rVSV-ZEBOV

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:佐剂是添加到疫苗中以增强产生的免疫反应的材料，是疫苗的重要组成部分，但很多时候被忽视。虽然疫苗总是包含一个抗原来告诉身体要接种什么，但同样重要的是，佐剂提供了如何产生一个完整的反应的重要因素。佐剂领域的发展一直很慢，20世纪30年代首次在获得许可的疫苗中使用佐剂，并且在接下来的80年里一直是获得许可的疫苗中唯一的佐剂。然而，随着疫苗成为抵御新的和复杂病原体的前沿，设计有效疫苗时考虑所有组成部分是很重要的。在这里，我们总结了获得许可的疫苗中佐剂的使用情况，以及临床试验中新型佐剂的使用情况，特别关注所使用的材料及其对免疫反应的影响。我们讨论了五大类佐剂材料：铝盐、纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液。对于每一类，我们深入探讨了当前的临床试验空间，这些材料对疫苗接种的影响，以及它们可以改进的一些方式。佐剂为改善疫苗反应和稳定性提供了一个激动人心的机会，这篇综述将有助于了解这一领域的当前进展。 转化影响声明：在COVID-19大流行之后，针对传染病的疫苗成为了焦点。虽然抗原一直是疫苗设计的重点关注对象，但佐剂是增强疫苗免疫反应的重要工具，大部分尚未得到充分开发。本文广泛回顾了佐剂的历史、当前疫苗佐剂领域以及临床试验中佐剂的进展。特别强调了佐剂的材料格局及其作用机制。展望未来，尽管新型疫苗佐剂领域具有令人兴奋的新技术和材料，但仍需要更多的东西来满足新的和复杂病原体的保护需求。 1.引言 疫苗接种是对抗传染病的重要公共卫生策略。疫苗通过使用抗原训练免疫系统，从而让身体产生针对特定抗原的抗体和/或特定抗原的T细胞的免疫反应。抗原和佐剂是疫苗的两个基本组成部分。抗原向免疫系统传达“要对抗什么”，而佐剂则增强免疫反应的强度。佐剂还可以提供额外的好处，包括减少所需抗原剂量，这提供了成本和依从性的好处。 自1926年Alexander T. Glenny发现铝盐（alum）作为佐剂以来，佐剂在疫苗中一直很常见。它被用于20世纪30年代美国食品药品监督管理局（FDA）批准的白喉和破伤风疫苗中。从那时起，alum就被添加到许多疫苗中以增强免疫反应。然而，尽管研究不多，直到2009年才有除了alum之外的其他佐剂被用于许可的疫苗中。由于佐剂材料的缺乏，许多疫苗设计时使用了减毒活病毒（例如，麻疹、腮腺炎和风疹疫苗以及水痘疫苗），以利用它们固有的佐剂特性；但它们对免疫受损个体构成风险。此外，许多疫苗使用了无佐剂的灭活（杀死）病原体（例如，季节性流感和脊髓灰质炎疫苗），这些疫苗单独使用可能难以实现效果。由于这些困难，以及20世纪80年代出现的重组蛋白抗原，其免疫原性低于减毒活病毒和全杀死抗原，佐剂创新的重要性变得更加明显。自2010年代以来，随着几种大流行病（如埃博拉、寨卡和COVID-19）的出现，FDA许可的疫苗中添加了几种佐剂材料，许多其他佐剂也在临床研究中，佐剂创新呈上升趋势。在这里，我们提供了针对传染病疫苗接种的当前临床佐剂景观的概述。我们重点介绍了FDA许可疫苗中的12种佐剂，并讨论了300多项疫苗佐剂的临床试验。本综述中的佐剂被广泛定义为与抗原分开的成分，它产生免疫反应，这允许评估脂质纳米颗粒和病毒载体等抗原载体，尽管它们不被CDC认定为佐剂。本综述的主要目的是向读者提供当前疫苗佐剂的临床景观，这可能指导未来开发更安全、更有效的佐剂的努力。 2.许可疫苗中的佐剂 自2010年代以来，许可疫苗中使用的佐剂迅速发展，在此之前，铝盐是唯一被许可疫苗中的佐剂。随着我们对免疫学和疫苗学的了解不断发展，更多具有不同作用机制（MOA）的材料被开发出来。到目前为止，FDA许可的疫苗中已经使用了12种佐剂（表1）。在这里，我们回顾这些产品并强调它们的适应症。 2.1.铝盐 自20世纪30年代以来，各种形式的铝盐一直占据着佐剂领域的主导地位。它最初是在Glenny用铝钾硫酸盐纯化白喉类毒素时偶然发现的，发现含有铝盐沉淀物的疫苗导致了更强的抗体反应。目前有四种类型的铝盐用于疫苗——氢氧化铝（AH）、磷酸铝（AP）、硫酸铝钾（alum）和无定形羟基磷酸硫酸铝（AAHS），其中AH和AP在许可疫苗中使用最多。AH是通过将铝溶液与氢氧化钠混合制备的，形成结晶铝羟氧化物。结晶度影响其吸收能力，由小晶体组成的AH具有更大的表面积和更强的吸收能力。AP是化学上无定形的羟基磷酸铝，是通过将铝盐溶液与三钠磷酸盐溶液混合或通过将铝盐与磷酸盐溶液混合并用氢氧化钠沉淀来配制的。与AH不同，AP是非结晶的，其吸收能力通常由缓冲条件和起始材料的组成决定。除了结晶度，还存在粒径和形状的变化。AH以长形颗粒的形式存在，平均计算尺寸为4.5×2.2×10纳米，而AP是大约50纳米的片状颗粒。尽管它们具有不同的物理化学特性，但由于它们在临床上验证的效力和安全性，含铝佐剂已被用于许多疫苗中，以特别增强体液反应，并继续在活跃的临床试验中使用（表1和图1b）。 2.2.AS04 AS04在2009年获得FDA批准，并由葛兰素史克（GSK）开发，用于HPV疫苗Cervarix。这种佐剂仍然使用氢氧化铝作为关键成分之一，但它还添加了一种Toll样受体（TLR）4激动剂，单磷酸脂A（MPL），被吸收到铝颗粒上。MPL是脂多糖（LPS）的一种纯化和解毒衍生物。LPS由许多革兰氏阴性细菌产生，并存在于它们的外膜上，使它们能够被免疫系统识别。脂质A是LPS的主要毒力因子，使其成为操纵成激动剂的理想选择。对于AS04，MPL衍生自Salmonella minnesota R595菌株的LPS。在临床前开发中，发现200纳米的颗粒大小是理想的，每剂含有50微克的MPL和500微克的氢氧化铝。添加MPL被证明能够产生比仅含铝的疫苗更强大、更持久的免疫反应（尤其是细胞免疫反应）。这在很大程度上是由于MPL能够通过激活抗原呈递细胞（APCs）和增加炎症细胞因子来诱导早期免疫反应。 2.3.AS03 AS03由GSK开发，用于H1N1疫苗，并在2013年获得许可使用；然而，这种疫苗目前在美国储备中，且AS03不在当前接受的任何疫苗中。这是第一种在许可疫苗中使用的不含铝的佐剂，属于油包水乳液新型佐剂。AS03包含角鲨烯（21.38 mg/ml）、Tween 80（9.72 mg/ml）和（D,L）-α-生育酚（23.72 mg/ml），配制在磷酸盐缓冲液（PBS）中。AS03的粒径约为150 nm，这被认为有助于抗原呈递细胞（APCs）的摄取。与铝盐相比，AS03诱导更强的抗原特异性抗体和T细胞反应，以及更高水平的细胞因子和免疫细胞募集到引流淋巴结。在配方方面，（D,L）-α-生育酚增强了AS03诱导的免疫反应的幅度，这将在本综述后面讨论。 2.4.MF59 MF59用于季节性流感疫苗（Fluad和Fluad Quadrivalent），在1997年获得欧洲许可后，于2015年获得FDA许可。目前，MF59佐剂的季节性流感疫苗仅用于65岁及以上的人群，以补偿他们减弱的免疫反应。这种佐剂由诺华公司开发，也是一种类似于AS03的油包水乳液。MF59由角鲨烯（4.3%）和两种表面活性剂，Tween 80（0.5%）和Span 85（0.5%），在柠檬酸缓冲液中组成，粒径约为160 nm。MF59可以通过在注射部位产生免疫能力环境来增强细胞和体液免疫反应，并且依赖于配方中的所有三个组分协同工作以产生最强大的免疫反应。 2.5.外膜囊泡 OMVs并不被传统定义为佐剂，因为它具有载体能力；然而，它们固有的佐剂特性在它们添加到配方中很重要。OMVs源自革兰氏阴性细菌的外膜，形成约25-250 nm的球形囊泡，展示许多细菌抗原和蛋白，可以作为TLR激动剂。这项技术仅被许可用于一种脑膜炎球菌B群疫苗，Bexsero，由诺华公司开发，然后被GSK在2015年美国批准前收购。各种革兰氏阴性细菌自然产生OMVs以应对压力，但也可以通过用于Bexsero的洗涤剂提取法获得。在Bexsero的情况下，OMV与重组蛋白抗原一起传递，并提供自身的固有抗原成分，主要的是PorA，因为它源自N. meningitidis细菌。OMVs的一个主要优势是它们同时表达的细菌抗原和自然存在于它们上的强效TLRs，这使得OMVs成为先天免疫反应的强大驱动力。Bexsero还与氢氧化铝配方，以增加佐剂效果。 2.6.AS01B AS01B是另一种组合佐剂，由皂苷QS-21和TLR4激动剂MPL的脂质体配方组成，大约100 nm大小。这种佐剂用于2017年FDA许可的带状疱疹疫苗（Shringrix），以及WHO预认证的RTS,S疟疾疫苗。虽然MPL之前在AS04佐剂系统中使用过，但这是首次在许可疫苗中使用QS-21——一种从南美树木Quillaja saponaria Molina树皮中提取的皂苷分子。QS-21特别被发现可以调节先天免疫系统，从而增强抗原特异性抗体反应和CD8 T细胞。以脂质体配方的QS-21仍然被用来传递许多TLR激动剂，将在本综述的TLR激动剂部分进一步讨论。当一起配方时，MPL和QS-21协同工作以增强对抗原的免疫反应。 2.7.CpG基序（1018和7909） 未甲基化的CpG基序，CpG 1018和CpG 7909，是两种TLR9激动剂，用于之前许可的疫苗中。CpG 1018首次在2017年用于许可的乙肝疫苗Heplisav-B中；CpG 7909则在2023年7月用于许可的炭疽疫苗Cyfendus中。CpG基序由中心未甲基化的CG二核苷酸和侧翼区域组成，源自合成的寡脱氧核苷酸（ODN），模仿细菌DNA。细菌DNA代表一种强大的病原体相关分子模式（PAMP），激活先天免疫系统。在感染期间，细菌DNA中高比例存在的未甲基化CpG基序与免疫细胞上的TLR9相互作用，触发保护性免疫反应。通过合成复制细菌DNA和分离特定触发特定免疫反应的合成未甲基化CpG基序，CpG 1018和7909是具有特定TLR9激活能力的佐剂，导致特别偏向细胞介导的或Th1反应的保护性反应。CpG基序通常与铝佐剂（例如，在含有CpG 7909的FDA许可的炭疽疫苗中）结合使用，因为这两种佐剂的结合导致强大的细胞和体液免疫。 2.8.rVSV 西非埃博拉病毒流行（2013-2016）导致了第一种许可的病毒载体疫苗。Vesicular Stomatitis Virus (VSV)是一种基于病毒载体的佐剂，用于默克公司的埃博拉疫苗ERVEBO（也称为V920, rVSVΔG-ZEBOV-GP或rVSV-ZEBOV），该疫苗于2015年获得FDA许可。ERVEBO是一种具有复制能力的、减毒的重组水泡性口炎病毒（rVSV）载体，其糖蛋白基因被ZEBOV替代。VSV糖蛋白G允许附着和进入宿主细胞，这被ZEBOV糖蛋白模仿以产生ZEBOV抗原特异性免疫反应。与其他许可的佐剂系统相比，rVSV是独特的，因为它编码抗原在载体表面表达，而不是被混合或绑定。然而，由此产生的免疫反应仍然由rVSV载体决定，与抗原无关，表明这项技术本身就是一种强大的免疫调节剂。具体来说，疫苗引发与VSV类似的感染，导致针对病毒蛋白的特定细胞和抗体反应，因此保护人们免受未来的暴露。疫苗在超过5000名接种者及其未接种的接触者中实现了100%的疫苗效力。 2.9.脂质纳米颗粒 两种基于脂质纳米颗粒的疫苗已由Pfizer-BioNTech和Moderna获得FDA许可。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中的脂质纳米颗粒，现在称为Comirnaty（BNT162b2），是美国第一种COVID-19疫苗，于2021年8月获得FDA许可。BNT162b2在43,548名参与者中显示出95%的效力预防COVID-19。疫苗的抗原是修饰的核苷酸RNA（modRNA），编码SARS-CoV-19病毒的刺突蛋白，由四种脂质配制的脂质纳米颗粒保护：一种离子化脂质（（（4-羟丁基）吖啶二基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）），一种聚乙二醇化脂质（2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-十四烷基乙酰胺），以及两种结构脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇）。疫苗在接种后显示出强烈的抗原特异性抗体反应、CD8+和CD4+ T细胞反应，以及免疫细胞产生的IFNγ。另一种脂质纳米颗粒用于Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗，也称为mRNA-1273，该疫苗于2020年12月获得FDA紧急使用授权，随后于2022年1月获得许可。与Pfizer-BioNTech的疫苗类似，Moderna的SPIKEVAX在30,420名参与者中显示出94.1%的效力。尽管它有类似的局部和全身反应，如头痛、发烧和疲劳，但没有安全问题。疫苗包含一个由脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸（mRNA）抗原，由四种脂质组成：SM-102、聚乙二醇（PEG）2000二硬脂酰甘油（DMG）、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）。与BNT162b2类似，mRNA-1273诱导CD4 T滤泡辅助、CD8+和Th1反应。 2.10.Matrix-M Novavax生产的COVID-19疫苗NVX-CoV2373含有纳米颗粒佐剂Matrix-M，该佐剂于2022年10月获得FDA的紧急批准。后来暂停，并在包括SARS-CoV-2 Omicron变体的刺突蛋白的更新疫苗中重新授权紧急使用。目前，它已于2023年10月由FDA重新授权紧急使用。Matrix-M佐剂是一种40 nm基于皂苷的纳米颗粒佐剂，由来自Quillaja saponaria树皮的两种纯化组分混合，与胆固醇和磷脂结合。疫苗与SARS-CoV2刺突蛋白三聚体抗原配制成27.2 nm的纳米颗粒，并与Matrix-M佐剂结合，制成NVX-CoV2372疫苗。结合使用时，该疫苗已显示出诱导强烈的Th1型和T滤泡辅助细胞（Tfh）反应，促进中和抗体的产生，以及CD4+ T细胞和CD8+ T细胞反应。该疫苗已被证明是安全的，副作用轻微至中等，如注射部位疼痛、头痛和疲劳。 3.当前临床试验 在这一部分，我们提供了截至2023年6月当前新疫苗佐剂临床试验的概况。我们在clinicaltrials.gov数据库上使用关键词“vaccine”和“communicable diseases”以及“recruiting, not yet recruiting, active, not recruiting, or enrolling by invitation”的状态进行了搜索。我们还指定了研究类型为“Interventional Studies”。返回的条目（总共641个）然后手动筛选，排除已经获得FDA许可或WHO预认证的疫苗，并且正在寻求扩展到不同人群/剂量计划的使用。排除后，总共识别出523项试验。在这个集合中，对不同的疫苗配方进行了分析，以识别佐剂成分。当多个试验中疫苗配方一致时，即使用了相同的抗原和佐剂组合，这些试验被归为一类。相反，当一个试验通过使用多个佐剂和/或抗原评估多种疫苗配方时，该试验根据疫苗配方的数量被多次计数。这导致了389种独特的疫苗配方正在评估中。 在识别的活跃疫苗临床试验中使用了多种佐剂（图1）。然而，23%的识别试验的疫苗配方中没有包含佐剂（图1a）。大约50%的这些不含佐剂的配方使用减毒活病毒作为抗原，这种抗原具有固有的高免疫原性。然而，这些类型的疫苗可能对免疫受损者有增加的安全问题。在其他50%不含佐剂的疫苗试验中，大多数使用灭活病原体作为抗原。使用灭活病原体可以提高疫苗的安全性，但可能会降低免疫原性，因为病原体不能复制或进入免疫细胞以促进强大的免疫反应。此外，没有佐剂，这些疫苗配方完全依赖于身体识别灭活抗原为危险并产生免疫反应。年度季节性流感疫苗使用灭活的流感病毒作为抗原，没有佐剂。这些疫苗通常效果有限。例如，在2007-2008年流感季节，流感疫苗Fluzone的保护率据报道仅为68%，强调了增加佐剂以提高疫苗免疫原性的必要性。 图1 展示了当前临床试验空间中许可疫苗的佐剂情况。(a) 根据佐剂许可状态评估的临床试验中独特疫苗配方的分类，其中独特的疫苗配方由试验空间中不同的佐剂和抗原组合定义。每个部分显示了独特疫苗配方的数量及其在整个试验中的百分比。(b) 显示了包含许可疫苗佐剂的临床试验数量，作为该佐剂在独特疫苗配方中使用的次数，以及在重复疫苗配方中使用该佐剂的试验数量。 一些识别的疫苗试验没有指定使用的佐剂，我们将这些试验在图1a中归类为“未知”。此外，对于确实包含佐剂的疫苗配方——之前在许可疫苗中使用过或新颖的——我们根据不同的佐剂类别进一步对它们进行分类（图2）。在接下来的讨论中，我们将逐步了解这些佐剂类别，讨论它们各自的机制，并概述每个类别的临床试验概况。 图2 展示了按佐剂类别划分的临床试验数量。这既包括包含独特疫苗配方的试验，也包括包含重复配方的试验。 3.1.铝盐 铝盐在识别的临床试验中继续占据主导地位，代表目前正在评估的疫苗配方中使用最广泛的佐剂（图2）。这些配方中的许多，88%，将铝盐作为配方中唯一的佐剂。然而，10%的配方包括TLR激动剂作为组合。类似于在AS04中看到的，添加TLR激动剂可以增强免疫反应，特别是细胞免疫，这是基于铝的佐剂单独难以实现的。将在本综述后面更深入地讨论TLR激动剂重点试验。在当前的临床试验景观中，使用铝佐剂的疫苗正在用于保护多种传染病，包括COVID-19、HIV、霍乱、百日咳等。 尽管铝盐作为佐剂的使用历史悠久，但其促进免疫反应的作用机制尚未完全阐明。在发现之后，Glenny等人提出了佐剂的作用机制——库效应，建议抗原库的创建可能导致持续和缓慢的抗原释放。这个机制多年来被该领域广泛接受，但最近这一观点因观察到在注射后2小时移除注射部位的铝库并不影响抗原特异性免疫反应而受到挑战。这与早期的研究形成鲜明对比，早期的研究表明，在注射后4天内移除库影响了免疫反应，但在注射后7天移除时则没有影响。总体而言，库的形成和库的持续时间如何影响整体佐剂效果仍然不清楚。除了库效应，还探索了铝的其他免疫调节特性，以描绘更完整的机制图景。具体来说，已经显示铝佐剂在注射部位诱导大量坏死，导致DAMPs（如DNA和尿酸）的释放。这些DAMPs促进免疫细胞的渗透和激活，最终与下游免疫反应相连。在渗透到现场的免疫细胞中，树突状细胞被确定为铝机制中的关键细胞。树突状细胞不仅增强了从注射部位到引流淋巴结的抗原运输，而且对铝的反应激活并增加了通过单核细胞分化为树突状细胞的细胞数量。虽然铝难以启动细胞免疫反应，但它通过激活补体级联反应是强大的体液免疫反应调节剂。 即使没有完全的机制理解，铝佐剂仍然在许可疫苗或那些在活跃的临床试验中广泛使用（图2）。铝佐剂在所有许可疫苗的佐剂中拥有最长的安全记录，过去80年一直是值得信赖的添加剂。虽然需要新材料来扩大佐剂空间，但铝佐剂在临床研究中继续占据主导地位。 3.2.纳米颗粒 纳米颗粒是识别试验中另一种广泛使用的疫苗佐剂（图2）。纳米颗粒可以由多种材料配方制成，其物理和化学属性如大小、形状、表面结构、物理化学性质、溶解度以及疏水性/亲水性可以调节。这激发了纳米颗粒佐剂在疫苗开发中的使用，特别是在COVID-19大流行期间。虽然许多纳米颗粒仅被视为抗原载体，但根据其材料和物理化学属性，纳米颗粒可以作为佐剂增强免疫反应。 纳米颗粒作为疫苗中的候选物质具有吸引力，因为它们具有可调节性。使用的抗原可以是封装在颗粒内的核酸，也可以是配方在颗粒表面的肽和蛋白质。佐剂成分也可以来自构建颗粒所用的材料，如Matrix M的情况，或者来自结合在表面的配体，如TLR激动剂，包括可能对抗原的多方面免疫反应。一些纳米颗粒还允许定时释放，通过使用金材料，这可以通过频繁暴露增强免疫反应。在当前的临床试验景观中，有75种独特的疫苗配方使用基于纳米颗粒的佐剂，总共有98项试验，包括Matrix-M、金纳米颗粒、脂质纳米颗粒以及其他脂质载体的变化（图3a）。其中，三种纳米颗粒已在许可疫苗中使用，包括Pfizer-BioNTech和Moderna设计的脂质纳米颗粒以及牛津大学设计的Matrix-M。自COVID-19大流行以来，纳米颗粒在临床疫苗中取得了很大进展，并继续作为识别活跃临床试验中的第二大佐剂组，在独特的疫苗配方中占18.2%，在总试验中占16.4%（图2）。 图3 展示了临床中纳米颗粒佐剂的情况。(a) 根据纳米颗粒类型：脂质纳米颗粒、Matrix-M、白桦脂醇纳米颗粒（NP）、金纳米颗粒（GNP）、纳米结构脂质载体（NLC）和脂质无机纳米颗粒（LION），在临床试验空间中包含纳米颗粒佐剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据负责临床试验的主体，包含脂质纳米颗粒的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 3.2.1.脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒（LNPs）是由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的不同比例制成的球形囊泡。通过在这些角色中使用不同的材料并改变它们的比例，许多公司已经生产了自己的LNPs用于疫苗接种（图3b）。这四种脂质的组成包裹了核酸和蛋白质作为针对目标疾病的抗原。在生理pH下，可电离脂质具有中性电荷，减少毒性并促进mRNA的摄取。当与细胞质相互作用时，可电离脂质的正电荷诱导mRNA释放到宿主细胞中。LNPs在识别的活跃临床试验中占纳米颗粒基佐剂的最大组（图3a），有55种独特的疫苗配方跨越67项试验，用于针对COVID-19、HIV、带状疱疹、尼帕病毒等多种疾病的疫苗接种（图3b）。如前所述，已有两项脂质纳米颗粒疫苗获得许可：Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗和Pfizer-BioTech的Comirnaty COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现LNPs可以诱导强烈的体液反应，如T滤泡辅助（Tfh）细胞、记忆B细胞和浆细胞。 Pfizer-BioNTech和Moderna疫苗都展示了类似的机制。疫苗包含编码SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白的修饰核苷mRNA，一旦进入宿主细胞质，就被放置在LNP中以保持稳定性和保护。然而，LNP不仅仅是抗原载体系统，而是具有自己的佐剂能力。BNT162b2（NCT05541861）和mRNA-1273（NCT05383560）LNPs以及临床试验中使用的其他LNPs，都包含类似的四个关键成分——可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），这些脂质的确切组成和比例都有专利差异。在这两种情况下，可电离脂质被认为是产生佐剂反应的原因。当增加LNP配方中可电离脂质的摩尔比例时，发现促炎细胞因子如IL-6的诱导随之增加。此外，可电离脂质直接影响疫苗产生的体液反应。当LNPs与抗原蛋白共注射时，无论是否包含封装的IVT-mRNA，都能产生抗原特异性抗体。然而，在LNPs缺乏可电离脂质的情况下注射抗原蛋白时，无法产生抗原特异性抗体。这表明可电离脂质在抗原生成和先天免疫信号传导中都起着至关重要的作用，尽管负责免疫激活的确切机制仍然不完全清楚。配方中的聚乙二醇化脂质保护纳米颗粒免受吞噬作用，允许长时间循环。最后，辅助脂质、胆固醇和DSPC通过稳定抗原封装和增强膜刚性来增强纳米颗粒的稳定性，从而提高整体效果和生物分布。一旦宿主细胞被感染，mRNA被翻译成SARS-CoV-2刺突蛋白，在宿主细胞上表达。虽然这两种疫苗类似，但它们具有不同的储存能力。Pfizer的BNT162b2需要在-60°C至-80°C下储存，可以储存6个月，而Moderna的mRNA-1273疫苗可以在2°C至8°C下储存，长达30天。 3.2.2.Matrix-M Matrix-M是一种40 nm的球形基于皂苷的纳米颗粒，由Quillaja saponaria树皮中的两种纯化组分Fraction-A和Fraction-C混合，与胆固醇和磷脂配方。有两种皂苷组分，Matrix-A和Matrix-C，组合成Matrix-M。在临床上，Matrix-M纳米颗粒在纳米颗粒类别中占独特疫苗配方的20.3%，占总试验的25%（图3a），目前用于针对包括Epstein-Barr病毒感染、疟疾和COVID-19在内的多种疾病的疫苗接种。在最近一项测试Matrix-M在没有抗原的情况下的小鼠免疫刺激性的研究中，发现佐剂将淋巴结和脾脏中的免疫细胞数量增加了3倍，并诱导了强烈的Th1反应。在注射部位，Matrix-M增强了先天免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的渗透，并促进了促炎细胞因子的释放。这种细胞因子的释放启动了更多先天免疫细胞的涌入，引发了一系列局部免疫反应，在随后的24-48小时内展开。Matrix-M和抗原也一起流向淋巴结，导致B细胞激活和增殖增加，以及T细胞的激活和极化。B细胞进一步增殖和分化为记忆B细胞和浆细胞，产生高亲和力抗体，通过疫苗针对的目标感染威胁提供保护。基于皂苷的佐剂一直被认为是有利的，并已用于动物疫苗以及在许可疫苗中使用的AS01b佐剂中的脂质体配方QS-21。如前所述，Matrix-M是Matrix-A和Matrix-C皂苷组分的组合，而QS-21包含Matrix-C。由于其不稳定性，QS-21与胆固醇一起在像AS01B这样的脂质体基佐剂中配方。 3.2.3.基于白桦脂醇的球形纳米颗粒 基于白桦脂醇的球形纳米颗粒大小为100-180 nm。白桦脂醇是由桦树皮产生的五环卢帕烷型萜类化合物配方而成，已显示出具有抗真菌、抗病毒和抗致癌作用。目前在临床景观中，基于白桦脂醇的纳米颗粒出现在一项名为Betuvax-CoV-2（NCT05270954）的COVID-19疫苗试验中。Betuvax-CoV-2包含基于白桦脂醇的球形纳米颗粒表面的重组RBD-SD1-Fc融合蛋白，该配方旨在模拟SARS-CoV-2病毒以类似方式触发免疫系统。在BetuvaxcoV02的最新研究中，它被证明是安全且可耐受的，并且对疫苗接种有轻微反应。已显示出特异性IgG抗体滴度以及对抗原的强烈CD4+和CD8+ T细胞反应。白桦脂醇的免疫调节机制有限，但已证明白桦脂醇可以增强人外周血淋巴细胞的增殖，以及增强巨噬细胞中的抗炎和促炎活性。由于白桦脂醇是一种常见自然资源的提取物，该化合物的丰富性和低细胞毒性使其作为疫苗佐剂更受欢迎。 3.2.4.金纳米颗粒 金纳米颗粒（GNP）在疫苗中特定用于增加抗原稳定性、抗原在淋巴结中的积累以及抗原呈递细胞的有效抗原摄取。在当前的临床研究景观中，有一项试验使用了金纳米颗粒，具体是用于COVID-19的生物制剂PepGNP-COVID-19，这是一种经皮COVID-19疫苗（NCT05633446）。虽然尚不清楚这种精确配方如何结合COVID-19抗原，但GNP可以通过多种方式与抗原结合，如通过硫醇和胺链接的化学缀合、吸附和封装。GNP的大小对于免疫反应至关重要。比较20 nm和40 nm的球形GNP时，较大的球形GNP被发现更有效地产生IL-6和IL-12等细胞因子。GNP的形状也很重要。当骨髓源性树突状细胞用杆状GNP处理时，发现两种特定的促炎细胞因子IL-1b和IL-18的产生增强。相比之下，像临床疫苗中看到的立方体和球形GNP导致不同促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFa）、IL-6、IL-17和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平升高。 3.2.5.纳米结构脂质载体 纳米结构脂质载体（NLC）被称为第二代脂质纳米颗粒，有可能克服以前脂质纳米颗粒的限制。它们由一个由液态和固态脂质组成的脂质基质核心组成，形成结晶结构，由脂质和表面活性剂壳层包围，与具有固态脂质核心的LNP相反。具体来说，NLCs由于其不完美的晶体结构，表现出更高的药物载荷能力，通过避免脂质结晶来防止药物驱逐，并增加药物溶解度和控制释放。目前，有一项活跃的试验中使用了NLC，其中自放大RNA（saRNA）抗原结合在NLC的外部。这种鼻内疫苗AAHI-SC2是由Access to Advanced Health Institutes（AAHI）开发的，用于保护COVID-19（NCT05370040）。这种疫苗中使用的NLC大约为125 nm，核心由固态脂质三酰甘油和液态脂质（角鲨烯）组成，壳层由表面活性剂和阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）组成，这有助于复合RNA。该平台是全球分发的绝佳候选物，因为它允许在冷藏状态下作为液体长期稳定，同时至少保持一年颗粒大小和浓度。疫苗可以很容易地从其液体形式配方，通过将疫苗RNA与NLC混合以创建NLC/RNA复合物，该复合物通过与阳离子脂质DOTAP的静电相互作用形成。此外，整个复合物可以很容易地冻干，并在室温下储存8个月或冷藏近两年。这种热稳定性是以前LNP配方所未见的，并且可以显著改善疫苗的分发。AAHI-SC2疫苗被证明可以产生高血清特异性IgG和SARS-CoV-2武汉株特异性中和抗体。在小鼠中比较肌肉内主剂和鼻内增强剂时，发现IFNγ分泌T细胞显著增加，具有强烈的Th1偏向反应和微不足道的Th2和Th17反应。此外，鼻内途径有强大的呼吸道粘膜免疫反应，具有SARS-CoV-2反应性的肺驻留记忆和肺归巢T细胞群体。异质给药方法，肌肉内主剂和鼻内增强途径，显示出使用这种佐剂最大化强大的粘膜和系统免疫的潜力。 3.2.6.脂质无机纳米颗粒 脂质无机纳米颗粒（LION）是52 nm颗粒，旨在增强治疗剂的稳定性、传递和免疫原性。在当前的临床试验中，LION在两项独特的疫苗配方中使用，共进行了三项针对COVID-19疫苗接种的试验。在这两种配方中，LION与自复制mRNA（repRNA）结合，编码SARS-CoV-2的刺突蛋白，结合在LION的外部，形成了在韩国由Quartis开发的疫苗QTP104（NCT05876364）和在美国和巴西由HDT Bio开发的疫苗HDT-301（NCT05132907，NCT05542693）。LION由含有15 nm超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒的角鲨烯乳液核心组成，以增强稳定性，并由表面活性剂和阳离子脂质DOTAP包围。基于角鲨烯的佐剂在本综述中已多次提及，而SPIO纳米颗粒在MRI对比和铁替代疗法中有着临床历史。一旦LION配方完成，它就与RNA结合，形成LION复合物。RNA的复合类似于NLCs中的情况，阳离子脂质DOTAP与嵌入的RNA分子形成静电连接。LION的优点是它可以在室温下稳定至少3个月，使其成为全球分发的绝佳候选物。对repRNACoV2S进行的持续研究表明，可以诱导SARS-CoV-2刺突蛋白的抗原特异性T细胞和抗体反应。此外，疫苗诱导了强烈的Th1偏向免疫反应，疫苗诱导了抗刺突蛋白IgG抗体和强烈的T细胞反应，更高剂量增强了Th1反应。在小鼠中进行的单次肌肉内免疫接种在14天后实现了100%的血清转换以及强烈的抗原特异性IgG反应。免疫接种还在年轻和老年小鼠之间进行了比较，所有年龄的小鼠都有强烈的脾T细胞反应，最老的17个月龄组的T细胞反应各异。非人灵长类动物如猕猴与小鼠的结果一致，并表明长期抗原特异性记忆T细胞反应。 3.3.病毒载体 病毒载体是被修改的病毒，普遍用于将目标基因传递给宿主细胞。在疫苗接种中，它们主要被识别为抗原载体，传递DNA抗原和蛋白抗原给免疫细胞。然而，病毒载体也具有佐剂能力，因为它们可以模仿由病毒引起的自然感染。通常，自然感染是通过病毒通过表面受体附着到宿主细胞上发生的。病毒的存在通过识别载体上的病原体结构或PAMPs以及与模式识别受体（PRR）的相互作用，有效地触发先天免疫反应。虽然载体诱导类似病毒的感染，但病毒载体被修改为非致病性和复制缺陷，以避免进一步的病毒特异性感染。虽然病毒载体是有效的佐剂，但它们也有一些缺点。主要的是，很难调节启动的先天反应，有时载体可能引起过于强烈的先天反应，导致细胞毒性、对重复剂量的免疫以及强烈的炎症反应，这些可能会降低效果甚至被身体清除。 在临床上使用的载体来自几个病毒家族，包括副黏液病毒、腺病毒科和正黏液病毒科。在每个家族中，有几种不同的病毒载体通过基因编辑进行了修改，以避免预先存在的免疫，同时减少毒性和免疫原性。如前所述，有一种病毒载体佐剂，即rVSV，已被用于默克公司的许可rVSV-ZEBOV扎伊尔埃博拉疫苗中。还有两种病毒载体获得了WHO和FDA的临时紧急批准。阿斯利康COVID-19疫苗中的ChAdOx1载体在2021年2月获得了WHO的紧急批准，但此后该批准已被撤销。此外，詹森COVID-19疫苗中使用的Ad26载体在2021年2月获得了FDA的紧急批准，但由于与疫苗接种相关的潜在血凝块风险，这一批准已被撤销。在当前的临床景观中，有27种病毒载体佐剂分布在八个病毒家族中。在临床试验中的佐剂中，15.8%的总试验和13.6%的独特疫苗配方使用了病毒载体，使其成为临床试验疫苗景观中第三大佐剂组。 3.3.1.弹状病毒 rVSV是临床试验中正在测试的唯一弹状病毒家族的病毒载体。rVSV是一种活的、减毒的重组水泡性口炎（印第安纳）病毒（VSV）。目前，该载体正在评估针对尼帕病毒、拉沙病毒和埃博拉苏丹病毒病（ESVD）的疫苗中的四种独特疫苗配方。VSV是一种11 kb非分段、单链、负义RNA病毒，由11,000-12,000个核苷酸组成，编码五个基因：N、P、M、G和L。该病毒主要感染昆虫、马、牛和猪，因此避免了人类的预先存在的免疫，并增加了VSV病毒载体疫苗的有效性。VSV的糖蛋白G是一种III类病毒融合蛋白，允许细胞附着和膜融合并使感染成为可能。在许可的rVSV ZEBOV疫苗中，VSV-EBOV，EBOV糖蛋白（GP）被整合到VSV载体中，其中G开放阅读框架被故意移除。这种修改允许复制rVSV显示弹状病毒的形态，同时在其表面表达EBOV GP。与其他病毒载体一样，rVSV产生与宿主的Toll样受体（TLRs）和模式识别受体相互作用的信号。这种相互作用触发先天免疫反应，从而增强适应性免疫反应。VSV病毒载体已被证明是一个有希望的平台，因为它的血清价、高复制性和接种个体中的低至温和症状。然而，虽然在产生所需抗原的免疫反应方面有效，但许可的疫苗也在超过三分之一的受试者中证明了对载体本身VSV的细胞毒性T细胞和抗体反应；这可以直接影响VSV-EBOV的复制能力。尽管如此，由于对免疫反应的积极影响和高制造性，这种载体继续被探索用于各种疫苗：rVSV可以通过转染表达感兴趣基因的哺乳动物细胞或HEK293T来高滴度生产。 3.3.2.腺病毒 腺病毒是非包膜双链DNA二十面体形状的病毒，在病毒载体空间中占主导地位，包括人类和黑猩猩腺病毒载体。在腺病毒科家族中，Mastadenovirus属由感染人类和非人灵长类动物（如牛、犬和黑猩猩等灵长类动物）的血清型组成。血清型进一步分为A-G种。在当前的临床试验空间中，人类腺病毒载体代表最大的病毒载体家族，有17种独特的疫苗配方跨越33项试验，研究多种COVID-19疫苗，以及HIV、狂犬病、霍乱等（图4a）。在56种人类腺病毒血清型中，野生型血清型引起轻度至中度的呼吸道或胃肠道疾病症状。这些多样化的菌株通常源于病毒复制过程中发生的自然基因变异。数字命名有助于科学家对这些变体进行分类和研究，每个数字代表人类腺病毒大家族中一个独特的基因组和血清型身份。在临床试验景观中，Ad5是最常用的病毒载体，包括针对COVID-19和诺如病毒的10种独特疫苗配方。在COVID-19大流行期间，Ad5病毒载体已被用作COVID-19疫苗平台，临床试验中正在测试几种载体修改的COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现不同剂量并没有显著增加抗体产生水平，这表明腺病毒载体的限制。Ad5病毒载体被证明可以产生特异性抗体和长期T细胞反应，但证明了高血清流行率，因为52%的参与者有高预先存在的免疫。Ad5载体被证明是有效和安全的，但由于其高血清流行率，许多其他衍生物已经从稀有人类腺病毒物种和非人灵长类动物中创造出来，这些物种今天出现在临床试验空间中，如用于COVID-19疫苗Ad26.COV2.S的Ad26。 图4 展示了临床中病毒载体的情况。(a) 根据病毒家族，临床试验空间中包含病毒载体的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据血清型，包含腺病毒载体的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 由于黑猩猩腺病毒（ChAd）在系统发育上与人类腺病毒相似，这两个腺病毒家族之间有许多相似的特征。ChAd在临床试验景观中的13种独特疫苗配方和27项总试验中被发现，构成了第二大病毒载体组。ChAd载体在各种传染病的试验中，包括HIV、COVID-19、狂犬病和埃博拉。在ChAd载体中，ChAdOx1在临床上最流行，有四种独特的疫苗配方和16项总试验（图4b）。ChAd病毒载体是起源于腺病毒科Mastadenovirus属的猴腺病毒；它们主要结构为非包膜双链DNA，能够感染人类和非人灵长类动物。最常用的猴腺病毒载体ChAdOx1源自黑猩猩腺病毒Y25，由牛津大学开发。这个载体是安全和高度可制造的，并且可以在2°C–8°C下储存，使其成为全球分发的理想选择。ChAdOx1还避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。在对单剂量ChadOX1 nCoV-19（AZD1222）进行的研究中，发现它诱导了强烈的Th1免疫反应、IgG1和IgG3抗体产生，以及CD8 T细胞、自然杀伤细胞和B细胞群体。像ChadOX1一样，许多其他载体，如ChAd155和ChAd36，显示出类似的免疫反应，具有强大的体液和细胞反应。总的来说，ChAd载体是有效的，并且适合全球分发，同时避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。 3.3.3.痘病毒科病毒 改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）是痘病毒科家族中唯一的病毒载体，并且在临床上用于10种独特的疫苗配方和11项总试验，占病毒载体景观中独特疫苗配方的17.2%。痘病毒是双链DNA病毒，它们在宿主细胞的细胞质中复制，从而消除了病毒与宿主基因组的整合。通常已知感染人类和动物，痘病毒通常引起病变、皮疹和皮肤结节。MVA载体是天花病毒的高度减毒株，已证明在人类中安全，包括HIV感染者，同时是一个多功能平台，可以长期储存。冻干MVA疫苗被证明可以在37°C下储存长达2周，并且在冷藏时超过一年。MVA主要在临床试验中用于上呼吸道疾病，如COVID-19、呼吸道合胞病毒、中东呼吸综合征（MERS）和疟疾。它已被证明可以诱导大量抗原特异性CD8和CD4 T细胞反应和快速记忆分化。在最近的一项研究中，MVA-EBOV-GP的给药，一种针对埃博拉病毒（EBOV）糖蛋白（GP）的病毒载体疫苗，导致了病毒中和抗体的产生，而MVA-EBOV-NP，一种针对埃博拉核蛋白（NP）的病毒载体疫苗，触发了针对NP的细胞毒性CD8 T细胞的发展。两种疫苗都证明了在引发保护性免疫反应方面的同等效力。 3.3.4.副黏液病毒 目前临床试验中有来自副黏液病毒科的两种病毒载体正在接受测试：PIV5和新城疫病毒（NDV），代表了九项总试验中的五种独特疫苗配方（图4a）。副黏液病毒是大小为150-300 nm的包膜病毒。它们是单链RNA病毒，像痘病毒科家族一样在宿主细胞质中复制。病毒含有两种跨膜糖蛋白：三聚体融合（F）蛋白使膜融合，而血凝素-神经氨酸酶（HN）、血凝素（HA）或糖蛋白（G）使病毒附着。这些病毒以其感染脊椎动物而闻名，如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒。两种病毒载体PIV5和NDV都含有相同的两种跨膜糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶蛋白HN和融合蛋白F。这些载体目前正在进行针对COVID-19和合胞病毒等上呼吸道感染的试验。PIV5在哺乳动物中表现出低毒力，除了犬类上呼吸道感染外，并且由于可以在Vero细胞中生长至8×108 PFU/ml，因此具有很高的可制造性。在最近一项针对PIV5 RSV疫苗的鼻内研究中，大约50%的参与者在基线时对PIV5中和抗体呈血清阳性，但显示出对RSV F蛋白的强烈细胞免疫反应；因此，先前接触这种病毒载体并不会抑制反应。类似地，NDV可以低成本大规模生产，因为它是一种禽病毒，可以在受精鸡蛋中生长。NDV在人类中没有预先存在的免疫，但已知在禽类中具有传染性和危险性。过去，NDV已被用作癌症治疗的安全候选物，并通过在肿瘤细胞中诱导I型和III型抗病毒干扰素以及非癌症细胞中的III型而显示出溶瘤优势。 3.3.5.正黏液病毒科病毒 正黏液病毒科由球形病毒组成，包含分段的单链负链RNA。这个家族最显著地包括流感病毒，它们在当前临床试验病毒载体空间中有代表。有两种独特的疫苗配方跨越两项试验，包含流感A病毒（图4a）的变种，特别是H1N1和H3N2，用于针对COVID-19的疫苗。流感病毒可以感染哺乳动物和鸟类，引起人类的轻度至重度呼吸道疾病，有四个亚型：A、B、C和D。亚型是基于蛋白质血凝素（H–H18）和神经氨酸酶（N1-N11），常见的亚型H1N1和H3N2是常见的在人类中传播的病毒。血凝素（HA）对病毒进入宿主至关重要，而神经氨酸酶（NA）有助于从感染细胞中释放新形成的病毒颗粒。正在评估的疫苗之一Corfluvec利用两种不同的减毒流感载体通过鼻内途径传递，重组H3N2载体用于初次免疫，基于2009年出现的H1N1病毒的重组H1N1pdm09载体用于增强（NCT05696067）。DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1也在临床评估中，用于针对COVID-19的保护；这种疫苗通过鼻内途径传递，利用流感A H1N1载体（A/California/4/2009, CA4）（NCT05200741）。虽然在两项试验中使用的载体都是弱化株，但预先存在的免疫原性对载体对疫苗的整体有效性和反应原性的影响尚不清楚，需要进一步阐明。 3.3.6.沙粒病毒科 沙粒病毒科由包膜单链病毒RNA组成。来自这个家族的皮钦德病毒（PICV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）构成了两种独特的疫苗配方，与交替载体免疫策略结合，测试慢性乙型肝炎治疗疫苗（NCT05770895）。PICV是一种非致病性RNA病毒，源自Oryzomys albigularis，也称为米鼠。它在感染啮齿动物的地区的人类人群中显示出低血清流行率，这减轻了PICV载体疫苗中的预先存在的免疫。LCMV由双节段负链RNA组成，但与PICV不同，LCMV是一种致病性病毒，通过有毒啮齿动物引起多种神经系统疾病，如脑膜炎、脑炎和婴儿出生缺陷。为了安全，LCMVs经历了遗传突变，减弱了复制能力并减少了疫苗中的致病性。沙粒病毒科因其能够诱导强大和功能性的细胞毒性T细胞反应而在过去的免疫学研究中被利用；然而，这两种基因相关的载体在初次增强组合中的使用增强了这种反应并避免了载体中和抗体。 3.3.7.疱疹病毒科 疱疹病毒科由大型双链DNA基因组组成。人类巨细胞病毒（HCMV）是疱疹病毒科中唯一目前在临床试验中的病毒载体，用于针对HIV疫苗VIR-1388，由Vir Biotechnology开发（NCT05854381）。这种疫苗已经显示出使用弱化的CMV病毒含有HIV材料来产生针对慢性HIV感染的HIV特异性T细胞。HCMV在欧洲和美国的人群中显示出80%的流行率，在非洲和亚洲为100%。HCMV感染在健康个体中通常是无症状的，但可能对免疫系统受损的患者，包括婴儿和艾滋病患者，构成严重的健康风险。症状可能表现为CMV单核细胞增多症、发热、白细胞减少、肺炎和胃肠疾病；在艾滋病患者中，常常导致视网膜炎。然而，这种疫苗目前用于没有HIV的健康成年人，并且由于HCMV在大多数成年人中是无症状的，因此它是健康个体中作为病毒载体的良好候选物。此外，在对小鼠CMV（MCMV）的研究中，即使在血清阳性患者中，病毒也被证明可以诱导T细胞反应；虽然这种特性使其难以预防CMV，但可以作为载体使用。HCMV是一个特例，因为它产生高频率的病毒特异性CD4+ T细胞，具有一系列的细胞毒性和效应功能，以及在宿主一生中充当效应记忆细胞的CD8+ T细胞群体。这种现象被称为“记忆膨胀”，使其成为具有长期免疫潜力的有效病毒载体，特别是对于需要强大细胞反应的疾病，如HIV。在非人模型中，CMV载体疫苗还证明了能够被遗传改变并编程多样化的CD8+ T细胞，具有不同的表位目标。这允许CMV载体针对特定的CD8+ T细胞反应量身定制，以针对不同的疾病模型。 3.4.TLR激动剂 TLR是一种模式识别受体（PRR），是具有识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）或受损组织的危险相关分子模式（DAMPs）的先天免疫受体。PRR最初由Charles Janeway在1989年提出，他假设它们作为先天和适应性免疫系统之间的联系。在这一预测之后，TLR4在1996年首次被发现，1998年发现LPS可以与该受体结合。从那时起，已经鉴定出具有独特先天免疫途径的其他TLR受体。TLR激动剂首次在2009年获得FDA许可的HPV疫苗中的AS04佐剂中使用。AS04含有TLR4激动剂MPL，也用于2017年许可使用的带状疱疹疫苗中的AS01b佐剂。在AS04和AS01b中，MPL被吸收到另一种免疫调节剂上，如铝或QS-21的脂质体配方。另外两种TLR激动剂（CpG 1018和CpG 7909）分别在2017年和2023年在临床许可疫苗中使用，每种都是未甲基化的CpG基序，作用于TLR9。 3.4.1.TLR3激动剂 TLR3激动剂是目前在临床中使用的一个小众材料群体，只有六种独特的疫苗配方在八项总试验中被评估（图5b）。在免疫细胞中，TLR3特别存在于髓样树突状细胞（mDCs）、巨噬细胞和肥大细胞上，主要定位在这些细胞的内质体中。配体结合后，TLR3与适配蛋白TRIF相关联，导致以I型干扰素（IFN）分泌增加为标志的抗病毒反应。TLR3在DCs上的激活非常重要，因为这启动了强大的IFN释放，并诱导了对适应性免疫重要的抗原特异性免疫反应。TLR3激活产生的强烈IFN反应和先天免疫级联反应，使这条途径对保护免受多种病毒如流感、RSV等的侵害变得重要。这种受体识别双链RNA（dsRNA），这是病毒复制的中间体，因此被临床中的TLR3激动剂所模仿。 图5 展示了临床中TLR激动剂的情况。(a) 根据TLR编号，包含TLR激动剂的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。(b) 根据TLR激动剂类型以及进一步指定的激动剂，临床试验空间中包含TLR激动剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 在已识别的临床试验中，有三种TLR3激动剂每种都在两种独特的疫苗配方中被探索——Poly I:C、PIKA和dsRNA发夹——只有PIKA作为其配方中唯一的佐剂（图5b）。Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)是一种合成的dsRNA类似物，是一种常见的TLR3激动剂，用于癌症和传染病应用。在临床中，Poly I:C目前用于三种试验中的两种不同的疫苗配方。它与QS-21和脂质分子结合，形成MA105，正在作为带状疱疹疫苗中的佐剂进行测试。此外，它与另外两个组分，宿主防御肽IDR-1002和阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP），结合形成TriAdj，正在研究用于新型COVID-19疫苗。另一种结合使用的TLR3激动剂是dsRNA发夹，它与Ad5病毒载体结合，用于Vaxart开发的口服诺如病毒（NCT05626803）和口服COVID-19（NCT05067933）疫苗。利用TLR3激动剂进行这种给药途径可以在肠道中产生更强大的先天免疫反应，因为TLR3可以在肠道上皮细胞中找到。在这个系统中，dsRNA发夹被纳入病毒载体，并与抗原编码在同一病毒载体上。在小鼠的流感模型评估中，dsRNA发夹在载体中的包含被证明可以增强对抗原的抗体反应。在已识别的试验中评估的最后一个TLR3激动剂是PIKA，这是一种由YS Biopharma开发的dsRNA稳定化学类似物，在用于狂犬病（NCT05667974）和COVID-19（NCT05463419）疫苗的两种配方中，PIKA与TLR3相互作用并启动与该受体相关的先天免疫途径。 3.4.2.TLR4激动剂TLR4激动剂是当前在活跃的临床试验中评估的最常见的TLR激动剂（图5a）。这可能是由于TLR4激动剂MPL在AS04和AS01B中的FDA批准历史。TLR4是一种跨膜蛋白，主要表达在髓样起源的免疫细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它也存在于非免疫细胞上，如上皮细胞、神经元和中枢神经系统（CNS）细胞。TLR4最初是通过其能够感知LPS而被发现的，然而，它也能够结合由组织损伤产生的内源性分子，即DAMPs。重要的是，TLR4本身不能感知LPS。相反，TLR4必须与细胞表面的MD-2物理相关联才能对LPS做出反应，形成LPS/TLR4/MD-2复合物以启动细胞中的相应免疫途径。一旦启动，TLR4可以触发两个独立且竞争的途径：MyD88独立（TRIF依赖）和MyD88依赖途径。适配蛋白如MyD88与TLR4复合物的关联决定了随后的免疫反应。MyD88依赖的反应导致如IL-6和TNF-a等促炎细胞因子的释放，而MyD88独立的反应导致I型IFN释放。 如前所述，在许可疫苗佐剂部分，MPL是来自Salmonella minnesota R595的LPS的非毒性衍生物，包含多个单磷酸脂A（六酰基、五酰基、四酰基和三酰基）的同系物，并与铝盐和QS-21结合使用，以前许可的佐剂系统中针对TLR4途径。脂质A是LPS的保守分子模式，是LPS免疫反应的主要诱导剂，使其成为作为佐剂使用的关键焦点。临床级MPL由GSK独家生产，用于他们的佐剂系统，而其他“通用”形式的单磷酸脂A也在临床中使用，并被指定为MPLA。在本综述中，MPL和MPLA将被称为MPL。MPL已被证明可以激活MyD88依赖和TRIF依赖途径，但偏向于TRIF依赖途径，这有助于其与LPS相比的低毒性和其整体佐剂效果。由于其天然衍生，MPL具有一些固有的异质性和制造难题，促使产生了一种纯合成的六酰基脂质A衍生物，葡萄糖基脂质A（GLA）。MPL和其他天然衍生的内毒素可能具有不同数量的链、附着位点和链内的碳原子；而GLA作为合成替代品，具有明确定义的链附着数量和碳原子长度。GLA产生与MPL类似的反应，但与LPS相比具有较低的内毒素性，偏向于通过TRIF依赖途径发出信号，并在小鼠树突状细胞中具有相似的剂量和时间依赖性反应。然而，它在人类单核细胞衍生的树突状细胞上显示出更强的刺激能力。另一种合成MPL，3D-PHAD，也在当前的临床试验空间中普遍存在，存在于ALF佐剂家族中的ALFQ和ALF43中。尽管GLA是六酰基MPL的合成结构类似物，3D-PHAD是源自细菌LPS的3-脱酰基单磷酸脂A的纯五酰基合成类似物，在临床前分析中显示出与GLA的等效性。 GLA、3D-PHAD和MPL在当前临床试验空间中占有显著地位，其中GLA在约17%含有TLR激动剂的疫苗配方中最为常见，3D-PHAD约占12%，MPL约占10%。这些激动剂通常与其他佐剂或载体结合配方，只有一种疫苗配方仅评估TLR激动剂MPL。当与其他材料结合使用时，这些TLR4激动剂通常与氢氧化铝（AS04）、QS-21脂质体（AS01b、AS01e、ALFQ）配方，或者在GLA的情况下与角鲨烯乳液（GLA-SE）配方。MPL、GLA和3D-PHAD正在活跃的临床试验中评估，用于保护免受寄生虫和细菌感染，如血吸虫病和麻风病，以及病毒感染，如HIV和COVID-19。 尽管MPL、GLA和3D-PHAD在TLR4临床试验空间中占主导地位，但目前还有两种TLR4激动剂正在评估中。第二代脂质佐剂（SLA）由开发GLA的同一家公司AAHI开发，其设计基于TLR4/MD-2复合体的结构知识，而不是MPL。SLA旨在通过从GLA的酰链末端移除碳原子来更好地适应MD-2，这允许与TLR4/MD-2复合体进行更紧凑的相互作用。这种紧凑的结合导致与GLA相比TRIF途径偏向的转变，导致Th1趋化因子和细胞因子的增加。SLA与角鲨烯乳液配方，并在一项针对带状疱疹保护的临床试验中使用。在活跃的临床试验中评估的最后一个TLR4激动剂是EcML，它存在于一种疫苗配方中，跨越两项针对COVID-19的试验。EcML是由Eubiologics通过工程大肠杆菌（E.coli）菌株生产的纯化MPL。它已被证明在小鼠中产生与MPL类似的免疫效应，同时减少了商业可获得MPL的制造时间和成本。目前正在评估的EcML配方与QS-21脂质体结合。 3.4.3.TLR7激动剂 TLR7激动剂在临床试验空间中是最少的TLR激动剂（图5a）。TLR7是一种内质体跨膜蛋白，主要存在于浆细胞样树突状细胞（pDCs）和B细胞上。它也存在于其他非免疫细胞类型上，如角质形成细胞和上皮细胞，但水平较低。TLR7感应富含鸟苷和尿苷的单链RNA（ssRNA）、ssRNA病毒，以及合成抗病毒核苷类似物。当结合时，TLR7通过MyD88胞质适配蛋白发出信号，通过与其他下游蛋白的关联和激活，导致炎症体激活和促炎细胞因子的释放，以促进先天免疫反应。 图6 展示了使用TLR激动剂的独特疫苗配方与其配方组合材料的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 Imiquimod是一种合成的咪唑喹啉胺，咪唑喹啉类药物是一类小于400 Da的合成核苷类似物，是迄今为止唯一被FDA批准用于细胞内TLR的激动剂。尽管它尚未作为传染病疫苗中的佐剂被用于许可的疫苗，但它目前被批准用于基底细胞癌或生殖器疣的局部治疗。Imiquimod已被证明可以结合TLR7并局部诱导多种促炎细胞因子，导致Th1偏向的免疫反应。目前在疫苗临床试验空间中，Imiquimod被用作流感和疟疾保护的局部佐剂，这两种抗原都被注入真皮空间。另一种TLR7激动剂正在临床试验中评估，之前在其他空间中未经批准。苯并萘骈吡啶-磷酸盐是一种TLR7激动剂，被吸收到铝上，产生完整的佐剂AS37，由诺华开发，后来被GSK收购。苯并萘骈吡啶类药物是通过体外筛选优化的一类新型TLR7激动剂，然后通过体内评估以产生具有低系统暴露、增加局部先天免疫反应和长期T细胞和抗体反应的顶级候选药物。产生的TLR7激动剂通过磷酸盐化学修饰，允许吸附到铝上，从而增强注射部位的保留，并加强随后的免疫反应。在临床试验空间中，AS37正在用于针对金黄色葡萄球菌和乙型肝炎的疫苗接种。 3.4.4.TLR7/8激动剂 TLR7/8激动剂具有独特的能力，能够结合TLR7和TLR8，以促进更强大的先天免疫反应。TLR8与TLR7类似，位于内质体膜上；然而，它在髓样树突状细胞和单核细胞上的表达更多，而不是像TLR7那样在pDCs上。TLR8通过MyD88途径发出信号，但在诱导的细胞因子谱上与TLR7不同。虽然TLR7主要与产生IFNα相关，但TLR8与产生其他促炎细胞因子如TNFα和IL-12相关。因此，激活这两个受体的能力有利于在对佐剂的反应中诱导更完整的细胞因子。 目前有两种TLR7/8激动剂正在活跃的临床试验中评估（图5b）：咪唑喹啉镓（IMDG）和3M-052。如前所述，咪唑喹啉类药物是一类能够与TLR7和TLR8特异性相互作用的核苷类似物。Ocugen开发的针对COVID-19保护的疫苗正在进行一项试验，该疫苗与吸附在铝上的IMDG一起使用。IMDG是一种二聚体咪唑喹啉分子，通过C2位置链接，具有拮抗TLR7和TLR8的独特能力，通过诱导强烈的I型干扰素反应，导致Th1免疫反应。3M开发的另一种TLR7/8激动剂3M-052在临床试验空间中有很强的流行性。这种激动剂出现在五项临床试验中，每项试验评估针对HIV和COVID-19的独特疫苗配方。在这五项试验中，3M-052都被吸附到铝上，其中一项试验还评估了未吸附的激动剂单独使用。3M-052是一种合成的咪唑喹啉酮，结构类似于resiquimod，但有一个18-C脂肪酸链，增强了分子的疏水性，因此减少了系统的扩散，并在免疫接种部位和引流淋巴结中提高了生物利用度。通过激活TLR7/8途径，3M-052诱导促炎细胞因子的释放，并增强Th1免疫反应。 3.4.5.TLR9激动剂 TLR9感应未甲基化的CpG二核苷酸，这是微生物DNA的特征。含有CpG基序的合成寡核苷酸（ODN）可以模仿这种感应并作为TLR9激动剂。TLR9是一种内质体膜受体，主要在pDCs和B细胞上表达，并在其他免疫细胞亚群上表达，通过MyD88途径发出信号，以启动I型干扰素的释放，从而改善对抗原的先天免疫反应。此外，TLR9激动剂有助于将适应性反应偏向Th1，并促进B细胞的增殖。有四种不同的CpG ODN类别，它们在人类细胞中的激活能力不同。B类ODN在临床试验中被最广泛研究，包括两种CpG佐剂，CpG 1018和CpG 7909，这些佐剂被用于许可的疫苗。这些ODN包含1至5个CpG基序，嵌入在磷酸硫代（PS）骨架中，可以触发pDCs分化并产生TNFα，同时仍然刺激B细胞增殖并分泌IgM。A类ODN包含一个CpG基序，被回文序列包围，导致形成茎环结构。虽然这些ODN同样触发pDC成熟和IFNα的释放，但由于它们定位在早期内质体上，它们不影响B细胞。 由于其在许可疫苗中的历史，TLR9激动剂在TLR激动剂的临床试验空间中占有强势地位，仅次于TLR4激动剂：共有30项试验和18种独特的疫苗配方。目前正在活跃的临床试验中评估六种TLR9激动剂，其中B类ODNs主导该空间，以及以前使用的TLR9激动剂CpG 1018在所有TLR9激动剂中最普遍。CpG 1018出现在10种独特的疫苗配方中，占19项针对COVID-19、流感、HIV和瘟疫的疫苗试验。除了一项试验（NCT05506969）外，CpG 1018都被吸附到氢氧化铝上。这种吸附已被证明可以增强对抗原的免疫反应。CpG 7909，另一种以前使用的B类ODN，是第二普遍的TLR9激动剂，用于四种独特的疫苗配方和五项总试验中；这种激动剂只在一半的配方中被吸附到氢氧化铝上，其余的独立交付。另外两种B类ODN也在评估中，CpG 10104和CpG55.2，都用于一种独特的疫苗配方中，分别针对钩虫（NCT03172975）和COVID-19（NCT05279456）。虽然CpG 10104正在测试吸附到氢氧化铝上，CpG55.2是与一种新型多糖佐剂Advax配方的，这是δ-菊粉颗粒。CpG 2216是一种A类ODN，正在评估结核病疫苗GamTBvac（NCT04975737）中。CpG 2216与一种阳离子衍生的右旋糖酐，右旋糖酐DEAE一起交付，以形成完整的佐剂系统。 3.4.6.组合材料 正如许多评估TLR激动剂的试验中所看到的，这些TLR激动剂并非总是单独交付；相反，只有15%的疫苗配方仅使用TLR激动剂和抗原。相反，这些激动剂通常与另一种佐剂材料结合使用，以增强其在注射部位的传递和持久性，以及由此产生的免疫反应。最常用的组合材料是氢氧化铝，占40%的疫苗配方正在评估中，其中TLR激动剂被吸附到铝颗粒的表面。脂质体是第二常用的组合材料，用于23%含有TLR激动剂的疫苗配方中。这些配方中几乎全都使用了QS-21的脂质体配方，如在许可疫苗中使用的佐剂系统AS01B。如前所述，QS-21是从南美树Quillaja saponaria Molina的树皮中提取的一种皂苷分子。QS-21是一种重要的免疫调节材料，促进促炎环境并增强对抗原的整体免疫反应。将QS-21与胆固醇结合在脂质体配方中是一个重要步骤；游离的QS-21具有毒性并导致细胞坏死。然而，当与胆固醇不可逆地结合时，它失去了毒性，同时保持了佐剂效果。虽然QS-21脂质体配方在化学组成和物理特性上有所不同，但使用的基础材料是一致的：磷脂、胆固醇、QS-21和TLR激动剂。在临床试验空间中最常见的脂质体配方是与TLR4激动剂、MPLA衍生物或合成类似物结合使用的，MA105是唯一含有TLR3激动剂Poly I:C的脂质体配方。AS01系统和ALFQ是临床试验空间中最普遍的脂质体佐剂。AS01使用中性的二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），与磷脂的33.7摩尔百分比的胆固醇，而ALFQ使用两种磷脂，中性的二酰磷脂酰胆碱（DMPC）和阴离子的二酰磷脂酰甘油（DMPG），与55摩尔百分比的胆固醇。这些化学差异导致两种脂质体的大小差异，AS01产生均质的100纳米颗粒，ALFQ导致脂质体的大小从50到30,000纳米不等。在临床试验中评估的不含QS-21的脂质体，ALF43，是ALF家族的成员，保持与ALFQ相同的磷脂组成，并添加3D-PHAD，但由43摩尔百分比的胆固醇组成。与氢氧化铝不同，脂质体，特别是QS-21的脂质体配方，目前只在与TLR激动剂结合时出现在临床试验空间中。 角鲨烯乳液是与TLR激动剂结合的第三常见的材料，在已识别的临床试验中。这些与GLA和SLA结合的稳定乳液将在下一节中讨论。如前一节所讨论的Ad5载体也用于传递dsRNA发夹，它作为TLR3激动剂。这种组合出现在两项独特的疫苗配方和三项试验中，是临床试验空间中唯一的病毒载体和TLR激动剂的组合。临床试验空间中也有新颖的组合材料。TriAdj是一种独特的组合，由宿主防御肽IDR-1002、阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP）和TLR3激动剂Poly I:C组成。虽然IDR-1002尚未显示出增强免疫细胞释放促炎细胞因子的能力，但它已在体外显示出是强效的诱导剂，对人类外周血单核细胞产生中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL8以及单核细胞趋化因子CCL2和CCL7。这将有助于通过白细胞募集在注射部位创造一个免疫能力环境。另一方面，PCEP单独与小鼠抗原一起交付时，促进了IFNy和IL-4的产生，导致强大的抗原特异性Th1和Th2反应。另一种新颖的组合材料，右旋糖酐DEAE，用于针对结核病的GamTBvac疫苗（NCT04975737）。右旋糖酐是一种天然多糖，是药物和抗原传递中最研究的α-葡聚糖之一；它已被证明可以增强细胞和体液反应，尽管确切机制尚不清楚。在GamTBvac中，阳离子右旋糖酐衍生物，右旋糖酐-DEAE，被CpG 2216（TLR9激动剂）包围，形成完整的佐剂系统，而抗原与右旋糖酐结合域融合，并在右旋糖酐上非共价固定。与右旋糖酐类似，右旋糖酐-DEAE的机制尚不清楚，但已显示出这种多组分佐剂允许抗原缓慢释放，刺激TLR9，并激活吞噬作用，所有这些都导致Th1免疫反应。最后一个新颖的组合材料也是一种天然多糖，菊粉，被配方成颗粒并与TLR9激动剂CpG55.2结合，用于针对COVID-19的佐剂系统（NCT05279456）。作为一种植物衍生的多糖，天然形式的菊粉没有免疫调节活性；然而，当结晶成颗粒形成δ-菊粉时，它具有强大的佐剂活性。δ-菊粉在40°C以上的温度下才溶解，这意味着它在体内保持稳定，可能增强其免疫学能力。重要的是，它还显示出启动人类补体系统，导致抗体反应，以及结合到单核细胞并增强它们的趋化因子产生。这些组合材料在佐剂系统中各自发挥作用，与TLR激动剂协同作用，并增强整体免疫反应。 3.5.乳液佐剂 乳液佐剂自2013年AS03在许可的H1N1疫苗中使用以来，一直在FDA许可的疫苗中使用，随后在2015年的流感疫苗中使用MF59。AS03和MF59都是基于角鲨烯的水包油乳液，AS03还包括(D,L)-α-生育酚（维生素E）以增加额外的免疫激活。在当前的临床试验景观中，大约9%的试验和大约8%正在评估的独特疫苗配方包含乳液佐剂。目前正在活跃的试验中评估12种独特的乳液佐剂，其中两种（AS03和MF59）已经用于许可的疫苗中。水包油（O/W）乳液是临床试验中最主要测试的乳液佐剂形式，也是许可疫苗空间中的形式，12种独特乳液佐剂中有11种是水包油乳液。另一种正在评估的乳液是油包水（W/O）乳液。这两种乳液之间的主要区别在于它们的连续相和分散相。O/W乳液具有水的连续相，油相分散其中，而W/O乳液则相反。在这两种类型的乳液中实现乳液的稳定性都很困难，但由于水滴的高流动性，W/O乳液的稳定性更低。此外，由于油的高浓度，W/O乳液的毒性和局部反应原性是一个更大的问题，导致在临床中评估的W/O乳液较少。 3.5.1.油包水乳液 Montanide ISA-51是目前唯一在临床试验中测试的W/O乳液，与肽配方结合，用于针对COVID-19的保护。这种乳液由矿物油和来自曼尼德单油酸酯家族的表面活性剂组成。W/O佐剂将留在注射部位并创建一个库，以缓慢释放抗原，这有助于整体免疫反应。此外，这种W/O库诱导炎症，并导致免疫细胞的募集以摄取抗原。虽然这些佐剂在增强对抗原的免疫反应方面非常有效，但它们可能带来严重的局部和系统性不良反应，这也是过去相关临床试验终止的原因。特别是，当以前在HIV疫苗中评估时，Montanide ISA-51的注射随后是注射部位的局部肿胀以及头痛、恶心和发烧等系统性反应。最令人关注的是，在多名患者中注射部位形成了无菌脓肿，这被认为是由佐剂诱导的炎症引起的。佐剂可以长时间留在注射部位，免疫细胞清除疫苗需要数月时间。由于这一点，以及油中产品持续激活TLRs引发的炎症级联反应，这种佐剂可能导致严重的炎症反应，对患者产生负面影响。 3.5.2.水包油乳液 对于O/W乳液，角鲨烯是临床试验中这些佐剂中使用的主要材料。事实上，在活跃试验中的11种独特的O/W乳液中，除了一种之外，都包含角鲨烯在它们的配方中。角鲨烯是一种从植物和鲨鱼肝油等几个关键来源天然衍生的三萜。在许多配方中，角鲨烯被用来稳定配方，促进抗原的溶解，并改变抗原的释放。它也是一种生物相容材料，与许多W/O乳液中使用的矿物油相比，它表现出较少的持续毒性。然而，过度捕捞减少了鲨鱼的数量并增强了对它们的保护，未来几年需要更可持续的资源。 MF59类似物 许可的角鲨烯乳液佐剂MF59目前正在七项临床试验中评估流感和COVID-19疫苗。当前临床试验空间中使用与MF59相同成分的另外三种佐剂（表2），其中SCT-VA02B在三项针对COVID-19的独特疫苗配方中使用相同的配方。SWE用略微改变的组成配方乳液，因此可以自由进行技术转让，以装备发展中国家的疫苗制造商；其组成有角鲨烯占3.9%，两种表面活性剂均为0.47%，目前正在评估COVID-19疫苗。SQBA佐剂呈现出与SWE类似的配方，也正在评估COVID-19疫苗。尽管配方有轻微变化，但这些角鲨烯乳液利用相同的免疫激活和反应有效地发挥作用作为佐剂。它们通过肌肉细胞释放ATP和细胞因子诱导，导致炎症细胞涌入注射部位，摄取抗原并将其带到引流淋巴结进行处理，从而在注射部位创造短暂和局部的免疫能力环境。MF59还显示出在淋巴结诱导RIPK3依赖性坏死凋亡，随后是凋亡，这与其诱导CD8+ T细胞反应和抗体反应的能力有关。已经研究了MF59中每个单独组分在加强免疫反应中的影响。单独的组分并不像整个配方那样有效。事实上，角鲨烯、Tween 80和柠檬酸缓冲液单独交付时没有免疫刺激性效果。Span 85在肌肉中确实有刺激性效果，但没有导致抗体或T细胞的产生，而MF59配方实现了这一点。 AS03类似物 AS03是另一种基于角鲨烯的乳液，通过包含DL-α-生育酚和去除Span 85，所有这些都在PBS缓冲液中配方，略有不同的组成。目前正在临床评估的两种其他佐剂包含AS03的不同变体（表2），其中BFA03代表相同组分的类似配方，以及用较少DL-α-生育酚（10 mg/ml）和饱和衍生物角鲨烷（30 mg/ml）配方的角鲨烷基乳液。AS03目前正在11项试验中的五项独特疫苗配方中评估，用于针对COVID-19和乙型肝炎的保护，BFA03（NCT05398848）和角鲨烷基乳液（NCT05726084）每种都用于针对COVID-19的保护。添加DL-α-生育酚（合成形式的维生素E）区分了这些配方及其产生的免疫反应，与MF59类似。与角鲨烯类似，DL-α-生育酚是一种可生物降解的聚异戊二烯。与不包含DL-α-生育酚的AS03配方相比，其中使用了等量的角鲨烯作为替代品，不含DL-α-生育酚的配方在肌肉中细胞因子释放的增加更早，与完整的配方相比，后者在注射后24小时调节了更多的促炎细胞因子。此外，当从配方中省略DL-α-生育酚时，观察到引流淋巴结中粒细胞浸润和单核细胞抗原装载的减少。这些配方依赖的先天免疫反应的变化导致在没有DL-α-生育酚的情况下接种疫苗时抗体反应减少了3.5至6倍。总的来说，AS03及其目前在临床中的类似物受益于DL-α-生育酚的添加。与MF59直接比较针对H5N1株的保护时，两种佐剂都能诱导广泛的同源和异源亚型抗体反应；然而，AS03实现了比MF59更高的抗体滴度和广度，突出了DL-α-生育酚在配方中的潜在益处。 GLA-SE 和 SLA-SE GLA-SE 和 SLA-SE 都使用了相同的角鲨烯乳液，称为稳定乳液（SE），它允许分别吸收 TLR 激动剂 GLA 和 SLA。这些乳液由 AAHI 开发，该公司也开发了 TLR 激动剂。这些乳液最初是首先基于配方的稳定性，其次是基于由此产生的适应性免疫反应而设计的。所得到的乳液由磷酸铵缓冲液中的水相与表面活性剂poloxamer 188（0.9 mg/ml）和甘油（22.5 mg/ml）混合乳化，以及包含DMPC（19 mg/ml）和 GLA 或 SLA（0.25 mg/ml）的10%油相在角鲨烯油中。这种75-90 nm大小的颗粒被发现在小鼠中诱导依赖于配方的免疫反应。具体来说，在评估 GLA-SE、单独的 SE 和水溶液配方中的 GLA（GLA-AF）时，与其它配方相比，GLA-SE 显示出产生强大的抗原特异性 Th1 反应，增加抗原特异性 Th1 CD4 细胞和抗体同种型转换到 IgG2c 亚类。这种对先天和适应性反应的增强主要归因于 GLA-SE 启动 IFNy 产生和激活炎症体——一种病原体识别途径——的能力，与单独的 SE 或 GLA-AF 相比。在当前的临床试验空间中，SLA-SE 正在一项针对带状疱疹保护的试验中使用，而 GLA-SE 与 MF59 一样在该领域中占据主导地位，出现在九项试验中的七种独特的疫苗配方中，使其成为在活跃的临床试验中研究最多的乳液配方，尚未在 FDA 许可的疫苗中使用。 LiteVax LiteVax 是一种新型角鲨烯乳液配方，与 MF59 和 AS03 保持相似，其中角鲨烯是主要成分，浓度为 80 mg/ml，表面活性剂 Tween 80 为 40 mg/ml。目前，LiteVax 正在作为已许可的季节性流感疫苗的佐剂在临床中使用。LiteVax 与 AS03 和 MF59 不同之处在于引入了另一种免疫调节成分，麦芽糖 40-单硫酸酯 1,2,3,6,20,30,60-十七烷酸酯（CMS），浓度为 40 mg/ml，与其他成分在 PBS 中配方。CMS 是碳水化合物脂肪酸硫酸酯（CFASE）的单硫酸盐衍生物。CFASE 佐剂之前在癌症疫苗和如流感等传染病的佐剂中进行了探索；然而，其毒性和副作用，如局部反应原性和体温升高，导致探索 CFASE 的改良。CMS 比 CFASE 反应原性低，同时保持免疫学益处，并且在针对流感的疫苗接种中能够产生比 MF59 类似物高 10-20 倍的抗体滴度。尽管完整的 LiteVax 配方被发现在体外轻微调节树突状细胞激活，但单独的 CMS 被发现在上调成熟共刺激标志物方面比完整配方更有效。这表明 CMS 对 LiteVax 的免疫调节活性的重要性，以及 CMS 增强乳液佐剂免疫反应的潜力。 Ne01（20% 纳米乳液） Ne01 是活跃的临床研究中唯一不包含角鲨烯的 O/W 乳液配方。它专门设计为粘膜佐剂，目前正在评估作为鼻内 H5N1 疫苗。这种乳液（400 nm 大小）最初在密歇根大学发明，现在由 BlueWillow Biologics 开发。它通过在水中乳化十六烷基氯化吡啶（CPC, 1%）、Tween 80（5%）和乙醇（8%），与大豆油（64%）混合制造，并且在室温下与抗原结合保持稳定和免疫原性长达 6 个月，在 40°C 下保持 3 个月。这种佐剂已经在雪貂中显示出产生强烈的细胞和体液反应，并有效地保护它们免受 H5N1 的致命挑战。虽然这种佐剂的确切机制仍在阐明中，但它已经显示出通过产生 IL-6 和 IL-17 产生 Th17 反应，也通过产生 IFNy 产生 Th1 反应。此外，已经显示 Ne01 导致抗原摄取和随后的上皮细胞凋亡，然后被树突状细胞吞噬，导致抗原摄取和 APC 成熟的间接途径。 3.6.以前许可的减毒活疫苗 减毒活疫苗由于使用活体、减毒的病毒，具有固有的佐剂特性。在针对疟疾保护的临床试验中，卡介苗（BCG）——减毒结核病（TB）疫苗——和黄热病疫苗YF-17D（也称为Stamaril）被皮内注射，与抗原一起用作佐剂。卡介苗由Calmette和Guerin开发，自1921年首次用于人类以来，至今仍是唯一许可的TB疫苗。它由导致牛结核病的分枝杆菌的减毒株组成，已被证明除了结核病外，还能对其他分枝杆菌感染如麻风病和Buruli溃疡提供保护。卡介苗在注射部位广泛诱导促炎反应，导致免疫细胞浸润和IFNy释放增加。卡介苗表达的各种蛋白质作为TLR激动剂，可以刺激免疫细胞。最终，这些先天反应导致强烈的体液和细胞适应性免疫反应。 黄热病疫苗Stamaril或YF-17D由Sanofi开发，于1987年获得WHO预认证，但在美国仍被视为研究性产品，未获得许可。它使用黄热病病毒的减毒17D-204株；重要的是，黄热病病毒疫苗的17D系列被认为是迄今为止生产最有效和最安全的减毒活疫苗之一。该疫苗通过多种TLR激动剂激活几种树突状细胞亚群，导致促炎细胞因子的产生，并导致强大的体液和细胞适应性免疫反应。 4.结论 佐剂是疫苗的重要组成部分，不仅可以增强整体免疫反应，还可以增强疫苗稳定性。当用于针对传染病的疫苗时，应用能够使疫苗在没有有效冷藏的情况下运输到各个地区的材料，或通过减少所需疫苗剂量和/或频率来降低疫苗成本，这一点至关重要。然而，尽管佐剂有潜力改善疫苗接种，但在铝盐获得批准后的近80年里，第二个获得FDA批准的佐剂才出现。尽管自2010年代以来，许可疫苗中使用了更多的佐剂，但铝盐继续主导佐剂领域，并且仍然是临床试验空间中最常用的佐剂。然而，就像单一抗原不能期望对所有病原体提供保护一样，单一佐剂也不能。正如在COVID-19大流行期间所经历的那样，新的或复杂的病毒和病原体需要在佐剂空间以及抗原方面的设计意图。这种完整的疫苗设计对于引发广泛和长期的保护至关重要。虽然超过一半针对传染病疫苗的活跃临床试验没有使用佐剂或使用了以前许可疫苗中的佐剂，但36%的试验正在研究尚未在许可疫苗空间中使用的新型佐剂。这些佐剂基于各种材料，如纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液，单独使用或与其他免疫调节材料结合使用。 展望未来，应评估更多材料作为疫苗接种中的佐剂，并应对多种抗原和疾病评估其免疫调节效果。在临床试验空间中，佐剂创新和探索方面存在明显差距。我们不能继续依赖我们已经拥有的材料来满足即将到来的大流行病的需求，也不能期望一个免疫原性差的抗原能引发足够强烈的免疫反应。通过对免疫调节化合物的更强大的物质理解，我们可以准备制定涉及合理设计的抗原以及佐剂的有效疫苗。佐剂的安全性在为公众接种疫苗时也极为重要，可能是许多在临床试验中评估的疫苗不使用佐剂或涉及以前许可疫苗中的佐剂的主要原因，这些疫苗具有经过验证的安全性。然而，通过有意识地设计安全性和免疫原性兼顾的佐剂，我们最终可以制定出更有效的疫苗，而不会牺牲患者的安全性。虽然疫苗一直是公共卫生的一部分，但佐剂领域相对处于起步阶段，看到未来我们将欢迎哪些新材料进入该领域将是令人兴奋的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。