Cetuximab

2026年9月18日，中国药科大学药学院的蒋晟研究团队在JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY上发表了题为“Discovery of Potent and Selective VHL-Recruiting PROTAC Degraders Targeting EGFR with Improved Developability and Potent Anti-NSCLC Efficacy”的文章。 在这篇文章中，研究团队通过整合基于已知临床分子的骨架借用策略与结构导向的PROTAC分子构效关系优化策略，针对非小细胞肺癌治疗中EGFR的PROTAC口服成药性差、血脑屏障穿透能力缺失的开发难题，先后对CRBN、VHL两类E3泛素连接酶配体、连接子长度与组成、VHL配体片段进行多轮迭代修饰，并基于zorifertinib与EGFR的结合模式选取哌嗪位点作为PROTAC连接子出口向量进行分子改造，成功开发出两款强效VHL招募型EGFR PROTAC降解剂C4与D4。这两个化合物对突变型EGFR（Del19、L858R）表现出优异的降解活性和出色的蛋白选择性，C4可诱导肿瘤细胞周期阻滞与凋亡，D4兼具口服生物利用度与血脑屏障穿透能力。 体外活性方面，化合物C4在突变EGFR降解实验中展现出强效的降解能力：在HCC827细胞（EGFRDel19）中DC50为1.41 nM，Dmax达99%；在H3255细胞（EGFRL858R）中DC50为3.30 nM，Dmax达95%。化合物D4在HCC827细胞中DC50为9.14 nM，Dmax达98%；在H3255细胞中DC50为15.2 nM，Dmax达98%。二者对A549细胞的野生型EGFR均无明显降解，定量蛋白质组学显示C4、D4几乎不影响HER2、HER3、HER4等ErbB家族其他成员蛋白水平，表现出良好的靶蛋白选择性。抗增殖活性方面，C4对HCC827细胞的IC50为0.89 nM，D4对HCC827细胞的IC50为3.55 nM。对下游信号轴的抑制表现为EGFR及其下游效应分子ERK、AKT的磷酸化水平显著降低，C4能够诱导HCC827细胞发生G0/G1周期阻滞，同时上调凋亡细胞比例，抑制克隆形成，发挥抗肿瘤细胞增殖效果。 在体内实验中，化合物C4、D4在雌性BALB/c裸小鼠建立的HCC827 NSCLC异种移植模型中分别采用不同给药方案，连续14天给药后动物耐受良好，各组小鼠体重无明显下降，无动物死亡，主要脏器H&E染色未见明显病理性损伤。C4按5 mg/kg、15 mg/kg每周两次静脉注射给药，均可实现明显肿瘤消退，肿瘤消退率分别为 75.4% 和 77.8%；D4按15 mg/kg每日一次口服给药可实现完全的肿瘤生长抑制，肿瘤生长抑制率达到101%。药代动力学分析显示，C4静脉5 mg/kg给药后清除率5.37 mL/min/kg，半衰期5.09 h，但口服30 mg/kg给药后口服生物利用度极差（F＜1%）；D4静脉5 mg/kg 给药后清除率2.45 mL/min/kg，半衰期8.48 h，口服30 mg/kg后具备中等口服生物利用度（F = 11.3%），并且可以穿透血脑屏障，不过脑‑血浆比值较低，后续仍需要进一步优化提升脑部药物暴露水平。 EGFR（表皮生长因子受体）是一种位于细胞膜上的跨膜糖蛋白，属于ErbB受体酪氨酸激酶家族（包括EGFR/HER1、HER2、HER3、HER4），其基因位于人类第7号染色体短臂，编码分子量约170 kDa的蛋白质。在结构上，EGFR由三个主要部分组成：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外域包含约621个氨基酸，由四个亚结构域组成（L1、CR1、L2、CR2），其中L1和L2负责结合配体，CR1区域参与受体二聚化；跨膜域为一段约22个氨基酸的疏水α螺旋，将受体锚定在细胞膜上；胞内域则包含近膜段、酪氨酸激酶结构域和C末端尾部，C末端尾部含有多个自磷酸化位点。EGFR的配体属于EGF家族，包括EGF、TGF-α、AREG、epiregulin、HB-EGF等，这些配体通常以膜锚定前体的形式存在，经ADAM17等金属蛋白酶切割后释放为可溶性形式，以自分泌或旁分泌方式与EGFR结合。配体结合后，EGFR发生构象变化，暴露二聚化臂，形成同源或异源二聚体，进而使胞内激酶结构域发生不对称二聚化并激活，导致C末端酪氨酸残基自磷酸化，为含有SH2或PTB结构域的衔接蛋白提供停靠位点。 EGFR激活后主要启动四条下游信号通路：RAS-RAF-MEK-ERK（MAPK）通路、PI3K-AKT-mTOR通路、PLCγ-PKC通路以及JAK-STAT通路，这些通路共同调控细胞增殖、存活、迁移、血管生成和代谢等过程。在癌症中，EGFR的异常激活是多种上皮来源肿瘤的关键驱动因素，其激活机制包括基因突变、基因扩增和过表达以及配体自分泌/旁分泌增多。在非小细胞肺癌中，EGFR激酶结构域（外显子18-21）的激活突变最为常见，其中外显子19缺失和外显子21的L858R点突变约占所有EGFR突变的90%，这些突变破坏了受体的自抑制机制，使其在不依赖配体的情况下持续激活。在胶质母细胞瘤中，EGFR基因扩增见于约40%的病例，其中约半数表达EGFRvIII，一种持续激活的突变受体。EGFR的过度激活通过下游信号通路增强细胞分裂、抑制凋亡、促进血管生成和肿瘤生长，从而驱动肿瘤的发生与发展。目前，针对EGFR的靶向治疗已成为EGFR突变型非小细胞肺癌等癌症的标准治疗手段，包括小分子酪氨酸激酶抑制剂（如吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼）和单克隆抗体（如西妥昔单抗），但几乎所有患者最终都会出现获得性耐药，如T790M和C797S等二次突变，因此持续开发新型抑制剂以克服耐药仍是当前研究的重点方向。 图1.先前已经报道的EGFR PROTAC的结构。 在整个研究过程中，作者首先针对现有EGFR‑PROTAC普遍存在口服成药性差、给药频率高、缺乏血脑屏障穿透能力的临床转化难题，开展基于zorifertinib骨架的EGFR‑PROTAC设计与系统构效关系探索。具体而言，研究团队选用已经获批、具备优异中枢神经系统穿透能力的EGFR抑制剂zorifertinib作为EGFR靶标配体，依托共晶结构（PDB：4I22）开展分子对接模拟，解析zorifertinib在EGFR ATP结合口袋的结合模式，确认喹唑啉母核与铰链区形成关键氢键，分子上的哌嗪环朝向溶剂暴露区域，该位点可作为PROTAC连接子的连接位点（图2）。随后研究团队优先选择CRBN泛素连接酶配体开展第一轮PROTAC合成，制备A1‑A10系列化合物，将zorifertinib片段分别与泊马利度胺、来那度胺衍生物进行偶联，设置多种不同碳链长度的烷基连接子来探究降解潜力。接下来在携带EGFR Del19突变的HCC827细胞中，采用24 h给药后的蛋白免疫印迹实验评价A1‑A10系列的EGFR降解效果，实验结果显示A1‑A10全部化合物均未表现出有效的EGFR降解活性（图3）。 图2.Linker连接位点的确定和初步的两轮PROTAC的设计 图3.A1‑A10全部化合物均无降解活性 接下来，鉴于CRBN招募系列全部失效，研究团队转而构建VHL招募型PROTAC分子，合成B1‑B6系列，选用经典VHL配体VH032，搭配不同长度烷基链、酰胺键、含氧杂原子改造的连接子探究构效。实验结果表明，六亚甲基碳链的B3活性最优（图4），在30、100、300nM 浓度下24h的EGFR降解率分别达到51%、75%、98%；碳链进一步延长至七亚甲基的B4活性下降，将连接子替换为酰胺键的B5活性部分下降，引入氧原子的B6几乎丧失降解活性。基于B3的活性基础，团队继续开展连接子改造，合成C1‑C11系列分子，评估环己基‑氮杂环丁烷、环己烷等受限构象连接子，同时对VHL配体苄位取代基团、末端杂环母核、连接子成键类型进行多样化修饰；在HCC827细胞中测定该系列分子不同浓度下的EGFR降解效率，筛选得到降解活性里程碑分子C4，在30、100、300nM浓度下24h降解率分别达到94%、98%、98%。CCK‑8细胞增殖实验进一步对B3、C2‑C6等活性分子开展体外抗增殖评估，以zorifertinib作为阳性对照，C4展现出最优的综合活性，IC50达到0.89nM。该系统的构效关系探索明确了E3连接酶类型、连接子长度、连接子刚性、VHL配体结构对EGFR‑PROTAC降解效力的影响规律，为后续进一步优化得到口服可利用的D4分子奠定坚实的先导化合物基础。 图4.化合物C4的发现历程 接下来，在获得高活性先导化合物C4之后，作者开展化合物C4的降解性质表征、作用机制解析以及体外抗肿瘤活性评价工作。具体而言，研究团队首先在HCC827（EGFR^Del19）和H3255（EGFR^L858R）细胞上检测C4浓度依赖性EGFR降解能力，结果显示C4在最高10μM 浓度范围内未观察到hook效应，在HCC827细胞中DC50 = 1.41nM、Dmax=99%；H3255细胞DC50 = 3.30nM、Dmax=95%，而在A549细胞中对野生型EGFR无明显降解（图5A‑C）。降解动力学实验，使用30nM C4处理HCC827细胞，结果处理6h后EGFR水平即显著下降，12h降解超过80%，降解效果可以维持至48h（图5D）。定量蛋白质组学分析，500nM C4处理HCC827细胞24h，一共鉴定超过8000个蛋白，C4可以显著下调EGFR，对HER2、HER3、HER4等ErbB家族其余蛋白几乎无影响，仅观察到JUND发生明显下调，证实C4具备较好的靶标选择性（图5E）。 图5.化合物C4的体外活性表征。 为阐明降解机制，研究团队分别使用蛋白酶体抑制剂MG132、NEDD8激活酶抑制剂MLN4924、溶酶体抑制剂氯喹CQ、EGFR抑制剂zorifertinib、VHL配体VH032对HCC827细胞进行预处理，再给予C4处理；实验结果显示MG132、MLN4924、zorifertinib、VH032均能够阻断C4介导的EGFR降解，而溶酶体抑制剂CQ不能阻断降解，证明C4依赖泛素‑蛋白酶体系统，并且同时结合EGFR与VHL蛋白才能发挥降解作用（图6A）。随后研究团队评价C4体外抗肿瘤表型，克隆形成实验证实C4呈浓度依赖性抑制HCC827细胞克隆生成，30nM条件下可以完全消除克隆形成；流式细胞检测表明C4诱导HCC827细胞发生G0/G1细胞周期阻滞，同时浓度依赖性提升细胞凋亡比例；蛋白免疫印迹结果显示C4降解EGFR之后，EGFR、ERK、AKT的磷酸化水平明显被抑制，总蛋白水平基本保持不变（图6B-E）。 图6.化合物C4的降解机制和体外抗肿瘤表型研究 随后，研究团队在ICR小鼠上开展C4体内药代动力学研究，分别采用静脉5 mg/kg、口服30 mg/kg给药；C4静脉给药清除率CL = 5.37mL/min/kg，半衰期T1/2=5.09h，但是口服暴露极低，口服生物利用度F＜1%，无法实现口服给药，提示需要新一轮分子改造，以改善口服生物利用度以及血脑屏障穿透性能（图7）。 图7.C4的体内药代动力学研究 接下来，在明确C4体外活性优异但口服生物利用度很差的成药性短板之后，作者进行新一轮分子设计，开展D系列PROTAC分子的设计、合成、体外活性筛选。具体而言，研究团队以降低氢键供体数量、提升口服生物利用度和血脑屏障通透性为改造目标，选用氢键供体更少的VHL配体VH101替换原来的VH032，选择叔亮氨酸位点作为连接子接入位点，引入硫醚连接方式，避免额外引入NH氢键供体。随后使用烷基、炔基、苯基、反式‑环己基、顺式-环己基等多种不同类型连接子将VH101配体与zorifertinib的哌嗪片段偶联，得到D1‑D5共5个目标化合物。在HCC827细胞中经24h处理后通过蛋白免疫印迹评估降解活性（图8），烷基(D1)、炔基(D2)、苯基(D3)、反式‑环己基(D4)均表现强效降解，30 nM下降解率大于50%，100 nM下降解率大于80%；而顺式‑环己基类似物D5降解活性明显减弱。接下来利用CCK‑8实验检测D1‑D5对HCC827细胞的体外抗增殖活性，以 zorifertinib作为阳性对照，D4的IC50为3.55nM，活性与阳性对照接近，综合表现最优，因此选定D4开展后续研究。 图8.D系列PROTAC分子的设计 接下来，研究团队进一步表征D4的降解特征。D4在HCC827（EGFR^Del19）细胞DC50=9.14nM，Dmax=98%；H3255（EGFR^L858R）细胞DC50 = 15.2 nM，Dmax = 98%；在A549细胞中对野生型EGFR无显著降解（图9A‑C）。降解动力学实验显示30 nM D4处理HCC827细胞，6h内EGFR降解率超过80%，降解效果可持续48h（图9D）。500nM D4处理HCC827细胞24h的定量蛋白质组学结果表明，D4可以高效降解EGFR，对HER2、HER3、HER4等ErbB家族其他成员几乎无影响，仅观察到POLR3G出现显著下调，证实D4具备良好靶标选择性（图9E）。完成D4体外活性评价之后，研究团队在ICR小鼠上开展D4体内药代动力学评价，分别实施静脉5 mg/kg、口服30 mg/kg 给药；D4静脉给药清除率CL = 2.45mL/min/kg，半衰期T1/2 = 8.48h；口服给药获得良好暴露，口服生物利用度F = 11.3%；同时脑组织样品检测证实D4具备血脑屏障穿透能力，但脑‑血浆比值小于0.035，脑部绝对药物浓度仍然偏低。 图9.化合物D4的体外活性表征。 最后，作者开展C4、D4在HCC827裸鼠异种移植模型的体内抗肿瘤药效学研究（图10）。具体而言，研究团队将HCC827细胞接种至雌性BALB/c裸鼠的左胁部，待平均肿瘤体积达到150‑200mm³时，将小鼠随机分为5组，每组6只，分别为溶剂对照组、D4（15mg/kg，口服，每日一次）、C4（5mg/kg，静脉，每周两次）、C4（15mg/kg，静脉，每周两次）以及阳性对照zorifertinib（15mg/kg，口服，每日一次），给药周期14天。肿瘤体积监测结果显示：口服D4组实现101%的肿瘤生长完全抑制；C4低剂量5mg/kg、高剂量15mg/kg静脉每周两次给药，分别实现75.4%、77.8%的肿瘤消退；阳性对照zorifertinib组肿瘤消退率为92.8%。整个给药周期内记录小鼠体重变化，所有给药组均无明显体重下降，无动物死亡，提示C4与D4在该给药条件下体内耐受性良好。研究人员取各组动物的心、肝、脾、肺、肾主要脏器进行H&E组织病理染色，切片未见明显组织损伤病变，进一步证明两个化合物具备可接受的体内系统安全性。 图10.化合物C4,D4体内抗肿瘤活性研究 综上所述，本文作者围绕NSCLC治疗中EGFR‑PROTAC成药性差、口服利用度不足、缺少血脑屏障穿透能力的难题，基于骨架借用结合构效关系导向的PROTAC药物设计策略，先后评估CRBN、VHL两类E3泛素连接酶配体，系统探究连接子长度、构型、化学组成以及VHL配体结构对降解活性的影响，合成多系列PROTAC分子，最终通过多轮结构优化获得代表性化合物C4与D4。C4对EGFR^Del19的DC50为1.41nM、Dmax=99%，对EGFR^L858R的DC50为3.30nM、Dmax=95%，蛋白组学显示对ErbB家族其他成员几乎无降解作用。细胞水平对HCC827细胞72 h抗增殖IC50可达0.89nM，能够诱导肿瘤细胞G0/G1周期阻滞与细胞凋亡，抑制下游EGFR‑ERK‑AKT信号通路。在HCC827异种移植模型中，C4以5 mg/kg、15 mg/kg每周两次静脉给药实现明显肿瘤消退，动物体重无明显下降，脏器H&E染色未见器官毒性，但口服生物利用度不足1%；经过进一步改造得到的D4，口服生物利用度达到11.3%，具备血脑屏障穿透能力，15 mg/kg每日口服给药14天可实现101%的肿瘤生长抑制，体内耐受性良好。该研究报道了VHL招募型EGFR PROTAC降解剂C4和D4在非小细胞肺癌中的应用，为开发可口服、具备血脑屏障渗透潜力的下一代EGFR靶向治疗手段提供了降解强效、选择性良好、体内药效明确的PROTAC先导分子范例。 原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01893 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓