Xanomeline Tartrate/Trospium Chloride

从氘代药物到GLP-1R口服激动剂，一文读懂药物化学中最经典、最实用的分子优化策略 ------------------------------------------------ 生物电子等排体（Bioisostere）——这个听起来略显拗口的术语，自1951年由Friedman正式提出以来，已经成为药物设计和开发中最核心的策略之一。简单来说，它指的是在先导化合物中用一个原子或基团替换另一个原子或基团，在保持生物活性的同时，改善分子的理化性质和成药性。 近日，BMS（百时美施贵宝）的Yong-Jin Wu等三位资深药物化学家在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"Application of Bioisosteres in the Design and Discovery of FDA-Approved Drugs and Advanced Clinical Candidates"的Perspective综述文章。该文系统梳理了57个FDA批准上市药物和18个进入后期临床的候选药物中生物电子等排体替换的成功案例，覆盖了从1-2个关键原子替换到骨架跃迁的各个层面，堪称近年来该领域最全面、最实用的综述之一。 核心观点：生物电子等排体替换绝非简单的"换原子"游戏。在先导化合物优化过程中，一次看似微不足道的1-2个原子替换，往往能解决potency、选择性、溶解度、代谢稳定性、血浆蛋白结合率、反应性代谢物等多维度问题，最终决定一个候选药物能否成功上市。 一、H、卤素和NO₂的生物电子等排体：1-2个原子的"四两拨千斤" 这一大类涵盖了仅通过1-2个关键原子替换就实现药物优化的经典案例，是生物电子等排体策略中最直观、也最常被使用的类别。 ① H→D：氘代药物——"动力学同位素效应"的巧妙利用 氘（D）取代氢（H）对分子的理化性质和药理活性影响极小，但由于动力学同位素效应（DIE）——C-D键断裂速率显著慢于C-H键——可以明显改变代谢谱。这一策略近年来催生了多款成功药物： Deutetrabenazine (2) 甲氧基H→D（6个D） 延长半衰期，减少给药频率 2017年FDA批准（亨廷顿舞蹈症） Deuruxolitinib (4) 环戊基H→D（8个D） 延长ruxolitinib半衰期 2024年FDA批准（斑秃） Deucravacitinib (5) 甲基H→D 阻断CYP450代谢，提高TYK2选择性 2022年FDA批准（银屑病） Deutivacaftor (7) 叔丁基甲基H→D 阻断CYP3A4氧化，t½从11h延长至16h 2024年FDA批准（囊性纤维化） ② H→F：氟取代——药物化学的"万能工具" H和F在体积上相近，但电负性差异显著。氟取代可增强代谢稳定性、提高结合亲和力、改善溶解度，甚至影响构象偏好。综述中列举了多个经典案例： Tezacaftor（8）和Lumacaftor（9）：消除反应性代谢物 苯并二氧戊环在体内可被CYP450代谢生成碳烯中间体，与血红素铁形成稳定的代谢中间体（MI）复合物，导致药物-药物相互作用；进一步释放的儿茶酚可氧化为邻醌，具有毒性风险。在tezacaftor和lumacaftor中引入两个氟原子形成2,2-二氟苯并二氧戊环，从根本上阻断了碳烯中间体的形成，同时保持活性不变。 Regorafenib（13）：一个F原子带来20倍活性提升 Sorafenib（12）和regorafenib（13）结构几乎完全相同，唯一区别是在中央苯环上增加了一个F原子。这个"多出来的"F增强了相邻脲基NH的酸性，使其成为更强的氢键供体，与VEGFR2中Glu885的羧基氧形成更强的氢键，使生化活性提高了约20倍。 Alpelisib（14）：CF₃取代一举三得 在PI3Kα抑制剂alpelisib的发现中，将叔丁基的一个甲基替换为CF₃，不仅提高了potency，还阻断了叔丁基的氧化代谢，显著降低了清除率，改善了药代动力学性质。共晶结构显示CF₃的一个F原子与Lys802的侧链胺形成了额外的氢键。 Bictegravir（15）：F取代改善溶解度与耐药性 在HIV整合酶抑制剂bictegravir的发现中，6位氟化使溶解度从34 μg/mL提高至87 μg/mL（pH 1），同时对HIV-1整合酶突变体G140S/Q148R的耐药fold shift也显著降低。结合手性中心翻转，最终获得了改善的体内外性质。 ③ F→Cl：Asciminib——卤素键的精准调控 Asciminib（16）是全球首个靶向ABL1豆蔻酰口袋的III型抑制剂，2021年获批用于CML。其前体化合物含有OCF₃基团，分子模拟显示将其中一个F替换为Cl（形成OCF₂Cl）可优化口袋内的结合。实验证实这一替换使potency提高了2倍。共晶结构揭示了Cl原子与Leu448骨架羰基氧之间形成的卤素键——C(sp3)-Cl···O角度接近理想的178.3°，距离3.3 Å。 ④ Cl→C≡CH：Erlotinib——炔基作为卤素生物电子等排体 Gefitinib（17）和erlotinib（18）是前两个获批的EGFR抑制剂，核心区别在于3-氯-4-氟苯基被替换为乙炔基苯基。在EGFR共晶结构中，氯原子通过卤素键与Leu788骨架酰胺羰基相互作用；而erlotinib中的弱酸性炔基氢则作为氢键供体与同一位置的Leu764骨架羰基氧形成氢键——炔基在此功能上等同于卤素生物电子等排体。 ⑤ OH→NH₂：JAB-21822——从Sotorasib的六步进化 JAB-21822（20）是从sotorasib（19）演化而来的KRAS G12C抑制剂，已完成II期临床试验。整个演化过程经历了六步生物电子等排体转换：C3→N/C、C6→F/Cl、OH→NH₂以及三次H/F替换。其中最关键的一步是将酚羟基替换为苯胺基（NH₂），解决了酚基葡萄糖醛酸化和渗透性不佳的问题。 ⑥ NO₂→Cl/CN：从氨氯地平到抗前列腺癌药物的迭代 硝基（NO₂）因其强吸电子性在药物中有特殊作用，但存在肝毒性风险。综述展示了硝基替换的两条成功路径： 路径一（NO₂→Cl）：Nifedipine（21）的硝基替换为氯原子，得到amlodipine（22）。后者引入乙醇胺侧链，末端伯胺作为氢键供体与Ser1011骨架酰胺氧形成氢键。这一改造使其半衰期显著延长，实现一日一次给药，成为全球最常用降压药之一，2006年峰值销售额达49亿美元。 路径二（NO₂→CN）：Flutamide（23）和nilutamide（24）的硝基可能导致特异质性肝毒性。将硝基替换为氰基后，肝毒性降低，抗雄激素活性保持。这一发现催生了第二代NSAA药物bicalutamide（25）、enzalutamide（26）和apalutamide（27）。 ⑦ NO₂→CF₃SO₂：Navitoclax——解决反应性代谢物问题 在BCL-2抑制剂navitoclax（28b）的发现中，前体化合物的硝基苯存在形成反应性代谢物的风险。将硝基替换为三氟甲基磺酰基（CF₃SO₂）后，不仅维持了与Tyr202的π-π堆积相互作用和与苯胺NH的分子内氢键，还显著改善了口服吸收和PK性质。 二、酰胺、酯和酸的生物电子等排体：官能团的"移花接木" 酰胺基团在上市药物中广泛存在，但其代谢不稳定性和渗透性问题常常成为优化的瓶颈。将酰胺替换为生物电子等排体可以改变构象、电子分布和极性，从而改善溶解度和PK性质。 ① 酰胺→磺酰胺：Dabrafenib Dabrafenib（29）是选择性BRAFV600E抑制剂，2013年获批用于BRAF突变黑色素瘤。先导化合物的苯甲酰胺基团细胞活性不佳，替换为苯磺酰胺后细胞抑制活性显著提升。共晶结构显示，磺酰胺NH（pKa~7）在生理条件下部分解离，与Asp594形成氢键；磺酰胺氧与Phe595形成另一氢键。 ② 酰胺→反向酰胺：Nilotinib Nilotinib（31）是基于imatinib（30）与ABL蛋白共晶结构理性设计的二代BCR-ABL抑制剂。通过将酰胺"翻转"（reverse amide），重新定向D环取代基的方向，使其能够与蛋白形成额外的结合相互作用。Nilotinib对野生型和耐药BCR-ABL细胞系的活性均显著优于imatinib，2021年销售额达21亿美元。 ③ 内酯→内酰胺：Ixabepilone Epothilone B（36a）是高效的微管稳定剂，但其内酯环在体内易被酯酶水解（半衰期仅20分钟）。将内酯替换为内酰胺得到ixabepilone（36），显著改善了跨物种的代谢稳定性。2007年获批用于转移性乳腺癌。 ④ 酸→四氮唑：Losartan——"沙坦类"药物的起点 Losartan（49）是首个口服非肽类AT1R拮抗剂，1994年上市。早期先导化合物——联苯羧酸——静注有效但口服效力大减。将羧基替换为四氮唑后，结合亲和力提高10倍，口服生物利用度达33%。这一突破开创了整个"沙坦类"降压药物家族。 ⑤ 酰胺→吡啶：Lenacapavir——"一年两针"的HIV革命性药物 Lenacapavir（43）是首个HIV-1衣壳蛋白（CA）抑制剂，2022年获批用于多重耐药HIV-1感染。其最remarkable的特征是超长效——每年仅需注射两次。在药物发现过程中，先导化合物的叔酰胺被环化为吡啶环，其中吡啶氮作为氢键受体与Asn57的酰胺NH形成关键氢键。Lenacapavir分子量高达968，含10个F原子（FDA批准药物中最多），是"突破类药规则"的经典案例。目前其一年一次注射剂型正在开发用于HIV预防（PrEP），在女性中已展现出接近疫苗级别的保护效果。 ⑥ 酯→噻二唑：Xanomeline——从槟榔碱到精神分裂症新药 Xanomeline（39）是M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂，起源于槟榔中的天然产物arecoline（39a）。Arecoline的酯基易被羧酸酯酶水解。研究者尝试了一系列酯的生物电子等排体，其中3-烷氧基-1,2,5-噻二唑类化合物xanomeline活性最优且具有CNS穿透性。Xanomeline与外周限制性拮抗剂trospium chloride的固定组合Cobenfy于2024年获FDA批准，成为数十年来首个具有全新机制的精神分裂症治疗药物。 三、砜和磺酰胺的生物电子等排体：为溶解度而战 ① 砜→亚砜亚胺（Sulfoximine）：AZD6738和VIP152 亚砜亚胺在化学和构型上稳定，其S=NH基团可同时作为氢键供体和受体。在AZD6738（51，ceralasertib，ATR抑制剂）的发现中，将砜替换为亚砜亚胺使溶解度提高了82倍，同时保持了ATR抑制活性。在VIP152（52，CDK9抑制剂）的优化中，亚砜亚胺不仅改善了溶解度，还通过与Glu107骨架羰基的额外氢键使CDK9抑制活性提高2倍、CDK2选择性提高100倍。 ② 砜→氧化膦：Brigatinib和SY-5609 Brigatinib（54）是首个含氧化膦基团的上市药物，2017年获批用于ALK阳性NSCLC。其前体TAE684（54a）因1,4-二氨基苯环的生物活化产生反应性代谢物而具有毒性。将异丙基砜替换为二甲基氧化膦（DMPO）后，不仅消除了反应性代谢物，还使血浆蛋白结合率从99%降至66%，溶解度从15 μg/mL提升至337 μg/mL。 ③ 砜→双四氢呋喃（bis-THF）：Darunavir 在HIV蛋白酶抑制剂darunavir（56）的设计中，砜的两个氧原子被bis-THF的两个缩醛氧原子替代。这一替换引入了第二个氢键受体，使其能与S2口袋中Asp29'和Asp30'的两个残基同时形成氢键网络，带来了卓越的蛋白酶抑制活性和抗病毒效力。 四、苯环的生物电子等排体：降低亲脂性、提升成药性 苯环虽在上市药物中无处不在，但它是clogP的主要贡献者，降低Fsp3并影响MPO评分，还可能遭受氧化代谢。综述系统讨论了多种苯环替代策略： ① 苯环→吡啶：从Enzalutamide到Apalutamide Apalutamide（27）从enzalutamide（26）演化而来，将苯基替换为吡啶基。两个药物靶点活性相似，但apalutamide的皮疹发生率显著更高——这被归因于吡啶环上被CF₃双重激活的氰基充当了亲电弹头，与蛋白中的半胱氨酸残基反应引发免疫反应。这一案例警示我们：生物电子等排体替换有时会带来意想不到的副作用。 ② 苯环→吡啶酮：Doravirine和Olutasidenib Doravirine（63）是第三代NNRTI，2018年获批用于HIV-1感染。中央苯环被替换为吡啶酮，改善了PK性质。Olutasidenib（64）是mIDH1抑制剂，2022年获批用于复发/难治性AML。苯环替换为吡啶酮后，引入(S)-构型的α-甲基使potency提高2倍，溶解度提高100倍。 ③ 苯酚→哒嗪酮：Resmetirom——MASH领域的里程碑 Resmetirom（65）于2024年获FDA批准，成为首个用于MASH的THR-β选择性激动剂。其设计起点是甲状腺激素T3（65a），富含电子的苯酚被替换为缺电子的吡嗪酮杂环，提高了THR-β选择性。值得注意的是，T3和早期类似物在微核试验中呈基因毒性阳性，而resmetirom为阴性——生物电子等排体替换在此同时解决了选择性和安全性问题。 ④ 苯环→哌啶：Leniolisib和Glasdegib Leniolisib（68）是PI3Kδ抑制剂，2023年获批用于APDS。喹唑啉核心被部分饱和为四氢吡啶并嘧啶，显著降低了亲脂性。Glasdegib（69）是Hedgehog通路抑制剂，将中央苯环替换为哌啶，使clogD从4.48降至2.1，游离分数从不足1%提升至10-14%。 五、芳杂环的生物电子等排体：杂环之间的"角色互换" ① 噻唑→噻二唑：Fezolinetant Fezolinetant（73）是NK3受体拮抗剂，2023年获批用于更年期血管舒缩症状。5-未取代噻唑在体内可经环氧化-水解-开环生成反应性代谢物。替换为1,2,4-噻二唑后，hERG抑制降低了10倍以上。 ② 苯并呋喃→吲哚：Alectinib Alectinib（76）是二代ALK抑制剂，2015年首次获批。先导化合物的苯并呋喃替换为吲哚后potency提高17倍。吲哚NH引入了新的氢键供体相互作用，同时氮原子的给电子效应增强了乙烯基酰胺羰基的氢键受体能力。 ③ 氨基吡唑并嘧啶→4-酰胺基-5-氨基吡唑：Zanubrutinib和Pirtobrutinib Ibrutinib（83）是首个共价BTK抑制剂，但其氨基吡唑并嘧啶铰链区结合基团存在脱靶问题。在zanubrutinib（84）的发现中，双环铰链区结合基团被替换为单环的5-氨基吡唑-4-甲酰胺，通过分子内氢键模拟双环系统的氢键模式。Pirtobrutinib（85）则进一步优化，成为非共价可逆BTK抑制剂，为共价BTK抑制剂耐药患者提供了新选择。 六、饱和环的生物电子等排体：从构象控制到代谢阻断 ① 环己烷→双环[3.1.0]己烷：Lenacapavir的另一重优化 在lenacapavir的发现中，先导化合物的吲哚环导致显著的CYP450抑制。研究者最终设计了双环[3.1.0]系统——通过环丙烷化锁定三个亚甲基，并在剩余亚甲基上引入偕二氟，彻底阻断了代谢。共晶结构揭示：四氢吲唑以翻转构象结合，饱和环以半椅构象延伸到一个吲哚无法触及的相邻疏水亚口袋——从构象角度它并非严格的苯环生物电子等排体，而是开拓了新的结合空间。 ② 哌啶→吗啉缩醛：Aprepitant——降低碱性的艺术 Aprepitant（92）是NK1受体拮抗剂，2003年获批用于化疗引起恶心呕吐。先导化合物的哌啶（pKa = 5.3）对L型钙通道有较强亲和力。将哌啶中的CH₂替换为O形成吗啉缩醛（pKa < 3），显著降低了对钙通道的亲和力，口服效力提高了4倍。 ③ 哌啶→四氢吡喃：PF-07220060——tPSA的精妙调控 PF-07220060（93）是选择性CDK4抑制剂，目前处于III期临床。将磺酰胺哌啶替换为四氢吡喃后，tPSA降低了21%，膜渗透性提高了5倍。细胞活性下降幅度远小于生化活性——渗透性的改善部分补偿了potency的损失。 ④ 碳大环→醚大环：Repotrectinib——克服TRK耐药突变 Repotrectinib（96）是二代TRK抑制剂，2023年获批用于NTRK融合阳性实体瘤。将碳大环替换为醚大环后，减少了甲基与溶剂前沿突变残基Arg595的空间位阻。 ⑤ 四氢呋喃→噁唑烷酮：Lamivudine和Emtricitabine——"unnatural构型"的意外惊喜 Lamivudine（99）和emtricitabine（100）是重要的抗HIV核苷类似物。核糖3'位碳原子被替换为硫原子形成噁唑烷酮环，且构型为非天然的L-(-)-对映体。令人意外的是，L-构型抗病毒效力与D-构型相当，但对人线粒体DNA聚合酶的抑制更弱，安全性更好——颠覆了"活性核苷类似物必须为D-构型"的传统认知。 七、结论与展望：生物电子等排体的未来 综述核心启示：这篇66页的Perspective以75个药物案例，系统展示了生物电子等排体策略在解决先导化合物优化中多维度挑战方面的不可替代价值。从1-2个原子的精准替换到杂环骨架的整体跃迁，每一次成功的替换背后都是对分子识别、理化平衡和可开发性的深刻理解。 作者特别指出：生物电子等排体的效果具有强烈的上下文依赖性——同一个替换在不同分子、不同靶点环境中可能产生截然不同的结果。这使得最优生物电子等排体的识别本质上仍然是一个经验性和迭代性的过程。 前沿趋势：GLP-1R口服激动剂中的生物电子等排体 综述最后将目光投向了当前最火热的药物研发领域——口服小分子GLP-1R激动剂。2026年4月，orforglipron（104）获FDA批准，成为首个非肽类口服GLP-1R激动剂。对比orforglipron与竞争对手GSBR-1290（105）和ECC5004（106），可以清晰看到生物电子等排体策略的两大主题： 吲哚/伪环替换 含吲唑 含伪环 含吲唑 氮原子位移 吲哚核心 吲哚核心 吡咯并吡啶骨架 临床阶段 FDA批准（2026.4） II期临床 II期临床 这些差异化的设计选择，正是生物电子等排体策略在当代药物化学中的直接体现——不同的等排体选择带来了不同的分子性质和临床表现。 技术驱动的未来 展望未来，实验和计算技术的进步正在重塑生物电子等排体设计的范式： ·结构生物学：X射线晶体学和冷冻电镜的进步使研究者有信心在蛋白局部环境中应用与结构兼容的生物电子等排体修饰 ·计算工具：匹配分子对分析（MMPA）、基于相似性的片段替换、数据驱动的ADME预测等工具使候选等排体的优先级排序更加系统化 ·人工智能：机器学习和生成模型的引入有望加速等排体的发现和优化过程 但作者也提醒：无论计算工具多么先进，生物电子等排体设计的核心仍然是基于化学直觉的理性推理——这正是成功药物化学家的不可替代之处。 --------------------------------------------------------------------- 文献来源：Wu, Y.-J.; Chmiel, A. F.; Bronson, J. J. Application of Bioisosteres in the Design and Discovery of FDA-Approved Drugs and Advanced Clinical Candidates. J. Med. Chem. 2026, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5c03492 本文基于原文献的解读与评述，详细数据请参阅原文

📑 文章目录 Basic Information英文标题：A multi-agent system for automating scientific discovery中文标题：一种用于自动化科学发现的多智能体系统发表日期：19 May 2026文章类型：Article所属期刊：Nature文章作者：Ali E. Ghareeb | Samuel G. Rodriques文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10652-yAbstractPara_01科学发现由观察、假设生成、实验和数据分析的迭代过程所驱动。尽管近年来人工智能在生物学中的应用取得了进展，但尚未有系统能够自动化完成所有这些阶段。在此我们介绍Robin，这是一种多智能体系统，能够完全自动化实验生物学中的假设生成和数据分析。通过将文献检索智能体与数据分析智能体相结合，Robin能够生成假设、提出实验方案、解释实验结果并生成更新后的假设，从而实现半自主的科学发现方法。通过应用该系统，我们成功识别出针对干性年龄相关性黄斑变性的潜在治疗候选药物，这种疾病是发达国家致盲的主要原因。Robin提出增强视网膜色素上皮细胞的吞噬作用作为治疗策略，并在体外识别和验证了ripasudil和KL001的有效性。Ripasudil是一种临床使用的Rho激酶抑制剂，据我们所知，此前从未被提出用于治疗干性年龄相关性黄斑变性。为了阐明ripasudil诱导吞噬作用上调的机制，Robin进一步提出并分析了一项后续的RNA测序实验，结果显示ABCA1表达上调，该基因编码一种脂质外排泵，可能代表一个新的潜在治疗靶点。本报告正文中的所有假设、实验方向、数据分析和数据图表均由Robin生成。作为首批在闭环迭代实验框架中自主发现并验证新型治疗候选药物的人工智能系统之一，Robin确立了人工智能驱动科学发现的新范式。Inline RecommendationsSimilar content being viewed by others 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Fig. 1: Architecture and workflow of the Robin system. - 图片说明 ◉ 当提供目标疾病的名称时，Robin会生成假设并选择最佳的治疗候选方案进行实验验证。Robin能够自主分析这些实验的原始数据，以合成科学见解并生成更新的治疗假设。◉ Robin与语言代理交互，以生成假设并分析实验数据。◉ Crow和Falcon分别用于进行简洁和深入的文献检索，以收集信息来指导假设的生成。Finch负责对实验数据进行分析，Robin利用这些分析结果获得见解，以指导下一轮假设的生成。Para_05为了展示Robin生成和优化新颖治疗假设的能力，我们尝试确定干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）的潜在新疗法。dAMD是发达国家不可逆视力丧失的主要原因，但目前可用的治疗选择有限。仅在美国，就有150万人患有威胁视力的dAMD，其中60万人因AMD而被法律认定为盲人，由于人口老龄化，这一数字预计到2050年将几乎增加至三倍。通过应用Robin来发现dAMD的新型治疗候选方案，这项工作代表了人工智能在科学研究中实现自动生成发现的重要一步。Robin: a multi-agent system for scientific discovery Robin：一个用于科学发现的多智能体系统Para_01Robin通过将多个语言智能体整合到一个结构化的工作流程中，为特定疾病生成治疗候选方案（图1a、b）。Crow和Falcon是基于PaperQA2的文献检索智能体，分别进行简明和深入的文献综述。PaperQA2在信息检索与摘要生成方面达到专家水平，能够访问科学文献、临床试验报告以及Open Targets平台。Finch是一个科学数据分析智能体，用于分析来自实验检测的实验数据，例如RNA测序（RNA-seq）和流式细胞术（图1c）。通过协调这些智能体以识别新颖且易于实验室验证的治疗策略，我们利用Robin构建了一个实验引导的系统，推动科学发现过程。Robin假设生成工作流程的一个示例见补充图1。在本文描述的工作流程中，Robin用30分钟分析了551篇论文，而人类完成相同任务预计需要294小时。根据已发表调查得出的估算，我们估计手动完成整个科研工作流程所需时间减少了约200倍（表1）。 Table 1 Estimated time-on-task comparison: human versus Robin-assisted discovery 表1 任务耗时估计比较：人工 versus Robin辅助发现 Therapeutic hypothesis generation 治疗假设生成Para_01当提供感兴趣的疾病（dAMD）时，Robin提出了关于该疾病病理的一系列一般性问题，并要求Crow回答每个问题。利用Crow提供的报告作为背景，Robin随后确定了十种潜在的致病机制。针对每种机制，Robin调用Crow撰写一份详细报告，描述可用于测试药物有效性的体外疾病模型。然后，Robin使用一个大语言模型评审员对这些报告进行两两比较，进而计算出它们的相对排名（见方法部分）。Robin采用排名最高的体外模型来确定治疗候选假设生成的实验策略。Para_02选定一种体外模型后，Robin 进行了类似的文献综述和假设生成步骤，提出30种候选治疗药物用于实验测试。随后，Robin 查询 Falcon 生成详细报告，以评估每种候选药物。这些报告既包含每种药物适用于缓解该体外模型所代表疾病机制的理由，也包括药物可能存在的潜在局限性。候选药物由大语言模型通过评判比赛方式进行排序，依据是科学推理的强度、药理学特征以及支持性文献的研究方法学质量。随后，人类科学家对排序结果进行审阅，并根据 Robin 建议的检测方法，按照人工设计的实验方案在实验室中对排名靠前的候选药物进行了测试。Experimental data analysis 实验数据分析Para_01实验完成后，我们上传了原始或半处理的数据（在本例中为流式细胞术的.FCS文件或RNA-seq的基因计数），并向Robin提出期望的分析方法，例如‘流式细胞术’或‘差异表达分析’。随后，Robin调用Finch来执行所需的分析。由于生物数据解释本身具有模糊性，这一分析步骤带来了独特的挑战。例如，流式细胞术分析中的设门选择或RNA-seq分析中使用的过滤条件在不同科研人员之间可能不同，并可能影响最终结论。同样，即使接收相同的提示和数据，由于语言代理的随机性，Finch的分析结果在不同运行之间也可能存在差异。为了利用这种多样性，我们将Robin配置为启动八条独立的Finch分析路径，每条路径均独立分析实验数据。在每条路径中，Finch在Jupyter笔记本中执行分析代码，并提供对其发现的可解释且可重复的总结。在所有路径完成后，通过一次元分析将所有输出整合为基于共识的结论。通过这种方式，Finch探索了多种分析路径，同时基于共识得出高度一致的最终结果（见方法部分）Para_02最后，Robin 从这些经过处理的实验结果中提炼出可操作的科学见解。Robin 还具备提出有针对性的后续实验以探索或确认重要或意外发现的能力。这些实验见解被用于指导下一周期的治疗假设生成。该循环持续进行，直到人类获得满意的候选药物。Robin expedites hypothesis generation Robin 加快了假设生成的速度Para_01我们应用Robin生成干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）的治疗候选方案，作为初步的概念验证（图2a和补充图1-11）。Robin通过识别和审阅151篇论文，启动了治疗假设生成的工作流程，并提出了10种具有生物学意义的dAMD机制用于检测。在对疾病机制及相应的实验策略进行排序后，Robin建议通过增强视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬作用来治疗dAMD，并建议通过流式细胞术检测药物在多大程度上提高患者来源或干细胞来源的RPE细胞的吞噬能力。 Fig. 2: Robin generates therapeutic candidate hypotheses for dAMD and analyses experimental data from in vitro experiments. - 图片说明 ◉ a，Robin提出了几种实验方法，最终决定采用RPE吞噬功能增强实验。Robin将这一策略整合为一个总体目标，随后生成了多个新型治疗候选物以增强RPE的吞噬功能。TEER代表跨上皮电阻。图a中的文字由Robin生成。◉ b，吞噬实验的示意图。RPE细胞在加入pHrodo标记的微珠或ROS之前，先与药物孵育1小时。细胞与微珠或ROS共同孵育3小时后，通过流式细胞术测量吞噬活性。该示意图使用BioRender绘制；Ghareeb, A. https://biorender.com/yf9q8b1 (2026)。◉ c–f，Finch流式细胞术分析流程中的示例图，经人类整理以提高出版可读性。c，Finch通过前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）图进行设门，排除碎片。◉ d，Finch通过前向散射高度（FSC-H）对FSC-A图筛选单细胞群体。◉ c、d中的红色轮廓区域表示细胞群。◉ e，Finch识别4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）信号，并排除死细胞。◉ f，Finch对候选药物与DMSO对照组进行统计学检验，并绘制结果。该柱状图显示相对于DMSO对照组的平均荧光强度变化倍数（FC MFI）（n = 3个孔；误差线表示标准误；显著性通过Dunnett检验确定：*P < 0.05）。Para_02随后，Robin调用Crow（补充图4）对约400篇与RPE吞噬作用及干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）治疗领域相关的文献进行了综述，并综合研究结果提出了30种现有药物候选分子，用于吞噬功能实验检测。Robin调用Falcon为这些分子生成了全面的评估报告（补充图9），并由大语言模型评判进行排序，形成排名结果。Para_03我们计算了在论文中运行的相同配置下Robin工作流的成本：num_queries = 5，num_assays = 10，num_candidates = 30。该配置将产生45次Crow调用和30次Falcon调用，平均成本分别为4.33美元和6.43美元，总计每次运行成本为10.76美元。Para_04我们对任务耗时的分析（表1）表明，Robin框架将一个发现周期的总体认知劳动从估计的359至424个人工小时减少到不到2小时。值得注意的是，该系统在大约30分钟内综合了约551篇参考文献，而根据学术阅读的既有文献基准，这一任务若由人工完成则大约需要294小时。ROCK inhibitor enhances phagocytosis ROCK抑制剂增强吞噬作用Para_01然后，我们从该排名中选出前五名候选药物进行实验测试：艾塞那肽-4、芬戈莫德、MFGE8、Y-27632以及5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR）与牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的组合。MFGE8已知可增加培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬作用，因此我们将其作为阳性对照纳入实验。尽管Robin建议使用荧光标记的感光细胞外节段作为RPE吞噬作用的底物，但我们最初因可获得性原因决定使用pHrodo微球。此外，Robin建议使用原代或干细胞来源的RPE细胞，但为了加快对Robin提出的假设的评估，我们在初步药物筛选中使用了ARPE-19细胞。pHrodo微球在溶酶体的低pH环境中会被荧光激活，从而可通过流式细胞术检测单个细胞的吞噬作用（图2b；显微镜验证见补充图12）。在RPE吞噬功能检测中测试这些候选治疗药物后，我们将原始流式细胞术数据、相关元数据以及分析指令上传至Robin。Robin调用了名为Finch的数据分析代理，该代理生成了一个Jupyter笔记本，通过对流式数据设门并进行统计检验，以量化每种化合物对RPE吞噬作用的影响。图2c–e展示了来自一个代表性Finch分析路径的图表结果。这些结果经由人工对该相同数据的分析得到了确认（补充表3和补充图13）。临床前模型已证明Y-27632能够恢复RPE细胞的吞噬效率，这证实了Robin基于文献提出该候选药物的合理性。Automated RNA-seq analysis 自动化RNA测序分析Para_01在分析了最初的流式细胞术结果后，Robin建议对经Y-27632处理的RPE细胞进行RNA测序，以研究ROCK抑制对转录的影响（图3a）。我们开展了第二次RPE吞噬实验，并使用Y-27632处理样本，随后通过批量RNA测序对样本进行了分析。Finch进行了差异基因表达（DGE）分析，并将结果汇总在火山图中（图3b）。尽管先前的研究表明Y-27632通过F-肌动蛋白动态的翻译后调控来增强吞噬杯的形成，但Finch的DGE分析显示，Y-27632处理还在吞噬过程中诱导了RPE细胞快速的转录变化。Finch的共识分析表明，在超过50%的轨迹中，Finch识别出相同的基因显著差异表达（图3c）。随后，Finch进行了基因本体富集分析，发现Y-27632在吞噬作用后显著改变了参与肌动蛋白丝组织、小GTP酶介导的信号转导以及自噬通路相关基因的表达（图3d）。这些结果表明，Y-27632可能通过细胞骨架重排促进吞噬作用的初始摄取阶段，并通过调控自噬相关基因的转录促进内化物质的清除；然而，仍需进一步研究来验证其对自噬的具体影响。该分析的人源版本与Finch的结果类似，见补充图14。 Fig. 3: RNA-seq analysis of ARPE-19 cells treated with the ROCK inhibitor Y-27632. - 图片说明 ◉ a，Robin 解读了第一次实验的结果，并提出了后续的检测方案。图 a 中的文字由 Robin 生成。◉ b–d，Finch 进行的 RNA-seq 分析示例图表，经人工调整格式以提高出版物中的可读性。◉ b，由 Finch 生成的火山图，显示吞噬作用后经 Y-27632 处理的细胞与野生型（WT）细胞之间差异表达的基因。◉ c，基于八条 RNA-seq 分析路径的 Finch 共识结果，显示识别出相同基因持续上调或下调的分析所占的百分比。◉ d，由 Finch 生成的差异表达基因的基因本体（Gene Ontology）术语富集分析；n = 3 个孔。Para_02DGE分析发现，在Y-27632处理的细胞中，编码关键脂质外排泵的ABCA1表达上调了三倍（校正后P值 = 2.13 × 10−83）。ROCK抑制剂诱导吞噬作用后ABCA1的差异表达对干性年龄相关性黄斑变性（dAMD）具有潜在意义，因为ABCA1对视网膜色素上皮（RPE）的正常功能至关重要。ABCA1介导胆固醇和磷脂从质膜主动转运至受体蛋白，随后将其排出细胞。进一步将这些发现与dAMD的病理机制联系起来，载脂蛋白E作为ABCA1的脂质受体，已在多项研究中被确认为黄斑变性的遗传易感等位基因。Para_03这些机制性见解源于Robin提出并由Finch分析的实验，展示了人工智能驱动的科学发现不仅能加速候选治疗化合物的体外数据生成，还能揭示疾病通路中可能原本未被探索的新型分子靶点。A repurposed drug for dAMD 一种用于dAMD的再利用药物Para_01除了建议对Y-27632进行RNA-seq分析外，Robin还开展了后续一轮的候选药物假说研究（图4a）我们通过实验测试了其中的十种药物，并将数据提供给Finch进行分析Finch的分析显示，ripasudil（一种在日本获批用于治疗青光眼的ROCK抑制剂）的表现优于Y-27632，与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，RPE细胞吞噬作用提高了1.89倍（人类样本分析显示提高了1.75倍；见补充表4和补充图15）在ARPE-19细胞中进行的剂量-反应实验进一步证实了ripasudil比Y-27632具有更强的效力（图4c）此外，作为一种已获批的药物，ripasudil具有明确的安全性特征，这使其在临床转化方面相较于作为研究用化合物的Y-27632更具优势 Fig. 4: Ripasudil and KL001 enhance RPE phagocytosis. - 图片说明 ◉ a，Robin关于ripasudil的提案摘录。根据第一轮实验分析的结果，Robin提出将ripasudil作为治疗dAMD的候选药物。在结果解读方面，由LLM从Finch结果生成JSON格式的输出（参见Robin GitHub仓库中prompts.py内的实验洞察应用ENDAGE；见代码可用性）。NECA：5′-N-乙基羧酰胺腺苷。图a中的文字由Robin生成。◉ b，在第二轮ARPE-19细胞实验中分析得到的流式细胞术数据表明，ripasudil能显著增强吞噬作用（n = 3个孔）。◉ c，ARPE-19细胞中ripasudil和Y-27632的剂量-反应曲线。在刺激ARPE-19细胞吞噬作用方面，ripasudil比Y-27632更具效力（n = 3个孔）。虚线水平线表示ripasudil（紫色）和Y-27632（蓝色）的半数最大有效浓度（EC50）。◉ d，在老年原代人视网膜色素上皮细胞（RPE-SCs）中对ripasudil进行验证，结果重现了Y-27632和ripasudil增强吞噬作用的效果（n = 4个孔）。◉ e，在RPE-SCs中，ripasudil的作用强于Y-27632（n = 4个孔）。带灰色阴影的虚线水平线表示DMSO对照组的MFI。所有图表中的误差线表示标准误（s.e.m.）。显著性通过Dunnett检验确定：*P < 0.05。Validation in primary human RPE cells 在原代人RPE细胞中进行验证Para_01RPE干细胞（RPE-SCs）是人类视网膜色素上皮细胞中的一个亚群，具有有限的有丝分裂潜能，可在体外进行培养。当扩增形成融合的单层并允许在体外成熟时，RPE-SCs能够表达典型的RPE基因，维持极化的屏障功能，并在形态上类似于天然的人类RPE细胞。此外，与诱导多能干细胞来源的RPE细胞不同，在RPE-SCs的培养过程中不需要使用ROCK抑制剂。我们从视力恢复眼库（纽约）获得了来自一位60岁以上患者的RPE-SCs，并将其扩增为融合的单层细胞。我们通过典型RPE标志物和吞噬机制的免疫细胞化学染色验证了其RPE表型（扩展数据图1和2）。Para_02我们重新筛选了Robin建议的所有药物，这次使用RPE-SCs替代ARPE-19细胞，并用荧光标记的牛视杆外节段（ROSs）替代微珠。再次确认ripasudil和Y-27632为有效化合物，其中ripasudil仍表现出更高的效力（图4d；另见补充表5中的人类分析和补充图16）。两种ROCK抑制剂均表现出剂量依赖性的吞噬作用增强，且ripasudil的效力高于Y-27632（图4e）。对该剂量反应实验的上清液进行了细胞毒性检测。Y-27632的剂量与RPE-SCs释放的乳酸脱氢酶（LDH）之间无相关性。ripasudil则显示出与LDH释放呈负相关关系，即药物浓度越高，LDH释放越少（扩展数据图3）。Para_03KL001是一种通过阻止CRY蛋白的泛素依赖性降解来调节生物钟的小分子化合物，也在RPE-SCs筛选中被识别为有效化合物。Robin基于RPE吞噬作用的昼夜节律调控提出了这种药物，据我们所知，此前尚无人提出KL001可作为吞噬作用的增强剂。Para_04为了进一步验证ABCA1的发现，我们对使用ripasudil或溶剂对照处理的RPE-SCs进行了RNA-seq分析（有或无ROSs）。在有或无ROSs的情况下，暴露于ripasudil的RPE-SCs中ABCA1的表达也上调（补充图17）Para_05尽管需要进行体内验证才能对这两种药物进行最终比较，但在此体外实验中，ripasudil相较于Y-27632初始表现出更优的性能，表明Robin能够通过迭代实验和反馈逐步优化治疗假设。Validation of the Robin architecture Robin架构的验证Para_01我们首先去除了文献检索代理Crow和Falcon，将其替换为对OpenAI的o4-mini的调用。随后，我们通过让野生型Robin及其去功能版本各自生成50个针对dAMD的药物候选方案，并对这些方案中的部分样本进行质量评估，来比较两者的性能。Para_02我们通过人工参考核查手动评估了它们的质量。结果如预期所示，剔除Falcon或同时剔除Crow和Falcon会导致虚构参考文献数量显著增加，而单独剔除Crow则不会出现这种情况（分别见扩展数据图4a和补充表6–8）。（Crow负责生成文献检索，以指导Falcon生成最终的候选药物报告，因此在Crow文献检索阶段产生的任何虚构参考文献都可能被Falcon在其最终报告中纠正。）为了确认Falcon确实在仅剔除Crow的实验中掩盖了由大语言模型生成的虚构参考文献，我们从野生型和剔除了Crow的Robin中分别生成了15份检测方案建议（由Crow而非Falcon生成最终的检测报告；见补充图1）。随后我们进行了人工参考核查，结果如预期，Crow未产生任何虚构参考文献，而o4-mini生成的参考文献中有44.5 ± 6.37%（均值±标准误，n = 15份检测方案建议）为虚构内容（见扩展数据图4b和补充表9）。Para_03为了探究Crow和Falcon文献检索是否比o4-mini生成的提案质量更高，我们通过LLM裁判（Claude Sonnet 3.7；参见补充图11中的裁判提示）进行了一对一的对比实验，比较了50个野生型和50个消融型提案。消除Crow、Falcon或同时消除Crow和Falcon始终导致最终药物提案的质量下降（扩展数据图4c）。Para_04接下来，我们评估了Finch在第二轮dAMD药物筛选中进行的流式细胞术和RNA测序任务中的表现。Finch被赋予了针对第二轮任务的具体提示和数据，并通过评估其遵循专家制定的评分标准的程度来衡量其表现（补充图18和19）。Finch在RNA测序任务中表现出稳定的结果（86 ± 0%（均值 ± 标准误）；n = 3次运行），在流式细胞术任务中表现同样优异（100 ± 0%（均值 ± 标准误）；n = 3次运行；扩展数据图5a）。Para_05为了探究Finch在一系列更复杂的数据分析任务中的失败模式，且不采用Robin工作流中针对特定任务的多步提示方法，我们从BixBench中整理了一个由专家生成的包含170个问答对的测试集，涵盖与药物发现相关的生物信息学和统计学任务（扩展数据图5b和补充表10）。Finch的整体表现达到22.8 ± 1.7%，相比之下，在没有代理框架的情况下单独使用Sonnet 3.7的表现仅为1.6 ± 1.2%（均值 ± 标准误，n = 3；扩展数据图5c,d）。Finch在统计学子集上的表现优于生物信息学子集，分别为47.9 ± 1.5%和15.3 ± 2.0%。通常情况下，生物信息学子集需要执行对参数设置敏感的多步骤分析流程，而生物统计学问题则只需对干净的表格数据进行单步计算。这些结果表明，Finch等代理框架通过为大语言模型配备与数据源交互所必需的工具，展现出明确的应用价值，同时也指出了在处理多步问题时仍有巨大的性能提升空间。Para_06为了确认Robin在吞噬作用实验中鉴定出的ROCK抑制剂无法通过基于通用大语言模型的代理轻易重现，我们将相同的候选生成提示（补充图8）提交给了OpenAI开发的Deep Research代理，该代理旨在对复杂任务进行多步研究。与Robin一样，我们要求Deep Research生成19种新的药物候选物（等于Robin在第一轮和第二轮中生成的药物候选物总数），随后我们在RPE-SCs中对这些候选物进行了筛选。Deep Research生成了17种独特的候选物（其中有2种药物候选物重复）。Deep Research所提出的药物中无一在该实验中表现出活性，值得注意的是，Deep Research并未提出通过ROCK抑制来增强RPE吞噬作用的策略（扩展数据图6）。DiscussionPara_01在本报告中，我们提出了Robin，这是一个集成了自动化假设生成和实验数据分析的多智能体系统，用于科学发现。当被赋予识别dAMD新型治疗药物的任务时，Robin提出增强吞噬作用作为治疗dAMD的策略，并通过迭代的实验室闭环发现循环，在测试化合物中鉴定出ripasudil和KL001可增强RPE细胞的吞噬作用。ripasudil已确立的安全性特征及其在眼科应用中的临床批准为其药物再利用提供了良好前景，而据我们所知，KL001代表了一种在RPE细胞中增强吞噬作用的新方法。Para_02值得注意的是，尽管ROCK抑制剂此前已被建议用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）及其他血管新生性视网膜疾病，但Robin是最早提出通过增强吞噬作用机制将其应用于干性AMD治疗的人之一。这一假说已获得多方面证据的支持。视网膜色素上皮（RPE）细胞的吞噬功能障碍不仅在正常衰老过程中被观察到，而且在AMD患者中表现更为显著。此外，ROCK抑制能够增强RPE细胞吞噬能力的作用已有研究证实。当然，该假说需要在合适的疾病模型中进行验证，并最终通过随机、安慰剂对照的临床试验来确认其临床有效性。Para_03这些结果共同表明，Robin 能够通过整合科学文献中已有的见解，有效生成新的、可检验的假设。通过聚焦于“组合合成”（即识别不同领域之间非显而易见的联系），Robin 能够有效地针对那些由于科学知识的割裂化而被人类专家忽视的“低垂果实”。这种可靠且基于文献的综合范式不仅适用于药物再利用，还可轻松扩展到材料科学等领域。Para_04除了dAMD的具体应用外，Robin还解决了一个更广泛的治疗开发挑战。在过去十年中，美国食品药品监督管理局每年批准的新药数量一直停滞在大约50种左右，因此迫切需要新的方法来扩大药物发现的规模。作为首个能够自动进行文献支持的假设生成和实验生物学数据分析的系统之一，与传统方法相比，Robin有望加快药物发现的速度。Para_05鉴于自动化发现系统有可能识别出强效的生物制剂，我们已在Robin框架内实施了防护措施。首先，该系统优先选择具有已知安全性的候选物质，并搜索其已知的毒性或脱靶相互作用。其次，作为实验室介入循环的系统，Robin的输出被视为治疗假设，必须经过标准的临床前验证，以确保在进入临床应用前，通过传统的体外和体内安全筛选发现任何潜在的毒性。关于双重用途的担忧，Robin使用的是经过广泛安全对齐的现成大语言模型（通过红队测试和基于人类反馈的强化学习），以防止生成恶意的生物实验方案。此外，所有对我们平台的查询都会通过一个大语言模型分类器进行检测，以筛查涉及不安全主题的内容。Para_06在当前的实现中，Robin 仍有多个可以持续发展的方向。例如，尽管 Robin 能够生成实验大纲，但它尚不能产生精确且可执行的实验方案；未来的版本旨在提供详细的实验方法，使其几乎无需人工转换即可用于实验室操作。Finch 数据分析代理也依赖领域专家进行提示工程，以获得可靠的分析结果。若能使 Finch 能够自主生成或调整适用于特定数据模态的提示，则可实现更自主的科学发现流程。最后，尽管本文中的结果依赖于2025年初可用的前沿大语言模型，但 Robin 的模型无关架构确保其能力将随着底层基础模型的进步而同步提升。尽管通用编码代理的基础能力正在快速进步，可能在标准计算任务上达到与 Finch 等专用框架相当的水平，但面向特定领域的架构对于严格实施实验约束以及可靠地协调专业生物信息学工具链仍然至关重要。Para_07通过在一个集成系统中自动进行假设生成、实验规划和数据分析，Robin代表了一种由人工智能驱动科学发现的强大新范式。这种方法不仅可以重塑治疗手段的开发，还能从根本上加速科学进程，推动对自然世界更深入的理解。MethodsRobin implementation Robin 的实现Para_01Robin 是通过 Aviary 框架实现的一个 Jupyter notebook，用于实例化和调用智能体。Robin 利用 OpenAI 的 o4-mini 模型综合文献并生成假设，并使用 Anthropic 公司的 Claude 3.7 Sonnet 模型作为评判者，通过成对比较对假设进行排序。在 Robin 中用于智能体及调用的大语言模型的提示词如补充图 2–11 所示。Para_02值得注意的是，尽管本文中的实验是通过Robin的智能体实现方式进行的，但我们观察到Robin几乎总是以相同的顺序调用工具，从而形成了一种确定性的工作流程。因此，我们将Robin转换为一个简化的Jupyter笔记本，以提高稳定性和易用性。Para_03假设的排序通过一系列由大型语言模型（LLM）裁判裁决的成对比较计算得出。在对25个或更少的假设进行排序时，采用循环赛方式比较所有可能的配对。当考虑超过25个假设时，则随机选取300组成对比较，以便在合理的计算和时间限制内实现全面评估。这些比较的结果被用于通过布拉德利–特里–卢斯（BTL）模型估计各假设的强度参数，进而确定每个假设的相对排名。尽管目前对于基于LLM裁判的排序尚无公认的最优策略，但我们选择成对比较而非逐项评分。一些研究表明，成对比较比逐项评分更具鲁棒性，因为逐项评分可能无法区分相似项目之间的细微差异。成对比较中的位置偏差通过采用高度分布式的比赛结构结合BTL模型来缓解，而不是依赖简单的胜负统计，后者极易受到位置偏差的影响。为了生成该LLM裁判的提示语，我们邀请领域专家在Robin系统中对治疗候选假设进行成对比较。这些专家评估的结果被提供给Google的Gemini 2.5 Pro预览版模型，以生成Robin系统中LLM裁判所使用的提示语。这一方法旨在使LLM裁判的决策与专家的偏好和评判标准保持一致。Para_04在比较LLM评判者与专家的偏好时，LLM评判者与专家的偏好表现出高度的一致性，其前十项假设中平均有7.25项与专家前十项假设相匹配（补充图20a）。这种一致性是随机选择预期结果的两倍以上。此外，LLM评判者表现出比人类专家更高的内部一致性（补充图20b）。在面对相同的成对比较时，LLM评判者在88%的比较中选择了相同的假设，而人类专家的选择一致率为61%。Finch implementation Finch 实现Para_01Finch 是一个自主的、原生支持 Jupyter 的数据分析代理，使用 Aviary 框架设计而成。Finch 根据提供的数据集和研究问题，系统地处理生物信息学工作流程，例如 RNA-seq 差异表达分析或流式细胞术。Para_02该智能体并非从代码库中检索静态模板，而是作为生成式推理引擎，实时逐行编写原创的、可执行的 Python 或 R 代码，确保分析逻辑能够动态适应数据分布，而不受硬编码子程序的限制。该智能体在 Aviary 框架提供的结构化执行环境中运行，Aviary 是一个专为语言智能体评估和迭代问题解决而设计的可扩展环境。选择 Aviary 框架主要基于其受控环境，该环境通过标准化的软件环境、一致的工具访问权限以及结构化的多步推理支持可重复的评估。Para_03Finch采用了一种基于ReAct方法的代理提示策略，有效平衡了逻辑推理与实际执行。每个Finch的执行轨迹都在一个预构建的Docker容器（BixBench-env:v1.0）中展开，该容器包含了大量面向生物信息学的Python、R和Bash库。这一标准化容器确保了结果的可重复性，并将评估严格限定在Finch的分析能力上，而非软件安装或依赖管理。尽管如此，Finch在需要时能够安装新的依赖项，并且能够熟练地完成这一过程。Tools and environment 工具和环境Para_01Finch 仅通过 Aviary 框架提供的两种工具进行交互edit_cell：代理可以选择、修改并执行 Jupyter 笔记本中的单元格。submit_answer：代理最终确定并提交分析结论。Para_02为了优化Finch的初始指令，我们对其提示工程进行了深入探索，并在补充图10中提供了示例。所有Finch的轨迹均可通过FutureHouse平台获取。Finch evaluation  Finch评估Para_01我们评估了 Finch 及其基础模型（Claude 3.7 Sonnet）在不具备代理能力的情况下，对来自 BixBench 生物信息学基准测试中与药物发现相关的 170 个问题的表现。在排除了低质量类别以及与人类药物发现无关的类别后，保留了涵盖 38 个数据胶囊的 170 个问题，并将其分为两类：生物信息学（共 131 道问题），包括 RNA-seq、基因组学、表观基因组学、功能富集和序列分析任务；以及生物统计学（共 39 道问题），包括图像分析任务和一般统计分析任务。为避免多标签分配中的重复计数，每个问题被归入其在 BixBench 类别映射中列出的第一个类别。Finch 和基础大语言模型均进行了三次重复运行。每种类别在每次重复中的平均准确率被计算出来，误差线表示三次重复间的平均值标准误。在失败模式分析中，每一个 Finch 的错误回答被分类为：错误答案（代理生成了特定的错误值）、干扰项匹配（回答与提供的干扰项一致）、格式错误（正确数值但格式不正确）、不确定（代理拒绝作答）或无响应/失败（未产生任何回应），并在这三次重复中进行汇总。Para_02每个 BixBench 问题包含一个自然语言提示，该提示引用封装在胶囊包（ZIP 压缩文件）中的数据文件，同时提供一个预期答案、三个干扰选项以及指定的评估方法。Finch 模型会同时接收问题和对胶囊包中数据的访问权限，并可以在最多十个步骤内编写并执行代码（Python 或 R）来生成答案。基础大语言模型仅接收问题文本，无法访问数据或执行代码。回答的评估采用每道题指定的三种方法之一：精确匹配（字符串或数值相等）、范围匹配（数值落在指定区间内）或大模型裁判（由另一个模型判断自由文本回答的语义等价性）。只有通过指定评估方式的回答才被视为正确；所有其他情况，包括分析过程合理但结果错误、格式不匹配以及拒绝作答，均记为错误。Robin validation Robin 验证Crow and Falcon ablation experiments 乌鸦和猎鹰消融实验Para_01对 FutureHouse 平台代理 Crow 和 Falcon 的调用已被替换为通过 OpenAI API 调用 o4-mini，系统提示和用户提示保持不变。在人工参考检查中，一位对来源不知情的科学家被提供了十条从野生型和消融版 Robin 中随机选出的提案。每当科学家在提案中遇到引用或参考文献时，会尝试在线查找原始文章。如果无法根据引用或参考文献（包括提案中提供的上下文）明确识别出原始文章，则该参考文献被标记为虚构；否则，标记为合法。Para_02对于LLM裁判比较，将50个野生型和50个消融型提案提交给由Claude Sonnet 3.7裁决的两两对决锦标赛，并利用这些比较结果通过BTL模型（在Robin内部排名系统中实现）生成提案排名。采用置换检验评估各组之间平均排名差异的统计显著性。观测到的检验统计量为消融组与野生型组之间的平均排名之差（消融组的平均排名减去野生型的平均排名）。在假设两组间无差异的零假设下，通过随机置换组标签10,000次并对每次置换重新计算检验统计量，从而生成零分布。P值计算为置换所得差异中大于或等于观测差异的比例（单尾检验）。所有分析均使用Python（v3.12.10）结合NumPy和pandas完成。Comparison with OpenAI’s Deep Research 与OpenAI的深度研究进行比较Para_01为了与Deep Research进行比较，通过ChatGPT用户界面向Deep Research提供了系统提示和用户提示，如补充图8所示。在这些查询提交给Deep Research时（2025年6月），Deep Research通常会在用户提示之后跟进2到3个问题，目的是澄清和明确搜索查询的内容。针对每个查询，我们都尽可能有帮助地回答了这些问题。当我们完成18个完整查询后，便订购了相应的药物并配制了药物储备液，具体细节见补充表1。吞噬作用实验是在RPE-SCs上进行的，该实验与我们验证Robin发现的实验为同一实验。Cost analysis 成本分析Para_01我们通过litellm（https://docs.litellm.ai/docs/providers/github）跟踪了大语言模型调用的成本，并计算了Crow和Falcon的平均成本（分别为0.0963美元和0.2142美元；n = 52次运行）。一次典型的Robin运行成本CRobin是通过假设包含45次Crow运行和30次Falcon运行来估算的。Para_02Finch 被排除在此估计之外，因为它每个迭代仅运行一次，其成本贡献可忽略不计。Cell culture 细胞培养Para_01ARPE-19细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，编号CRL-2302），经三次传代扩增后分装冷冻保存。本研究中所有ARPE-19实验均使用这些分装细胞。在培养过程中，ARPE-19细胞在DMEM/F12培养基（15-090-CV，Corning）中培养，添加10%胎牛血清（FBS；10082-147，Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（25030-081，Gibco）、1 mM丙酮酸钠（11360-070，Gibco）和1%青霉素-链霉素（15140-122，Gibco），于37°C、5% CO2条件下培养。进行吞噬功能检测时，将细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔组织培养板（10861-666，VWR）中，每孔加入100 µL完全培养基。细胞培养至融合后，继续孵育7天，期间不更换培养基。此时细胞已形成单层，并表现出分化特征（如黑色素颗粒表达和鹅卵石样形态）。Para_02原代RPE-SCs来自一位年龄超过60岁、无已知眼部疾病的单一供体，由 Sight Restoration 眼库提供。RPE-SCs 解冻后按照先前描述的方案进行接种和培养。简而言之，患者来源的 RPE-SCs 在收到后立即解冻，并接种于涂有 Synthemax II 的24孔组织培养板（3470，Corning）中，在含有10%热灭活FBS的细胞培养基中培养5小时。7天后，将培养基更换为含2%热灭活FBS的培养基。作为对 Fernandes 等人方案的一项改进，培养基在每周一、三、五更换三次，每次移除三分之二的旧培养基并补充等量的新鲜培养基。细胞在接种4周后被传代至96孔板或transwell小室（3470，Corning），再继续成熟培养4周，随后进行ELISA检测。Para_03RPE-SC培养基的基础培养基为DMEM/F12（D8062，Sigma-Aldrich）和αMEM（M4526，Sigma-Aldrich）按1:1比例混合而成。培养基中添加了1X青霉素-链霉素（15140-163，Life Technologies）、1X Glutamax（35050-079，Life Technologies）、1X非必需氨基酸（11140-076，Life Technologies）和1X丙酮酸钠（11360-070，Life Technologies）。额外添加的成分包括2%或10%（v/v）热灭活胎牛血清（F4135，Sigma-Aldrich）、10 mM烟酰胺（N5535，Sigma-Aldrich）、N1培养基添加剂（使用浓度为厂家推荐浓度的50%，N6530，Sigma-Aldrich）、0.25 mg ml−1牛磺酸（T0625，Sigma-Aldrich）、0.02 µg ml−1氢化可的松（H4001，Sigma-Aldrich）以及0.013 ng ml−1 3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T5516，Sigma-Aldrich）。所有细胞系均检测为支原体污染阴性。Phagocytosis drug screen 吞噬作用药物筛选Drug library preparation 药物库制备Para_01在文献中找到了Robin提出的药物在细胞培养中的最佳浓度，如果提出了多个浓度，则选择最高的浓度用于吞噬实验。在进行吞噬实验的当天，使用药物储备液在完全培养基中配制工作液，浓度为2倍工作浓度。pHrodo bead preparation pHrodo 微球制备Para_01为了特异性检测被吞噬的颗粒，我们使用了pHrodo珠子（A10010，Thermo Fisher），这种珠子只有在溶酶体的低pH环境下才会产生荧光。深红色大肠杆菌pHrodo珠子按照制造商的说明解冻，并重悬于2 ml PBS中。将重悬后的珠子在室温下于水浴中超声处理10分钟，然后加入细胞培养板中。Bovine ROS preparation 牛活性氧制备Para_01在RPE-SC验证实验中，使用牛视杆外节段（ROSs）替代了pHrodo珠子。牛视杆外节段来自Invision BioResources（98740），以冷冻沉淀物的形式接收。将该沉淀物用冰冷的无菌PBS重悬，浓度为每100 µl含1 × 10^7个ROSs，并分装后储存在−80 °C。实验当天，将ROS分装样品在冰上解冻，并与pHrodo red dye SE（P36600，Thermo Fisher）进行偶联。根据制造商说明，将pHrodo red染料用DMSO溶解至10 mM浓度。ROSs在4 °C、6,500g条件下离心7分钟，然后重悬于无菌冷偶联缓冲液（0.2 mM碳酸氢钠缓冲液，pH 9.2）中，使浓度达到每100 µl含1 × 10^6个ROSs（即原分装液十倍稀释）。对于每100 µl稀释后的ROSs（1 × 10^6个ROSs），加入1 µl的10 mM pHrodo SE，并通过移液混合均匀。随后将ROSs置于黑暗环境中，在21 °C、500 rpm的振荡培养箱中孵育。孵育结束后，通过离心并用冰冷无菌PBS重悬的方式洗涤pHrodo red标记的ROSs，以去除多余的染料。在将偶联后的ROSs加入细胞前，将其用细胞培养基重悬至每100 µl含1 × 10^7个ROSs的浓度，并向96孔板的每个孔中加入4 µl（相当于每个细胞10个ROSs）。通过移液使ROSs在孔内分布均匀，并进行肉眼检查以确保覆盖均匀。Phagocytosis assay 吞噬作用测定Para_01在进行吞噬作用实验时，在加入微珠之前，细胞在37°C、5% CO2条件下，用测试化合物或对照溶剂（0.5% DMSO）处理60分钟，通过向细胞中加入100 µl含2倍浓度药物的完全培养基实现。在孵育60分钟时，向每孔加入10 µl浓度为1 µg/µl的pHrodo微珠。加入微珠后，将培养板在37°C继续孵育3小时。然后使用TrypLE Express（12604-013, Gibco）将细胞重悬10分钟，并用FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白（BSA）以及500 ng/ml 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或5 µM Hoechst 33342，溶于无钙镁PBS缓冲液中）稀释，以获得适合流式细胞术分析的细胞悬液。Para_02在RPE-SC验证实验中，我们用pHrodo Red SE（Thermo Fisher）标记的牛视网膜外节段（Invision BioResources）替代了pHrodo微球，并用Hoechst 33342（BP-42012，BroadPharm）替代了DAPI。此外，在将视网膜外节段加入细胞前，将其重新悬浮于细胞培养基中。由于有额外的供体细胞可用，我们进行了四次技术重复的RPE-SC筛选（比ARPE-19筛选多一次）。除此之外，RPE-SC药物筛选的操作方式与ARPE-19筛选相同。Flow cytometry 流式细胞术Para_01悬浮在96孔细胞培养板FACS缓冲液中的ARPE-19或RPE-SCs立即被转移至配备自动进样器的Attune NxT流式细胞仪（A24858，Thermo Fisher）。在ARPE19实验中，使用637 nm和405 nm激光分别激发pHrodo珠子和DAPI的荧光，并使用670/14和450/40滤光片分别检测。在RPE-SC实验中，使用532 nm和405 nm激光分别激发pHrodo红色染料和Hoechst 33342，并使用585/16和450/40滤光片分别检测。根据预实验孔界定细胞群体，然后使用细胞门控将每个孔的细胞群体事件数限定为5000个。这是必要的，因为检测到的大多数事件属于牛视杆外节。RNA-seq RNA测序Para_01ARPE-19细胞以每组三个重复的方式接种于24孔组织培养板中，按照生产商的指导说明，使用Maxwell RSC 48（AS8500，Promega）和Maxwell RSC SimplyTissue试剂盒（AS1340，Promega）进行细胞裂解并提取RNA。使用Qubit仪器（Q33327，Thermo Fisher）和Qubit高灵敏度RNA试剂盒（Q10210，Thermo Fisher）对总RNA进行定量。以1 µg总RNA作为起始材料，利用NEBNext Poly(A) mRNA磁性分离模块（E7490，New England Biolabs）分离带有polyA尾的mRNA，随后使用NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina，E7760，New England Biolabs）制备测序样品。使用Agilent Bioanalyzer进行质量控制。文库加入1% PhiX后，采用P3流动槽在Illumina NextSeq 2000平台上进行测序，读长为75个碱基的双端测序。Immunocytochemistry 免疫细胞化学Para_01细胞在室温下用4%多聚甲醛固定25分钟，随后用PBS洗涤三次，每次5分钟。通过将细胞与封闭缓冲液（1% BSA和22.52 mg ml−1甘氨酸溶于PBST（PBS + 0.1% Tween 20））孵育30分钟，以阻断非特异性抗体结合。然后将细胞在4°C下与用1% BSA配制的PBST稀释的一抗溶液孵育过夜。接着，细胞在室温避光条件下用含1% BSA的二抗溶液孵育1小时，最后用DAPI染色，并进行最终的洗涤步骤。补充表2列出了本研究中使用的所有抗体。ELISA 酶联免疫吸附测定Para_01将RPE-SCs以每插入物15,000个细胞的密度接种在6.5毫米的Transwell插入物上，该插入物带有0.4微米孔径的聚酯膜（3470，Corning），并继续培养4周。使用Invitrogen Novex VEGF Human ELISA试剂盒（KHG0111，Thermo Fisher）进行VEGF ELISA检测。在更换培养基48小时后，分别采集顶腔和底腔的细胞培养基，并用样本稀释缓冲液按1:10比例稀释，然后按照制造商的说明进行ELISA检测。LDH assay LDH检测Para_01RPE-SC剂量反应实验的上清液在实验结束后立即于−80°C保存。乳酸脱氢酶（LDH）检测按照制造商的说明，使用Promega公司的LDH-Glo细胞毒性检测试剂盒（J2381）进行。为了测量最大LDH活性，通过Triton X-100（X100，Sigma-Aldrich）裂解细胞建立阳性对照，以用于计算相对细胞毒性。Data analysis 数据分析Flow cytometry 流式细胞术Para_01Finch 是一个数据分析代理，对我们的流式细胞术数据进行了端到端分析。根据前向散射和侧向散射参数，排除了碎片和细胞聚集体。通常情况下，Finch 使用 R 语言的 flowMeans 包对前向散射与侧向散射图进行 k 均值聚类，然后选择最可能包含主要细胞群的聚类。对于后续的设门，Finch 生成散点图，并利用这些图来定义门控区域。单个细胞根据脉冲宽度和面积参数进行设门。通过量化每孔 pHrodo 信号的平均荧光强度，评估吞噬作用的程度。Para_02流式细胞术数据还由一位人类科学家进行了分析（补充图13、15和16）。人类对流式细胞术数据的分析过程与Finch的方法类似，不同之处在于人类分析额外增加了使用无珠对照来去除Alexa 647通道背景信号的步骤，而该背景信号被证明极小。人类分析首先通过前向散射与侧向散射图确定主要的细胞群体。接着识别出单细胞群体。然后利用DAPI通道去除死细胞。最后使用无珠对照去除Alexa 647通道的背景信号。RNA-seq RNA测序Para_01由人工完成读段的解复用和比对，随后的差异基因表达分析由Finch完成（代码可在Robin的GitHub仓库获取；参见代码可用性说明）。Read alignment and processing 读段比对与处理Para_01对12个样本（包括Y27632处理组、溶剂对照组和珠子处理组）的原始双端RNA-seq测序数据（2 × 150 bp）使用自定义的Bash流程进行处理。从FASTQ目录中获取测序文件（_R1_001.fastq.gz和_R2_001.fastq.gz），并使用HISAT2将每个文件单独比对到GRCh38人类参考基因组（基于GENCODE v44构建的HISAT2索引），采用–dta参数以保留剪接位点信息，用于下游转录组组装。比对过程使用八个CPU线程（-p 8）执行，并以SAM格式输出结果。每个SAM文件通过samtools view -bS转换为BAM格式，随后进行排序（samtools sort）和索引（samtools index），生成压缩的、按坐标排序的BAM文件。为节省磁盘空间，删除了中间产生的SAM文件及未排序的BAM文件。该流程确保所有比对结果均经过统一处理，可用于后续定量分析。Gene-level quantification 基因水平的定量Para_01使用Subread软件包中的featureCounts工具，并结合GENCODE v44 GTF注释文件获取基因计数。指定双端模式（-p）以正确处理片段计数，并使用八个线程（-T 8）加速处理过程。所有已建立索引并排序的BAM文件被同时提供，并根据提供的外显子特征将读段分配给基因。生成的原始基因水平计数矩阵被写入gene_counts.txt文件，作为后续标准化和差异表达分析的输入数据。该工作流程为从原始测序数据到基因水平定量的高通量RNA-seq数据分析提供了可重复的框架。Differential gene expression analysis 差异基因表达分析Para_01将原始基因计数数据导入R（v4.2.0）并进行过滤，以去除非计数列，得到包含六个样本、对应两种条件（Y-27632和未处理）的矩阵。将计数矩阵和元数据封装到DESeqDataSet对象中（DESeq2 v1.36.0）。通过标准化、离散估计和Wald检验来检测差异表达。使用biomaRt将转录本标识符映射到基因符号，并定义一个成对比较（Y-27632与未处理）。结果按校正后的P值排序，导出为CSV文件，并使用EnhancedVolcano（v1.14.0）生成火山图，设定阈值为|log2倍数变化| > 1且校正后P < 0.05。RPE-SC RNA-seq validation RPE-SC RNA-seq 验证Para_01本实验旨在验证ARPE-19细胞RNA测序实验中发现的ABCA1结果，使用Maxwell RSC simplyRNA Cells试剂盒（AS1390，Promega）提取总RNA，并送至Plasmidsaurus（plasmidsaurus.com）进行文库构建和测序，采用其超快速RNA测序服务。文库构建采用高通量的3′端计数策略，靶向多聚腺苷酸化转录本。简而言之，从总RNA样本中捕获polyA+ mRNA，并使用含有样本特异性条形码、唯一分子标识符和Illumina Read 1序列的oligo-dT引物将其逆转录为cDNA。在完成第二链合成后，cDNA经过标签片段化处理，同时实现分子片段化并引入Read 2序列。通过扩增反应连接P5/P7接头以及独特的双端索引（i5和i7），完成文库构建。测序在Illumina平台上进行，每个样本的去重后测序深度约为1000万条（原始数据约2000万条）。原始测序读段通过聚类唯一分子标识符序列以去除PCR重复，基因计数由去重后比对成功的读段生成。Reporting summary 报告摘要Data availabilityPara_01本研究生成的原始RNA-seq数据已存入NCBI序列读取档案库，BioProject登录编号为PRJNA1464762。Code availabilityPara_01Robin 的示例轨迹和代码（https://github.com/Future-House/robin）以及 Finch 的代码（https://github.com/Future-House/finch）均可在 GitHub 上获取。