Sonolisib

本文系统评述了共价药物发现领域的突破性进展：成功开发出超越传统半胱氨酸靶向的新型共价弹头，能够精准、不可逆地修饰蛋白质中更为丰富的酪氨酸与赖氨酸残基。该策略极大拓展了可靶向的蛋白质组范围，为干预“不可成药”靶点（如蛋白-蛋白相互作用界面）提供了全新工具与理论框架，开辟了针对难治性疾病的新药研发路径。 题目： 超越半胱氨酸的共价配体和药物发现进展 摘要： 靶向难以处理的蛋白质仍然是药物发现中的一个关键挑战，因为这些蛋白质通常缺乏明确的结合口袋或拥有传统药物设计不易解决的浅表表面。共价化学已成为一种强大的解决方案，用于触及难以配体区域的蛋白质位点。通过利用基于活性的蛋白质分析（ABPP）和LC-MS/MS技术，学术界和工业界已经鉴定出半胱氨酸反应性配体，这些配体能够选择性靶向具有挑战性的蛋白质位点，以调节以前无法触及的生物学通路。然而，蛋白质中的半胱氨酸含量稀少，开发靶向其他残基的共价配体对于进一步扩展可配体蛋白质组具有巨大前景。本评述重点介绍了在靶向超越半胱氨酸结合的氨基酸方面的最新进展，重点介绍了酪氨酸和赖氨酸导向的共价配体及其在化学生物学和治疗开发中的应用。我们概述了使用化学蛋白质组学方法开发共价配体的过程，重点介绍了最近成功的例子，并讨论了对未来扩展到蛋白质上其他氨基酸位点的考虑。 引言： 共价药物发现的进展缓解了长期存在的污名，即亲电化合物由于其生物系统中的混杂反应性而导致不良药物事件，从而限制了其临床应用。最近FDA对Sotorasib（Amgen, 2021）的批准强调了共价化学在为难治性蛋白类别开发高度靶向疗法方面的效用。Sotorasib在其KRAS靶向支架中策略性地加入了一个丙烯酰胺部分，使其能够与突变半胱氨酸残基反应，并通过竞争性抑制GTP结合将KRAS G12C锁定在其非活性状态。可逆的KRAS抑制剂已被证明无效，因为GTP和GDP的细胞内浓度高（亚毫摩尔范围）且在生理条件下它们对KRAS具有强亲和力，这在历史上使得KRAS成为“不可成药”的靶点。然而，共价化合物通过靶向可逆配体认为不可成药的位点来弥合这一差距，从而解决药物化学中关键但具有挑战性的靶点，并通过氨基酸选择性的亲电试剂提高靶点特异性来推进精准医疗。 此外，共价化合物的选择性可以使用ABPP进行全局评估和风险降低，ABPP通过化学蛋白质组学结合串联液相色谱/质谱法（LC-MS/MS）定量分析整个蛋白质组中的靶向和非靶向相互作用。这种全蛋白质组范围的评估有助于进行构效关系（SAR）研究，以优化药物特性，并使用不可逆化合物探索新的或以前难以处理的靶点。此外，通过化学蛋白质组学鉴定结合位点为通过计算机研究优化小分子提供了宝贵的见解。 许多氨基酸选择性亲电试剂已被开发出来，包括用于半胱氨酸的碘乙酰胺（IA）和用于活性位点丝氨酸的氟膦酸盐。半胱氨酸因其高亲核性、在功能口袋中的定位以及已证实的与亲电配体的可配体性，已被广泛用于化学探针和药物发现。几种靶向半胱氨酸的共价配体已转化为药物，其中FDA批准的用于实体瘤的药物Sotorasib就是一个显著的例子。Rilectitinib（Pfizer, 2023）是用于非肿瘤适应症的靶向半胱氨酸共价药物的一个显著例子。这种用于斑秃的新型治疗剂与其他JAK亚型相比，对JAK2表现出卓越的选择性。Rilectitinib的高选择性主要归因于其能够与C909形成共价键，该残基独特地存在于JAK3中。有趣的是，这个半胱氨酸残基在TEC家族激酶中是保守的，使得Rilectitinib能够对JAK3和TEC家族成员发挥双重抑制作用。这种独特的双重作用机制，结合其不可逆结合特性，在选择性、和治疗效果方面提供了显著优势，特别是对于斑秃治疗。认识到其潜力，FDA于2023年批准Rilectitinib用于治疗12岁及以上患者的严重斑秃。 将亲电试剂靶向范围扩展到半胱氨酸之外的努力源于该残基在蛋白质中的低丰度（人类蛋白质组中氨基酸的1.7%）。靶向其他亲核氨基酸如酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的探针已有报道。与半胱氨酸相比，酪氨酸更为丰富（3.2%），并且最近已被基于砜的亲电试剂靶向，从而扩展了可配体蛋白质组。赖氨酸也因其在人类蛋白质中的丰度（6.0%）以及与其他残基相比相对较低的突变率而备受关注。这突显了赖氨酸反应性化学在揭示新生物学见解方面的潜力。 在本评述中，我们讨论了使用亲电小分子在细胞蛋白质组中共价靶向赖氨酸和酪氨酸残基的历史和近期进展（过去3年内）。涉及使用光、酶和过渡金属催化修饰的方法超出了本评述的范围，将不予涵盖。相反，我们引导读者参考以下全面的评述。 新型共价配体的开发 速率常数和键形成机制 酶抑制剂可以通过可逆或不可逆机制起作用，每种机制都具有不同的结合动力学和反应途径（图1）。可逆的非共价抑制剂通过单步反应形成瞬时的酶-抑制剂复合物 [P + L] 来抑制酶活性（图1A）。这种相互作用的终点由平衡状态定义，反映了抑制剂结合和解离之间的平衡。相比之下，不可逆抑制剂通过形成共价键实现完全的酶失活，使得解离可以忽略不计（图1B）。 与传统的快速结合抑制剂不同，一些抑制剂表现出时间依赖性或缓慢结合行为，其中稳态平衡或完全失活是逐渐发生的。这种现象在采用共价结合模式的抑制剂中尤其常见，因为共价加合物的形成不是一个瞬时过程。对于可逆共价抑制剂，结合过程涉及两个不同的步骤：初始的快速相互作用形成非共价酶-抑制剂 [P + L] 复合物，随后是一个较慢的步骤，形成共价 [P – L] 加合物。重要的是，由于可逆性质，共价 [P – L] 加合物与非共价 [P + L] 复合物保持平衡（图1D）。稳态抑制常数捕获了这种整体平衡。可逆共价抑制剂的优化通常侧重于通过降低解离速率来增强结合亲和力，因为较慢的解离速率和延长的停留时间与改善的治疗效果相关。 相比之下，不可逆抑制剂形成共价 [P - L] 加合物，这些加合物不会恢复到起始原料。这种不可逆机制改变了抑制剂效力的评估方式，因为诸如IC50之类的动力学参数可能因孵育时间而异。许多不可逆抑制剂遵循两步机制：初始的非共价相互作用形成 [P + L] 复合物，随后转变为共价 [P - L] 加合物。此类抑制剂的效力取决于其非共价结合亲和力（KI）和最大失活速率（Kinact）。比率Kinactt/KI 被广泛认为是两步不可逆抑制剂最可靠的效力衡量标准。 另一方面，高反应性化合物如硫醇烷基化剂可能完全绕过非共价中间体，直接一步结合（图1C）。对于一步机制，使用诸如Kchem 之类的参数来评估效力和效率。 开发可逆和不可逆共价抑制剂的策略可能有很大不同。对于可逆共价抑制剂，努力集中在优化整体亲和力和延长停留时间以增强治疗效果。另一方面，设计不可逆共价抑制剂需要在快速形成共价键与最小化对非预期蛋白质或内源性亲核试剂（如谷胱甘肽（GSH））的非靶向反应性之间取得平衡。KIit/Kinact 的临床相关范围必须考虑因素，例如目标氨基酸残基的亲核性以及内源性分子的竞争。 例如，Sotorasib 表现出Kinact值为 6.24×10−3 s−16.24×10−3s−1，和 KIi 值为 3.11×10−7 M3.11×10−7M，这足以开发为药物。通过理解这些不同的机制并优化关键参数，研究人员可以定制抑制剂设计，以实现所需的治疗效果，同时将不良反应降至最低。 Figure1: 蛋白质 [P] 与可逆/不可逆配体 [L] 之间结合机制的概述。 蛋白质-配体相互作用模式通常分为 (A) 一步可逆，(B) 两步不可逆，(C) 一步不可逆，和 (D) 两步共价可逆结合。Kon= 非共价可逆结合速率常数， Koff= 非共价可逆解离速率常数，Kincl= 最大潜在失活速率， Kchem= 单周转速率常数，Koncv= 共价可逆结合速率常数，Keffcov= 共价可逆解离速率常数 Kf= [P][L]/[P+L]；可逆结合的抑制常数。利用LC-MS/MS进行共价配体发现 ABPP与LC-MS/MS联用是开发广谱分析探针和残基导向共价抑制剂的有力工具。例如，使用半胱氨酸反应性共价探针（如脱硫生物素-碘乙酰胺（DBIA）和基于丙烯酰胺的配体）的竞争性ABPP代表了该领域中半胱氨酸共价靶向的成熟方法。这些探针直接包含报告标签或末端炔烃，后者通过点击化学（铜（I）催化的叠氮-炔环加成或CuAAC）与报告-N3试剂反应，用于修饰蛋白质位点的检测和定量。 基于活性的探针（ABPs）共价结合多种蛋白质，并用于ABPP（图2）。这种方法可以监测各种激活刺激下蛋白质结合活性的变化。在药物发现中，竞争性ABPP为药物化学家提供了宝贵的见解。首先，它能够在裂解液、细胞和动物中评估不可逆和可逆（在动力学控制条件下）配体对目标蛋白质的亲和力。传统的药物发现方法通常依赖高通量筛选（HTS）来识别蛋白质靶点的配体；然而，这些方法面临显著的限制，包括成本高、验证细胞中蛋白质靶向和非靶向结合的挑战，以及缺乏在没有先验生物学见解的情况下评估目标蛋白质活性的分析方法。 Figure2 (A) LC-MS/MS ABPP 及通过SILAC (B) 和TMT (C) 进行同位素标记的示意图概述。 总的来说，上述因素导致许多蛋白质被归类为不可成药。相比之下，LC-MS/MS有助于在整个蛋白质组中鉴定蛋白质及其修饰残基，选择性ABPs可作为功能评估的有效工具。因此，ABPP策略可以解决更广泛的蛋白质类别问题，并且在某些情况下，探针结合可以作为挑战性靶点的替代活性分析。 其次，ABPP提供了关于配体对目标蛋白质的选择性和效力的关键信息。诸如细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）、同位素标记的脱硫生物素叠氮化物（isoDTB）以及最近的串联质量标签（TMT）试剂等标记技术利用LC-MS/MS中的同位素标记策略来量化被ABPs修饰的肽段。这些方法与先进的数据分析软件（如SE-QUEST、Comet、MaxQuant和Byonic）相结合，在解读复杂的LC-MS/MS数据方面发挥着关键作用。这强调了在ABPP实验中有效标记策略和强大计算工具的双重重要性。此外，用潜在的共价结合剂进行预处理可以阻断探针结合，从而能够评估不可逆配体的结合亲和力。为了最大化蛋白质检测并最小化由不可逆配体引起的不可检测的非靶向效应，高反应性和残基导向的探针至关重要。IA亲电试剂是一种有效的硫醇烷基化剂，因此其炔基化探针作为通用的半胱氨酸反应性ABP非常有效。对应的ABPs开发起来更具挑战性，这也是为什么超越半胱氨酸的ABPP直到最近才出现的原因。 我们课题组和其他课题组用于通过ABPP开发用于蛋白质和共价配体发现的亲电基团的通用工作流程包括以下步骤：1）化学选择性ABP开发：开发具有可调谐亲电弹头的新型全局ABPs，并分析它们的结合活性，包括在蛋白质组中的氨基酸化学选择性。优先考虑简单性和高反应性，以最大化修饰蛋白质和结合位点的检测。过于复杂的ABP结构在分析过程中存在碎裂和LC兼容性差的风险，导致检测效率降低。2）使用片段亲电试剂和竞争性ABPP进行可配体性评估：构建包含亲电弹头的类片段化合物库，用于通过竞争性ABPP评估包含目标残基的蛋白质位点的可配体性。对配体和ABP设计使用共同的亲电试剂可以减少ABPs未检测到的配体位点遗漏的可能性。3）通过功能分析确定配体位点的优先级：通过基因和药理学扰动目标蛋白质位点来验证生物化学和细胞生物学效应。4）靶向共价调节剂的开发：将可配体性发现转化为高效力和选择性的工具化合物，用于目标蛋白质的细胞和体内评估。进行SAR研究以减少ABPP结果中识别的非靶向亲和力，并增强对目标蛋白质的效力。计算机对接研究或分子动力学模拟可以帮助微调靶向和非靶向的亲和力。此外，需要药代动力学优化以平衡固有反应性与水解和代谢稳定性。 我们课题组的一个例子是开发了一种包含磺酰基-唑（SufAz）弹头的PTGR2（Y100）共价抑制剂，这说明了该工作流程的实际应用（图3）。SufAz ABPs被设计为酪氨酸/赖氨酸选择性弹头，对半胱氨酸的可检测亲和力可忽略不计，我们推测这是由于预测的磺酰基硫脲（SO22-S）加合物固有的不稳定性所致。使用这些ABPs，定量ABPP方法被用来评估磺酰基-唑片段亲电试剂库对PTGR2失活的效力和选择性。在这些化合物中，HHS-0701脱颖而出，成为先导的PTGR2抑制剂，具有合理的全蛋白质组选择性和细胞活性。进一步的SAR研究表明，用咪唑离去基团交换三唑可以进一步提高对该类亲电试剂常见非靶标的选择性。 起源于药物发现中基于活性的蛋白质分析（ABPP）的概念框架，Kelly和Sharpless课题组引入了反向药物发现（IDD）方法。与通常使用广泛反应性探针的全局ABPs不同，IDD采用包含潜在亲电弹头（如芳基氟硫酸酯和硫酰胺氟化物）的炔基取代探针。这些探针用于评述对其自身活性或相应配体的活性进行生物学评估，化学修饰最小。由于它们对共价结合的固有反应性较弱，与使用全局ABPs相比，通过LC-MS/MS鉴定的缀合蛋白质数量有限。尽管化学结构的复杂性可能给蛋白质鉴定带来挑战，但这种策略在与适当选择的加合基团配对时，可以显著减少对意外非靶向效应的担忧。 此外，残基导向弹头的发展能够选择性靶向突变体，并解决与因开放结合位点而表现出短停留时间的可逆抑制剂相关的局限性。简单引入残基反应性弹头可以将可逆抑制剂转化为具有增强治疗潜力的不可逆抑制剂。 Figure3： ‘超越半胱氨酸’ ABPP 和蛋白质配体发现的示例工作流程。 可调谐亲电支架的部署能够无缝开发反应性探针和相应的片段化合物，分别用于化学选择性和可配体性评估。该方法与药物化学相结合，导致了RJG-3017的发现，这是一种源自先导命中化合物HHS-0701的脂质酶PTGR2的靶向共价抑制剂。 残基反应性支架 半胱氨酸反应性支架 对于药物开发，半胱氨酸是一个有吸引力的靶点，部分原因是其高亲核性和低丰度，这有助于提高对目标蛋白质的选择性。特别是，丙烯酰胺亲电基团已被广泛研究，并在临床上验证可用于开发共价药物。在基于丙烯酰胺的共价药物中，激酶是突出的靶点，因为能够在高度保守的ATP结合口袋内配体非保守半胱氨酸，从而开发更具选择性的药物化合物。例子包括Ibrutinib（Abbvie, 2013），它是一种丙烯酰胺抑制剂，结合Bruton酪氨酸激酶（BTK）的C481，以及一系列靶向表皮生长因子（EGFR）的C797以对抗T790M突变的共价抑制剂，如Afatinib（Boehringer Ingelheim, 2013）和Osimertinib（Astrazeneca, 2015）。 许多具有不同半胱氨酸反应性弹头的探针也被开发出来。除了IA之外，还开发了许多α-卤代酰胺和αβ-不饱和酰胺作为共价探针。此外，卤代杂芳族化合物，包括用于RNA结合蛋白的简单探针以及核苷和核碱基模拟物（例如，可点击的亲电嘌呤），与半胱氨酸发生亲核芳香取代（SNAr）。关于靶向半胱氨酸的更多信息，我们引导读者参考最近关于半胱氨酸反应性亲电试剂及其应用的评述。 靶向半胱氨酸的理由是明确的，但并非每个蛋白质口袋都含有可用的半胱氨酸，这促使人们探索能够配体半胱氨酸以外位点的亲电基团。在以下部分中，我们总结了在超越半胱氨酸靶向的亲电试剂开发方面的最新进展。我们最初关注赖氨酸靶向化学，因为赖氨酸的高丰度及其在蛋白质生物化学中的功能作用。我们以靶向酪氨酸的亲电试剂结束本评述，酪氨酸的丰度介于半胱氨酸和赖氨酸之间，并为破坏蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸识别提供了机会。 赖氨酸反应性支架 赖氨酸的生物学特征。 当赖氨酸作为游离氨基酸存在时，其ε-NH3+3+基团的pKaα为10.4，这意味着在生理条件下（pH = 7.4），大多数赖氨酸残基是质子化的。然而，赖氨酸的pKa可能因其在蛋白质中的位置而有显著差异。例如，研究表明，埋藏与溶剂暴露的赖氨酸侧链的pKa降低了5个对数单位，从而增加了其亲核性和亲电修饰的倾向。Garcia-Moreno等人产生了25个葡萄球菌核酸酶（SNase）变体，以分析基于其环境的赖氨酸侧链pKa变化。K92（I92K）突变体的侧链埋藏在SNase中，计算得出其pKa为5.2，而溶剂暴露的N118K的pKa为10.4（图4A）。 赖氨酸经历各种PTMs，这些修饰在细胞生物学中起着关键作用，包括信号转导（图4B）。使用质谱法已绘制了超过10,000个蛋白质上超过100,000个赖氨酸PTM位点；然而，许多PTM的功能仍然不清楚。赖氨酸上的PTMs包括与各种酰基底物的酰基取代（例如，乙酰化、泛素化）或由甲基转移酶介导的烷基化（例如，甲基化、二甲基化或三甲基化）。赖氨酸的亲核性与PTM（如乙酰化）的频率相关。 赖氨酸也易于氧化脱氨生成醛，这在组蛋白中已得到充分研究和常见观察。赖氨酸的氧化脱氨是由铜依赖性胺氧化酶（CAOs）介导的。 CAOs使用共价连接的醌辅因子2,4,5-三羟基苯丙氨酸醌（TPQ）或赖氨酸酪氨酰醌（LTQ）催化氧化胺化，将CAO家族细分为TPQ依赖性CAOs（即CAOs）或LTQ依赖性赖氨酰氧化酶（LOXs）。赖氨酸还可以通过羧化过程捕获二氧化碳，并通过氨基甲酰化捕获氰酸盐。特别是，赖氨酸上的许多PTM受到酶对（如组蛋白乙酰化酶（HACs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs））的可逆调节，取决于生理条件。由于上述功能重要性，有相当多的研究工作集中在开发能够在特定赖氨酸残基上执行PTM（如乙酰化）的分子。因此，如上所述，赖氨酸的共价修饰可能受其质子化状态以及与各种PTM相互作用的影响，使得赖氨酸成为共价修饰的一个有吸引力的残基。 Figure4 (A) 选定位点突变为赖氨酸的葡萄球菌核酸酶（SNase）晶体结构（使用Pymol生成），及其pKa值基于Garcia-Moreno等人已发表的工作。 (B) 在赖氨酸残基上发现的翻译后修饰（PTMs）示例。 赖氨酸靶向化学 天然赖氨酸靶向醛类及其模拟物  醛亚胺的形成常用于有机化学，例如流行的还原胺化反应，可得到伯胺、仲胺或叔胺。使用醛产生醛亚胺用于与蛋白质上赖氨酸生物缀合受到亚胺热力学不稳定性的限制，亚胺在水溶液中迅速恢复为其醛和胺前体。 在水性条件下稳定亚胺的努力受到B6维生素PL和PLP能力的启发，后者是必需维生素和活性B6维生素，能够与异生物质和生物分子中的胺缀合。该主题已被Eliot和Kirsch全面评述，因此此处仅涵盖近期文献。已知PLP可共价修饰各种蛋白质中的赖氨酸，这被丙氨酸消旋酶、天冬氨酸氨基转移酶、丝氨酸羟甲基转移酶、芳香族L-氨基酸脱羧酶和其他蛋白质利用以促进氨基酸的转化（图5A）。使用NMR，Crugeiras等人表征了在水溶液中胺缀合的吡哆醛中亚胺与邻羟基质子之间分子内氢键的强度约为3 kcal/mol（图5B）。 吡哆醛-胺分子内氢键比α-螺旋中的i+4氢键更稳定（约2 kcal/mol）。在大肠杆菌中，PLP以约1 nM的KD结合PLP稳态蛋白（PLPHP或YggS）中的K36，并且没有酶功能，表明PLPHP分别作为调节或PLP转移机制来调节PLP水平或介导PLP依赖性酶反应；然而，需要更多证据来定义PLPHP的作用。PLP结合蛋白质中赖氨酸的能力值得讨论与PLP相互作用导致维生素B6缺乏或治疗剂本身失活的含胺和肼的治疗剂。异烟肼（结核病的一线治疗）与PLP之间的相互作用是首批被研究的药物-PLP相互作用之一，原因是患者中诱导了异烟肼神经炎，即异烟肼干扰维生素B6代谢，通过与吡哆醇共同给药可以缓解。然而，异烟肼与其他代谢物和辅因子（如NAD+）的相互作用可能参与异烟肼相关的毒性问题。异烟肼-PLP缀合物的形成动力学与肼和其他含肼药物（如卡比多巴和肼屈嗪）相比是最快的，并且与每个肼部分中伯胺的pKa相关（例如，异烟肼（pKa = 11.10）> 肼（pKa = 8.10）> 卡比多巴（pKa = 7.25）> 肼屈嗪（pKa = 7.20））。卡比多巴用于治疗帕金森病，因为它通过抑制外周组织中的芳香族L-氨基酸脱羧酶（AAAD）来减轻多巴的降解，从而允许更多多巴到达大脑。在给予100 mg/kg卡比多巴的大鼠中观察到血清（88%）、肝脏（51%）、肌肉（18%）、大脑（27%）和下丘脑（18%）中PLP浓度的降低；然而，临床相关剂量，如10–30 mg/kg，在降低PLP浓度方面效果较差。与异烟肼类似，吡哆醇盐酸盐与卡比多巴共同给药可以减轻PLP水平的降低。除了上述例子，还有许多药物（例如，肼屈嗪、苯乙肼、环丝氨酸、青霉胺和苯丙胺）能够缀合PLP导致维生素B6缺乏（图5C）。Sieber及其同事合成了模拟PLP的ABPs（1-3）以检测PLP依赖性酶（PLP-DE），这些酶被吡哆醛激酶在磷酸化，并鉴定PLP-DE抑制剂（如D-环丝氨酸）的非靶标。非活性对照物4，缺乏PLP催化的电子能力，用于评估PL支架的非特异性反应性。使用ABPs（1-3），成功检测了真核细胞、革兰氏阳性菌和阴性菌的显著部分，并用于抗生素药物发现（图5D）。 Figure5 (A) 描述胺转移机制的示意图，从与吡哆醛磷酸（PLP）结合的天冬氨酸氨基转移酶（AAT）开始，以及PLP与AAT中K258结合的晶体结构（PDB ID: 1ARS）。 (B) B6维生素吡哆醛（PL）转化为活性PLP随后转化为PLP-治疗剂缀合物的示意图。亚胺的稳定性通过强分子内氢键（红色突出显示）增强。 (C) 已知与PLP缀合的治疗剂示例。 (D) 模拟PLP的ABPs的化学结构。PLP模拟ABP 1的结构异构体（4）被用作非活性对照。 类似地结Folkers等人发现，食用高水平味精（MSG）食物个体观察到的敏感性与血液中PLP水平降低有关。与安慰剂组相比，在饮食中共同施用MSG和PLP减轻了MSG相关毒性的症状，表明MSG与PLP结合，从而将其浓度降低到不健康的水平。 2014年，Wilde等人报道了肼屈嗪可以共价修饰双链和单链DNA中的脱碱基（Ap）位点，这些位点以环闭合的半缩醛（5）和环打开的醛（6）之间的平衡存在。肼屈嗪与醛（6）反应形成腙（7），后者可以进行环闭合产生半酰胺（8），一种容易出错且可能致突变的结构（图6A）。此外，醛糖自然与蛋白质或脂质形成晚期糖基化终末产物（AGEs）（图6B）。这些AGEs可以在血管壁中积聚，导致微血管和大血管并发症，并与各种衰老和酒精相关疾病有关。在衰老和高血糖条件下AGEs的形成，它们与细胞表面受体结合，增加活性氧（ROS），改变细胞外基质，修饰激素水平，并与其他蛋白质（如胶原蛋白）交联。蛋白质-醛糖生物缀合物是通过蛋白质上的赖氨酸或精氨酸残基与糖上的醛通过类似于上述机制的机制形成的。为了研究AGE形成的生物学事件，甲基乙二醛（MG），它是作为AGEs前体的主要反应性羰基物种，被用来开发用于化学蛋白质组学分析的ABP（图6C）。氨基胍是一种治疗剂，可共价修饰1,2-二羰基化合物，增加口服吸收的AGEs的尿排泄，并减少其在肾脏和肝脏中的积累。其他AGE相关治疗剂如ALT-946和吡哆胺遵循与氨基胍类似的机制，而ALT-711通过断裂1,2-二羰基之间的键起作用（图6D）。 Figure6  (A) 说明醛糖与肼屈嗪缩合形成稳定半酰胺的机理示意图。 (B) 描述通过蛋白质上赖氨酸残基与含1,2-二羰基的聚糖缩合自然合成晚期糖基化终末产物（AGEs）的反应示意图。 (C) 使用甲基乙二醛ABP分析代谢物和AGE蛋白质组。 (D) AGE相关治疗剂的化学结构。 合成醛弹头。 如前一节所述，水杨醛对胺的可逆共价加合的固有稳定性和选择性启发了靶向催化赖氨酸的合成小分子。ORIN1001，一种肌醇需求酶1（IRE1）的抑制剂，已作为抗肿瘤剂进入临床试验，起源于水杨醛筛选先导化合物13（图7A）。共价可逆Ber-Abl激酶抑制剂15是通过引入醛弹头从可逆抑制剂PPY-A衍生而来（图7B）。基于PPY-A与ABL1激酶的X射线共晶结构（图7C，PDB ID: 2QOH），设计了这些共价可逆抑制剂来靶向催化赖氨酸K271。 共价可逆抑制剂14，含有能够稳定亚胺中间体的羰基硼酸，在体外表现出高效力；然而，其在活细胞中的活性显著降低，这可能是由于该支架内醛官能团的代谢。将羰基硼酸结构修饰为水杨醛增强了原位的抗增殖效果，增加了对ABL的抑制活性，并且使用与化合物15对应的炔基探针进行ABPP证实了高激酶选择性。 值得注意的是，溶剂暴露的非催化赖氨酸残基通常不是醛亲电试剂的优选靶点，因为它们的可逆性质和高可能性以质子化形式存在。然而，2-羟基-1-萘醛（16）可以特异性结合KRIT1的K720，该残基具有固有的低亲核性。K720是位于KRIT1的HEG1结合域内的表面残基；因此，16可以起到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）抑制剂的作用（图7D）。 Figure7  (A) ORIN1001和 (B) 化合物15的醛类共价可逆抑制剂的SAR研究。 (C) ABL1激酶T310I突变体与可逆ABL1抑制剂PPY-A结合的X射线共晶结构，突出了K271的位置。（PDB ID: 2QOH） (D) 2-羟基-1-萘醛衍生物（16）作为PPI抑制剂的作用模式。 最近，Cravan等人通过引入水杨醛弹头，将临床可逆泛AKT1变构抑制剂ARQ092修饰成不可逆AKT1-(E17K)突变体选择性抑制剂17（图8）。这种选择性是通过招募内源性锌离子实现的，这些锌离子稳定了E17K突变体和水杨醛弹头之间形成的醛亚胺产物。泛AKT1抑制剂在临床研究中与高血糖作为副作用相关，但新开发的不可逆AKT1(E17K)突变体选择性化合物17未诱导高血糖。 Figure8： 通过引入水杨醛弹头从可逆泛AKT抑制剂开发不可逆AKT1(E17K)突变体选择性抑制剂。 Gao课题组设计了与2-甲酰基或2-酮基芳基硼酸相比具有延长停留时间的硼酸。通过将2-甲酰基苯氨基基团连接到邻苄位，他们观察到共价修饰的半衰期（t1/2）显著增加。赖氨酸形成一个与硼配位的亚胺，类似于2-甲酰基硼酸；然而，苯氨基氮也与硼配位，导致形成双环结构（图9）。 Figure9： 提出的RMR1与赖氨酸缀合形成水合二氮杂硼杂环的机制。 水杨醛的共价可逆性质最近促进了对多种含醛ABPs的探索，这些ABPs通常需要与还原剂（如NaBH4）还原以进行检测。Yang等人基于停留时间开发了赖氨酸靶向ABPs（图10A）。虽然苯甲醛（18）和水杨醛探针（19-20）检测到相似数量的激酶，但探针18在洗脱后表现出短半衰期（图10B）。相比之下，水杨醛稳定了亚胺共价产物，显著增加了洗脱后可逆共价探针的半衰期（图10C）。有趣的是，洗脱后在激酶之间观察到不同的解离速率，使得ABPs能够在体外和体内系统中选择性结合激酶，如极光激酶A（AURKA）K162。使用ABPP与LC-MS/MS筛选亲胺化合物，鉴定了二醛片段，包括Jensenone（21）和22，作为潜在的赖氨酸靶向侦察分子（图10D）。 Figure10  (A) 包含水杨醛支架的基于停留时间的ABPs的化学结构。 (B) 洗脱后每个靶蛋白探针的半衰期（t1/2）和 (C) 剩余百分比。 (D) 基于从亲胺化合物库中发现的二醛片段合成的间苯三酚类萜及其相应探针的化学结构。 基于这些发现，合成了间苯三酚类萜及其相应的探针，以绘制活细胞中赖氨酸-间苯三酚类萜相互作用图（图10D）。最近，Chen等人应用2-乙炔基苯甲醛（2-EBA）弹头开发催化赖氨酸靶向配体。与其他醛弹头不同，2-EBA不可逆地结合肽段或赖氨酸残基的N-末端，形成稳定的异喹啉鎓产物（图11A）。由于2-EBA弹头的低固有反应性，27对GSH表现出可忽略的反应性。基于报道的可逆抑制剂结构，研究了2-EBA和磺酰氟衍生物（图11B）。该研究证明了2-EBA衍生物的优异效力和赖氨酸选择性。此外，使用2-EBA弹头，在弱酸性条件（pH = 6.5）下成功实现了对N-末端胺相对于赖氨酸残基的修饰。 Figure11 (A) 提出的2-EBA弹头与赖氨酸的不可逆结合机制。(B) 含2-EBA弹头的衍生物及其相应的可逆或磺酰氟配体的化学结构。 迈克尔受体弹头。 尽管迈克尔受体如丙烯酰胺、乙烯基砜和乙烯基磺酰胺主要靶向半胱氨酸残基，但优先取向的迈克尔受体也可以结合赖氨酸残基。PX-866（Sonolisib），一种研究性药物和口服可用的泛PI3K抑制剂，是天然产物Wortmannin的修饰衍生物。PX-866的取代丙烯酰胺共价结合并抑制p100α中的催化K802和p110γ中的K883。 通过结构药物设计方法，可逆的细胞周期蛋白D激酶2（CDK2）抑制剂NU6155被转化为不可逆抑制剂NU6300，通过引入靶向K87的乙烯基磺酰基，该残基在蛋白激酶家族中保守性不高（图12A）。类似地，HIV逆转录酶的可逆非核苷抑制剂（33）通过在与催化残基（如K102和Y181C）附近引入丙烯酰胺基团，转化为不可逆抑制剂（34-35）（图12B）。 Figure12  (A) CDK2可逆抑制剂NU6155转化为不可逆抑制剂类似物NU6300及其与CDK2的X射线共晶结构（PDB ID: 5CYI）。(B) HIV-1 RT不可逆抑制剂的开发策略和含化合物33的X射线共晶结构（PDB ID: 4H4M）。根据目标催化残基（如K102, Y181C 和 Y181），在化合物33的不同位置引入亲电试剂。 此外，比较各种迈克尔受体与GSH和N-α-乙酰-L-赖氨酸反应性的研究表明，乙烯基砜和磺酰胺与N-α-乙酰-L-赖氨酸的反应速度比与GSH快。这一观察结果可归因于N-α-乙酰-L-赖氨酸的硬亲核性质，与较软的丙烯酰胺亲电试剂相比，它能更有效地与硬亲电试剂（如乙烯基磺酰胺）相互作用。这些发现为优化赖氨酸靶向迈克尔受体化合物在效力和稳定性方面提供了宝贵的见解（图13）。 Figure13：亲电试剂与作为亲核试剂的N-α-乙酰-L-赖氨酸在pH 10.2下反应评估的半衰期。 活化酯弹头。 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯是代表性的赖氨酸反应性活化酯。最广泛使用的NHS酯之一，TMT试剂有效标记N-末端游离NH3基团和赖氨酸残基（图14A）。然而，NHS酯高度易受水解影响，并且它们的残基特异性可能因其高反应性而恶化。 许多研究试图最小化由NHS酯基TMT试剂引起的过度标记，这些试剂对其他残基（如丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）表现出混杂性。Ward等人使用同位素串联正交蛋白酶解-活性蛋白质分析（isoTOP-ABPP）平台研究了NHS酯-炔ABP（37）在小鼠肝脏蛋白质组中的残基选择性。他们的研究总共鉴定了3,372个修饰肽段，其中49%的标记位点对应于赖氨酸残基（图14B）。Hacker等人合成了多种活化酯ABPs，包括NHS、硝基取代苯基和氟代苯基酯。其中，磺基四氟苯基（STP）-炔ABP（38）表现出强大的蛋白质组反应性和对赖氨酸残基的高选择性。最常修饰的替代位点是丝氨酸残基（约8%的标记肽段），其他残基的修饰观察到少于5%（图14C）。值得注意的是，赖氨酸修饰可能干扰胰蛋白酶在切割位点的消化，可能导致LC-MS/MS检测到的修饰位点误解。 此外，使用ABP 38，在癌细胞蛋白质组中筛选了超过30种亲胺化学型，揭示了77%的配体蛋白质是非DrugBank蛋白质。这一发现表明，发现的亲胺片段可以作为靶向以前难以处理的蛋白质的侦察分子。Wan等人合成了一系列活化酯，使用含赖氨酸肽系统调整反应性。在这些测试的酯中，三嗪酯42在体外表现出最高的反应性和赖氨酸选择性（图14D）。使用活化酯弹头，可逆选择性PI3Kδ抑制剂GSK2292767和GSK2269557（相对于PI3Kα, β, γ选择性约1,000倍）通过修饰与K779相互作用的磺酰胺药效团成功转化为不可逆抑制剂46（图15A）。此外，ATP和ADP-脱硫生物素探针已被广泛用作ABPs，通过靶向ATP结合位点中的保守赖氨酸残基以及各种核苷酸结合蛋白（如ATPases和热休克蛋白）来分析蛋白激酶。（图15B）。两个高度保守的赖氨酸残基通常在蛋白激酶中发现：一个位于亚域II（WNK家族除外），另一个位于HRDxKxxN基序内的亚域VIB中（图15C）。 Figure14 (A) TMT试剂的化学结构和反应机制。使用 1313C 和 1515N 同位素来操纵质量差异；红色星号表示TMT蛋白质组学中每个TMT22标记试剂的同位素位置。 (B, C) 赖氨酸反应性ABPs的化学结构及其残基特异性谱。 (D) 取决于活化酯结构的反应速率常数。 Figure15 (A) 引入活化酯将可逆抑制剂转化为不可逆抑制剂46的示例。 (B) 用ATP-脱硫生物素ABP标记赖氨酸的机制。 (C) 高度保守赖氨酸在蛋白激酶中与ATP的γ磷酸的接近程度，其中ATP-脱硫生物素ABP的酰基磷酸弹头位于此处（PDB ID: 1ATP）。 N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）弹头。 NASA部分已被广泛用作固相肽合成中安全捕获连接子的反应性物种。NASA支架作为赖氨酸反应的酰基供体，Hamachi课题组优化了该官能团作为ABPs中的亲电弹头（图16A）。N-酰基-N-芳基磺酰胺（ArNASA）衍生物（51）表现出与NASA本身相比显著延长的半衰期，以及增加的选择性（图16B）。此外，配体导向的含NASA抑制剂（52-53）在靶向活细胞中蛋白质（如C481S Bruton酪氨酸激酶（BTK）和热休克蛋白90（Hsp90））中的赖氨酸残基时，与其母体化合物相比显示出改善的效力（图16C）。在人双微体2（HDM2）蛋白中也观察到NASA弹头与N-末端α-胺和酪氨酸残基的结合，在那里它们作为PPI抑制剂。Tivon等人进一步开发了含NASA的适配体来标记目标赖氨酸残基。在这种方法中，寡核苷酸促进了目标蛋白和NASA弹头之间的接近，使得赖氨酸残基能够攻击NASA亲电试剂并有效标记蛋白质。Ryan等人报道了能够将乙酰基位点特异性转移到人类细胞中赖氨酸残基的N-乙酰基-N-烷基磺酰胺衍生物。此外，Teng等人开发了一种潜在的靶向降解剂，该降解剂使用NASA弹头将CDK2配体与CRBN招募配体结合。尽管研究证实了CDK2-CRBN复合物的形成，但未观察到CDK2的降解。 Figure16  (A) 开发用于药物发现的NASA弹头。 (B) 各种NASA衍生物根据其化学结构的半衰期。 (C) 源自母体小分子的NASA类似物的化学结构。 方酸酯、方酰胺和方酰胺弹头。 方酰胺是尿素、硫脲、胍和氰基胍的生物电子等排体，常用于药物化学。此外，方酰胺和方酸已被纳入核苷中作为磷酸基团的等排体。已经开发了几种方法来合成含方酸酯和方酰胺的构建块，例如氨基酸、肽、蛋白质、聚合物、核苷、荧光探针和发光探针，这些方法利用了方酸酯与游离胺的高反应性。 Kiessling及其同事比较了方酸酯和方酰胺与其他赖氨酸反应性亲电试剂（如NHS酯）的反应速率。方酰胺的第二个连续反应速率比NHS酯慢得多，证明了它们的温和反应性（比NHS酯慢>10^4倍；图17A）。随后，将方酰胺部分引入UDP的末端磷酸作为糖基转移酶GifT2的底物模拟物。该化合物选择性地抑制了一个催化赖氨酸残基，而二氯三嗪类似物修饰了GIFT2中的八个赖氨酸。Ohara等人设计了一种聚糖-BODIPY-方酰胺缀合物59，该缀合物结合了识别苷元的N-糖基化酶人UGGT1（HUGT1）。通过与方酰胺59反应对K1424进行不可逆修饰，为了解HUGT1的苷元结合位点和折叠感应机制提供了见解（图17B）。 Abbasov等人进一步探索了赖氨酸特异性方酰胺，得到了化合物60和61作为比其他空间位阻方酰胺更广泛的赖氨酸反应性方酰胺（图17C）。值得注意的是，61共价修饰了Ku70（XRCC6）中的K351，抑制了其与Ku80（XRCC5）的二聚化。这个过程破坏了人类细胞中修复DNA双链断裂至关重要的非同源末端连接。 方酰胺的独特性质，如它们的两个连续反应位点和温和反应性，使其在生物分子缀合研究中非常有用。Ponvielle等人制备了RNA衍生物方酰胺用于与肽和蛋白质缀合，以鉴定或共价修饰tRNA酶结合位点。Ivanova等人将方酸酯连接到脱氧胞苷核苷酸上，创建了方酸酯连接的dCTPs（dCF5858TPs, 62），这些dCTPs被DNA聚合酶掺入DNA。这些合成的DNA探针（DNA CESO）与DNA结合蛋白有效反应，但与缺乏DNA结合亲和力的肽段反应有限（图17D）。如上所示，赖氨酸特异性和温和的亲电方酰胺因其通过各种生物缀合策略发现不可成药蛋白质（如DNA结合蛋白）的多功能性而脱颖而出。 Figure17  (A) 方酸酯、方酰胺和NHS-酯反应速率的比较。(B) 模拟含苷元糖蛋白的HUGT1方酰胺探针（59）的化学结构。(C) 通过筛选亲胺化合物库发现的广谱赖氨酸反应性方酰胺（60-61）。(D) 方酰胺作为生物分子间连接剂及在DNA荧光标记中的应用。 硫（VI）-氟化物弹头：磺酰氟（-SO2F）和氟硫酸酯（-OSO2F）。 磺酰氟历史上被认为是不合适的亲电试剂，因为其动力学和热力学稳定性的结合限制了其与亲核试剂的反应性。然而，Baker首先证明了如果化合物首先可逆地结合蛋白质，磺酰氟可以快速形成共价键，促进共价键形成的通路。这一见解此后在药物发现和化学蛋白质组学中引起了极大的兴趣。磺酰氟可以与残基如酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和组氨酸反应。其水解稳定性易于调节，为许多不稳定的不可逆配体提供了有价值的替代品（图18A）。然而，亲电试剂对蛋白质的亲和力不一定与其固有反应性相关，因为化合物与结合位点之间可逆相互作用的速率显著影响共价键的形成。 Zhao等人开发了XO-44，一种对蛋白激酶高度选择性的ABP，在活Jurkat细胞中检测到133种内源性激酶（图18B）。XO-44还通过与酪氨酸激酶抑制剂Dasatinib的竞争性ABP研究展示了其鉴定激酶抑制剂非靶标的潜力（图18C）。此外，在375种测试的纯化蛋白激酶中，XO-44对219种激酶表现出低于1 μM的IC50值（图18D）。XO-44也被用于鉴定多酪氨酸激酶抑制剂乐伐替尼耐药机制的研究中。这些发现表明，XO-44可用于评估激酶抑制剂谱，并可能作为开发激酶抑制剂的有前途的支架。 Figure18  (A) S(IV)-F亲电试剂（63-71）的固有反应性和水解稳定性取决于取代基。显示了化合物在PBS缓冲液（pH = 8）中的半衰期；括号中的值代表pH = 10时的半衰期。(B) XO-44的化学结构。(C) 使用KinMap绘制的激酶组系统发育树，显示了在Jurkat细胞中由XO-44检测到的蛋白激酶（灰色）以及被Dasatinib配体的激酶（红色）。(D) 基于纯化激酶实验确定的被XO-44抑制的激酶。 Cheeseman课题组通过模仿可逆核苷酸竞争性抑制剂（如8-N-苄基腺苷）引入亲电弹头，设计了Hsp72的共价抑制剂。例如，引入丙烯酰胺弹头将可逆抑制剂转化为靶向K56的不可逆类似物。然而，这种修饰导致低的Kinactt，原因是弹头与近端残基之间不利的构象阻碍了共价键的形成。基于对Hsp72 X射线共晶结构的系统分析，合理设计的晶体学结构引入了，与丙烯酰胺衍生物相比，动力学参数Kinactt/KI提高了108倍。 最近，氟硫酸酯（-OSO2F），比磺酰氟更稳定和潜在的亲胺试剂，已成为开发不可逆配体的亲电弹头。Tang等人将氟硫酸酯引入第一代EGFR抑制剂厄洛替尼中以靶向催化保守的K745（图19A）。得到的不可逆抑制剂72显示出与厄洛替尼相当的细胞活性，同时在体外和体内表现出有利的药代动力学特征。Tang等人还合成了XO-44的氟硫酸酯衍生物，并分析了它们在整个人类赖氨酸激酶组中的谱图，同时评估了它们的稳定性和反应性（图19B）。在这些衍生物中，ABP 73比XO-44检测到更多的激酶，并与VX-680结合用于开发不可逆极光激酶抑制剂。新合成的不可逆抑制剂74对AURKA表现出相当的效力，但显示出比VX-680更高的选择性。 Figure19  (A) 第一代EGFR药物厄洛替尼及其相应的含氟硫酸酯亲电试剂的不可逆抑制剂72的化学结构。 (B) 氟硫酸酯探针73和含氟硫酸酯的不可逆泛极光激酶抑制剂74的开发策略。维恩图表示在Jurkat细胞中由73和X044鉴定的激酶数量。 磺酰基-唑（SufAz）弹头。 硫（IV）-氟化物和SufAz弹头之间的一个明显区别是磺酰基亲电中心离去基团的选择，SufAz化合物具有通过修饰唑离去基团进行额外可调谐性的优势。特别是，我们课题组引入了硫-三唑交换（SuTEx）化学用于化学蛋白质组学和蛋白质配体发现（图20）。1,2,4-磺酰基-三唑修饰酪氨酸和赖氨酸残基，优先选择酪氨酸。与本部分相关的是，通过切换到1,2,3-三唑离去基团或通过使用激酶结合支架将亲电试剂定位在催化赖氨酸附近，可以增强SuTEx化学的赖氨酸结合活性。后者通过使用含SuTEx弹头的XO44衍生物KY-26得到证明，使用改良的LC-MS/MS方案鉴定激酶上的结合位点（约50%的修饰肽段被检测为赖氨酸）。 Figure20： 开发为Tyr/Lys反应性弹头的SufAz以及用于蛋白质组学研究的SufAz衍生物中合成唑类的化学结构。 酪氨酸反应性支架 酪氨酸的生物学特征。 酪氨酸，尽管其pKa（~10）略低于质子化赖氨酸，但使用共价配体进行靶向一直更具挑战性。这可归因于其侧链的结构特征，该侧链更刚性且被酚羟基空间位阻。这些因素对实现有效共价结合所需的最佳几何结构构成了挑战。 然而，酪氨酸靶向亲电试剂已被证明在研究PPIs中很有价值。酪氨酸在蛋白质-蛋白质界面显著丰富，其独特性质对分子识别有重要贡献。其两亲性质允许多种相互作用，而其刚性增强了结合亲和力和特异性。酪氨酸有限的构象灵活性在结合过程中减少了熵罚，从而最小化了非特异性相互作用。这种特异性在酪氨酸丰富的界面中尤为关键，这些界面本身就不容易发生非特异性结合事件。 此外，PTMs（如酪氨酸残基的磷酸化）在调节对生物过程至关重要的PPIs中起着关键作用。因此，靶向受磷酸化影响的酪氨酸可能作为调节信号通路的一种不同策略。开发酪氨酸反应性弹头可能能够精确调节这些关键残基，并为信号机制提供更深入的见解。因此，开发新型酪氨酸反应性弹头具有巨大潜力，可以增进我们对蛋白质信号网络的理解，并发现具有前所未有的机制的不可逆小分子调节剂。 酪氨酸靶向化学。 曼尼希型弹头。 Francis及其同事开发了一种三组分曼尼希型酪氨酸缀合策略。利用曼尼希反应的Betti变体，他们在富电子苯胺和甲醛之间进行原位亚胺缩合，随后与酪氨酸形成C–C键（图21）。尽管该反应在温和条件下进行，但需要延长反应时间和最佳pH。而且，它也会导致色氨酸和半胱氨酸加合物的形成，限制了其化学选择性。 Figure21： 三组分曼尼希型酪氨酸缀合的机制。 为了解决这些局限性，Tanaka及其同事引入了一种双组分曼尼希型酪氨酸生物缀合策略。在这种方法中，预先合成一个稳定的环状亚胺，随后与酪氨酸反应。该方法具有几个优点：它在广泛的pH范围内具有通用性，防止反应过程中烯胺形成，并表现出改善的抗水解性。这些特性使曼尼希型缀合在生物系统中对于选择性酪氨酸靶向更具应用性。尽管环状亚胺对全局酪氨酸标记显示有限活性，但它显示出靶向共价标记和抑制的巨大潜力。 基于这种酪氨酸生物缀合策略，Wang等人合成了环状亚胺弹头作为靶向共价抑制剂。在评估的环状亚胺中，环己基亚氨基内酯和内酰胺在PBS缓冲液（pH 7, 37 °C）中表现出对Ac-Tyr-NHMe的反应性。虽然内酯显示出高反应性，但这种亲电试剂不稳定且易受水解影响。相反，环己基亚氨基内酰胺在GSH处理以及酸性和碱性条件下表现出稳定性。对于可逆双重CBX2和CBX8抑制剂SW2_110A（75），引入环状亚胺以选择性靶向CBX8的非保守Y39，从而增强对CBX2的选择性（图22A）。这种共价抑制剂的设计得益于CBX8与寡肽UNC3866结合的共晶结构（PDB ID: SEQ0, 图22B）。生化分析和LC-MS/MS分析表明，环状亚胺77通过靶向共价结合策略提高了选择性（图22C）。 Figure22  (A) CBX同工型的序列比对。 (B) 包含UNC3866的CBX2的X射线共晶结构（PDB ID: 5EQ0）。 (C) 合成的CBX8抑制剂的化学结构。 三唑啉二酮（TAD）弹头。 环状TAD弹头的酪氨酸缀合潜力由Barbas及其同事首次报道。由于它们对酪氨酸和色氨酸的高选择性以及所得加合物的稳定性，TAD弹头已被广泛研究（图23）。然而，它们较差的水稳定性给药物开发带来了挑战。此外，TAD水解产生异氰酸酯，这些异氰酸酯可以非特异性地结合残基如赖氨酸，尽管这可以通过使用Tris缓冲液清除异氰酸酯副产物来缓解。Decoene等人进一步证明，TAD的Tyr/Trp选择性可以通过pH调节，酸性条件有利于色氨酸修饰。Moinpour等人量化了表面酪氨酸残基上的TAD标记，提供了对蛋白质构象变化的见解，这对于理解PPI至关重要。 Figure23： TAD与酪氨酸和色氨酸结合的机制。 硫（VI）-氟化物弹头：磺酰氟（-SO2F）和氟硫酸酯（-OSO2F）。 如上所述，磺酰氟弹头对酪氨酸以及赖氨酸残基表现出显著的反应性。Scammells等人通过传统的SAR研究，将可逆的A1腺苷受体（A1AR）拮抗剂DPCPX转化为不可逆拮抗剂FSCPX。FSCPX的共价失活是通过在8位或N3位引入芳基磺酰氟弹头实现的。接下来，改善代谢稳定性的优化策略导致了DU172的发现；与人类A1AR（hA1AR）的X射线共晶结构证实了配体与hA1AR的Y2657.36之间的共价结合（图24A）。此外，开发了不可逆部分hA1AR激动剂和含磺酰氟的ABPs，并用于可视化活细胞中的受体，模拟可逆hA1AR部分激动剂Capadenoson。 hA1AR与DU172的同源建模进一步启发了Yang等人设计新型不可逆人类A3腺苷受体（hA33AR）拮抗剂。由于大多数现有的hA33AR调节剂是可逆配体，开发不可逆配体提供了额外的化学探针，以扩展我们对hA33AR的理解。将亲电试剂简单地引入DU172导致与hA33AR的Y2717,567,56发生共价相互作用。这种修饰被进一步发展为具有末端烷烃基团的ABPs，用于分析内源性hA33AR表达（图24B）。 Figure24  (A) 开发不可逆hA1AR拮抗剂DU172的SAR研究。 (B) 通过hA1AR同源模型引入磺酰氟亲电试剂用于hA3AR共价抑制，并进一步开发hA3AR ABP。 Jones及其同事设计了用于RNA结合蛋白DepS的ABPs和不可逆抑制剂。DepS与D153249（78）的X射线共晶结构确定了苄基附近的三个亲核残基（Y113, Y143, K142），促使在苄基取代基的邻位、间位或对位引入磺酰氟。正如预期的那样，SF-p1（79）修饰了Y143，而SF-m1（80）和SF-o1（81）与Y113结合（图25）。此外，80的炔基化促进了其作为评估DepS靶标结合的工具的使用。 Figure25： 基于磺酰氟弹头定位改变目标酪氨酸残基。 Chen等人报道了芳基氟硫酸酯ABPs，这些ABPs选择性修饰细胞内脂质结合蛋白（iLBP）家族底物结合位点中的保守酪氨酸残基。其中，联苯芳基氟硫酸酯在活细胞中选择性标记了CRABP2。这种选择性归因于CRABP2 Y134的pKa降低（~7.6），受相邻精氨酸残基的影响。Olsen及其同事通过开发不可逆SIRTS选择性氟硫酸酯抑制剂和ABPs进一步推动了该领域的发展。他们早期的基于机制的可逆SIRTS抑制剂82，包含一个硫脲部分，存在细胞渗透性和血清稳定性问题。为了解决这些局限性，探索了生物电子等排体和前药策略，但对于体内应用证明不足。通过将弹头替换为氟硫酸酯基团并引入胍基部分以增加水溶性，他们成功开发了在体内具有功能的SIRTS ABP 83（图26）。 Figure26： 可逆SIRT5抑制剂及其相应的不可逆磺酰氟ABP的化学结构。 磺酰基-唑（SufAz）弹头。 SufAz亲电试剂是目前可用的最具酪氨酸选择性的支架之一，为化学蛋白质组学应用提供了足够的稳定性和可调性。SuTEx配体已被证明通过配体蛋白质上的催化和非催化酪氨酸来破坏酶活性位点，并扰动参与生物分子凝聚物形成和溶解的蛋白质-蛋白质或蛋白质-RNA复合物。Hahm等人合成了一系列SuTEx化合物，其中HHS-465（84）和HHS-475（85）经常用于裂解液和活细胞中的ABPP研究（图27）。值得注意的是，HHS-482（86）表现出中等反应性但优异的酪氨酸选择性（Y/K比 ~ 5）。 Figure27： SuTEx ABPs的化学结构。 Brulet等人通过修饰加合基团和离去基团上的取代基，在有机溶液和蛋白质组中研究了SuTEx化合物的可调性。作为加合基团的芳基取代基表现出优异的反应性，而环丙基取代的加合基团降低了亲电性。此外，SuTEx化合物的反应性与其取代基的电子性质密切相关（图28）。 Figure28： SuTEx化合物的半衰期取决于加合和离去基团修饰的改变。使用DMSO/ACN（1:9）中的对甲酚和四甲基胍比较对酪氨酸的反应性。 Huang等人将血清素受体拮抗剂利坦色林的RF001片段与SuTEx弹头结合（图29）。利坦色林对代谢激酶（如二酰基甘油激酶（DGK）α）具有次级活性，促使引入RF001结合元件用于开发激酶靶向ABPs。ABP设计将结构复杂的RF001部分安装在离去基团中，以介导识别，而不会使所得肽段-探针加合物复杂化，从而增强LC-MS/MS对修饰位点的可检测性。所得的SuTEx ABP，TH211，在活细胞中鉴定了超过50种蛋白质和代谢激酶的催化或调节域中的酪氨酸残基。此外，TH211被用于捕获预测的DGKs结合口袋中的位点，以指导未来的抑制剂开发。 Figure29： 模拟利坦色林的激酶ABP TH211的化学结构。 共价配体设计中的立体选择性识别 用于评估细胞活性的传统配体筛选很容易受到配体物理化学性质的改变，这可能增加SAR分析的复杂性。此外，许多蛋白质利用立体化学性质作为区分底物的关键因素之一。因此，立体探针对的概念被提出作为一种创新解决方案，以进行系统性SAR分析，最小化物理化学性质的担忧。立体探针对作为理想匹配的对照，用于评估亲电配体的靶向与非特异性结合和细胞活性。最初使用对映探针的蛋白质组学图谱集中于使用迈克尔受体亲电试剂靶向半胱氨酸，或使用光反应性重氮嗪基团以蛋白质残基无关的方式广泛靶向蛋白质组（图30）。 Figure30 (A) 用于共价配体发现的对映探针对的开发。立体选择性修饰肽段和蛋白质的定量通过ABPP分析确定，如图2所示。 (B) 在R1, R2或色氨酸环核心具有末端炔烃的色氨酸丙烯酰胺立体探针对的化学结构。 最近，Taunton课题组合成了酪氨酸和赖氨酸反应性磺酰氟的对映体ABP对，证明立体化学影响超越半胱氨酸的蛋白质残基上的结合偏好（图31）。通过筛选十对对映体对（96-105），作者在活细胞中2,343个总修饰位点（1,728 Tyr, 615 Lys）中检测到634个立体选择性修饰位点（513 Tyr, 121 Lys）。这些对映体对提供了对蛋白质结合位点立体化学偏好的宝贵见解，不仅可以指导设计小分子以靶向新蛋白质，还可以作为有用的工具，将靶向与非靶向结合位点结合与在化合物处理的细胞中观察到的表型联系起来。 Figure31： 具有酪氨酸和赖氨酸反应性磺酰氟作为亲电试剂的对映探针对的化学结构。 结论与未来展望： 大多数人类蛋白质组（~85%）缺乏明确的结合口袋，使其成为传统药物设计的挑战性靶点。此类蛋白质的例子包括p53和c-Myc，它们通常依赖PPIs或本质无序区域发挥功能。为了克服这些挑战，共价化学和ABPP已成为药物发现中不可或缺的工具，简化了从靶点识别到先导化合物优化的步骤。ABPP技术与LC-MS/MS的结合通过为发现氨基酸导向的共价弹头及其后续优化高度靶向的共价配体提供了一条可行的途径，从而改变了药物发现。此外，ABPP扩大了先前被认为难以处理的的可配体蛋白质的范围。 虽然已经开发了许多半胱氨酸导向的共价抑制剂，但仅靶向半胱氨酸只覆盖了蛋白质组的一小部分。因此，对靶向蛋白质上更广泛氨基酸的共价化学的需求日益增长。在这些残基中，赖氨酸和酪氨酸已成为共价调节剂开发的有吸引力的靶点。 迄今为止，已经发现并利用了各种赖氨酸反应性弹头进行蛋白质分析和共价抑制剂的开发。此外，一些研究关注赖氨酸残基的PTMs，并将位点选择性赖氨酸化学应用于多种生物学应用，如抗体-药物偶联物（ADC）和人血清白蛋白（HSA）缀合策略。尽管开发了许多酪氨酸和赖氨酸反应性弹头，但考虑到人类蛋白质组中潜在可配体位点的巨大多样性，每个支架的覆盖范围有限。事实上，残基内的邻近驱动环境强烈影响弹头的反应性，这取决于它们的电子和空间性质。这强调需要继续开发多样化的支架来靶向难以配体的蛋白质。 特别是，避免与半胱氨酸反应性的酪氨酸和赖氨酸反应性弹头，如磺酰基亲电试剂，对于实现新靶点的选择性修饰至关重要。半胱氨酸和GSH上的硫醇是细胞中的主要亲核试剂，容易与亲电试剂形成共价键。因此，设计用于靶向非半胱氨酸残基的亲电试剂必须避免或最小化生物系统中硫醇的交叉反应性。发现新的亲电试剂并将其精确整合到非共价识别支架中，对于推进靶向赖氨酸以及其他亲核残基（如酪氨酸、非催化丝氨酸/苏氨酸和组氨酸）的共价抑制剂和化学蛋白质组学探针至关重要。酪氨酸特别有趣，因为它们比半胱氨酸更丰富，但不像赖氨酸那样普遍，从而在不影响选择性的情况下扩展蛋白质靶向机会。此外，已知酪氨酸在蛋白质结合表面富集，这表明靶向酪氨酸对于开发PPI抑制剂具有很高的潜力。 近年来，IDD方法已成为发现新型共价配体（包括对映体ABP对）的重要策略。虽然手性通常被纳入对映体对的加合基团中，但将手性包含在亲电中心本身也代表了共价配体开发的一个有前途且未充分探索的途径。 化学蛋白质组学探针设计的进展与多重定量质谱相结合，将进一步扩大可进行共价靶向的功能性蛋白质口袋的范围。这一进步将为蛋白质生物化学和生物学提供新的基础见解，并在此过程中推动治疗开发的创新。 原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.chemrev.5c00001

关注并星标CPHI制药在线   PI3K的研发道路曲折漫长，一波三折，很多上市的药物都撤销了适应症，如吉利德的Idelalisib，Secura Bio的Duvelisib和TG Therapeutics的Umbralisib，不仅如此，拜耳Copanlisib在欧盟用于治疗边缘区淋巴瘤（MZL）和TG Therapeutics的Umbralisib用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）的新药申请都被拒绝。       PI3K药物研发一时乌云笼罩，不过也有好消息，诺华研发的PI3Kα抑制剂Alpelisib探索新适应症，成功获批乳腺癌适应症，后又于去年获批治疗PIK3CA相关过度生长疾病谱系（PROS）成人和2岁及以上儿童患者的新适应症，得益于此，Alpelisib的销售额稳步上升，2021年销售额达到3.29亿美元，今年上半年销售额已经达到2.46亿美元，大幅度增加。       近期，林普利塞拟纳入优先审评，用于既往接受过一线充分治疗的复发和/或难治性外周T/NK细胞淋巴瘤成人患者。林普利塞是由璎黎/恒瑞开发的首个国产自主研发获批的PI3Kδ抑制剂，曾于去年11月获NMPA附条件批准，用于既往接受过至少两种系统性治疗的复发或难治滤泡性淋巴瘤（FL）成人患者。       目前PI3K药物的研发竞争还是很激烈，国内外很多药企从事于PI3K药物开发，如罗氏、诺华、吉利德和百济等，开发的类型多样，包括pan-PI3K抑制剂，亚型特异性选择抑制剂和靶向突变位点的抑制剂。       其中靶向PI3Kα H1047R药物LOXO-783、RLY-2608和STX-478等值得关注，不过RLY-2608披露的临床数据也给大家浇了盆冷水，临床疗效达不到终点，但是毒性确实比靶向野生型PI3K的抑制剂小，LOXO-783和STX-478还在临床试验中，后续的开发需密切关注安全性问题。       PI3K家族和信号通路       磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）是一种胞内脂质磷酸激酶，主要是在磷脂酰肌醇（phosphatidylinositide，Ptdlns）3’端的羟基上加上磷酸。已经发现了三类PI3K，即I类，II类和III类，除了常见的底物Akt（图1）外，每种PI3Ks都有特定的底物和不同的效应器（图1）[1]。       图1. I、II 和 III 类 PI3K 的不同效应器       I类PI3K含有四种催化亚型，p110α，p110β，p110γ和p110δ，它们分别由PIK3CA、PIK3CB、PIK3CG和PIK3CD编码。在四种I类催化亚型中，PIK3CA由于其频繁的突变在人类癌症中普遍被提及，如在胃癌（36.4%）、甲状腺癌（30%）、前列腺癌（28%）、卵巢癌（13.3-29.8%）、宫颈癌（9.1-76.4%）和其他癌症中经常扩增。       I类PI3K由 p110 催化亚基和 p85 调节亚基组成的异二聚体通过激活下游酪氨酸激酶如 G 蛋白偶联受体（GPCR）和小单体GTP酶发挥其功能。此外，p85亚基可以通过下游蛋白质的活化来传递各种细胞信号（图2）[1]。       II类PI3K包括C2α、C2β和C2γ催化亚型和缺乏调节亚基，因此，它们可以作为单体被活化。在哺乳动物中，已经鉴定出三种II类PI3K亚型，其中PI3KC2α和PI3KC2β广泛表达，而PI3KC2γ主要在肝脏中表达。       III类PI3K VPS34（也称为PIK3C3）是独特的，因为它通过与由调节亚基和催化亚基组成的蛋白质复合物结合调节其在自噬和巨噬细胞吞噬作用，因此，异源二聚体III类PI3K也可以调节自噬。       PI3K/Akt通路在各种细胞过程中起至关重要的作用，并在癌症中异常激活，导致肿瘤的发生和发展，具体情况如下（图2）。       一方面，配体与特定的RTK（EGFR，VEGFR和FGFR）相结合可以通过RAS激活I类PI3K；另一方面，I 类 PI3K 可以通过 B 细胞适配器和 GPCR 由 BCR 激活。FGFR底物FRS2与GRB2，SOS和GAB1结合磷酸化以激活I类PI3K。除了被EGFR激活外，II 类 PI3K 可以通过 TCR 激活。当III类PI3K被氨基酸激活时，活化的PI3K磷酸化PIP2肌醇头的第三个碳并将其转化为PIP3，从而通过PDK1和RAC激活AKT，PTEN可以抑制这种转化过程。此外，I GF-1与IGF1R联合可以招募IRS-1和I类PI3K，然后参与PIP2向PIP3的转化（图2）。图2. PI3K/Akt 信号通路的激活       获批上市的PI3K抑制剂       目前，研究人员开发的PI3K抑制剂种类很多，根据作用机制，大致可分为广谱型PI3K抑制剂（pan-PI3K）、亚型特异性PI3K抑制剂和靶向PI3K/mTOR双重抑制剂三大类。       PI3Kδ是目前已上市的用于治疗恶性血液病的PI3K抑制剂最常用的治疗靶点，因为PI3Kδ主要存在于白细胞中，在多种B细胞淋巴瘤中处于活化状态以及在调节适应性免疫系统细胞（B细胞和部分T细胞）以及先天免疫系统（中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞）中具有重要作用，所以之前被认为是治疗血液系统恶性肿瘤的理想靶点之一。       全球总共批准5款PI3K抑制剂，包括吉利德的Idelalisib（Zydelig）、拜耳的Copanlisib（Aliqopa）、Secura Bio的Duvelisib（Copiktra）、诺华的Alpelisib（BYL719，Piqray）、TG therapeutics的Umbralisib和璎黎的林普利塞片（因他瑞），除了诺华的Alpelisib是抑制剂PI3Ka，大部分都是抑制PI3Kδ（图3）。       图3. 获批上市的5款PI3K抑制剂信息       然而上市的药物由于安全性问题被大规模撤回适应症。2021年Secura Bio 撤销了duvelisib 复发性或难治性FL的适应症，2022年6月30日，FDA再一次对duvelisib可能会增加慢性血癌（CLL/SLL）患者的死亡和严重副作用风险发出安全性警告，同年9月23日，FDA召开审议duvelisib与奥法木单抗（ofatumumab）治疗复发性/难治性CLL/SLL的5年对照试验DUO数据的会议。       结果表明与奥法木单抗相比，duvelisib完全不仅没有总生存期（OS）优势，还明显出现了更高的毒性（图4）[2]。因此，FDA肿瘤药物咨询委员会以8：4的投票结果，反对批准Duvelisib三线治疗CLL/ SLL的适应证，这几乎等同于建议Duvelisib退出美国市场。       图4. duvelisib与奥法木单抗临床试验数据       除了duvelisib之外， 2022年1月14日，吉利德的Idelalisib也从美国被撤销了2个适应症FL和SLL。去年TG therapeutics也撤回了Umbralisib的滤泡性淋巴瘤（FL）和边缘区淋巴瘤（MZL）适应症。       不仅如此，还有一些新药上市申请也被拒绝，如拜耳的Copanlisib（Aliqopa）在欧盟用于治疗边缘区淋巴瘤（MZL）的上市申请被拒绝，FDA拒绝了TG Therapeutics的Umbralisib慢性淋巴细胞白血病（CLL）新药申请的批准（图5）[2]。       图5. 被FDA撤回适应症和被NDA拒绝申请的PI3K药物       国内目前只有石药集团从Verastem引进的PI3Kδ/γ双重抑制剂度维利塞胶囊（Duvelisib）和璎黎/恒瑞的林普利塞片上市。       林普利塞是由璎黎研发的PI3Kδ抑制剂，结构如图6所示，2021年2月8 日，恒瑞医药对璎黎药业进行2000万美元股权投资（占总股本6.67%），并获得了林普利塞在大中华地区的联合开发权益以及排他性独家商业化权益。林普利塞于2022年11月获NMPA附条件批准，用于既往接受过至少两种系统性治疗的复发或难治FL成人患者，成为首个国产上市的PI3Kδ抑制剂。       图6. 林普利塞结构       8月15日， CDE 官网显示林普利塞拟纳入优先审评，用于既往接受过一线充分治疗的复发和/或难治性外周 T/NK 细胞淋巴瘤成人患者。       去年欧洲血液学协会（EHA）年会公布了林普利塞治疗R/R FL患者的中国2期临床试验最新数据：患者总缓解率（ORR）为79.8%，中位PFS为13.4个月，中位缓解持续时间（DOR）为12.3个月，疾病控制率（DCR）96.6%，12个月OS率为91.4%。       今年1月13日，林普利塞片正式进入临床应用，由哈尔滨血液病肿瘤研究所马军教授和苏州大学附属第一医院吴德沛教授开出首批处方，零售价格为22800元人民币/120粒/20mg/盒。       其它在研的PI3K抑制剂       尽管如此，PI3K的研发竞争还是很厉害，不少大药企仍然在开发PI3K抑制剂，如诺华、罗氏、安进和阿斯利康等，国内也有很多药企在开发PI3K的抑制剂如百济神州和信达等（图7）。       但是如前面所示，PI3K药物开发困难重重，即使上市了都有可能因为毒性问题被撤适应症，其它新药的研发也遇到种种困难，去年2月份，Incyte公司向FDA撤回了parsaclisib针对FL、MZL和套细胞淋巴瘤（MCL）的新药上市申请（NDA），随后3月份，FDA拒绝了MEI Pharma的zandelisib上市申请，临床上也有很多PI3K抑制剂被终止，如Pilaralisib（XL147）、Sonolisib（PX-866）和SAR260301等。       Parsaclisib是由美国Incyte研发的靶向PI3Kδ的新型口服抑制剂，对于抑制PI3Kδ在恶性B细胞淋巴瘤的生长、存活中起到重要作用。在临床前研究中，它展现出的高选择性和有效性的数据使其有潜力为淋巴瘤及其它恶性血液肿瘤患者提供临床获益。2018年底，信达生物制药和Incyte达成战略合作和独家开发协议，信达生物以高达约3.9亿美元（含4000万美元首付款）的总金额引进了pemigatinib（FGFR1/2/3抑制剂）、itacitinib（JAK1抑制剂）及parsaclisib（PI3Kδ抑制剂）三款产品。       2022年10月25日，帕萨利司片（parsaclisib，IBI376）在中国首次申报上市，随后11月，parsaclisib被CDE纳入优先审评，用于既往接受过至少两种系统性治疗的复发或难治性FL成人患者。2023年1月6日，parsaclisib的新药上市申请获得CDE受理。此次NDA受理基于parsaclisib的一项在中国开展的II期临床（NCT04298879）研究结果：在既往接受过至少两种系统性治疗的FL患者（n=61）中，客观缓解率（ORR）为86.9%，完全缓解率（CR）为31.1%，部分缓解（PR）率为55.7%。中位缓解持续时间（DOR）和中位无进展生存期（PFS）尚未达到。       然而今年4月份Incyte公司宣布缩减其研发管线，共终止6项研究，其中包括结束parsaclisib针对温抗体型自身免疫溶血性贫血的3期研究。       图7. 部分临床在研的PI3K药物       PI3Kα H1047R变构抑制剂       上市的5款PI3K药物中只有诺华的Alpelisib（Piqray）是靶向PI3K，于2019年5月24日被FDA批准上市，与氟维司群联合用于激素受体（HR）阳性，人表皮生长因子受体2（HER2）阴性，PIK3CA突变，晚期或转移性乳腺癌绝经后女性和男性。       2022年4月6日，alpelisib被FDA批准新的适应症，用于治疗需要接受系统治疗的PIK3CA相关过度生长疾病谱系（PROS）成人和2岁及以上儿童患者，成为首 个被FDA批准的PROS治疗药物。       不同于其它PI3K抑制剂，Alpelisib获批之后销量不错，2020销售额突破3亿美元，得益于PROS适应症的获批，2023年第一季度销售额达到1.16亿美元，同比增长61%，第二季度销售额达到1.3亿美元，同比增长54%。       Alpelisib的表现振奋人心，基于此，很多药企开发选择性PI3Ka抑制剂，如罗氏的Inavolisib和Petra Pharm的Serabelisib等。       PI3Kα是一种异二聚体，由催化亚基p110α和调节亚基p85α组成，催化亚基p110α在癌症中经常发生突变，主要包括E542K、E545K和H1047R，很多药企开始研发靶向PI3Kα突变位点的选择性抑制剂，如礼来的LOXO-783、Relay Therapeutics的RLY-2608和Scorpion的STX-478等（图8）[3]。       图8. PI3Ka结构以及突变位点       LOXO-783是礼来研发的靶向PI3Kα H1047R突变位点的变构抑制剂，也是礼来非常重视的一款早期研发管线，它是一种强效、高度突变选择性和可入脑的化合物，不抑制野生型PI3Kα、其他PI3K亚型或其他激酶。       目前LOXO-783正在进行两项Ia/Ib 期研究（NCT05894928和NCT05307705），用于治疗 PIK3CA H1047R 突变的晚期乳腺癌和其他实体瘤患者的疗效和安全性，今年2月份，礼来报道了LOXO-783与标准治疗（SOC）在临床前乳腺癌模型中的疗效的数据结果（PIKASSO-01试验，NCT05307705）：LOXO-783结合SOC治疗在含有PI3Kα H1047R（单突变或双突变）的HR+ 和三阴性乳腺癌显示出协同的抗肿瘤功效（图9）[4]。       图9. LOXO-783与SOC治疗联用结果       去年 11 月被NMPA批准临床（受理号：JXHL2200238），成为国内个获批临床的PI3Kα H1047X 变构抑制剂。       RLY-2608是由Relay Therapeutics研发的一款靶向PI3Kα H1047R突变位点的变构抑制剂，对野生型PI3Kα活性很弱。但是今年披露的一项一期临床中期数据显示16例可评估疗效的患者中，9例（56%）的患者肿瘤缩小，仅1例患者达到unconfirmed PR，首次消息影响，Relay的股价一天跌掉36%，创历史新低。不过RLY-2608相比于其他非选择性PI3Kα抑制剂来说安全性优势更为明显，由于副作用导致alpelisib停药的17例患者中，接受RLY-2608治疗后都没有出现3级及以上副作用。       STX-478是由Scorpion基于Drug-hunting platform发现靶向PI3Kα H1047R突变位点的变构抑制剂，使小分子特异性靶向PI3Kα突变体，避免脱靶产生的代谢副作用。STX-478对PI3Kα H1047R的选择性超PI3Kα野生型14倍（IC50:11 nMvs146 nM），STX-478具备适当的CNS渗透性可治疗脑肿瘤，较长的半衰期和最小的峰谷血药浓度支持每日一次的给药并达到良好的治疗指数。       今年5月份，Scorpion Therapeutics宣布STX-478的1/2期临床试验中首次给药，1/2期临床试验将评估STX-478作为多种实体瘤的单一疗法，包括乳腺癌和妇科癌症、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）等，以及单一疗法和与批准的药物联合用于HR+/HER2-乳腺癌患者。Scorpion公司预计将在2024年公布初步的安全性、药代动力学和药效学结果，包括STX-478对提示抗肿瘤活性的潜在生物标志物的影响的数据[5]。       小结       PI3K基因扩增发生在很多肿瘤中，是一个有前景的肿瘤靶点，目前已获批上市5款药物，除了诺华的alpelisib的靶向PI3Ka，其它的都靶向PI3Kd。       但是近几年由于安全性问题很多PI3K上市药物的适应症被撤回，不仅如此，还有一些药物的上市申请也被拒绝，一时间使得PI3K药物研发乌云笼罩。然而诺华的alpelisib逆势而为，不仅获批乳腺癌适应症，去年还获批用于治疗PIK3CA相关过度生长疾病谱系（PROS）成人和2岁及以上儿童患者新的适应症，今年上半年得销量大幅度增加至2.46亿美元。       国内目前获批上市的只有石药集团从Verastem引进的PI3Kδ/γ双重抑制剂度维利塞胶囊（Duvelisib）和璎黎/恒瑞的林普利塞片。近期，林普利塞拟纳入优先审评，用于既往接受过一线充分治疗的复发和/或难治性外周 T/NK 细胞淋巴瘤成人患者。       尽管PI3K的药物研发遭受挫折，但是还是有很多药企仍然在开发不同类型的PI3K抑制剂以及探索它们新的适应症，如pan-PI3K，亚型选择性PI3K抑制剂或者靶向PI3K突变位点的选择性，希望能够减少毒副作用，提高安全性。       References       1.Yan He, Miao Miao Sun, Guo Geng Zhang, Jing Yang, Kui Sheng Chen, Wen Wen Xu and Bin Li, Targeting PI3K/Akt signal transduction for cancer therapy, Signal Transduction and Targeted Therapy (2021) 6:425）       2.https://www.fda.gov/media/161777/download.       3.Discovery and characterization of RLY-2608, the first allosteric, mutant, and isoform-selective inhibitor of PI3Kα.     4.https://www.loxooncology.com/docs/publications/sabcs2022_puca.pdf    5.Scorpion Therapeutics Announces First Patient Dosed in Phase 1/2 Clinical Trial of STX-478, Its Mutant-Selective PI3Kα Inhibitor for the Treatment of Breast Cancer and Other Solid Tumors – Scorpion Therapeutics (scorpiontx.com).智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~