛋白配体通过接头连接，与血小板共孵育后可实现靶蛋白配体在血小板内热休克蛋白 90 上的共价偶联，血小板激活后会释放偶联有配体的热休克蛋白 90，可通过泛素 - 蛋白酶体系统降解肿瘤细胞内的 BRD4，或通过溶酶体降解肿瘤细胞表面的 PD-L1，在乳腺癌术后模型中，该工程化血小板能有效抑制肿瘤复发和转移。从血小板祖细胞制备工程化血小板，是实现规模化生产的重要方向，主要包括体外改造和骨髓原位改造两种方式，体外可通过改造巨核细胞、造血干祖细胞诱导生成工程化血小板，诱导多能干细胞来源的血小板已进入首次人体临床试验，证实了其可行性和安全性，改造巨核细胞使其表达 PD-1，生成的工程化血小板在黑色素瘤模型中能靶向瘤床残留肿瘤细胞的 PD-L1，激活抗肿瘤 T 细胞反应，慢病毒转导 CD34 + 造血干祖细胞使其表达 TRAIL，生成的 TRAIL 阳性血小板能在体外杀伤循环肿瘤细胞，在乳腺癌和前列腺癌模型中显著减少肿瘤转移；此外，输注改造后的成熟巨核细胞，其能归巢至肺血管并原位生成功能化血小板，无需体外血小板分离，简化了制备流程。骨髓原位改造则是通过骨内递送慢病毒载体，或系统递送优化的脂质纳米颗粒，实现骨髓内血小板祖细胞的基因修饰，在血友病 A 小鼠模型中，骨内递送编码凝血因子 VIII 的慢病毒，能实现血小板中凝血因子 VIII 的稳定表达，且效果持续数月，这种方式无需体外细胞操作，能实现工程化血小板的体内持续生成，为长期肿瘤治疗提供了可能。 工程化血小板在肿瘤治疗中展现出巨大的应用潜力，但从基础研究走向临床应用，仍需要攻克一系列关键挑战，这些挑战涵盖制备、功能、安全、监管等多个方面，也是当前研究的重点方向。首先是规模化制备与质量控制，工程化血小板的临床应用需要适配工业级的制备工艺，目前已有能模拟骨髓剪切力的生物反应器系统，可实现巨核细胞和血小板的体外大规模生产，同时需要采用质量源于设计的原则，明确工程化血小板的关键质量属性和工艺参数，建立标准化的制备流程和质量检测体系，保证批次间的一致性，这也是细胞治疗产品临床转化的核心要求。其次是血小板的稳定性与活化控制，体外改造过程中的化学修饰、药物装载等操作，可能会导致血小板过早活化或功能受损，因此需要优化改造条件，比如采用常温、无激活剂的缓冲液、缩短反应时间，同时控制表面偶联的药物密度，平衡药物装载量与血小板天然功能的保留；此外，工程化血小板的循环半衰期和货架期也亟待提升，天然血小板的循环半衰期为 7-10 天，输注的血小板为 24-72 小时，血小板衍生细胞外囊泡仅约 5.3 小时，且工程化血小板的免疫原性可能升高，导致清除加快，未来需要开发稳定化策略，延长其体内循环时间和体外保存时间。再者是安全性风险的规避，一方面，工程化血小板可能残留血小板的天然促瘤活性，因此需要通过基因修饰敲低 TGFβ、VEGF 等促瘤因子，或通过抗体、小分子药物阻断 P 选择素、GPIIb/IIIa 等介导血小板 - 肿瘤细胞相互作用的表面受体，在不影响药物递送和抑瘤功能的前提下，削弱其促瘤效应；另一方面，免疫相容性是异基因工程化血小板临床应用的关键，通过敲低血小板的 MHC-I 分子可制备通用型血小板，避免免疫排斥，且血小板无增殖能力，能大幅降低移植物抗宿主病的风险，结合输血医学中成熟的血型匹配策略，可进一步提升工程化血小板的免疫相容性。同时，患者选择和治疗策略的优化也至关重要，工程化血小板主要依托肿瘤 - 血小板相互作用或肿瘤微环境的血栓、炎症特征实现靶向，因此合并心血管疾病、炎症或血栓的肿瘤患者，工程化血小板可能在损伤血管部位非特异性富集，而非肿瘤组织，这类患者需要谨慎选择；而围手术期给药则能减少工程化血小板与循环血小板的竞争，提升其在瘤床边缘的富集效率，更适合接受肿瘤手术切除的患者。最后是监管框架的适配，工程化血小板属于新型生物合成杂化产品，其临床审批需要借鉴 CAR-T 等细胞疗法和细胞外囊泡疗法的转化经验，同时结合血小板输注在输血医学中的成熟临床经验，建立适配的审批路径和监管标准，为其临床推广提供政策支撑。 血小板从传统认知中的止血细胞，到被发现为肿瘤进展的环境依赖性调控因子，再到成为工程化改造的肿瘤治疗靶点，其研究价值被不断挖掘，而基因、化学、生物材料和纳米材料工程的发展，让血小板及其衍生物的多功能改造成为可能，使其兼具靶向药物递送载体和直接抗肿瘤效应细胞的双重功能，成为突破现有肿瘤治疗局限的潜在新型平台。工程化血小板的独特优势在于，其继承了天然的肿瘤归巢能力、免疫逃逸特性和临床可及性，能在自体和异基因场景中应用，且改造后的血小板能实现治疗药物的肿瘤局部可控释放，或直接发挥抑瘤效应，有效解决了传统肿瘤治疗中肿瘤特异性差、脱靶毒性高、规模化制备难等问题。目前已有多项工程化血小板的研究进入早期临床试验，比如 IL-2 偶联血小板联合或不联合全身免疫检查点抑制剂治疗晚期实体瘤的临床试验，血小板膜包被的免疫治疗纳米制剂 CE120 也获得了临床试验批准，这些研究为工程化血小板的临床转化奠定了基础。未来，工程化血小板的研究将聚焦于更精准的改造策略，结合单细胞测序、分子分型等技术，解析不同肿瘤类型中血小板的作用机制，实现个性化的工程化改造；同时跨学科的合作将成为关键，肿瘤学、血液学、生物工程、纳米材料等领域的融合，将推动工程化血小板制备工艺、功能优化、安全性评估的不断完善。此外，工程化血小板还能与手术、化疗、放疗、免疫治疗等现有肿瘤治疗手段联合使用，形成协同治疗效应，进一步提升治疗效果。除了肿瘤治疗，工程化血小板的改造策略还能为出血性疾病、炎症性疾病等其他疾病的细胞治疗提供新的思路，其作为多功能、环境响应性的细胞治疗平台，未来有望在生物医药领域展现出更广阔的应用前景。 看了这么久，累了吧，玩个游戏放松下吧？ 原文链接： https://doi.org/10.1038/s41571-026-01122-5

JMC速览 2026.02.18 近日，中国药科大学杨鹏/李萍/杨华团队联合南京大学刘志红团队在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"基于计算机辅助研究的咪唑并[1,2-a]吡啶类TLR7拮抗剂的理性设计及其在银屑病治疗中的应用"的研究论文。该研究针对自身免疫性疾病银屑病治疗中TLR7靶点的关键作用，通过计算机辅助药物设计手段重建了"开放型"人源TLR7（HTLR7）蛋白结构，系统阐明了TLR7拮抗剂的共同结合模式，并创新性地提出了由氢键弹头（H-bond warhead）、疏水体（hydrophobic body）和氨基尾（amino tail）三部分组成的通用骨架策略。研究团队基于Q354侧链的诱导变形效应，区分了"诱导型"与"非诱导型"氢键弹头设计策略，最终获得具有亚纳摩尔级TLR7拮抗活性的选择性化合物44#（IC₅₀ = 0.3 nM），其对TLR7的选择性分别是对TLR8和TLR9的近5000倍和900倍。在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中，口服给药44#显著改善皮肤病变、降低脾脏肿大，并有效抑制c-Rel等关键炎症因子的表达，展现出良好的体内药效和安全性，为开发新型银屑病治疗药物提供了重要的先导化合物和结构优化策略。药化如何从Paper到临床？药科大杨鹏/肖易倍/郝海平团队：成功推向临床的DYRK2抑制剂“破冰”耐药前列腺癌【JMC】中国药科大学杨鹏/孙程亮/王晓：TIM-3小分子抑制剂破局肿瘤免疫逃逸最新综述【JMC】中国药科大学杨鹏：新型PI3Kα抑制剂及抗乳腺癌活性【JMC】中国药科大学杨鹏/肖易倍/郝海平/王晓：新型PTPN2抑制剂及其抗黑色素瘤【JMC】中国药科大学杨鹏/肖易倍/郝海平/王晓：新型PTPN2抑制剂及其抗黑色素瘤【JMC】中国药科大学杨鹏/王晓/袁凯团队发现新型MET转录抑制剂，靶向G-四链体结构展现抗NSCLC活性【JMC】中国药科大学杨鹏团队：新型PRMT7抑制剂治疗前列腺癌【JMC】中国药科大学杨鹏&肖易倍等开发新型PD-L1/VISTA双重抑制剂作为潜在免疫治疗药物 1 min速览 研究背景 Toll样受体7（TLR7）是先天免疫系统中重要的模式识别受体，主要识别病毒单链RNA，在抗病毒免疫中发挥关键作用。然而，TLR7的异常激活与多种自身免疫疾病密切相关，包括系统性红斑狼疮和银屑病。研究表明，TLR7信号通路的激活可通过调控c-Rel等关键转录因子驱动银屑病炎症反应，而TLR7激动剂咪喹莫德（IMQ）更是被广泛用作诱导银屑病动物模型的工具。尽管TLR7拮抗剂具有明确的治疗潜力，但由于长期缺乏人源TLR7（HTLR7）与拮抗剂结合的共晶结构，基于结构的理性药物设计面临重大挑战。目前仅有少数TLR7拮抗剂进入临床研究，开发具有高选择性和优异药效的新型TLR7拮抗剂具有重要的科学价值和临床意义。 重点内容 计算机辅助结构重建与结合模式解析 研究团队基于已报道的食蟹猴TLR7（MmTLR7）"开放型"共晶结构（PDB: 6LW1），通过分子对接和结构叠合手段，首次在计算机中重建了人源TLR7的"开放型"二聚体结构（7CYN rebuilt）。该结构验证显示与MmTLR7具有高度保守的拮抗剂结合口袋，由S1、S2、S3三个亚口袋组成。通过对六种已知TLR7拮抗剂（Cpd-1至Cpd-5及Enpatoran）的分子对接分析，系统阐明了其共同结合模式：所有拮抗剂均通过氢键弹头与Q354主链氨基形成关键氢键，疏水体占据S2/S3口袋形成π-π堆积和疏水相互作用，氨基尾则延伸至溶剂暴露区域。 2. 基于通用骨架的系统性结构优化 基于上述结合模式，研究团队提出了TLR7拮抗剂的通用三部件骨架策略： 氢键弹头优化：设计了多种六元并五元杂环结构，发现8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头可通过甲氧基氧原子和咪唑sp²氮原子与Q354主链形成双氢键，同时甲基基团占据S1口袋形成疏水相互作用，表现出最优活性（6#: IC₅₀ = 6.6 nM）。 疏水体优化：证实吡啶环比苯环更适合作为疏水体，间位三氟甲基取代可通过与S3口袋残基（F349、F351、V381）形成广泛疏水相互作用和卤键，显著提升活性。 氨基尾优化：揭示氨基尾通过调控分子碱性和亲脂性实现溶酶体靶向，而非直接与蛋白相互作用。4-甲基-4-氨基哌啶尾在碱性和亲脂性之间达到最佳平衡，使44#活性提升至0.3 nM。 3. 诱导型与非诱导型氢键弹头的设计策略 研究团队发现Q354侧链具有"翻转"柔性，可呈现"外翻"（flipped-out）或"内翻"（flipped-in）两种构象。基于这一现象，提出了两类氢键弹头设计策略： 诱导型弹头（如含硝基）：吸引Q354侧链内翻，形成额外氢键但导致S1口袋关闭； 非诱导型弹头（如含甲氧基/乙氧基）：维持Q354侧链外翻，保持S1口袋开放以形成疏水相互作用。实验证实，非诱导型弹头因能同时获得氢键和疏水相互作用优势，活性显著优于诱导型弹头。 4. 化合物44#的选择性、药效学与体内评价 最优化合物44#对TLR7表现出卓越的选择性（TLR7 IC₅₀ = 0.3 nM；TLR8 IC₅₀ = 1637.9 nM；TLR9 IC₅₀ = 292.8 nM）。在体外细胞实验中，44#显著抑制R848诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-α等炎症因子的表达，活性优于阳性对照药Enpatoran。药代动力学研究显示44#口服生物利用度达46.66%，半衰期约13.6小时。在咪喹莫特诱导的雌性银屑病小鼠模型中，口服给药44#（15和45 mg/kg）显著改善皮肤红斑、鳞屑和厚度，降低脾脏肿大，抑制c-Rel和p65的mRNA表达，并减少血清及皮肤组织中IL-17A和IL-1β的水平。长期给药安全性评价表明，44#可有效逆转模型小鼠的肝肾功能异常，且主要脏器未见明显病理损伤。 研究总结 本研究通过整合计算机辅助药物设计与多轮结构优化，成功开发了具有亚纳摩尔级活性和高选择性的TLR7拮抗剂44#，为银屑病治疗提供了新的候选药物。研究的主要创新点包括：（1）首次重建并验证了"开放型"人源TLR7结构，为基于结构的TLR7拮抗剂设计提供了重要工具；（2）系统阐明了TLR7拮抗剂的共同结合模式和构效关系，提出了氢键弹头-疏水体-氨基尾的通用骨架策略；（3）揭示了Q354侧链的诱导变形效应，区分了诱导型与非诱导型氢键弹头的设计原则，强调了S1口袋疏水相互作用的重要性；（4）阐明了氨基尾通过调控碱性和亲脂性实现溶酶体靶向的作用机制，为 TLR7 拮抗剂的尾部优化提供了理论指导。化合物44#在银屑病小鼠模型中展现出的优异体内药效和安全性，证明了该设计策略的有效性，也为进一步开发治疗自身免疫性疾病的TLR7靶向药物奠定了坚实基础。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 模式识别受体（PRRs）是哺乳动物先天免疫系统的重要组成部分，其中Toll样受体7（TLR7）主要位于内体/溶酶体中，识别病毒单链RNA并发挥抗病毒作用。TLR7的异常激活不仅与系统性红斑狼疮高度相关，也与银屑病等自身免疫疾病密切相关——TLR7激动剂咪喹莫德可诱导银屑病样炎症，且TLR7通过调控c-Rel特异性驱动银屑病相关炎症信号。2020年Shimizu等人首次报道了食蟹猴TLR7与拮抗剂结合的"开放型"晶体结构，但人源TLR7（HTLR7）的相应结构至今未获解析。本研究基于"开放型"MmTLR7重建了HTLR7计算机模型，探索已知拮抗剂的共同结合模式，提出由氢键弹头、疏水体和氨基尾组成的三部分通用骨架策略；并基于Q354侧链的诱导变形效应，区分了诱导型与非诱导型氢键弹头设计策略。通过合成46个化合物进行优化，最终获得亚纳摩尔级选择性TLR7拮抗剂44#，在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中显示出良好的治疗效果。 02 Drug Design ①药物设计 TLR7拮抗剂的初步分析 研究团队选取了六种结构多样的TLR7拮抗剂以探索其共同特征：Cpd-1是诺华开发的基于吡啶酮结构的TLR7/8双抑制剂，对人TLR7/8的IC₅₀分别为0.62/1.5 nM；Cpd-2是基于嘌呤结构的TLR7拮抗剂，对人或小鼠TLR7的IC₅₀分别为15或192 nM，Shimizu等人也报道了其与食蟹猴TLR7的首个共晶结构；Cpd-3是百时美施贵宝开发的2-苯基吲哚类TLR7/9拮抗剂，对TLR7的IC₅₀为10 nM；Cpd-4是诺华开发的6-吡啶基咪唑类TLR7/8拮抗剂，对TLR7和TLR8 PBMC细胞的IC₅₀分别为7和0.08 nM；Cpd-5是诺华开发的基于吡唑并[3,4-b]吡啶结构的纳摩尔级TLR7/8双拮抗剂；Enpatoran是默克集团开发的"first-in-class"口服TLR7/8拮抗剂，目前处于II期临床试验，在本研究中作为阳性对照药物。值得注意的是，上述六种分子在结构上确实存在一些相似性，如中部的疏水取代基或尾部的脂肪胺结构，因此找出它们的共同结合模式对于设计拮抗剂至关重要。 "开放型"HTLR7结构的重建 合适的人源化蛋白结构对于分子对接至关重要。2021年Shimizu等人报道了首个HTLR7蛋白结构（PDB ID: 7CYN），但该蛋白未结合任何配体，仅与其分子伴侣UNC93B1结合，因此HTLR7与拮抗剂结合的共晶结构至今尚未获得。相比之下，Shimizu等人已解析了食蟹猴TLR7（MmTLR7）与Cpd-2结合的共晶结构（PDB ID: 6LW1），其中MmTLR7因Cpd-2的结合而采取"开放型"二聚化构象，两个TLR7单体C末端间距扩大至69 Å。考虑到TLR7在不同物种间的保守性以及MmTLR7与HTLR7之间93.9%的序列相似性，基于MmTLR7结构在计算机中构建"开放型"HTLR7是可行的。与"开放型"（6LW1）或"闭合型"（6LVX）的MmTLR7不同，7CYN中两个TLR7单体C末端间距经测量为59 Å，表明HTLR7与UNC93B1结合时维持的二聚化构象既非"开放型"（69 Å）也非"闭合型"（36 Å）。为便于7CYN与"开放型"6LW1的叠合，仅保留胞外域（ECD）二聚体。通过"分割-叠合-合并"三步法获得二聚体：将7CYN和6LW1中的TLR7二聚体均分割为A、B两个单体，以6LW1的两个单体为参照，将7CYN中对应的两个单体与之叠合，然后将7CYN单体A和B合并为一个二聚体以构建"开放型"7CYN。此后，7CYN重建结构中两个TLR7单体C末端间距扩大至69 Å，与"开放型"6LW1一致。为简化表述，下文所有7CYN均指重建后的7CYN。 重建HTLR7蛋白结构的验证 在使用重建的人源化TLR7（7CYN重建）进行分子对接前，有必要对该结构进行验证。将7CYN重建结构与6LW1叠合，以密切比较拮抗剂口袋周围残基的侧链构象。选取6LW1中Cpd-2周围5 Å范围内的所有残基，同时选取7CYN中相应残基进行结构比较。值得注意的是，两种蛋白不仅主链高度重叠，且口袋周围残基的侧链构象也高度相似，提示人源TLR7与食蟹猴TLR7的拮抗剂结合口袋可能高度相似。采用基于遗传算法的GOLD软件进行分子对接，为进一步验证7CYN重建结构，将Cpd-2对接到其中以获得蛋白-配体复合物，随后与MmTLR7（6LW1）结构进行比较。Cpd-2与两种蛋白形成的相互作用也高度相似：嘌呤结构中的sp²杂化氮原子均与谷氨酰胺Q354主链氨基形成氢键。同时，GOLD预测的Cpd-2在HTLR7（7CYN重建）中的结合模式（图3B）与MmTLR7晶体结构中的结合模式（图3A）高度相似，两种TLR7复合物的叠合结构清晰显示不同复合物中的Cpd-2均能良好叠合。此外，HTLR7和MmTLR7均具有鸡冠状结合口袋，HTLR7可划分为三个亚口袋（亚口袋1-3）。对于Cpd-2，亚口袋1（S1）容纳其嘌呤的乙氧基，亚口袋2（S2）容纳甲基，而亚口袋3（S3）部分容纳其氟吡啶。与S2和S3口袋不同，S1口袋末端有缺口使其呈开放状态。实际上，拮抗剂结合口袋由二聚化的TLR7单体A和B共同形成，其中A链提供大部分残基形成口袋，而B链似乎仅贡献两个苯丙氨酸（F506和F507）。当然，这一说法有些片面，因为TLR7二聚体是对称结构，在二聚体另一侧存在相同的结合位点，该口袋中A链仅贡献两个苯丙氨酸，而B链提供大部分残基形成口袋。重建的7CYN蛋白将用于后续的分子对接研究。 衍生物设计与化学合成 先导化合物F2（4-(叔丁基)-N-(2-羟基-5-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯基)苯甲酰胺）具有苯甲酰胺核心结构，由两个芳环（I环和II环）通过酰胺连接子（X）相连。二维和三维分子对接模拟显示，F2主要通过疏水相互作用与HOXA1蛋白结合，特别是与关键氨基酸残基Lys286形成π-烷基相互作用。为探索构效关系，研究团队基于F2骨架进行了系统的结构修饰：（i）I环修饰：将R2位支链烷基从2,4,4-三甲基戊基缩短为叔丁基或叔戊基以增强与Lys283的疏水堆积，同时将R1位羟基替换为氨基（-NH₂）作为生物电子等排体；（ii）II环取代：将原有叔丁基替换为甲基或氯取代基，以调节Arg287附近的电子效应和空间位阻；（iii）连接子修饰（X）：将非贡献性酰胺键（-NHCO-）替换为多种连接子（-CH=CH-、-CH₂CH₂-、-CONH-、-COO-、-CH₂O-、-NHCH₂-），以评估刚性、极性和氢键形成能力对结合亲和力的影响。共设计了25个新衍生物。F2及其25个衍生物（F2-1至F2-25）按照方案1和2所示的合成路线进行合成。 ②构效关系 芳香性对疏水体重要性的探索 为研究芳香性对疏水体（B部分）的影响，将Enpatoran中的哌啶替换为苯或吡啶以构建化合物1#和2#。同时，在疏水体的间位保留三氟甲基，并在间位（苯）和对位（吡啶）引入氨基以比较氨基间位和对位取代对活性的影响。Enpatoran的IC₅₀为126.6 nM，而1#和2#的IC₅₀分别达到45.2 nM和26.1 nM，表明芳香环比脂肪环更适合作为疏水体，引入芳香环增强的活性可能源于疏水体与周围丰富苯丙氨酸之间形成的额外π-π堆积相互作用。为评估抑制剂活性，采用Invivo Gen公司的专利细胞系HEK-Blue HTLR7 Cells，通过SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）检测化合物对HEK-Blue HTLR7细胞中NF-κB水平的抑制活性，该细胞经TLR7激动剂R848激活。 基于口袋形状与氢键相互作用的氢键弹头设计 Q354主链氨基位于S1口袋和S2口袋交汇处的凹槽中，因此当Cpd-3以其两个甲氧基占据S1和S2口袋时，两个氧原子均与Q354主链氨基形成氢键相互作用。尽管Enpatoran中的喹啉弹头也占据这两个口袋，但仅喹啉中的sp²氮原子形成氢键相互作用。为使氢键弹头在占据S1口袋时也能形成氢键，将喹啉的氰基替换为额外的吡啶，构建1,10-菲啰啉作为3#和4#的弹头。同时，对接结果显示三环菲啰啉结构有效适应S1和S2口袋。化合物3#保持高活性（45.4 nM），而4#活性显著下降至2261 nM。随后对1,10-菲啰啉进行开环修饰，引入甲氧基占据S2口袋，构建8-甲氧基喹啉基弹头（5#）。尽管5#活性确实有一定程度改善，但仍需进一步优化。然后，构建具有紧凑六元并五元环结构的8-甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头（6#）。令人惊讶的是，6#表现出优异活性，IC₅₀达到6.6 nM。对接结果显示，新设计的三种氢键弹头（4#-6#）有效占据S1和S2口袋，并与Q354主链氨基形成两个独立的氢键，如同Cpd-3一样。然而，与Cpd-2和Cpd-4相比，新设计的弹头缺乏与S1口袋残基的疏水相互作用。因此，在咪唑并[1,2-a]吡啶的2位引入甲基（7#）以可能与L353和Y264建立疏水相互作用，7#确实表现良好（16.4 nM）。此外，与6-溴-8-甲氧基咪唑并[1,2-a]吡啶（6#原料）相比，引入甲基也提高了6-溴-8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶（7#原料）的环化反应收率。 疏水体与氨基尾连接位置的探索 在苯基疏水体的间位（1#、3#）或吡啶基疏水体的对位（2#、6#、7#）引入氨基均是可行的。然而，当引入更大的氨基尾时，间位或对位哪个更合适尚不确定。同时，在构建1#和2#时，将Enpatoran中的哌啶替换为芳香环可能导致亲脂性损失。因此，引入具有3-哌啶甲酰胺或4-哌啶甲酰胺的亲脂性氨基尾进行补偿（8#-13#）。弹头采用Enpatoran的8-氰基喹啉或新设计的8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶。值得注意的是，在吡啶疏水体对位引入哌啶氨基尾（9#、11#、13#）总是优于在苯环疏水体间位引入（8#、10#、12#）。13#相对于9#的活性优势也证明了咪唑并[1,2-a]吡啶弹头的潜力。有趣的是，8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头特别不适合间位取代的苯环疏水体，因为10#和12#均无活性。此外，在哌啶对位引入甲酰胺（11#）优于间位（13#）。因此，使用吡啶作为疏水体并在对位引入氨基尾更为合适。同时，在氨基尾哌啶的对位连续引入对位取代基似乎是更好的选择。 氢键弹头与Q354主链形成关键氢键 此前的分子对接结果显示，所有六种拮抗剂均通过其氢键弹头与Q354主链氨基形成氢键相互作用。为探索该氢键的重要性，消除了不同氢键弹头中参与形成氢键的关键原子或基团。在保留关键sp²氮原子的化合物中，14#采用Cpd-4的吡啶弹头，9#和16#均采用Enpatoran的8-氰基喹啉弹头，而18#引入新开发的1,10-菲啰啉作为其弹头。在用于比较的化合物（15#、17#、19#、21#）中，弹头中关键的sp²杂化氮原子被无法形成常规氢键的碳原子取代，同时每对比较化合物的B和C部分保持相同。值得注意的是，15#、17#、19#和21#的抑制活性明显丧失，其中21#完全丧失对TLR7的拮抗活性。相比之下，保留关键sp²杂化氮的类似物14#、16#、18#和9#对TLR7表现出更强的抑制效果。事实上，在每个弹头中将关键sp²氮原子替换为碳原子均导致活性显著丧失，进一步凸显了与Q354主链形成氢键相互作用的关键作用。因此，氢键弹头与Q354主链氨基之间形成的氢键相互作用对所有TLR7拮抗剂至关重要。此外，16#（426.7 nM）活性显著优于9#，这与之前观察到的趋势一致，即11#（48.2 nM）明显优于13#，表明在氨基尾对位引入取代基比间位更有效。同时，11#活性仍强于16#，进一步证明了8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶的优势。观察到一种现象：尽管化合物4#活性不理想，但将氨基替换为4-哌啶甲酰胺衍生的18#表现出优异活性（80.2 nM）。可见氨基尾对化合物活性的调控微妙而复杂。由于在共晶结构或对接结果中氨基尾始终未与蛋白形成相互作用，研究团队决定暂时不探索氨基尾的结构与功能。 疏水体的功能与设计策略 由于研究团队化合物的吡啶疏水体是从Enpatoran的哌啶结构优化而来，间位三氟甲基始终保留。同时，对接结果表明，从疏水体伸出的邻位（Cpd-3和Cpd-4）或间位（Cpd-1、Cpd-2、Cpd-5和Enpatoran）取代基占据S3口袋并与周围残基形成疏水相互作用或卤键。然而，这些突出取代基是否发挥重要作用尚不清楚。基于16#的结构构建了在疏水体间位无取代基的20#，类似地，将三氟甲基替换为氟原子构建了22#。与16#（430 nM）相比，20#活性大幅下降至2310 nM，表明疏水体上取代基形成的疏水相互作用同样重要。同时，22#（1270 nM）活性确实高于20#，但仍无法与引入三氟甲基的16#相比。为深入理解其结合模式的差异，对16#、20#和22#进行了分子对接。这三种化合物采用大致相同的构象，其sp²氮均与Q354主链氨基形成氢键，疏水体中的吡啶也与F408和F506形成π-π堆积相互作用。然而，它们与S3口袋形成的相互作用差异显著。16#通过其三氟甲基与F349、F351、V381等疏水残基形成广泛疏水相互作用，此外16#还通过氟原子与G379和T406形成卤键。相比之下，22#仅通过单个氟原子与T406维持卤键，而20#因缺乏取代基未能与S3口袋产生任何相互作用。与S3口袋残基相互作用的缺失导致20#和22#活性不佳，因此为疏水体引入合适的疏水取代基至关重要。类似地，Mussari等人在优化Cpd-3时也发现，在吲哚邻位引入异丙基比甲基具有更高的抑制活性。实际上，Cpd-3和Cpd-4疏水体中的邻位取代基与间位取代的三氟甲基发挥相同作用。与甲基相比，三氟甲基、异丙基和环丙基均具有更大体积，可能有助于拮抗剂顺利占据S3口袋并形成更多相互作用。因此，芳香疏水体具有双重功能，其设计策略可总结为：构建芳香结构以与F408和F506形成π-π堆积相互作用，并引入疏水取代基占据S3口袋以形成疏水相互作用和卤键。值得注意的是，取代基应具有适当体积而非"越大越好"，对于Cpd-2，由于其吡啶已部分进入S3口袋，在吡啶间位仅引入氟原子即可奏效。 非诱导型氢键弹头的活性优势源于与S1残基的疏水相互作用 近日，Yin及其团队报道了一系列基于8-硝基喹啉用于治疗系统性红斑狼疮（SLE）的TLR7拮抗剂。他们同样通过实验证明了Q354主链与拮抗剂之间形成的氢键相互作用的重要性。同时，他们获得了与新型TLR7拮抗剂TH-407b结合的食蟹猴TLR7新共晶结构（PDB ID: 8I96）。与6LW1类似，8I96中的二聚体也保持"开放型"，两个原聚体C末端相距69 Å。将6LW1和8I96结构叠合以比较两种结构中配体周围5 Å范围内的残基。意外的是，Q354侧链在两种蛋白中显示出明显不同的结构，而其他所有残基均无显著差异。与6LW1相比，8I96中Q354侧链明显翻转，使其侧链取向从远离配体（6LW1）变为朝向配体（8I96）。为区分这两种不同构象，将6LW1中远离配体的Q354构象命名为"外翻型"，而将8I96中的构象命名为"内翻型"。得益于Q354侧链的"内翻型"构象，TH-407b中的硝基与Cpd-2相比新形成了与Q354侧链酰胺以及Y264的额外氢键相互作用。然而，由于Q354的初始构象尚不确定，"内翻型"或"外翻型"构象均可能是变形的结果。因此，将"开放型"HTLR7（7CYN重建）与上述两种MmTLR7叠合，显示7CYN中的Q354侧链采用相同的"外翻型"构象。由于7CYN缺乏配体结合，无配体结合的Q354初始构象应为"外翻型"而非"内翻型"。因此，Q354的"内翻型"构象来源于"外翻型"的构象变化，而这种变形很可能是由硝基诱导的。为深入研究，通过柔性对接将TH-407b对接到蛋白（6LW1和7CYN）中，其中Q354侧链采用"外翻型"构象，同时将谷氨酰胺Q354设为柔性残基。有趣的是，柔性对接显示无论TH-407b结合MmTLR7还是HTLR7，Q354侧链均发生翻转，变为靠近配体的"内翻型"。此外，TH-407b的硝基与Q354侧链以及Y264形成额外氢键，模拟了8I96中的相互作用。因此，Q354侧链的"内翻型"构象来源于硝基吸引引起的变形。值得注意的是，6LW1和8I96结合口袋的溶剂可及表面指出，Q354侧链的变形也导致8I96中S1口袋的关闭，这完全阻止了配体与S1口袋残基产生任何疏水相互作用。相比之下，尽管6LW1中的Cpd-2缺乏与Q354侧链的额外氢键相互作用，但"外翻型"Q354保持S1口袋开放，允许乙氧基占据S1口袋形成疏水相互作用。Q354侧链就像一个开关，控制S1口袋的开放或关闭。值得注意的是，同一配体必须在形成与Q354侧链的额外氢键或与S1口袋残基建立疏水相互作用之间做出选择，因为这两种相互冲突的相互作用分别依赖于Q354侧链的"内翻型"或"外翻型"构象。 通过"反向优化"探索非诱导型氢键弹头的三重功能 研究团队已开发了三种可与Q354主链形成双氢键的弹头，包括11#中的8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶（IC₅₀ = 48.3 nM）、18#中的1,10-菲啰啉（IC₅₀ = 80.2 nM）和25#中的8-乙氧基喹啉。其中，8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头具有最佳药效。考虑到Q354侧链表现出诱导变形效应，研究团队通过柔性对接验证其是否确实属于非诱导型氢键弹头。结果显示，当11#与7CYN结合时，Q354侧链稳定在"外翻型"构象，从而保持S1口袋开放。因此，咪唑并[1,2-a]吡啶弹头确实属于非诱导型。同时，11#咪唑环上的甲基恰好进入S1口袋并与L353和Y264产生疏水相互作用，其功能与25#中的乙氧基类似。与Cpd-1至Cpd-5中的氢键弹头类似，8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头也产生三种相互作用：与Q354主链氨基形成的两个氢键、咪唑甲基与S1口袋残基产生的疏水相互作用，以及咪唑并[1,2-a]吡啶环与F507形成的π-π堆积相互作用。值得注意的是，11#中甲氧基的氧原子和咪唑的sp²氮原子分别与Q354主链氨基独立形成氢键，维持稳定的三角结构，类似于HDAC抑制剂以双齿方式螯合锌离子。这种双氢键相互作用可能促进弹头更稳定地结合入口袋。令人困惑的是，尽管甲基和乙氧基等疏水取代基占据S1口袋可发挥有利作用，但这一理论无法解释6#和7#的构效关系，因为不含咪唑甲基的6#（IC₅₀ = 6.6 nM）甚至表现出略优于7#的活性。为验证疏水取代基是否对活性有益，对8-甲氧基-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶弹头进行"反向优化"（26#-28#），依次破坏三个相互作用亚结构。首先，消除甲基使26#活性降至1.5 μM；然后，消除吡啶上的甲氧基（27#）使IC₅₀进一步升高至超过10 μM，但在10 μM浓度下仍保持50.4%的抑制率；最后，将咪唑并[1,2-a]吡啶还原为5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡啶使28#对TLR7完全失活。通过三步"反向优化"，依次破坏了参与疏水相互作用、氢键形成和π-π堆积的取代基或亚结构，使分子活性持续受损直至完全消失。这些发现不仅证明向咪唑并[1,2-a]吡啶弹头引入甲基作为疏水取代基是有益的，更凸显了氢键弹头的多样化功能/作用，其功能不仅限于参与氢键形成。 氢键弹头的功能与设计策略、六元并五元杂环弹头的比较及氨基尾的非直接蛋白相互作用机制 非诱导型氢键弹头具有形成芳香堆积、氢键和疏水相互作用三重功能，其设计策略为：（1）构建芳香环形成π-π堆积；（2）引入sp²氮或含氧取代基与Q354主链形成氢键；（3）引入疏水取代基占据S1口袋。研究团队比较了多种六元并五元杂环弹头，发现咪唑并[1,2-a]吡啶仍是最佳选择，芳香性对活性至关重要，氧原子不能取代氮原子。关于氨基尾，此前1#-7#的氨基尾部远离蛋白残基，可能不直接相互作用；且6#与7#的活性差异提示氨基尾的结构变化可能抵消甲基的有利效应。文献报道碱性有助于分子进入酸性内体，因此研究团队假设氨基尾通过碱性实现溶酶体靶向，而非直接蛋白结合。 HCQ侧链靶向溶酶体、改善亲脂性以提升活性及氨基尾的普遍活性增强作用 羟氯喹（HCQ）广泛用于自身免疫疾病治疗，可有效抑制多种内体TLR的激活。研究表明HCQ对TLR7信号的抑制可能并非源于与TLR7的直接相互作用，而是其抑制内体pH酸化的能力，因为高pH可阻碍TLR7蛋白的功能成熟。除喹啉外，HCQ的脂肪胺侧链更可能赋予其亲脂性和碱性双重性质。因此，将2-(4-氨基戊基-(乙基)氨基)乙醇（HCQ侧链）作为43#的氨基尾引入，使43#的IC₅₀达到17.4 nM，证明引入适当氨基尾帮助分子靶向溶酶体的策略有效合理。迄今活性最强的化合物是39#（IC₅₀ = 6.8 nM），其氨基尾为4-氨基哌啶，活性明显优于Enpatoran（126.6 nM）。考虑到向哌嗪引入甲基（42#）进一步改善了41#的活性，向39#的4-氨基哌啶4位引入甲基，44#的活性大幅提升，IC₅₀达到0.3 nM。作为氨基尾，4-甲基-4-氨基哌啶可能恰好达到溶酶体偏好的碱性与亲脂性平衡。基于碱性和亲脂性对活性的有利影响，有理由相信氨基尾具有增强化合物活性的普遍适用性。将4-甲基-4-氨基哌啶引入替代16#原有的4-哌啶甲酰胺作为氨基尾，得到化合物45#，与16#相比活性提升10倍以上。将4-甲基-4-氨基哌啶与8-乙氧基喹啉弹头结合构建46#，与先导化合物25#（181.9 nM）相比活性提升近20倍（9.3 nM）。通过改善另外两种喹啉类化合物的氨基尾碱性和亲脂性，化合物活性均大幅提升，证明氨基尾带来的活性增强具有普遍性。 氨基尾的功能与设计策略及咪唑并吡啶弹头的TLR7选择性拮抗作用 研究团队通过控制变量策略探索了亲脂性、碱性与活性的关系。总体而言，氨基尾的作用可概括为调节整个分子的碱性和亲脂性，并协助分子定位于酸性亚细胞区室。碱性是氨基尾重要且不可或缺的性质，亲脂性可视为依赖于碱性的有利因素，而亲水性则是不利因素。基于这些发现，氨基尾的设计策略为：优先引入碱性基团，然后考虑引入适当亲脂基团以进一步提升活性；同时应尽量避免引入亲水性基团，因其可能破坏化合物的亲脂性。明确氨基尾功能后，建议将溶酶体靶向亚结构作为分子的氨基尾，如羟乙基哌嗪和吗啉。实际上，氨基尾不直接与蛋白相互作用，而是作为辅助结构调节分子的碱性和亲脂性，从而帮助化合物完成细胞内定位；因此，仅携带适当氨基尾的分子才能完成细胞内定位。鉴于TLR7、TLR8和TLR9之间的高度序列同源性，多种拮抗剂在这些受体间表现出交叉反应性，因此确定报道化合物是作为选择性TLR7拮抗剂还是双重/多重TLR拮抗剂至关重要。研究团队测定了Enpatoran、44#和45#对TLR8和TLR9的拮抗活性。44#对TLR7的选择性比对TLR8（1637.9 nM）近5000倍，比对TLR9（292.8 nM）近900倍，使其成为选择性TLR7拮抗剂。同时，Enpatoran对TLR7和TLR8具有相似的拮抗效果，但对TLR9无效，与此前研究一致。引入相同喹啉弹头的45#也可视为TLR7/8双重拮抗剂，但对TLR9活性较差（459.2 nM）。考虑到44#和45#仅在弹头上存在结构差异，研究团队认为咪唑并[1,2-a]吡啶是TLR7的选择性弹头，在与TLR7特异性结合中发挥关键作用。 03 RESULTS ①44#体外下调多种炎症因子的表达 促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在炎症反应中发挥关键作用，其相互作用和协同效应使炎症反应更加复杂多样。研究发现，活动期银屑病患者PBMC产生的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症细胞因子水平显著高于非活动期患者。类似地，对寻常型银屑病患者外周血mRNA水平的检测发现，上述三种炎症因子的mRNA水平显著高于正常人群。因此，用R848（TLR7激动剂）刺激的RAW 264.7细胞经不同浓度44#处理12小时后，测定IL-1β、IL-6和TNF-α的转录水平。同时，考虑到TLR7激活的关键下游标志物是干扰素α（IFN-α），用R848刺激的RAW 264.7细胞和HEK-Blue-HTLR7细胞经不同浓度44#处理12小时，分别测定IFN-α的表达和转录水平。如图9A-C所示，44#处理对R848刺激诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平呈浓度依赖性下调。同时，在5 μM浓度下，44#对三种炎症因子mRNA水平的抑制优于阳性药物Enpatoran。特别是对于IL-1β和IL-6，0.5 μM的44#抑制效果已优于5 μM的Enpatoran。在RAW 264.7细胞中，0.5 μM 44#给药效果略优于5 μM Enpatoran；在HEK-Blue-HTLR7细胞中，0.5 μM 44#显著下调IFN-α转录水平，效果明显优于5 μM Enpatoran。为明确44#对IFN-α的下调作用，研究团队检测了RAW 264.7细胞中两种I型干扰素特征基因MX1和IFIT的转录水平。已知这两种基因在I型干扰素（IFN-I）通路激活后显著上调。结果显示，44#给药逆转了R848刺激引起的转录水平升高，并呈浓度依赖性下调IFIT和MX1的转录水平，且在相同浓度下优于Enpatoran（1 μM）。上述结果支持研究团队使用44#进行银屑病小鼠模型的体内药效学评价。 ②体内疗效 研究团队采用咪喹莫德诱导的雌性银屑病小鼠模型评价44#体内药效。小鼠分为对照组、模型组及15 mg/kg、45 mg/kg剂量组。44#口服给药显著改善模型小鼠皮肤红斑、增厚和鳞屑，PASI评分接近正常水平。 ③44#长期口服安全性评价 众所周知，银屑病是一种慢性疾病，患者可能需要长期用药以有效控制症状，因此评估化合物的长期安全性十分必要。为此，研究团队在小鼠20天治疗期间评估了血常规指标、肝功能和肾功能。咪喹莫德给药导致模型组小鼠白细胞计数和淋巴细胞计数显著增加，淋巴细胞百分比中度升高，其他血常规指标未见异常，这与银屑病患者血液学结果结论一致，表明该银屑病小鼠模型表现出与银屑病患者相似的广泛全身炎症。幸运的是，两个剂量44#给药均显著降低升高的白细胞和淋巴细胞计数，并将淋巴细胞百分比恢复至与对照组几乎无差别的水平。同时，模型组小鼠ALT、AST水平以及血尿素氮和肌酐水平显著升高，提示肝肾功能异常。44#给药后，低剂量组和高剂量组肝肾功能基本得到保护，尤其是高剂量组保护作用最为显著。事实上，肝功能异常在银屑病患者中相对普遍，而肾功能异常通常仅见于红皮病型银屑病，在斑块型银屑病和脓疱型银屑病中较少见。因此，模型组小鼠观察到的肝肾功能异常可能源于银屑病和咪喹莫德副作用的双重效应。相比之下，44#给药以剂量依赖性方式降低小鼠异常升高的肝肾功能指标。44#与咪喹莫德同时给药不仅未进一步损害小鼠肾功能，还对TLR7激活诱导的全身炎症及肝肾功能异常表现出显著治疗效果。因此，有理由相信长期口服44#相对安全。此外，收集四组小鼠肝脏和肾脏并称重，各组间无显著差异；肝脏、肾脏和脾脏的苏木精-伊红染色也未发现明显病理损伤，证实了44#口服给药的安全性。 总结与展望 本研究在计算机中重建并验证了"开放型"人源TLR7，有助于探索TLR7拮抗剂的共同结合模式。通过总结六种已知TLR7拮抗剂的结构特征，提出了TLR7拮抗剂的通用骨架。同时，本研究基于三部分的结构和功能提出了氢键弹头、疏水体和氨基尾的概念，并对其功能进行了探索和阐明。研究团队确定了氢键弹头的三个重要作用，包括形成氢键、疏水相互作用和π-π堆积相互作用；同样发现疏水体参与芳香堆积和疏水相互作用的形成。值得注意的是，研究发现含硝基弹头可对Q354侧链产生独特的诱导变形效应，导致侧链翻转。基于这一诱导变形效应，研究团队提出了诱导型或非诱导型弹头的概念，并设计相应化合物进行比较，阐明了弹头与S1口袋之间疏水相互作用的重要性。此外，通过引入不同碱性和亲脂性取代基探索了氨基尾的功能，发现增加氨基尾的碱性和亲脂性对优化TLR7拮抗剂活性具有普遍性。通过综合结构优化，44#实现了对TLR7的选择性拮抗，对TLR7的选择性分别比对TLR8和TLR9近5000倍和900倍。同时，44#表现出良好的药代动力学性质。在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中，44#给药有效保护小鼠免受皮肤损伤和红斑；血液学结果证明了44#对咪喹莫德诱导全身炎症的抑制能力；肝肾功能测试证明连续20天口服44#未造成明显损伤。此外，研究发现44#可在体外和体内下调炎症细胞因子的分泌，这可能通过阻断TLR7-c-Rel轴实现。总体而言，本研究开发了具有优异活性的选择性TLR7拮抗剂，并验证了其在小鼠模型中的良好治疗效果，这可能进一步拓展TLR7拮抗剂的治疗范围。同时，本研究也提出了TLR7拮抗剂的新设计策略，分享了开发TLR7拮抗剂的经验教训，以促进选择性TLR7拮抗剂的发展。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02121  信息来源：药研视角 往期推荐 ! 免责声明 “汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。  喜欢的点个“看一看”和"喜欢"吧 不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~