Bardoxolone Methyl

引用格式：J. Med. Chem. 2026, 69, 8688−8718摘要 蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）已成为药物研发领域的颠覆性技术范式。尽管PROTAC领域已取得重大进展，但当前研究绝大多数仍局限于招募极少数经典E3泛素连接酶（如小脑蛋白CRBN、希佩尔-林道蛋白VHL），这制约了其潜在治疗应用。在此背景下，基于非经典E3连接酶的PROTAC分子近年来不断涌现。 PROTAC面临的另一大挑战是目标蛋白在非靶组织中降解引发的全身毒性，这推动了前体PROTAC（pre-PROTAC）的发展，以实现目标蛋白水平的条件性、时空精准调控。本文全面总结并探讨了基于新型E3连接酶的PROTAC、经外源刺激与肿瘤微环境激活的PROTAC前药的最新研究进展，同时展望了高效、高选择性PROTAC的设计方向。 研究意义 本观点综述梳理了PROTAC领域的新兴策略，包括新型E3连接酶配体、热休克蛋白介导的降解、前体PROTAC设计等，拓展了靶向蛋白降解的应用范围与技术灵活性。本文通过解析作用机制与设计原则，为克服当前PROTAC在效率、选择性、肿瘤靶向性方面的局限提供思路，为开发高效高选择性的新型降解剂提供战略参考。1. 引言 近年来，以蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）为代表的靶向蛋白降解（TPD）技术，已成为利用小分子配体重编程细胞蛋白稳态的前沿技术范式。与传统小分子抑制剂（SMI）通过占位驱动药理学发挥作用不同，PROTAC通过事件驱动机制启动目标蛋白（POI）的降解过程。 与抑制策略相比，靶向蛋白降解具备多项核心优势： 可靶向传统意义上“不可成药”的蛋白； 彻底清除靶蛋白，进而消除其全部功能（这对于多结构域蛋白尤为重要——传统抑制剂仅能结合单个结构域，往往无法实现完全失活），同时可克服耐药性； 事件驱动的PROTAC介导靶蛋白降解，相比传统需要高抑制剂浓度的占位驱动药理学具有显著优势； 因亲和力低、靶标调控能力弱而在传统药理学中无效的配体，也可用于开发高效PROTAC分子； 借助“目标蛋白-PROTAC-E3连接酶”三元复合物的正协同效应，可将非特异性抑制剂转化为高选择性降解剂。 因此，近年来涌现出多种拓展靶向蛋白降解应用场景的新策略，包括溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、自噬体拴系化合物（ATTEC）、分子伴侣介导的自噬靶向嵌合体（CMATAC）等。这些分子通过诱导蛋白空间邻近，促进目标蛋白降解，主要依赖泛素-蛋白酶体系统（UPS）与溶酶体降解两条途径。 在已报道的靶向蛋白降解策略中，PROTAC是研究最深入、应用最广泛的技术形式，已在肿瘤、自身免疫病、心血管疾病、代谢疾病等多个疾病领域展开研究。 PROTAC的概念验证最早可追溯至2001年Sakamoto等人的研究：他们以SCFβ-TRCP E3连接酶招募磷酸肽（DRHDpSGLDpSM，源自NF-κB抑制剂-α）作为E3结合元件，制备了可降解MetAP-2的PROTAC分子。此后，Crews课题组于2008年报道了首个小分子PROTAC——利用nutlin劫持E3连接酶鼠双微体2（MDM2）降解雄激素受体（AR），开启了PROTAC领域的快速发展。 目前，PROTAC-DB 3.0数据库已收录超过6000个合成PROTAC分子，可成功降解200余种靶蛋白。近年来，数十个PROTAC分子推进至临床试验阶段，其中epdegestrant、catadegbrutinib与gridegalutamide已进入III期临床试验，相关综述已对此进行总结。鉴于PROTAC在靶向蛋白降解领域的丰硕成果，本文聚焦该领域的最新研究进展。 PROTAC是一类双功能分子，通过优化的连接子将目标蛋白配体与E3泛素连接酶招募配体偶联。这种几何精准的连接子使目标蛋白与E3连接酶保持足够近的空间距离，促进目标蛋白发生泛素化并最终降解。 连接子的类型（包括长度、亲水性、刚性）对PROTAC的降解效率与选择性至关重要——它不仅决定了PROTAC的理化性质，还通过调控靶蛋白与E3连接酶的空间邻近程度，影响三元复合物的形成。连接子过短会产生空间位阻，阻碍三元复合物结合，反而促使二元复合物（PROTAC-靶蛋白或PROTAC-E3连接酶）形成；反之，连接子过长会增加PROTAC两端配体的相对自由度，降低E3连接酶与靶蛋白的结合亲和力，削弱靶蛋白泛素化效果， destabilize三元复合物。此外，过长的连接子还会增加分子量，可能损害细胞通透性。 目前，PROTAC降解剂的设计中，聚乙二醇（PEG）、饱和亚甲基链、三氮唑及其组合是最常用的连接子。柔性的PEG与饱和亚甲基链易发生氧化代谢，导致药物浓度降低、暴露时间缩短，加速PROTAC在体内的清除。因此，增加连接子刚性已被证实是改善PROTAC药代动力学特征与口服生物利用度的有效手段。此外，适宜的连接子刚性有助于维持PROTAC的生物活性构象，有望提升蛋白降解效率。刚性芳香环、杂环与大环连接子已被证明可减少不利构象。 哌嗪、PEG等亲水性连接子有望提高水溶性，微调脂溶性。然而，为特定PROTAC实现最优连接子的理性设计，目前仍是一大挑战。有研究者提出，PROTAC初始设计可采用长连接子，随后逐步缩短以优化构效关系（SAR）。在连接子中引入极性基团或原子，有利于调控PROTAC的药代动力学/药效动力学（PK/PD）特征，还可参与三元结合界面的氨基酸残基相互作用，增强正协同效应。 PROTAC可分为小分子PROTAC（smPROTAC）与生物型PROTAC（bioPROTAC，即经工程改造的双功能蛋白，包含靶蛋白结合域与E3连接酶，实现靶蛋白特异性降解）。本文仅讨论小分子PROTAC。 当PROTAC分子同时结合靶蛋白与E3连接酶形成三元复合物时，降解过程启动：泛素化机器被拉近至靶蛋白附近，诱导靶蛋白多聚泛素化，随后经26S蛋白酶体降解。 尽管人类基因组中已鉴定出600余种E3连接酶，但仅有极少数被成功应用于PROTAC介导的降解。其中，希佩尔-林道蛋白（VHL）与小脑蛋白（CRBN）是PROTAC中最主流的两种E3连接酶，围绕这两种连接酶的经典PROTAC已有大量文献报道。 尽管PROTAC已成为强大的药物发现平台，但可用的E3连接酶招募元件有限，仍是该领域公认的制约因素。此外，PROTAC的临床转化还受限于“靶内但脱组织”的蛋白降解（即非预期组织中的靶蛋白降解），进而引发严重全身毒性。 为应对这些挑战，研究者开发了多种非经典PROTAC。鉴于已有大量综述聚焦基于CRBN与VHL的经典PROTAC，本文重点关注2021-2025年间报道的、基于CRBN、VHL、MDM2、凋亡抑制蛋白（IAP）之外新型E3泛素连接酶的非经典PROTAC，以及响应型PROTAC（基于成熟的CRBN、VHL配体），着重阐述其设计策略与PROTAC发展前景。2. 基于新型E3连接酶的PROTAC 尽管人类基因组中已发现600余种E3连接酶，但仅有约1%被用于PROTAC设计，包括4种经典连接酶：CRBN、VHL、MDM2与IAP。其中，CRBN与VHL的应用最广泛，分别占已报道PROTAC的约60%与30%。 然而，越来越多的证据表明，CRBN与VHL在靶向蛋白降解中表现出明显且狭窄的底物特异性。VHL作为一种抑癌蛋白，在多种肿瘤细胞中频繁发生突变。由于可用于靶向蛋白降解的E3连接酶数量稀少、特异性强，许多靶蛋白无法被PROTAC有效降解——部分原因是被招募的E3连接酶在靶细胞中表达量低或活性不足。此外，E3连接酶工具箱的局限性也为获得性耐药埋下隐患。 实验与临床研究均表明，E3连接酶或其通路相关组分的改变，必然会损害泛素化过程，降低细胞对PROTAC介导降解的敏感性。CRBN与VHL的广泛表达虽赋予了PROTAC普适性，但也给组织选择性降解剂的开发带来困难，增加了“靶内脱组织”毒性的风险。此外，为特定靶蛋白选择最优E3连接酶，是实现高效降解活性与效力的关键。 为应对这些挑战，发掘更多E3连接酶招募元件以开发新型PROTAC，有助于克服耐药机制、产生不同的选择性与降解动力学特征，实现细胞类型或定位特异性降解。近期，Han课题组通过综合评估化学成药性、表达特异性、相互作用组特征、结构可及性、功能相关性、亚细胞定位、界面结构等参数，鉴定出76种E3连接酶可作为潜在的PROTAC搭档。这一发现表明，开发兼容PROTAC的E3连接酶仍有巨大潜力。 人类基因组编码600余种E3泛素连接酶，可分为4大家族：RING指型、HECT型、RBR型与RCR型。如图1A所示，HECT、RBR与RCR型泛素连接酶的共同特征是：均含有至少一个催化半胱氨酸残基，先与泛素C端甘氨酸形成共价E3Ub硫酯中间体，再将泛素转移到底物上。与之不同，RING指型泛素连接酶不含催化半胱氨酸，依赖活化的E2酶（E2Ub）将泛素直接转移到底物。 在人类E3泛素连接酶中，RING指型家族规模最大，其中cullin-RING泛素连接酶（CRL）是最主要的E3亚家族（占比近半数），负责催化多种细胞蛋白的泛素化，维持基因组稳定性。人类基因组编码8种CRL，包括CRL1、2、3、4A、4B、5、7，以及研究较少的CRL9（又称PARC）。 如图1B、1C所示，CRL的整体结构以cullin蛋白为核心，由模块化组分组装而成：N端通过衔接蛋白桥接底物受体，形成底物识别模块；C端的RING蛋白负责招募E2酶。底物特异性由CRL的底物受体决定，不同底物受体分属不同的蛋白家族。底物识别依赖于底物内部的特定基序——即“降解决定子（degron）”，它是决定底物被靶向降解的关键元件。 图1. E3泛素连接酶的作用机制与结构特征(A) HECT、RBR与RCR型泛素连接酶均需先形成E3Ub硫酯中间体，再将泛素转移到底物；而RING型连接酶无催化半胱氨酸，通过活化的E2Ub结合物协同完成泛素递送。(B) 经典CRL复合物的相互作用示意图。(C) 经典CRL复合物的结构组装示意图。2.1 F盒蛋白22（FBXO22，CRL1FBXO22） FBXO22是SCF（CUL1）E3连接酶复合物中特征明确的底物受体，在肿瘤进展中发挥作用，且在多种肿瘤中高表达。然而，目前针对FBXO22的抑制剂/配体开发及其向PROTAC工具的转化进展极为有限。 近期，两项研究通过从活性降解剂中筛选潜在E3泛素连接酶，证实FBXO22可作为靶向蛋白降解的可用E3连接酶。2024年，Zhang课题组首次鉴定出FBXO22可被招募用于靶向蛋白降解。该研究以双功能PROTAC 1（22-SLF，图2A）为工具分子——将FKBP12结合配体与亲电α-氯乙酰胺弹头（一种广谱反应性亲电片段，有结合内源性E3连接酶的潜力）连接。通过针对人源E3连接酶的CRISPR-Cas9转录激活筛选，他们证实22-SLF介导的FKBP12降解依赖于FBXO22，且通过共价修饰FBXO22的C227和/或C228位半胱氨酸实现。此外，该研究还验证了基于FBXO22的PROTAC可有效降解其他内源性蛋白，包括BRD4与EML4-ALK融合蛋白。 与此同时，Winter课题组解析了SP3N（2）的作用机制——这是一种偶然发现的烷基胺类FKBP12降解剂，可经代谢生成活性醛类物质3（SP3CHO，图2B），进而共价劫持FBXO22。但研究者也指出，尽管烷基胺类降解剂的概念可推广至其他靶点（如NSD2、XIAP），但这类降解剂需针对每个靶点逐一优化——例如掺入JQ1的烷基胺类似物无法有效降解BRD4。 图2. (A) 22-SLF（1）的化学结构，及通过CRISPR-Cas9筛选鉴定FBXO22为22-SLF招募的E3连接酶；(B) 靶向FBXO22的SP3N（2）及其活性代谢产物SP3CHO（3）的化学结构。转载自参考文献40。版权所有 2024 Springer Nature。2.2 Fem-1同源物B（FEM1B，CRL2FEM1B） FEM1B是CUL2 E3连接酶复合物的底物识别亚基，在还原应激状态下通过识别FNIP1的还原型半胱氨酸，介导其泛素化与降解，从而恢复线粒体功能、氧化还原平衡与干细胞完整性。 结构生物学研究表明，FEM1B的Cys186对FNIP1识别至关重要，提示Cys186是开发半胱氨酸反应性共价FEM1B招募剂的关键残基（图3A、3B）。 2022年，Nomura课题组通过竞争性荧光偏振筛选——对含半胱氨酸反应性共价配体的化合物库，与TAMRA标记的FNIP1562−591降解决定子、重组小鼠FEM1B进行筛选——鉴定出氯乙酰胺衍生物4（EN106）为首个靶向FEM1B的共价配体（图3C）。EN106通过与FEM1B的C186形成共价键，破坏FEM1B-FNIP1识别，阻断FNIP1降解。 基于此，他们将EN106与BET溴结构域抑制剂JQ1（5，NJH-1-106）或BCR-ABL抑制剂达沙替尼（6，NJH-2−142）偶联，开发了基于FEM1B的降解剂（图3D、3E）。其中，化合物5对BRD4的降解效果最显著（DC50=250 nM，Dmax=94%）；化合物6可有效清除BCR-ABL融合蛋白，证明FEM1B有潜力作为PROTAC应用中通用的E3连接酶招募元件。 图3. 基于FEM1B的PROTAC分子结构(A) FEM1B（蓝色）与FNIP1（橙色）的相互作用示意图。(B) FEM1B与FNIP1的半胱氨酸、组氨酸残基配位Zn2+的示意图。(C) 通过筛选发现EN106的过程。(D, E) 基于EN106的PROTAC（5与6）的结构。转载自参考文献45。版权所有 2021 Elsevier Inc.2.3 含Kelch样同源结构域蛋白2（KLHDC2，CRL2KLHDC2） KLHDC2是一种CUL2衔接蛋白，是C端降解决定子通路的核心组分，可识别底物蛋白的C端双甘氨酸基序，促进其泛素化与后续降解。 硒蛋白K（SelK）是KLHDC2的底物之一，其C端的Gly-Gly二肽埋在KLHDC2 β-螺旋桨的中央空腔中，降解决定子的N端朝向溶剂侧。KLHDC2-SelK复合物的晶体结构与相互作用分析，为发现KLHDC2小分子配体与降解剂奠定了关键基础。 2023年，Sim课题组将SelK衍生肽与广谱激酶抑制剂YHJ1039结合，合成了多种利用KLHDC2的PROTAC（图4A、4B）。其中活性最强的化合物KYH1872（7）采用双PEG连接子，将YHJ1039与7个氨基酸的SelK肽（PPPMAGG）相连；在MOLM-14细胞中处理24小时后，该化合物可在1 μM与10 μM浓度下降解NEK9、FAK、CDK4、CDK6、WEE1等激酶。 由于SelK肽的细胞通透性有限，KYH1872的活性远低于对应的CRBN招募型PROTAC DB0625。尽管如此，该研究仍为KLHDC2可作为PROTAC应用的功能性E3连接酶提供了直接的药理学验证。 同期，Sapkota课题组利用亲和导向蛋白导弹（AdPROM）系统，筛选了30余种E3连接酶降解4种靶标（KRAS、STK33、β-连环蛋白、FoxP3）的能力，鉴定出包括KLHDC2在内的多种新型E3连接酶有望用于PROTAC开发。这一假设随后被PROTAC分子8（HALO-SelK pPROTAC，图4C）进一步验证——该分子由KLHDC2招募型SelK肽（SPPPMAGG）通过PEG连接子与HALO配体氯代烷烃偶联而成。用150 μM HALO-SelK p-PROTAC处理HALO-GFP细胞8小时后，GFP荧光强度下降约40%。 随后，也有研究报道了靶向KLHDC2底物结合域（SBD）的非肽类配体在PROTAC开发中的应用。由于天然底物的C端羧基是决定结合选择性与亲和力的主要因素，近期报道的KLHDC2SBD靶向小分子大多保留了这一特征，但可能会影响细胞通透性。 在2024年的一项研究中，Arvinas公司的研究者披露了首批靶向E3连接酶KLHDC2的非共价小分子配体，并进一步开发为靶向BET家族蛋白与雄激素受体（AR）的KLHDC2型PROTAC降解剂（图4D）。 他们以KLHDC2-SelK的晶体结构为起点，结合计算机辅助药物设计（CADD）与结构优化的迭代循环，最终鉴定出两种萘啶酮类小分子配体KDRLKZ-1（9）与KDRLKZ-2（10），二者与KLHDC2的结合力较强（SPR检测KD分别为0.36 μM与0.095 μM）。 考虑到含酸性基团的化合物细胞通透性不佳，他们制备了甲酯形式的前药——进入细胞后可被细胞内酯酶转化为活性羧酸形式。掺入该甲酯型KLHDC2配体的双功能PROTAC K2−B4−5e（11）可快速高效降解HiBiT-BRD4（DC50=6.2 nM），4-6小时内降解率达93%，活性优于含羧酸的降解剂。此外，研究者还证实其可成功应用于雄激素受体（AR）的降解。 总体而言，这些萘啶酮配体整合入双功能PROTAC后，可通过KLHDC2依赖机制诱导BRD4与AR降解，支持了KLHDC2在PROTAC开发中的应用价值。进一步的冷冻电镜研究捕捉到KLHDC2 E3连接酶动态组装为C端介导四聚体的过程，而底物或配体结合可调控这一平衡。 同年，Schulman课题组开发了热迁移实验方法，筛选约9000个分子，随后进行苗头到先导的优化，发现了适用于PROTAC开发的KLHDC2配体12（SJ46418，图4E），结合亲和力满足开发需求（SPR Kd=1.0 μM；TR-FRET IC50=1.1 μM）。 获得KLHDC2配体后，他们开发了靶向溴结构域的PROTAC 14（SJ46421），可驱动与BRD3形成高协同性、高特异性的三元复合物；羧酸酯化前药SJ46420（13）介导的细胞内BRD3降解也证实了这一点（羧基酯化可促进跨膜细胞通透性）。SJ46420在多株内源性表达KLHDC2的细胞系中，以不同效率促进BRD3降解；其中SKBR3细胞中BRD3降解迅速，2小时内蛋白水平下降约70%。 与前述Arvinas公司的KLHDC2型PROTAC（K2−B4−3e与K2−B4−5e）相比，在SKBR3细胞处理4小时或U2OS细胞处理8小时后，SJ46420的活性是K2−B4−3e的2-3倍，但比K2−B4−5e低3-4倍。 在另一项研究中，Bollong课题组基于荧光偏振的高通量筛选，对Calibr小分子库的子集进行筛选，再经结构修饰，得到一系列可结合KLHDC2 Kelch结构域的四氢喹啉衍生物（图4F）。 为提高细胞通透性，研究者选取代表性化合物15的甲酯衍生物用于开发靶向BRD4的PROTAC。其中采用半刚性连接子的PROTAC 16，在稳定表达HiBiT标签BRD4的HEK293T细胞与SK-BR-3细胞中，均表现出显著的BRD4降解活性。 尽管已报道的CRBN招募型BRD4 PROTAC降解剂dBET1在4小时时活性更强（DC50=22 nM），但24小时后活性丧失，提示PROTAC 16在细胞内对BRD4的降解具有长效动力学特征。 图4. (A) KLHDC2与SelK C端在底物结合口袋中的共晶结构（PDB ID: 6DO3）；(B, C) 基于SelK的PROTAC的化学结构；(D) 基于小分子KDRLKZ-2的PROTAC的化学结构；(E) KLHDC2与小分子SJ46418的共晶结构（PDB ID:9BCC）及基于SJ46418的PROTAC的化学结构；(F) 靶向KLHDC2的小分子15及其衍生PROTAC 16的化学结构。2.4 Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1，CRL3KEAP1） KEAP1是细胞氧化与亲电应激防御的调控因子，作为cullin 3（CUL3）E3连接酶复合物的底物衔接蛋白发挥作用，可泛素化核因子E2相关因子2（Nrf2），调控抗氧化蛋白表达，维持细胞氧化还原稳态。 KEAP1-Nrf2通路失调与多种疾病相关，包括肿瘤、神经退行性疾病、衰老、糖尿病、心血管疾病、炎症性疾病、肺纤维化、急性肺损伤等。因此，过去二十年间，大量靶向KEAP1-Nrf2通路的调控剂被开发出来。 此外，与VHL和CRBN相比，KEAP1在多种肿瘤（如肺癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌）中高表达，这有利于拓展基于KEAP1的PROTAC的应用场景。 值得注意的是，将KEAP1作为E3连接酶用于PROTAC开发的研究最早于2018年被报道，由Jiang课题组完成开创性研究。他们设计了靶向tau的PROTAC，采用肽类KEAP1配体，提供了概念验证，但配体的肽类性质限制了其在细胞或体内研究中的应用。 此后，Nomura课题组将KEAP1-Nrf2激活剂巴多索隆（bardoxolone，靶向KEAP1 BTB结构域的Cys151）与JQ1偶联，构建了新型高效的靶向BRD4的PROTAC（CDDO-JQ1）。 鉴于巴多索隆是KEAP1的非选择性反应性配体，可能导致其他E3连接酶的脱靶共价修饰，Jin课题组近期报道了以KI696（17）为招募元件、劫持KEAP1的BRD4降解剂（图5A、5B）。 KI696是一种高效、高选择性的非共价KEAP1抑制剂，可直接结合其Nrf2口袋，破坏KEAP1-Nrf2相互作用。其中活性最强的降解剂MS83（18），可在三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系中，以浓度依赖、时间依赖、KEAP1依赖与蛋白酶体依赖的方式，有效降低BRD4/3亚型的蛋白水平；在MDA-MB-468细胞中，其降解效果比基于CRBN的PROTAC dBET1更持久。 更重要的是，在三阴性乳腺癌细胞系中，MS83对BRD4/3的降解作用更持久，抗增殖活性是CRBN招募型PROTAC dBET1的17倍（MDA-MB-468与MDA-MB-231细胞的GI50值分别为280 nM与130 nM），凸显了利用选择性KEAP1配体开发PROTAC的潜力。 事实上，与CRBN、VHL类似，KEAP1降解靶蛋白也有其适用范围。近期，Gray课题组尝试将非共价KEAP1抑制剂KI696改造为双功能分子，用于降解更多靶标（包括BRD4/9与一系列激酶），以进一步表征基于KEAP1的PROTAC的潜力（图5C）。 他们制备的对应KEAP1型PROTAC DGY-06-177 pk2（19）与NJH-04098（20），可分别降解BRD4与黏着斑激酶（FAK），但无法降解BTK、BRD9、CDK4/6、EGFR——这些靶标均可被招募CRBN或VHL的PROTAC有效降解。 这些结果表明，每对E3连接酶-靶蛋白的独特性质，可能促进或阻碍PROTAC介导的功能性复合物形成。此外，细胞系的选择对KEAP1型PROTAC的降解活性也至关重要。因此研究者认为，KEAP1招募型PROTAC的适用范围窄于VHL或CRBN招募型PROTAC。 在PROTAC分子中，共价E3连接酶配体相比非共价配体可能表现出更优性能，因为三元复合物形成效率更高，且对内源性E3底物的干扰更小。在此背景下，已有研究表明，在PROTAC中掺入共价E3连接酶配体可提升对特定靶蛋白的选择性。 基于此，Lv课题组将胡椒碱（PL，21，一种可结合多种E3酶的天然化合物）与CDK抑制剂SNS-032连接，合成了靶向CDK的共价PROTAC（图5D）。所得偶联物22在MOLT4细胞中暴露16小时后，可高效降解CDK9，DC50值为9 nM。 机制研究表明，KEAP1是22诱导CDK9降解的关键E3连接酶：救援实验显示，NEDD8激活酶抑制剂MLN4924可阻断22诱导的CDK9降解；TurboID诱饵结合活性蛋白谱（ABPP）实验鉴定出KEAP1是唯一参与该过程的CRL。 此外，他们合成了多种PL-塞瑞替尼偶联物，鉴定出化合物23可在NCI-H2228细胞中中度降解EML4-ALK融合癌蛋白，提示PL在劫持E3连接酶用于靶向蛋白降解方面有更广泛的应用。 图5. 基于KEAP1的PROTAC分子结构(A) KI696（17）的结构，及KEAP1 kelch结构域与KI696复合物的共晶结构（PDB ID: 5FNU）。(B, C) 基于KI696的PROTAC的结构。(D) 胡椒碱（PL，21）及基于PL的PROTAC的结构。2.5 Kelch样蛋白20（KLHL20，CRL3KLHL20） 与其他CRL E3连接酶相比，CUL3在细胞内丰度更高，亚细胞定位模式更多样，这使其在靶向蛋白降解领域具备优势——可接触到细胞内更多种类的靶蛋白。 Kelch样蛋白20（KLHL20）属于BTB-Kelch家族成员，可与CUL3、RBX1形成Cullin-RING E3连接酶复合物，近期已被验证为PROTAC开发的有效靶标。 Yeh课题组以DAPK1肽段与KLHL20 Kelch结构域复合物的晶体结构（PDB: 6GY5，图6A）为指导，合成了高特异性的大环类KLHL20靶向配体BTR2000（24）。为形成大环，他们引入两个半胱氨酸残基替代L1336与A1341——这两个残基不与KLHL20直接接触（图6B）。 随后，他们开发了多种双功能降解剂，以BTR2003（25，图6C）为代表，可招募KLHL20作用于BET家族蛋白，在PC3细胞中4小时内即可显著降解BRD2/3/4；且多数降解剂对BRD2、BRD3的选择性高于BRD4。 图6. (A) KLHL20 Kelch结构域与DAPK衍生肽片段1334LGLPDLVAK1342结合的晶体结构（PDB ID: 6GY5，绿色为DAPK衍生肽）；(B) BTR2000（24）的化学结构；(C) 基于BTR2000的PROTAC BTR2003（25）的结构。2.6 DDB1与CUL4相关因子（DCAFs，CRL4DCAFs） DCAF（DDB1-与CUL4-相关因子）是一类与DDB1、CUL4结合的蛋白家族，作为底物受体将E3连接酶招募至DDB1-CUL4复合物。CRL4是靶向蛋白降解领域研究最广泛的E3泛素连接酶之一，其中CRBN是最具代表性的DCAF。 与CRBN相比，其他DCAF（人类基因组中有60余个DCAF基因）的亚细胞定位特异性更强。近期，几种主要定位于特定亚细胞区室的E3连接酶被用于PROTAC开发，例如定位于细胞核的DCAF11、DCAF15、DCAF1与DCAF16。本文将介绍近期报道的、招募DCAF15、DCAF16、DCAF11、DCAF1与DCAF2的PROTAC案例研究。2.6.1 DCAF16 DCAF16 E3连接酶最早通过化学蛋白质组学筛选，利用KB02-SLF（26，图7）等双功能降解剂被鉴定为亲电PROTAC的靶标。 这类降解剂由广谱反应性、半胱氨酸靶向的亲电片段KB02，与细胞内蛋白的选择性配体（如靶向FKBP12的SLF）偶联构建。值得注意的是，所得PROTAC仅促进核蛋白降解，为通过避免结合胞质蛋白、提高靶向蛋白降解特异性提供了新思路。 受此启发，Li课题组将PARP1/2抑制剂奥拉帕利、CDK4/6抑制剂哌柏西利，与已报道的共价DCAF16配体KB02偶联，合成了一系列新型靶向PARP2与CDK4/6的PROTAC。所得活性化合物C8（27）与A4（28）（图7）可分别有效降解靶蛋白PARP2与CDK4/6。遗憾的是，研究未与对应的CRBN或VHL型PROTAC进行进一步对比。 由于亲电片段KB02在单数字微摩尔浓度下即可结合蛋白质组中大量半胱氨酸，这种非特异性限制了其应用。近期，Zhang课题组通过重新分析已发表的蛋白质组学数据集，鉴定出新型DCAF16招募剂YY4（29），是颇具潜力的先导骨架，并构建了靶向FKBP12的PROTAC MC-25B（30，图7）。 与此前基于KB02-SLF的DCAF16型PROTAC相比，基于该DCAF16招募剂的PROTAC 30的蛋白质组水平选择性有所提升。研究者进一步证实，将该DCAF16招募剂通过PEG连接子与广谱激酶结合剂偶联，可用于降解其他内源性蛋白。 图7. 基于DCAF16的PROTAC 26−30的化学结构2.6.2 DCAF11 Zhang课题组通过Ugi反应，将靶向FKBP12的SLF配体与多种亲电基团（主要为α-氯乙酰胺）经PEG连接子连接，构建了一系列亲电PROTAC。 在多株人类癌细胞系中进行的细胞水平评价显示，多个阳性分子可通过Cullin-RING连接酶介导胞质与胞核FKBP12降解；其中化合物21-SLF（31）对前列腺癌细胞表现出选择性活性（图8A）。 后续的化学蛋白质组学结合CRISPR/Cas9敲除研究验证，DCAF11是31介导蛋白降解过程中的核心E3连接酶。但需要指出的是，从已报道数据来看，31对FKBP12的降解效率低于对应的CRBN型PROTAC（Len-SLF），且细胞特异性更强。 研究者进一步在内源性靶标上验证，DCAF11招募型亲电PROTAC可降解雄激素受体，支持DCAF11可作为亲电PROTAC介导降解的E3连接酶。 受该研究启发，Hansen课题组合成了一系列DCAF11招募型PROTAC，并鉴定出FF2039（32）是高效降解HDAC1与HDAC6的降解剂（图8B）。机制研究证实，FF2039通过泛素-蛋白酶体系统发挥作用，且依赖DCAF11。 与他们此前开发的CRBN招募型HDAC6选择性PROTAC相比，切换为DCAF11后，降解谱发生了显著变化，凸显了E3连接酶选择对特异性与效力的决定性作用。 鉴于α,β-不饱和吲哚啉酮GW5074（33）可靶向LC3B，促进亨廷顿蛋白的自噬降解（图8C），Waldmann课题组将该亚芳基吲哚啉酮衍生物，与PDEδ脂蛋白伴侣配体（34）、BRD蛋白配体（35）、BTK与BLK激酶配体（36）偶联，旨在通过自噬诱导蛋白降解（图8D）。 出乎意料的是，所得双功能降解剂触发的是泛素-蛋白酶体系统依赖的蛋白降解，而非自噬介导的降解。靶标鉴定与机制研究表明，亚芳基吲哚啉酮与DCAF11形成共价相互作用。 类似地，研究者将烯基羟吲哚结构（自噬相关LC3B蛋白的配体）与BRD4抑制剂JQ1通过多种连接子连接，合成了一系列双功能偶联物（图8E）；所得降解剂HL435（37）表现出强效BRD4降解活性，在MDA-MB-231细胞中DC50为11.9 nM，在MCF-7细胞中为21.9 nM。 一致地，这种降解归因于泛素-蛋白酶体系统而非自噬-溶酶体途径；经混合CRISPR干扰（CRISPRi）筛选验证，DCAF11是发挥作用的E3连接酶。 随后，该课题组系统改变芳环、连接子与羟吲哚母核的取代基，研究构效关系，得到了活性更强、DCAF11依赖的BRD4降解剂L134（38，图8F），在MDA-MB-231细胞中的DC50值为7 nM。 图8. (A, B) 基于α-氯乙酰胺衍生物的PROTAC 31与32的化学结构；(C) GW5074（33）的化学结构；(D−F) 基于GW5074的PROTAC 34−38的化学结构。2.6.3 DCAF1 在成功开发DCAF16与DCAF11招募探针后，Zhang课题组采用成熟的半胱氨酸靶向质谱活性蛋白谱（MS-ABPP）策略，鉴定出亲电氮杂环丁烷丙烯酰胺MY-1B（39，图9A）是靶向DCAF1的配体。 与修饰DCAF16/11的反应性α-氯乙酰胺片段不同，氮杂环丁烷丙烯酰胺与DCAF1的单个半胱氨酸（C1113）发生立体专一、位点专一的反应。 值得注意的是，掺入氮杂环丁烷丙烯酰胺、靶向FKBP12或BRD4的PROTAC 40与41，仅在表达重组DCAF1的HEK293T细胞中诱导外源性蛋白降解（图9B）。这种有限的效力，可能是由于生理浓度下配体与内源性活性DCAF1的C1113残基结合不足导致的。 值得关注的是，两个研究团队独立报道了高效DCAF1配体的发现及其在DCAF1导向PROTAC中的应用。 Vulpetti课题组通过两轮迭代聚焦筛选——基于内部WDR结构域认知筛选小型化合物库，再进行苗头扩展与基于结构的设计——鉴定出纳摩尔级效力的非共价DCAF1结合剂43（图9C，KD=0.031 μM）。 基于该配体，他们开发了一系列DCAF1招募型PROTAC，靶向BRD9、酪氨酸激酶与BTK。与此前报道的共价DCAF1导向PROTAC（仅在DCAF1过表达时诱导底物降解，内源性DCAF1水平下无活性）相比，这些配体衍生的PROTAC可有效招募内源性DCAF1，介导靶蛋白降解。 例如，DCAF1导向的达沙替尼靶向PROTAC，可有效降解CSK、TEC等胞质与膜结合酪氨酸激酶——尽管DCAF1主要定位于细胞核。 更重要的是，高效高选择性的DCAF1-BTK PROTAC DBt-10（44），可在已对CRBN-BTK PROTAC产生获得性耐药的细胞中降解BTK；而DCAF1-BRD9 PROTAC DBr-1（45），甚至在内源性缺失VHL表达的细胞系中仍能有效降解BRD9。 这些发现表明，靶向DCAF1等替代E3连接酶，是克服传统PROTAC内源性或获得性耐药的可行策略。 同期，Vedadi课题组致力于发现可逆性DCAF1结合剂，他们通过相似性搜索与机器学习，筛选大规模DNA编码库（DEL）以鉴定候选化合物。经结构导向的苗头优化，得到OICR-8268（46），对DCAF1具有高亲和力（图9D，KD=38 nM）。 利用这种强效非共价DCAF1配体，他们开发了4种可诱导内源性与外源性WDR5降解的PROTAC。其中PROTAC 48的降解效率最强，EC50为40.2 nM，Dmax为73.8%，几乎达到基于VHL的WDR5靶向PROTAC MS67降解外源性HiBiT WDR5的水平（Dmax=78.7%）。 DCAF1-PROTAC-WDR5三元复合物的高分辨率晶体结构显示，柔性的DCAF1环区提供了表面可塑性，这解释了DCAF1底物谱广泛的原因。 图9. (A, B) MY-1B及基于MY-1B的PROTAC的化学结构；(C) DCAF1与化合物43复合物的共晶结构（PDB ID: 8OO5），及化合物43与基于43的PROTAC的化学结构；(D) DCAF1与OICR-8268复合物的共晶结构（PDB ID: 8F8E），及OICR-8268与基于OICR-8268的PROTAC 48的化学结构。2.6.4 DCAF2与DCAF15 尽管研究者对其他DCAF的兴趣日益浓厚，但DCAF2与DCAF15在PROTAC开发中的潜力尚未得到充分挖掘，相关研究报道较少。 DCAF2在多种肿瘤中过表达，凸显了其作为肿瘤选择性干预靶标的潜力。然而，公开结构数据的缺失给降解剂设计带来了巨大障碍。 近期，Wang课题组证实内源性DCAF2的C141位可被配体结合。通过文献挖掘与一系列生物学验证，他们鉴定出潜在的C141结合剂CL95（49，图10A），随后设计了靶向BRD4的双功能工具分子（如50，图10B）。 综合冷冻电镜复合物结构分析与相关生化实验表明，DCAF2是极具前景的PROTAC开发用E3连接酶。 DCAF15介导RNA结合基序蛋白39（RBM39）降解，是一系列剪接抑制剂磺酰胺类（SPLAM）的作用机制，包括indisulam、E7820（51）、CQS、他舒拉胺等；因此，部分这类分子被报道用于开发结合DCAF15的PROTAC。 DP1（52）是一种新型BRD4降解剂，由Chen课题组于2020年开发——将DCAF15招募配体E7820与JQ1偶联（图10C、10D）。该偶联物仅在高浓度下才引发明显的靶蛋白降解（DC50=10.8 μM），且依赖DCAF15。 近期，Lucas课题组将E7820优化为活性更强的DCAF15配体（53，IC50=53 nM），并制备了一系列针对多靶标的PROTAC，但仅观察到BRD4的降解（以54为代表，图10E、10F）。 出乎意料的是，机制研究证实这种降解效应不依赖DCAF15。因此研究者推测，DCAF15介导的双功能降解的广谱适用性可能有限。在我们看来，这种不理想的蛋白降解效果，也可能受细胞系选择与所用DCAF15招募配体的影响。 图10. (A) CL95的化学结构，及DCAF2与CL95复合物的共晶结构（PDB ID: 9C5U）；(B) 基于CL95的PROTAC 50的化学结构，及DCAF2-BRD4-化合物3三元复合物的晶体结构（PDB ID:9C5V）；(C) E7820（51）的化学结构；(D) 基于E7820的PROTAC DP1（52）的化学结构；(E, F) E7820的化学优化（53）及基于E7820衍生物的PROTAC 54的化学结构。2.7 环指蛋白114（RNF114） 在早期研究中，Nomura课题组证实，天然柠檬苦素类三萜化合物印楝素（nimbolide），可通过共价修饰RING结构域E3连接酶RNF114非结构化N端区域的8位半胱氨酸（C8），将其招募用于靶向蛋白降解（包括BRD4与BCR-ABL），该结论通过ABPP化学蛋白质组学平台验证。 尽管印楝素在靶向蛋白降解中有效，但其分子量大、稳定性一般、合成可及性有限，促使该课题组寻找更易合成的RNF114配体用于PROTAC开发。 近期，通过基于凝胶的竞争性ABPP筛选半胱氨酸反应性氯乙酰胺与丙烯酰胺，他们鉴定出EN219（55）是RNF114结合IA-罗丹明（罗丹明功能化的半胱氨酸反应性碘乙酰胺探针）的强效抑制剂（IC50=470 nM，图11）。 它通过共价结合RNF114的C8，抑制RNF114介导的自身泛素化与p21泛素化。将EN219整合入BET靶向元件JQ1或BCR-ABL靶向元件达沙替尼，他们构建了PROTAC（如ML2−14（56）与ML2−23（57）），可通过蛋白酶体与RNF114依赖的方式，选择性清除BRD4与BCR-ABL。 图11. 基于EN219的PROTAC 56与57的化学结构2.8 含三结构域蛋白21（TRIM21） 三结构域蛋白（TRIM）是单多肽RING E3连接酶中最大的亚家族之一，人类中包含近80个成员，可直接催化泛素与SUMO转移到底物蛋白上，触发降解。 与其他TRIM蛋白不同，TRIM21因对抗体Fc结构域具有高亲和力，在靶向蛋白降解工具开发中备受关注。 基于TRIM21的抗体受体与泛素连接酶双重功能，Clift等人此前建立了一种快速清除内源性蛋白的工具——“Trim-Away”：通过递送外源性TRIM21与抗靶蛋白抗体，触发TRIM21介导的泛素化与降解。 近两年来，利用TRIM21的小分子PROTAC被开发出来。Han课题组通过表型筛选结合靶标去卷积，鉴定出抗精神病药乙酰丙嗪（ACE，58，对野生型TRIM21亲和力低）的代谢产物(S)-ACE-OH（59），是TRIM21D355A与核孔蛋白NUP98之间的分子胶，可导致多聚体核孔复合物中部分蛋白被清除（图12A、12B）。 此外，以TRIM21的PRYSPRY结构域与乙酰丙嗪的共晶复合物为指导，他们将乙酰丙嗪功能化为PROTAC，合成了一系列TRIM21型降解剂，可选择性促进BRD4（TrimTAC1（60），图12C）、FKBP12（TrimTAC2（61），图12D）等多聚体靶标的降解，为基于TRIM21的多聚体选择性降解剂治疗异常蛋白聚集疾病提供了有前景的策略。 类似地，Adams课题组近期通过表型筛选发现，BMS-214662（62）与PRLX-93936（63）是强效分子胶，可结合TRIM21，驱动核孔蛋白降解并抑制核转运（图12E、12F）。 他们还将其中一种TRIM21分子胶PRLX-93936改造为双功能降解剂64，可利用野生型TRIM21清除聚集蛋白，无需表达TRIM21突变体即可发挥活性（图12G）。 总体而言，目前已报道的基于TRIM21的PROTAC均源自分子胶，尤其适合降解聚集蛋白。尽管靶向TRIM21的分子胶不断被发现，但这些化合物的结构相似性较低。 图12. (A, B) ACE、(S)-ACE-OH的化学结构，及TRIM21与ACE复合物的共晶结构（PDB ID: 8Y58）；(C, D) 基于ACE的PROTAC 60与61的化学结构；(E−G) BMS-214662（62）、PRLX-93936（63）及基于PRLX-93936的PROTAC 64的化学结构。2.9 GID4 葡萄糖诱导降解蛋白4（GID4）是人源C端至LisH（CTLH）E3泛素连接酶复合物的底物受体，可识别N端脯氨酸降解信号（Pro/N降解决定子）与特定疏水基序，介导蛋白酶体降解。 GID4与CRBN、VHL类似，呈广泛表达模式，因此是PROTAC开发中颇具吸引力的E3连接酶，Dong课题组的研究证实了这一点。 PFI-7（65）是该课题组此前开发的非共价GID4拮抗剂，通过靶向GID4底物结合口袋的β-桶结构，破坏经典Pro/N-降解决定子肽的识别。 近期，他们将65与成熟的BRD4抑制剂JQ1偶联，合成了一系列基于GID4的双功能分子（图13A、13B）。以NEP108（66）为代表的PROTAC，以GID4与泛素-蛋白酶体系统依赖的方式清除对应靶标，表明基于GID4的平台可应用于多种靶标。 值得注意的是，部分GID4型降解剂可降解BRD4/2，但不能降解BRD3。此外，三元复合物的晶体结构显示，PROTAC以灵活、动态的构象介导GID4-BRD4相互作用（图13C）。 除BET家族外，他们进一步验证了GID4型PROTAC策略可成功应用于清除其他靶标，包括雌激素受体α（ERα）与SMARCA2。这些发现表明GID4可作为PROTAC开发的适用E3连接酶。 图13. (A) PFI-7（65）的化学结构，及GID4与PFI-7复合物的共晶结构（PDB ID: 7SLZ）；(B) 基于EN219的PROTAC NEP108（66）的化学结构；(C) GID4-BRD4-NEP108三元复合物的晶体结构（PDB ID: 8X7G）。2.10 代表性E3连接酶配体简要总结 如前所述，PROTAC的降解效率受多种因素影响，其中选择合适的E3连接酶招募配体是核心决定因素，原因包括： E3连接酶的组织特异性表达谱各不相同； 靶标与E3连接酶的亚细胞共定位存在差异； E3结合元件赋予PROTAC的理化性质各不相同。 迄今为止，成熟的CRBN与VHL仍是PROTAC开发中应用最广泛的E3连接酶，尤其是结构紧凑的CRBN结合剂（沙利度胺及其衍生物），通常能赋予PROTAC更优的理化性质与理想的口服生物利用度特征。 随着发掘新型可成药PROTAC E3连接酶的热度上升，近期针对FBXO22、FEM1B、KLHDC2、KEAP1、KLHL20、DCAF、RNF114、TRIM21、GID4等的配体相继被探索。 其中大多数配体带有靶向半胱氨酸的亲电弹头（如氯乙酰胺或α,β-不饱和羰基），且多通过筛选而非理性设计发现。将这些共价E3连接酶结合剂用于PROTAC设计，相比可逆型配体具有明显优势——可将三元复合物相互作用转化为共价修饰E3连接酶与靶标的简单二元相互作用。 但需要注意的是，这类共价结构的高反应性也伴随着脱靶效应与潜在毒性风险的升高。此外，少部分非共价E3配体源自其天然底物，或经计算机辅助药物设计指导的理性设计与优化得到。 同时，分子胶也为PROTAC开发提供了另一条路径。总体而言，这些新兴E3配体目前主要作为工具化合物使用，且现有研究大多缺乏与成熟CRBN/VHL型PROTAC的直接对比，其应用范围与性质仍需更全面的验证。3. 热休克蛋白介导的PROTAC 热休克蛋白（HSP）作为分子伴侣蛋白，对蛋白稳定与细胞基本存活过程至关重要。该大家族中，HSP90与HSP70是研究最深入的两个成员。 HSP90与多种共分子伴侣（如Cdc37、HIP、p23、HOP）协同作用，调控雌激素受体（ER）、HIF-1α、雄激素受体（AR）等关键致癌客户蛋白，进而促进肿瘤生长与存活。 鉴于HSP90在维持癌蛋白稳定中的核心作用，它已成为颇具前景的治疗靶标，至少有18种抑制剂进入临床试验。迄今为止，匹米司匹布（pimitespib）仍是唯一获批的HSP抑制剂，其他候选药物大多受限于全身毒性或其他HSP的代偿性上调。 鉴于靶向蛋白降解在提升蛋白选择性方面的优势，已有靶向特定HSP90亚型的PROTAC被报道。例如，Wu课题组开发了选择性Hsp90α降解剂X10g，可在体内有效抑制肿瘤生长，且毒性更低。 除了参与新生多肽与变性蛋白的折叠，HSP90还可识别错误折叠蛋白，加速其经泛素-蛋白酶体系统降解；研究发现，约30%的人类E3连接酶可与该分子伴侣相互作用。这启发了另一种靶向蛋白降解策略：将新底物招募至HSP90，间接结合E3连接酶。 与传统PROTAC相比，基于HSP90的PROTAC可能具备以下优势： HSP90在几乎所有肿瘤细胞中过表达，可增强HSP90结合化合物的肿瘤选择性药代动力学； 通过与HSP90复合物相关的多种泛素酶触发靶蛋白降解，可拓宽底物适用范围，降低耐药可能性； 与E3配体选择相对有限不同，已有20余种处于临床阶段、大量处于临床前阶段的HSP90抑制剂，为探索与优化提供了更多选择。 近年来，已有多项研究报道了利用热休克蛋白HSP90伴侣复合物触发蛋白降解的双功能分子（以下简称“HSP90-PROTAC”，图14）。 Ranok Therapeutics的Ying课题组率先将HSP90配体应用于其伴侣介导的蛋白降解（CHAMP）平台。文献综述显示，该团队已申请多项针对不同靶标的CHAMP专利，靶标包括BRD4、KRASG12C、KRASG12D、ERK5等，采用的HSP90靶向配体包括SNX2112与Ganetespib（STA-9090）。 令人振奋的是，代表性的靶向BRD4化合物RNK05047已进入I/II期临床试验，用于治疗晚期实体瘤；但RNK05047的化学结构与相关临床前数据尚未公开披露。 后续研究也报道了针对其他靶蛋白的HSP90型降解剂，且被赋予了不同命名： Li课题组成功开发了HEMTAC 26（67），利用HSP90配体BII021实现客户蛋白CDK4/6的蛋白酶体降解； Dong等人报道了高效谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）降解剂HIM-PROTAC GDCNF-11（68），通过将靶蛋白拴系至HSP90诱导铁死亡； Wang课题组披露了HSPTAC DDO3602（69），通过桥接PARP1与HSP90，有效诱导聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP1）降解； Chen课题组开发了eHSPTAC dPDL1−4（70），可通过网格蛋白依赖的内吞与溶酶体途径，有效降解膜蛋白程序性死亡配体1（PD-L1）。 此外，参与HSP90介导蛋白降解的靶标还包括WEE1（71）、极光激酶A（AurAP14，72）、雄激素受体（AR，WCA-814，73）等。 有趣的是，Hu课题组开发了一种新型靶向蛋白降解策略：将靶蛋白配体与HSP90共价连接，通过泛素-蛋白酶体机制（胞内靶标）或溶酶体途径（胞外靶标）清除靶蛋白。 该研究通过N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）连接子——一种常用于选择性标记胞内与膜蛋白的化学工具——将靶蛋白配体与HSP90配体PU-H71共价偶联。利用这种配体导向的共价标记方法，他们制备了两个代表性分子iHAC（74）与eHAC（75），分别有效降解胞内BRD4与胞外PD-L1（图15A、15B）。 此外，鉴于血小板中HSP90丰度高，研究者将这些化合物与血小板孵育，制备了预标记血小板，被证实可有效抑制癌症复发或转移。总体而言，这项工作为整合HSP90型PROTAC技术与细胞递送系统提供了新思路，可显著提升PROTAC的治疗效力与靶向性能。 HSP70是热休克蛋白家族的另一重要成员，与HSP90类似，HSP70也可通过将HSP70配体与靶蛋白结合剂偶联，作为招募E3泛素连接酶的通用衔接分子。 近期，Dong等人率先开发了首个HSP70相互作用组介导的蛋白水解靶向嵌合体（HSP70-PROTAC），用于清除GPX4，通过泛素-蛋白酶体系统与分子伴侣介导的自噬（CMA）双重作用触发铁死亡（图16A）。 他们将GPX4靶向配体ML162与HSP70靶向配体apoptozole偶联，随后优化连接子组成与长度，鉴定出活性GPX4降解剂GDAz-3（76），在HT1080细胞中的DC50值为0.13 μM（图16B）。 与HSP90-PROTAC系统中α、β亚型均参与靶蛋白降解不同，HSP70-PROTAC的机制仅涉及Hsc70亚型。 更重要的是，与他们此前报道的、由HSP90伴侣复合物介导的活性GPX4降解剂GDCNF-11相比，HSP70-PROTAC分子GDAz-3的GPX4降解动力学更快，作用持续时间更长。 同时，GDAz-3诱导的GPX4降解似乎不依赖CRBN与VHL——在CRBN/VHL敲低的HT1080细胞，与内源性缺失VHL表达的786-O细胞中，其降解效率相当。这一特性有助于拓展其治疗应用，帮助克服传统PROTAC的耐药性。 如前所述，热休克蛋白介导的PROTAC具有显著优势。但在我们看来，其也存在若干潜在风险值得关注： HSP90/HSP70参与维持细胞蛋白稳态，广泛招募可能干扰正常蛋白折叠，导致非特异性降解或毒性，最终损害正常细胞存活； HSP90/HSP70-PROTAC介导的泛素化降解机制尚未完全阐明，可能阻碍降解效率的预测与优化； 与更小的CRBN靶向配体相比，目前报道的HSP90/HSP70配体分子量通常更高，可能损害HSP90/HSP70-PROTAC的细胞通透性与口服生物利用度； 药理学干扰HSP70/HSP90功能可能触发其他伴侣蛋白的代偿性上调，进一步使治疗结果复杂化。 总体而言，热休克蛋白介导的PROTAC是靶向蛋白降解领域新兴且有前景的策略，仍需进一步拓展与优化。 图14. HSP90-PROTAC降解靶蛋白的作用示意图，及基于HSP90的PROTAC 67−73的化学结构转载自参考文献34。版权所有 2024 美国化学会。 图15. (A) 基于血小板的蛋白降解平台，通过共价标记HSP90实现胞内与胞外蛋白靶向降解的示意图；(B) iHAC 74与eHAC 75的化学结构转载自参考文献109。版权所有 2024 Springer Nature。 图16. (A) HSP70-PROTAC降解靶蛋白的作用示意图；(B) 基于HSP70的PROTAC GDAz-3（76）的化学结构转载自参考文献110。版权所有 2025 John Wiley & Sons, Inc.4. 刺激响应型PROTAC 如前所述，除E3连接酶工具箱有限这一主要瓶颈外，PROTAC开发还面临成药性不佳、靶内脱肿瘤毒性风险等其他挑战。 PROTAC因三元结构通常分子量较高，往往不符合利平斯基五规则（Ro5）。因此，许多PROTAC的通透性、溶解性与口服生物利用度不佳。 为克服这些局限——包括靶内脱肿瘤毒性，同时受抗体药物偶联物（ADC）在提升靶标特异性与药代动力学方面成功应用的启发，降解剂-抗体偶联物（DAC）近期成为热门策略——通过单克隆抗体介导PROTAC递送。 迄今为止，已报道的DAC靶蛋白包括但不限于BRD4、ERα、TGFβR2、BRM、ROR1等。尽管DAC领域仍处于起步阶段，可能面临诸多问题（如筛选适合构建DAC的PROTAC分子、验证降解剂与抗体之间的连接子组成与连接位点等），但DAC代表了一种改善PROTAC不良药代动力学（PK）特征、提升体内治疗潜力的新途径。 具有类似功能的其他偶联物还包括核酸适体-PROTAC等。此外，脂质体、胶束、树状大分子、外泌体、聚合物纳米粒、金属有机框架（MOF）等纳米载体递送系统，在改善传统PROTAC的药物代谢与药代动力学（DMPK）特征、提高生物利用度方面也受到大量研究关注。 PROTAC纳米药物递送也是提升肿瘤选择性、降低毒性的有前景的方向，已有多篇综述对此进行阐述。本文聚焦小分子PROTAC的设计以应对上述挑战，因此PROTAC的递送不在后续讨论范围内。 在病理组织中实现药物激活的精准时空调控，有助于提升选择性、最小化脱靶效应，进而提高治疗效力。大量研究探索了多种可断裂共价基团，将PROTAC改造为无活性前药，再在靶组织中选择性激活。 这些化学掩蔽基团可引入PROTAC的任意部位（靶蛋白配体、E3招募元件或连接子），并可被多种刺激断裂，包括外源光照、肿瘤微环境（如特定酶、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH））等。本文将简要介绍近年来的研究进展。4.1 光激活PROTAC 光激活PROTAC（包括光笼型与光开关型PROTAC）于2019年问世，是最早的靶向蛋白降解调控手段之一。其构建方式是在VHL或CRBN等E3连接酶的配体上连接光可断裂保护基，实现活性降解剂分子释放的空间精准控制。 然而，依赖紫外光激活极大限制了体内应用，因为紫外光的组织穿透性差。相比之下，近红外（NIR）光具有深层组织穿透优势，可更有效地穿过生物组织。 Li课题组近期报道了一种近红外光激活纳米PROTAC（NAP，77）：它由两亲性偶联物分子自组装而成，偶联物中PROTAC通过单线态氧（1O2）可断裂连接子，与近红外光敏剂脱镁叶绿酸A（PA）相连（图17）。 NAP的纳米制剂可促进PROTAC在肿瘤组织的蓄积。近红外光照射后，包载的PA产生1O2，发挥双重功能：一方面断裂连接子释放活性PROTAC，另一方面同时发挥光动力治疗（PDT）效应。 无光照时，NAP无法降解BRD4；但经5分钟近红外照射后，NAP逐渐恢复BRD4降解活性：照射后12小时，随着NAP浓度从0.5 μM升至5 μM，降解率从65%提升至97%。此外，在MCF-7荷瘤小鼠中，近红外光照射后的肿瘤抑制率高达83.4%。 总体而言，这些发现证实NAP可通过近红外触发的光动力蛋白水解，实现安全有效的肿瘤抑制。 鉴于X射线辐射具有高空间精度与深层组织穿透性，Yang等人开发了首个放疗触发的PROTAC前药（RT-PROTAC，78）：在靶向BRD的PROTAC中嵌入X射线可激活的苯基叠氮笼蔽基团，实现X射线照射下蛋白降解的时空精准调控（图18）。 RT-PROTAC前药在基础状态下活性较低；经X射线照射后，发生化学键断裂反应，释放活性PROTAC（80），从而特异性作用于肿瘤细胞中的BRD蛋白。 为验证该激活机制，研究者用不同浓度的PROTAC、RT-PROTAC，或RT-PROTAC联合X射线处理MCF-7细胞。结果显示，即使浓度高达300 nM，单独RT-PROTAC也无法降解BRD4；但联合X射线照射后，BRD4发生显著降解（DC50对应Dmax=68.75%），低于母本PROTAC（DC50=31.23 nM，Dmax=77.47%）。 后续在MCF-7异种移植模型中的体内评价显示，注射后16天，X射线/RT-PROTAC组与X射线/PROTAC组的肿瘤体积仅分别增长1.89倍与1.63倍，远低于PBS对照组的8.89倍。 总体而言，该研究为体内蛋白降解的精准时空调控建立了有前景的平台，可降低PROTAC的非预期全身毒性。 与光的组织穿透深度有限相比，超声（US）的组织穿透能力更强，软组织中穿透深度可达10 cm。声动力治疗（SDT）是一种高精度治疗手段，通过施加超声激活声敏剂产生活性氧（ROS），是治疗胰腺癌等深部肿瘤的无创方式。 声动力治疗后，产生的肿瘤细胞碎片可作为肿瘤抗原，刺激淋巴细胞浸润肿瘤，加速肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD）过程。但这种免疫应答伴随着大量三磷酸腺苷（ATP）的释放，ATP可代谢为腺苷，结合免疫细胞上的A2A受体（A2AR），导致PD-L1上调，使肿瘤细胞逃避免疫监视。 为解决这一问题，Yuan课题组近期开发了超声激活的纳米粒PROTAC递送系统NP Ce6+PRO，用于BRD4降解；其中靶蛋白配体JQ1可通过抑制肿瘤PD-L1表达，使免疫功能正常化，克服免疫耐受（图19A、19B）。 超声照射触发Ce6介导的ROS生成，具有双重作用：一方面实现声动力治疗，另一方面通过断裂硫缩酮（TK）键促进活性PROTAC释放。 用超声刺激细胞7分钟后，KPC细胞中BRD4的降解效率为68.5%。此外，超声激活的NP Ce6+PRO在胰腺癌原位模型中可显著抑制细胞增殖与肿瘤生长，提示该前药通过增强声动力免疫治疗，可有效治疗深部肿瘤。 图17. NAP（77）的近红外触发激活机制示意图，实现肿瘤组织内的时空可控释放，转载自参考文献120。版权所有 2023 美国化学会。 图18. RT-PROTAC的优势，及RT-PROTAC释放活性PROAC的反应过程 图19. (A) 纳米沉淀法构建NP Ce6+PRO的示意图；(B) NP Ce6+PRO通过增强免疫原性细胞死亡强化声动力免疫治疗、在胰腺癌原位模型中发挥作用的机制示意图，转载自参考文献122。版权所有 2024 美国化学会。4.2 肿瘤微环境响应型PROTAC4.2.1 缺氧激活PROTAC 由于癌细胞持续增殖，缺氧是实体瘤的共同特征，可促进多种致癌蛋白（如HIF、VEGFR、EGFR）上调，加剧肿瘤耐药，提高肿瘤细胞存活率。 缺氧条件通常伴随着硝基还原酶（NTR）表达升高——这种酶在实体瘤缺氧区域高表达，而在正常组织与细胞中含量极低或不存在。因此，肿瘤缺氧微环境为设计掺入缺氧激活离去基团（HALG，如硝基芳香/杂环基团、醌类）的前药提供了良好基础。 在肿瘤缺氧条件下激活时，HALG从母核骨架上断裂，经电子转移与后续分子重排释放活性化合物，赋予选择性抗肿瘤活性。该策略此前已被用于开发多种抑制剂，包括HDAC、Chk1、DNA-PK抑制剂等。其中部分已进入临床试验，包括泛HER抑制剂他洛昔替尼、氮芥类烷化剂TH-302、DNA烷化剂CP-506。 鉴于肿瘤缺氧的固有特征，Zhang课题组于2021年率先设计了缺氧激活PROTAC（简称“ha-PROTAC”）：将缺氧激活离去基团（(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基与4-硝基苄基）引入靶向EGFR的PROTAC骨架中（图20A、20B）。 在合成的分子中，ha-PROTAC 81在HCC4006细胞中对EGFRDel19表现出优异的缺氧选择性降解活性，常氧条件下几乎无活性。4-硝基苄基作为缺氧响应笼蔽基团，在前药形式下可使EGFRDel19的结合亲和力降低1000倍以上。 经缺氧激活后，硝基还原酶介导的生物还原断裂该笼蔽基团，恢复强效PROTAC活性，体外酶实验验证了这一点。 随后，他们将HALG引入CRBN的配体中，合成了另外两种ha-PROTAC：82与83。与此前在靶蛋白配体上引入笼蔽基团的研究相比，在E3连接酶配体上引入的适用范围更广。 两种化合物均可在肿瘤缺氧条件下有效、选择性地降解EGFRDel19；其中化合物83的选择性更佳——在常氧条件下的所有测试浓度中，几乎不引起EGFRDel19降解。此外，该化合物在缺氧条件下对细胞活力、迁移的抑制作用更强，凋亡诱导效应更显著。 同期，受硝基咪唑的NTR响应特性启发，Zhu课题组将硝基咪唑基团引入靶向EGFR的PROTAC，构建了NTR响应型PROTAC 84（图20C、20D）。 化合物84在正常组织中无活性，抗肿瘤作用可忽略，且检测不到蛋白降解；但在过表达NTR的缺氧肿瘤组织中，可被选择性激活释放活性PROTAC，从而实现肿瘤组织中EGFR蛋白的选择性降解。 近期，Conway课题组报道了新型吲哚醌（IQ）缺氧激活基团，有望适用于所有PROTAC（图20E）。他们将该生物还原基团连接至PROTAC的VHL或CRBN招募配体的关键功能位点。 缺氧条件下，该基团可被生物还原，释放活性PROTAC，实现BRD4的选择性降解。与此前报道的1-甲基-2-硝基咪唑衍生物（NI-VHL与NI-CRBN）相比，基于吲哚醌的HAP-TAC IQ-VHL（85）与IQ-CRBN（86）可在缺氧中选择性释放活性PROTAC——酶促生物还原实验证实了这一点，且常氧条件下释放量可忽略，表现出良好的选择性特征。 同时研究者也指出，4-硝基苄基不适合构建缺氧激活PROTAC。与酶实验结果一致，细胞实验显示IQ-VHL与IQ-CRBN在降解BRD4方面具有更强的缺氧选择性。 超越单刺激激活，Thayumanavan课题组提出了基于布尔逻辑的双作用仅激活PROTAC（DAO-PROTAC）：仅在同时暴露于两种正交疾病特异性刺激时才激活，从而提高特异性、最小化毒性（图21）。 与单笼蔽PROTAC仍可结合靶蛋白或E3连接酶、进而引发下游细胞毒性不同，DAO-PROTAC可有效减轻这些效应。该研究选择缺氧与组织蛋白酶L（Cath-L）作为激活触发因素（二者均与肿瘤相关），并以靶向BRD4的PROTAC dBET1为例验证DAO原理。 缺氧可激活修饰通过在JQ1附近引入4-硝基苄基实现；而沙利度胺一侧引入可被Cath-L断裂的ε-乙酰化N-Boc赖氨酸基团。Cath-L断裂N-Boc赖氨酸C端的酰胺键，触发自 immolation级联反应，恢复沙利度胺端的仲酰胺。同时，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）启动ε-乙酰-N-Boc赖氨酸向N-Boc赖氨酸的转化，确保胞内激活。 与预期一致，同时接受缺氧与Cath-L双重刺激后，DAO-dBET1降解BRD4的DC50为277 nM，与未修饰的dBET1（DC50=158 nM）在MDA-MB-231细胞中处理24小时后的活性相当。 在活力实验中，同时具备缺氧与Cath-L触发条件时，DAO-dBET1（87）的IC50为281 nM，与dBET1（IC50=167 nM）接近。更重要的是，DAO-dBET1在Cath-L水平低的健康HEK-293细胞中安全性显著更高——浓度高达1 μM时仍未出现明显的BRD4降解。 综上，DAO-PROTAC被证实是下一代精准降解剂疗法的 promising 基础。 图20. 缺氧激活PROTAC的化学结构(A, B) ha-PROTAC 82与83的化学结构。(C) 硝基还原酶激活PROTAC的机制示意图。(D) 硝基还原酶激活PROTAC 84的化学结构。(E) HAP-TAC 85与86的化学结构。 图21. DAO-PROTAC经缺氧与组织蛋白酶L双重响应激活、生成功能性PROTAC的机制示意图4.2.2 ROS激活PROTAC 活性氧（ROS，如超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基）在正常生理中处于基础水平，但在肿瘤微环境中显著升高（尤其是癌细胞中H2O2浓度可达100 μM），驱动癌症发生与进展。 因此，大量ROS响应型前药与探针被成功开发，它们对癌细胞具有抗增殖活性，而对正常细胞毒性较低。 基于这些发现，Chen课题组首次报道了ROS激活的前体PROTAC：将芳基硼酸基团引入靶向BRD的PROTAC中（图22）。在合成的化合物中，前体PROTAC 93在高ROS的T47D细胞中可高效降解BRD3，而在低ROS的293T细胞中无明显降解。 与其降解活性一致，该化合物对肿瘤细胞的细胞毒性显著高于正常细胞。这些结果凸显了利用内源性ROS微环境实现PROTAC精准激活的潜力。 在Sun课题组的另一项研究中，他们通过碳酸酯键，将芳基硼酸笼蔽基团连接至靶向BRD4的PROTAC的VHL配体羟基上，构建了H2O2诱导型PROTAC前体94（图22）。 同样地，他们证实化合物94在富H2O2的癌细胞中，比缺H2O2的正常细胞更高效地降解BRD4，细胞毒性也更强。 有趣的是，Wang课题组报道了NAD(P)H醌脱氢酶1（NQO1）调控的级联反应，可放大并区分癌细胞内环境，激活前体PROTAC（图22）。 β-拉帕醌被NQO1还原后，可在活细胞内产生大量ROS，可用于激活ROS响应型PROTAC。受此概念启发，他们设计了ROS触发的BRD4靶向PROTAC（95）——用芳基硼酸酯基团笼蔽活性降解剂，该基团可被ROS断裂。 仅在NQO1过表达且同时存在β-拉帕醌的条件下，ROS-BRD-PROTAC才会激活并释放BRD-PROTAC（96），高效降解BRD4，从而提高细胞选择性。 图22. ROS激活PROTAC的化学结构4.2.3 GSH激活PROTAC 为抵消升高的氧化应激，癌细胞通常含有高水平的抗氧化剂。作为主要的ROS清除剂，癌细胞中的谷胱甘肽（GSH）水平（0.5-10 mM）显著高于正常细胞，因此可作为激活PROTAC前体的内源性刺激，从而降低PROTAC的潜在脱组织效应。 受此启发，Sun课题组开发了一系列GSH响应型PROTAC前体：将不同的硝基苯磺酰基（吸电子取代基如-F、-NO2，可提高对GSH的敏感性），连接至对应BRD4靶向PROTAC（97）、ERα靶向PROTAC（GSH-ER-P1，98）、SMARCA2/4靶向PROTAC（99）的VHL配体或靶蛋白配体的羟基上（图23）。 与假设一致，这些前体在GSH水平较低的正常细胞中既无生物活性也无细胞毒性，但可被内源性GSH选择性激活，在富GSH的癌细胞中释放活性PROTAC，降解对应靶蛋白，从而最大程度降低对正常细胞的不良反应。 图23. GSH激活PROTAC 97−99的化学结构4.3 靶向降解的正交PROTAC 生物正交激活前药策略，为药物的精准递送与非生物激活提供了另一种有前景的途径。 鉴于四嗪（Tz）与反式环辛烯（TCO）的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应，具有快速反应动力学、优异的生物正交性与生物相容性，Wang课题组将TCO基团引入PROTAC ARV-771（102），构建了生物正交PROTAC前药TCO-ARV-771（100，图24A、24B）。 αvβ3整合素在特定癌细胞表面高表达，已被广泛用于肿瘤成像、诊断与靶向给药，实现癌细胞特异性激活。受此启发，他们将Tz基团通过PhMeTz连接子（兼顾稳定性与反应性，且制备简便）与αvβ3整合素结合配体c(RGDyK)偶联，实现TCO笼蔽的PROTAC前药在癌细胞内的选择性激活。 与预期一致，仅在同时存在TCO-ARV-771与c(RGDyK)-Tz（101）时，才能实现高效的BRD4蛋白降解。由于正常细胞中不存在αvβ3整合素介导的c(RGDyK)-Tz，无活性的PROTAC前药TCO-ARV-771仅在癌细胞中激活，为肿瘤中靶蛋白的选择性降解提供了新途径。 在另一项研究中，Xing课题组报道了一种由肿瘤微环境响应酶激活的可点击PROTAC平台（简称ENCTAC），以最大程度减少非特异性靶向与潜在毒性（图24C）。 经修饰的CRBN配体泊马度胺（104，Y952），被接上短肽Ac-Val-Cit-Cys(StBu)-OH——该肽可被肿瘤过表达的组织蛋白酶B（CTSB）断裂，释放半胱氨酸上的游离1,2-氨基硫醇基团。该基团可与2-氰基苯并噻唑（CBT）修饰的BRD4配体JQ1（105，J558）发生反应，在肿瘤区域局部生成双功能降解剂Y1106（106）。 因此，Y1106在4T1肿瘤细胞中表现出靶蛋白的选择性降解，而在HEK-293T正常细胞中未检测到明显降解，凸显了可点击片段相比传统PROTAC，可增强肿瘤靶向选择性。 图24. (A) 靶向αvβ3整合素的c(RGDyK)-Tz在肿瘤细胞中生物正交激活并释放TCO-PROTAC前药的示意图；(B) TCO-ARV-771（102）与c(RGDyK)-Tz的结构，及二者通过“点击释放”反应释放活化ARV-771的过程；(C) 组织蛋白酶B酶切触发Y952与J558片段原位生成Y1106降解剂的反应示意图5. 结论与展望 近年来，靶向蛋白降解（TPD）已成为药物发现领域的颠覆性范式，为通过泛素-蛋白酶体系统和/或自噬-溶酶体系统清除疾病相关蛋白提供了创新方案。 在已开发的多种降解平台中，PROTAC因其独特机制（事件驱动药理学、亚化学计量浓度下的催化机制）与简洁的分子设计，尤其受到关注。这些特性使PROTAC能够应对耐药、靶向传统不可成药蛋白、通过三元复合物形成提高选择性等核心挑战。 PROTAC依赖劫持E3连接酶实现胞内蛋白的选择性降解。当前PROTAC开发仍主要依赖少数几种E3连接酶，其中CRBN与VHL占已报道PROTAC降解剂的90%以上。 这一现状会引发新的问题，包括耐药性产生、降解效率不佳、以及因特定细胞/组织中E3连接酶的共定位、表达水平或突变导致的毒性。 在此背景下，越来越多的研究致力于发现新型配体、表征未被探索的E3泛素连接酶，以拓展新型PROTAC的工具箱，包括但不限于CRL4DCAF、CRL2FEM1B、CRL2KLHDC2、CRL3KEAP1等。 目前，尽管有限的研究尚无法明确哪种E3连接酶的治疗潜力最广，但利用这些新发掘酶的PROTAC，与基于CRBN或VHL的PROTAC一样，都具有明显的细胞类型选择性，且对连接子的组成与长度高度敏感。 尽管如此，这些发现仍极大拓宽了E3连接酶工具箱，为未来的靶向蛋白降解研究赋能。表型筛选与基于CRISPR的筛选方法，在发现与验证新型连接酶方面已被证实非常有效。 同时，化学蛋白质组学——尤其是活性蛋白谱（ABPP）——可用于鉴定共价配体招募的E3连接酶，并定位其结合位点。然而，化学蛋白质组学作为一种自下而上的方法，因小型亲电片段反应性广泛、非特异性强，仍面临挑战。 目前已报道的新型E3泛素连接酶配体，大多为共价、不可逆类型。尽管它们在促进三元复合物组装方面具有优势，但这些不可逆弹头也可能带来挑战，尤其是选择性下降与催化优势丧失。 相比之下，开发高效、高选择性的非共价或可逆共价配体，是克服共价PROTAC固有催化效率不足的可行策略。 值得注意的是，目前新兴E3连接酶在PROTAC开发中的探索，高度集中于BET家族蛋白，尤其是对降解高度敏感的BRD4。因此，未来的研究应在更多非BRD4靶标上进行验证，以证明这些潜在可成药E3连接酶的广谱适用性。 同时，招募可与多种E3连接酶相互作用的分子伴侣（如HSP90、HSP70），为避免E3连接酶与底物错配提供了另一种策略。 PROTAC临床转化的另一大障碍，是正常组织中“靶内但脱组织”降解引发的全身毒性。因此，大量研究致力于开发PROTAC前药，通过外源刺激（如光、声）与肿瘤微环境（如缺氧、ROS、GSH、酶、原位生物正交反应）实现精准的刺激响应激活。 这些条件激活型PROTAC可实现肿瘤内靶蛋白的精准降解，从而提升安全性。但目前它们仍处于临床前研究阶段。 事实上，前药策略也面临一些挑战。例如，引入掩蔽基团会导致分子过大，进一步损害前药在生物系统中的细胞穿透能力与生物利用度。此外，前药的稳定性、生物正交反应的体内效率，也都需要纳入考量。 如前所述，成功的PROTAC项目需要优化众多参数，包括靶蛋白与E3连接酶的合适配体选择、连接子连接位点、连接子本身的结构与理化性质（如长度、组成、刚性、几何构型、极性）等。 由于计算建模在PROTAC理性设计方面仍有局限，构效关系的探索目前仍以经验为主，导致化合物合成难度大，需要投入大量时间与资源。 为应对这些挑战，“直接生物学（Direct-to-Biology, D2B）”方法近期兴起——将高通量合成与粗品化合物的生物测试结合，无需纯化即可加速高效PROTAC的发现。 尽管存在板间产物转化率不一、微量杂质可能干扰生物检测等固有局限，但D2B方法在初步筛选与苗头验证中仍极具吸引力。类似地，其他高通量PROTAC合成与筛选平台还包括“preTACs-cytoblot”与“Auto-RapTAC”。 此外，实验PROTAC数据的不断积累，为人工智能（AI）与机器学习（ML）方法的应用提供了宝贵基础，有望成为加速发现高效PROTAC的有力手段。 泛素-蛋白酶体系统是一个复杂网络，目前已报道的PROTAC主要通过结合E3泛素连接酶的底物受体，招募E3连接酶复合物触发靶蛋白降解。 E3底物受体的局限性，促使靶向蛋白降解领域的研究者探索更多招募蛋白进入泛素-蛋白酶体系统的策略——不局限于E3底物受体，尽管这些研究仍处于起步阶段： 有研究表明，招募CUL4衔接蛋白DDB1也可用于开发PROTAC，有效触发靶蛋白降解； 部分研究披露了BE2D等E2泛素结合酶用于PROTAC开发的潜力； 尽管泛素化介导的降解过程复杂，已有少数研究者尝试开发不依赖泛素的PROTAC——直接招募蛋白酶体或蛋白酶体相关蛋白，绕开泛素化通路。 综上，除底物受体外，发现靶向泛素-蛋白酶体系统其他关键组分（如E2、底物衔接蛋白（SKP1、DDB1等）、蛋白酶体相关蛋白）的招募元件，可为PROTAC设计开辟新途径，拓宽靶向蛋白降解的格局。 但从目前报道的结果来看，拓展E3泛素连接酶工具箱、发现高效配体，仍需大量工作以进一步推动基于PROTAC的靶向蛋白降解技术发展。往期文章推荐 2026最新有机和药化期刊影响因子汇总 Chemical.Reviews，Buchwald–Hartwig 反应中的金属–氮杂环卡宾配合物的综述 Nature Reviews Drug Discovery  《迈向mRNA疗法2.0》综述翻译与解析 Alessio Ciulli 团队在Chemical Reviews的PROTAC综述全解析 2026.6 降解类BIOTECH管线整理（三） 2026.6 BIOTECH管线整理（二）ADC 2026.6 降解类Biotech管线整理（一） 高光与质疑并存：站在 ASCO 之巅的夏瑜，和康方的未竟之战 朱忠远：从投出半个医药圈，到自己跑出一个ADC的IPO JMC综述-基于喹啉骨架的抗疟药物发现与开发进展

第一章 靶点概述与生物学基础 1靶点身份卡 字段 EGFR (HER1) HER3 (ErbB3) UniProt ID P00533 P21860 蛋白类型 受体酪氨酸激酶 受体酪氨酸激酶 假激酶 分子量 ~170 kDa ~145-150 kDa 跨膜次数 1次 1次 关键配体 EGF, TGFA, AREG, HBEGF NRG1, NRG2, NRG3 组织表达 上皮组织广泛表达 上皮组织、脑组织 🔬 核心差异：EGFR是具有完整激酶活性的经典受体酪氨酸激酶，而HER3因关键催化残基突变而丧失激酶活性，必须通过与HER2形成异源二聚体才能传递信号。这一独特结构决定了HER3无法被传统ATP竞争性小分子直接靶向，必须依赖抗体、ADC、双抗或蛋白降解等新策略。信号通路网络 疾病关联NSCLC（非小细胞肺癌） ：EGFR突变率40-50%（东亚），是最大适应症TNBC（三阴性乳腺癌） ：EGFR过表达率达80-90%ESCC（食管鳞癌） ：中国高发癌种，BL-B01D1关键适应症NRG1融合阳性实体瘤 ：NSCLC和胰腺癌中1-3%频率胶质母细胞瘤 ：EGFR扩增/mVIII突变发生率40-60%HNSCC（头颈鳞癌） ：EGFR标志性过表达第二章 结构信息与可靶向性评估 2EGFR 晶体结构库（PDB） PDB ID 配体 关键特征 3NJP Gefitinib 第一代TKI结合态 4HJO Erlotinib 厄洛替尼结合非活化构象（突破性的柔性环捕获） 4L1Y Afatinib 第二代TKI不可逆共价结合结构 5AMB Osimertinib 第三代TKI结合T790M突变体 6LUD CH7233163 第四代TKI结合Del19/T790M/C797S三重突变 6Z4B Osimertinib + Mavelertinib 第三突变体共结晶结构 300+ EGFR相关PDB结构 分辨率最高1.20ÅEGFR激酶结构域结合口袋 EGFR TKD的结合口袋位于ATP结合位点，是一个典型的深疏水口袋，体积约~700 ų。不同代际TKI通过不同策略占据该口袋：第一代（吉非替尼/厄洛替尼） ：可逆占据ATP口袋，通过氢键与D776、V769等关键残基结合第二代（阿法替尼/达可替尼） ：在ATP结合基础上增加丙烯酰胺共价基团，与C797形成不可逆共价键第三代（奥希替尼） ：哌啶环巧妙覆盖T790M突变引入的侧链体积增大效应第四代（在研） ：特异性靶向C797S顺式三重突变体，设计难度极大 ⚠️ HER3的挑战：HER3的TKD因催化环中关键残基D1078替代了谷氨酸而丧失激酶活性，ATP竞争性小分子无法直接靶向。这意味着HER3必须通过抗体/ADC、双特异性分子、或蛋白降解（PROTAC/分子胶水）策略来实现"成药"。CRO Assay 可及性评估 第三章 适应症与市场分析 3核心适应症矩阵 适应症 EGFR-TKI策略 EGFR×HER3双靶策略 市场规模NSCLC 奥希替尼一线标准（FLAURA）已上市 U3-1402后线三线BL-B01D1拓展适应症 全球最大，EGFR突变占40-50%（东亚）TNBC EGFR-TKI效果有限 BL-B01D1 Phase 3成功NDA已受理 三阴乳腺癌约占所有乳腺癌的15-20%ESCC 缺乏标准靶向方案 BL-B01D1 Phase 3双终点阳性首次中国主导 中国占全球约50%病例NRG1融合+ - Zenocutuzumab (FDA加速批准)2024.12获批 罕见但高度依赖HER3EGFR抑制剂全球市场 🎯 HER3靶向治疗作为新兴赛道，预计2030年将达到30-50亿美元市场规模，主要驱动力来自ADC和双特异性抗体的临床转化，以及NRG1融合阳性肿瘤的精准医疗突破。第四章 竞争格局与差异化策略 4核心竞争药物矩阵 药物 类型 公司 阶段 关键适应症Osimertinib EGFR-TKI三代 AstraZeneca已上市 EGFR突变NSCLCBL-B01D1iza-bren EGFR×HER3双抗ADC 百利天恒↕ BMSNDA受理 TNBC, ESCCZenocutuzumabMCLA-128 HER2×HER3双抗 AbbVieFDA批准 NRG1融合+ NSCLCU3-1402patritumab deruxtecan HER3 ADC (DXd) Daiichi SankyoIII期 EGFR-TKI耐药NSCLCJSKN016 TROP2/HER3双抗ADC 康宁杰瑞I期 HER2阴性乳腺癌里程碑时间线 2002 吉非替尼(Iressa)首次获批，开启EGFR-TKI时代 2013 阿法替尼(Gilotrif)获批，第二代不可逆TKI 2015 奥希替尼(Tagrisso)获批，第三代TKI改变NSCLC治疗格局 2023.12 百利天恒以$8.4亿授权BL-B01D1给BMS，创中国ADC单品种出海纪录 2024.07 沈琳团队Nature Medicine发表BL-B01D1在ESCC中II期数据 2024.12 Zenocutuzumab获FDA加速批准，首个NRG1融合阳性实体瘤治疗药物 2025.05 ASCO 2026：BL-B01D1 TNBC III期 + ESCC III期 双口头报告 2026.06 BL-B01D1针对TNBC的上市申请获CDE受理BL-B01D1 (iza-bren) 深度点评 核心设计：基于SI-B001双特异性抗体（同时结合EGFR和HER3胞外域）偶联自研拓扑异构酶I抑制剂Ed-04（喜树酮衍生物）和可裂解四肽连接子。 差异化亮点：双靶点"协同占领"策略——即使肿瘤细胞下调某一靶点表达，抗体仍可通过另一靶点完成内吞和毒素递送，从机制上降低单靶点逃逸耐药风险。 ESCC II期数据：ORR达61%，中位PFS 8.2个月，2025年7月发表于《Nature Medicine》。 NDA受理依据：PANKU-Breast02 III期研究实现PFS和OS双主要终点阳性。差异化策略四维分析 第五章 专利态势与安全策略 5专利格局与拥挤度EGFR-TKI 拥挤度 8/10 一代/二代专利已到期，仿制药涌入；三代奥希替尼核心专利约2030年到期；第四代和PROTAC仍有空白窗口双抗/ADC 拥挤度 6/10 BL-B01D1/百利天恒构建了较完整的专利护城河；HER3 ADC赛道有多家追赶者，但EGFR×HER3方向仍有差异化空间安全性评估 On-target毒性（EGFR-TKI）：痤疮样皮疹（60-80%，3级约5-10%）+ 腹泻（30-50%）。奥希替尼的毒性发生率低于一代/二代。值得注意的是，皮疹严重程度与临床获益呈正相关，可作为潜在的药效生物标志物。 ADC特殊风险：U3-1402的剂量限制性毒性为间质性肺病/肺炎(ILD)，这是DXd毒素类的class effect，需要在临床试验设计中设置严格的ILD监测和管理预案。 KO表型参考：EGFR敲除小鼠存活但皮肤/毛发异常；HER3敲除小鼠存活但感觉神经发育缺陷——提示临床上HER3靶向治疗需要关注神经系统不良反应风险。第六章 前沿动态与策略建议 6前沿研究方向EGFR PROTAC降解剂 ：HJM-561等分子在临床前阶段展现出对抗第三代TKI耐药株（T790M+C797S）的活性。与TKI不同，PROTAC不依赖于精确识别激酶域突变，通过泛素化-蛋白酶体途径彻底清除靶蛋白分子胶水（Molecular Glue） ：2024年《Oncogene》报道首个EGFR分子胶水（CDDO-Me），开辟了"无需两个binding arm即可诱导降解"的新范式第四代EGFR-TKI ：特异性靶向C797S顺式三重突变体（Del19+T790M+C797S），如Merus/Amgen的MAZ1/MAZ51、Scholar Rock的SRx-202等NRG1融合精准治疗 ：Zenocutuzumab（2024.12 FDA批准）和Seribantumab（II期）开启了基于生物标志物筛选的HER3靶向治疗新纪元EGFR×HER3双抗ADC拓展 ：BL-B01D1正在向胃癌、头颈鳞癌等癌种扩展，百利天恒已提交第三项NDA申请（NSCLC线后治疗）耐药机制全景 研究表明，约57-67%的EGFR突变患者在TKI治疗后出现HER3表达上调，这是HER3靶向ADC在后线治疗中大放异彩的根本原因。其他耐药机制包括： 7SWOT综合分析 8差异化立项建议 ★★★★★ 强烈推荐策略一（首选）：EGFR×HER3双抗ADC的Next-generation 在BL-B01D1基础上优化linker-payload设计（如采用更稳定的不可裂解linker或新毒素如PBD二聚体），或提升双抗结合亲和力/内吞效率。瞄准BL-B01D1尚未覆盖的适应症（胃癌、头颈鳞癌、NSCLC后线治疗）推进临床。 ★★★★☆ 高推荐策略二（中长期）：第四代EGFR-TKI 或 EGFR PROTAC 这是解决奥希替尼耐药（C797S突变）的根本性策略，市场空间可达数万EGFR突变NSCLC患者。PROTAC路线的优势在于不依赖于精确激酶域突变识别，通过泛素化-蛋白酶体途径直接清除EGFR野生型和突变体蛋白。 ★★★☆☆ 中推荐策略三：NRG1/HER3轴伴随诊断开发 Zenocutuzumab、U3-1402及未来所有HER3靶向分子都需要NRG1融合状态和HER3表达水平检测。开发NGS Panel或FISH检测试剂盒本身也具有独立的诊断试剂商业价值。关键里程碑时间线 M1（0-6月） 确定先导分子 scaffold（双抗/ADC/小分子/PROTAC），完成体外结合和功能 assay 验证 M2（6-12月） Lead optimization，完成PK/PD和GLP毒理预实验 M3（12-18月） IND-enabling studies（GLP毒理、CMC放大） M4（18-24月） 提交IND申请，启动Phase 1临床试验 9高引文献推荐 1 Emerging importance of HER3 in tumorigenesis and targeted therapy Nat Rev Clin Oncol, 2025 · HER3生物学和靶向治疗最权威的年度综述 · 全面覆盖HER3结构、信号通路、耐药机制和靶向策略 2 A bispecific antibody–drug conjugate targeting EGFR and HER3 in metastatic esophageal squamous cell carcinoma Nat Med, 2025 (沈琳团队) · BL-B01D1首次人体临床数据 · ORR 61%，中位PFS 8.2个月 3 BL-B01D1 (iza-bren) in locally advanced/metastatic solid tumours Lancet Oncol, 2024 · BL-B01D1首次人体试验Phase 1结果 · 确立安全性和初步抗肿瘤活性 4 HER3 signaling and targeted therapy in cancer PtPMc, 2018 · 经典综述 · >200次引用 · HER3信号网络和靶向治疗策略的系统性梳理 5 Small Molecule EGFR Inhibitors as Anti-Cancer Agents: Discovery, Mechanisms, and Opportunities Int J Mol Sci, 2023 · >100次引用 · EGFR-TKI从发现到耐药机制的全景综述 6 Discovery of a molecular glue for EGFR degradation Oncogene, 2024 · 首个EGFR分子胶水CDDO-Me的发现 · 开辟EGFR降解研究新方向 7 Overcoming EGFR mutation resistance: dual inhibition strategies using TKIs Eur J Med Chem, 2025 · 双靶点小分子抑制策略克服EGFR耐药的全面分析 · 指导第四代/双靶点TKI设计 ★靶点价值综合评分 强烈推荐立项，优先考虑EGFR×HER3双抗ADC Next-gen 和 PROTAC降解方向 数据截止：2026年6月20日 数据来源：UniProt · RCSB PDB · ClinicalTrials.gov · PubMed · ASCO 2026 · AACR 2026 · NMPA/CDE · FDA ⚠️ 本报告仅供药物研发决策参考，不构成投资建议。所有临床和商业数据来源于公开渠道。