Cetuximab

2025年9月24日发表于Molecular Cancer 摘要 RAS信号通路，特别是KRAS、NRAS和HRAS基因突变，在多种癌症的发生发展中起着关键作用。多年来，由于RAS蛋白表面光滑且缺乏深结合口袋，它们一直被认为是“不可成药”的。然而，近年来针对特定RAS突变（尤其是KRAS G12C突变）的靶向治疗取得了突破性进展，彻底改变了这一领域。共价抑制剂的发现，尤其是那些能够结合KRAS G12C半胱氨酸残基附近变构口袋的抑制剂，促成了FDA批准药物的研发，这标志着RAS靶向治疗领域的一个重要里程碑。本文全面概述了直接RAS抑制剂的发展历程，重点介绍了小分子抑制剂、分子胶、蛋白降解剂和其他新兴策略的化学开发。我们着重阐述了KRAS抑制剂的结构演变，从基于共价片段的方法到非共价抑制剂以及泛RAS靶向策略。此外，本文还探讨了关键抑制剂的临床进展，包括其疗效、耐药机制和联合治疗方案。最后，本文还探讨了其他创新方法，例如环肽抑制剂，并概述了RAS靶向治疗策略的未来发展方向。RAS靶向治疗的成功凸显了克服RAS“不可成药”特性的巨大潜力，为RAS驱动型癌症患者带来了新的希望。 背景：RAS在癌症中的概述 RAS信号通路受到精细调控，以维持正常的细胞功能。RAS蛋白属于小GTP酶家族，作为分子开关，在活性和非活性状态之间切换，控制着包括细胞增殖、存活、分化和迁移在内的关键过程。当细胞外信号（主要是生长因子）与细胞膜上的受体酪氨酸激酶（RTK）结合时，RAS信号通路被激活。这种结合触发受体二聚化和自身磷酸化，从而为衔接蛋白（例如生长因子受体结合蛋白2 (GRB2)）提供结合位点，GRB2进一步募集SOS1。SOS1是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），催化RAS上GDP与GTP的交换，使其转化为活性形式。RAS一旦被激活，便会与多个下游效应分子相互作用，其中最显著的是RAF激酶，进而激活MEK和ERK磷酸化级联反应，从而调控参与细胞生长和分化的基因表达。PI3K/AKT/mTOR通路是RAS激活的另一条关键通路，可促进细胞存活和代谢活性。此外，RAS还能激活Ral-GEF通路，影响细胞骨架动力学和细胞迁移。在正常情况下，RAS的激活是短暂的，GTP酶激活蛋白（GAPs），例如神经纤维蛋白（NF1），会加速GTP水解为GDP，从而使RAS失活，进而严格调控其信号传导。 RAS基因突变或扩增发生于超过20%的人类癌症中，使其成为最常见的异常之一。最常见的突变发生在12、13和61号密码子，这些突变使RAS对GAP催化的GTP水解为GDP不敏感。这些突变使RAS主要锁定在GTP结合的活性状态，导致下游信号通路持续激活，即使在没有外部生长信号的情况下也是如此。KRAS是最常见的突变亚型，在高达90%的胰腺腺癌、40%的结直肠癌(CRC)和25%的非小细胞肺癌(NSCLC)中均有发现。HRAS突变不太常见，但出现在膀胱癌和头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 等癌症中，而NRAS突变在黑色素瘤和血液系统恶性肿瘤中很普遍。 癌症中RAS的激活会导致细胞不受控制地分裂和抵抗凋亡，从而驱动转移和血管生成。多年来，由于RAS的结构特征——光滑的表面缺乏小分子有效结合的深口袋——它一直被认为是“不可成药”的靶点。然而，近年来针对特定RAS突变（尤其是KRAS G12C突变）的靶向治疗取得了突破性进展，展现出良好的前景。2013年，Kevan Shokat及其同事发现了一种化合物，该化合物能够与半胱氨酸残基附近新发现的变构口袋（称为开关II口袋）共价结合，并将半胱氨酸残基捕获在非活性GDP结合状态。这项工作促成了多种KRAS G12C突变特异性抑制剂的开发，其中sotorasib和adagrasib是美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准用于治疗至少接受过一次全身治疗的局部晚期或转移性NSCLC患者的前两种KRAS G12C抑制剂。 这两种药物的成功引发了RAS靶向治疗药物研发的爆炸式增长，打破了RAS“不可成药”的长期认知。它们为靶向其他KRAS突变（例如G12D）、泛KRAS和泛RAS突变开辟了新的途径，并推动了探索新型RAS靶向策略的研究热潮。图1概述了RAS直接靶向策略发展的关键事件以及相关药物结构的正式发布日期。 本文将概述RAS蛋白的直接抑制策略，重点关注以下两方面：（1）RAS靶向药物的化学演变，包括小分子抑制剂、分子胶（RAS-ON抑制剂）、蛋白降解剂和其他新兴方法；（2）关键抑制剂的临床前和临床开发现状。 图1. 直接 RAS 抑制剂研发历程中的里程碑。 RAS小分子抑制剂的化学演变 KRAS蛋白对GTP/GDP具有皮摩尔级的高亲和力，但缺乏合适的药物结合口袋，这使得KRAS药物的研发极具挑战性。KRAS G12C抑制剂的研发揭示了一种关键的药理机制：共价靶向能够不可逆地稳定非活性（OFF态）KRAS构象，尽管其基础水平低于活性（ON态）KRAS。这些抑制剂通过与突变半胱氨酸残基形成共价键，形成动力学上被捕获的复合物，其解离常数接近无穷大。这种共价结合从根本上改变了ON态和OFF态之间的热力学平衡，驱动KRAS构象向非活性构象转变，从而抑制下游信号传导。这种范式展现出优于传统占位驱动抑制的优势，它证明共价修饰可以强制重编程动态蛋白质状态，即使靶向构象不利的异构体也是如此。此外，人们已经认识到，通过共价靶向，可以固定先导化合物的结合模式/区域和取向，从而可以逐步优化先导分子中的其余片段，极大地加速药物开发过程。 本节将重点探讨KRAS抑制剂研发过程中分子结构的演变。通过阐述抑制剂结构从先导化合物到类药共价抑制剂的转变，以及抑制剂从单突变靶向抑制剂到广谱抑制剂的研发路径，本节将清晰地展现该领域的发展轨迹。 KRAS抑制剂从共价片段的起源发展 此前，大多数共价抑制剂都是偶然发现的，或是通过将共价活性基团引入现有药物骨架而获得的。然而，2013年，Shokat课题组利用Sunesis公司科学家开发的半胱氨酸连接技术，鉴定出化合物12（图2）。该化合物能够通过与KRAS的开关II口袋结合并与KRAS G12C形成共价键，从而共价靶向KRAS的G12C位点。尽管化合物12缺乏成药特性，但它为后续的分子优化奠定了基础。后续的设计和修饰始终保留了能够与G12C共价结合的丙烯酰胺结构，为所有候选分子提供了明确的结合口袋和方向，显著提高了后续分子优化的效率。 图2. 针对特定KRAS突变体或泛KRAS的直接抑制剂的结构演变。 2014年，Araxes公司基于化合物12，调整了丙烯酰胺部分与Cys12残基之间的距离，使其形成共价键，从而开发出ARS-853，其细胞IC50为2 μmol /L（图2）。尽管其药代动力学性能和体内疗效较差，但这一初步优化为KRAS抑制剂的进一步开发提供了宝贵的经验。 此外，Araxes公司对候选化合物进行了大量的结构修饰，以优化其结合部分，并进一步鉴定出分子ARS-1620（图2）。2015年，ARS-1620的结构在一项专利（WO2015054572）中公开，相关的体内活性数据于2018年发表。ARS-1620的开发不仅首次证明了KRAS抑制剂的体内活性，而且为后续众多KRAS G12C抑制剂的设计提供了基础核心结构和起点。这些修饰过程中积累的经验，以及通过专利申请与科学界分享的信息，启发了其他公司和学术机构的研究团队，从而促进了新分子的研发。 随后，安进公司受ARS-1620结构的启发，开发了首个获得FDA批准的KRAS G12C抑制剂药物AMG 510（图2）。最初，安进与Carmot Therapeutics公司合作，共同开发靶向G12C的抑制剂。在先导化合物优化阶段，ARS-1620的结构专利于2015年公开（WO2015054572）。安进借鉴ARS-1620的结构特征，并结合自身在构效关系研究方面的经验，在喹唑啉的N1原子位置引入并延伸了一个新的侧链，从而生成了AMG 510分子。此外，后续针对G12C的快速后续药物，如garsorasib、glecirasib、fulzerasib和MK-1084，也采用了类似的策略，它们均通过对该区域进行不同的结构替换而取得成功（图2）。AMG 510（Sotorasib）及其后续快速后续药物的卓越成就，极大地革新了该领域，堪称最重要的里程碑。 在ARS-1620奠定的基础上，阿斯利康的研究人员创造性地将喹唑啉和哌嗪环化，生产出AZD4625（图2），这一修饰将分子构象限制为有利的结合构象，同时还提高了生物利用度并减少了肝外清除率。 这种环化改进不仅为进一步的药物优化提供了宝贵的见解，而且还可作为参考先导化合物。首先，研究人员通过保留核心环化结构并去除一个杂环，对AZD4625进行了进一步修饰，得到了AZD4747，该化合物能够有效穿透血脑屏障（BBB），从而开发出靶向中枢神经系统的药物分子（图2）。此外，这种环化策略也启发了KRAS G12D抑制剂的开发，例如HRS-4642和GFH375（图2）（WO2024061370 A1）。 与此同时，MIRATI在KRAS抑制剂的开发中开辟了另一条化学进化之路，并通过片段优化、片段增长和弹头取代等策略贡献了两个重要的里程碑分子。 第一个里程碑是adagrasib (MRTX849)（图2），其中片段优化包括在四氢吡啶位置添加萘环结构，在嘧啶环上添加环戊胺结构。这种优化不仅在中心骨架上引入了新的有利侧链，从而促成了MRTX849的成功，而且还为开发其他KRAS抑制剂（例如divarasib (GDC-6036) (WO2020097537 A2)）提供了新的基团。 第二个里程碑是分子MRTX1133（图2），其设计始于ARS-1620首次引入的芳香双环体系，并直接用哌嗪结构取代丙烯酰胺共价活性基团。这一修饰与Asp 12形成盐桥相互作用，从而优化了靶向KRAS G12D的起始策略，其Kd值为3.5 µM ，为非共价靶向抑制剂的开发奠定了基础。这一进展表明，抑制剂与KRAS结合的驱动力开始从共价锚定位点转变为非共价相互作用。随后对哌嗪结构（包括盐桥形成）、萘环和环戊胺的优化显著提高了抑制剂的性能，每次侧链优化都使效力提升了一个数量级。对先导化合物的这些优化促成了MRTX1133的开发，这是第一个具有临床活性的KRAS G12D抑制剂。 MRTX1133的成功凸显了通过改变活性基团来调控抑制剂分子靶向不同突变体变体的潜力。此外，MRTX1133中萘环和六氢-1H-吡咯嗪基团的优化替换已被广泛应用于其他KRAS突变体或泛KRAS抑制剂的开发。基于MRTX1133和MRTX849的优化基团，通过替换MRTX1133的活性基团，获得了一系列靶向不同KRAS突变的共价抑制剂，包括G12S（Shokat实验室）、G12R（Shokat实验室）、G12D/C（Li实验室）和G12D（Shokat实验室）（图2）。尽管这些分子含有高反应性弹头，由于稳定性低，难以在体内使用，但它们无可否认地支持了这样一种观点：通过改变弹头，可以有效地靶向不同的KRAS突变变体。 此外，这些例子也表明，当中心骨架所有侧链和功能基团的非共价优化达到足够水平时，小分子对共价活性基团与KRAS结合的依赖性会减弱。这一进展为成功开发泛KRAS抑制剂铺平了道路。MIRATI公司的专利申请结果表明，通过保持MRTX1133的核心结构不变，仅替换活性基团，即可获得多种高效的泛KRAS抑制剂（WO2022132200，WO2022133038）。最近，安进公司公开了AMG 410，这是一种源自Mirati Therapeutics公司化合物5结构优化的泛KRAS抑制剂。该分子通过策略性地引入一种新型环化基序而构建，展现出增强的靶点结合能力和类药特性。 本节讨论的大多数分子优先靶向GDP结合的非活性（RAS-OFF）构象，但新兴的结构导向优化策略已筛选出一些化合物，这些化合物开始对GTP结合的活性（RAS-ON）状态表现出可测量的活性。代表性例子包括BBO-8520和FMC-376，后者在临床前评估中表现出RAS-ON/OFF的双重抑制作用。与构象选择性抑制剂相比，这些双态调节剂在临床前模型中显示出更高的治疗效果，这可能是由于它们能够通过同时稳定非活性状态和干扰活性构象中的效应物结合来扰乱GTP酶循环。 KRAS抑制剂从非共价片段的结构演变 事实上，范德比尔特大学Stephen Fesik的团队与勃林格殷格翰 (BI) 的科学家们合作，采用了一种截然不同的方法来开发一系列靶向KRAS的分子。他们利用基于核磁共振 (NMR) 的片段筛选来鉴定新的KRAS结合配体，揭示了开关I/II口袋界面处一个此前未被发现的口袋，这代表了靶向RAS亚型方面的一项突破。他们从筛选出的与开关I/II口袋结合的片段出发，采用片段增长和优化策略开发了多种KRAS抑制剂。由于缺乏共价活性基团的辅助，这无疑是一条从一开始就充满挑战的道路，这主要是因为KRAS本身具有难以成药的特性。 为了鉴定与开关II口袋（不同于开关I/II口袋）结合的片段，研究团队采用了一种此前由Fesik团队开发的阻断KRAS主要结合位点的方法：他们首先将KRAS的G12V突变为C39，并用共价工具片段修饰该半胱氨酸残基，使其占据开关I/II口袋。随后，他们利用HSQC-NMR方法特异性地筛选与开关II口袋结合的片段。通过筛选超过13000个片段，BI的科学家发现了片段1，并对其进行进一步优化，得到片段2（图3）。通过进一步的片段扩增和对片段2的优化，获得了片段3和前体1。值得一提的是，前体1的结构是所有后续BI系列分子的核心结构（图3）。Precursor 1与KRAS的结合区域与MRTX1133具有部分相似性，但存在关键的结构差异。虽然两种化合物均靶向KRAS的保守结合亚区，但Precursor 1缺乏MRTX1133中观察到的延伸至G12区域的化学结构。这种结构上的截短赋予Precursor 1不依赖于G12突变的结合能力，使其能够对多种KRAS突变体保持基础亲和力。比较分析表明，MRTX1133通过与三个关键亚结构域的三价相互作用增强了抑制效力：突变敏感的G12口袋、H95溶剂面向区域和D69极性区域。相比之下，Precursor 1仅与两个亚结构域（H95和D69）结合，尽管其突变兼容性更广，但活性却显著降低。 图3. KRAS抑制剂从非共价结合片段的进化途径。 前体1的简化结合特性为通过策略性结构优化开发功能差异化的 KRAS 抑制剂提供了一个多功能的支架。定向修饰可能包括：1）针对G12的延伸，引入亲电基团或构象限制基序以恢复突变特异性效力；2）优化前体1与H95/D69区域之间的相互作用以增强泛突变体抑制性能。例如，添加连接子和丙烯酰胺共价基团可得到G12C抑制剂BI-0474（图3）（WO2021245055 A1），而引入带正电荷的氨基则可开发G12D抑制剂。此外，由于前体1能够结合多种KRAS突变体，因此通过进一步优化前体1也可获得泛KRAS抑制剂。 在开发一系列用于泛KRAS抑制剂的BI分子过程中，涌现出两个关键分子。第一个是BI-2865（图3）（WO2023099592），其中哌嗪结构片段被优化为吡咯烷结构；第二个是BI-2493（图3）（WO2023099623），其中季碳手性中心被转化为螺环结构。这两个分子均优化了与H95或D69区域的结合，并且与前体1相比，活性显著增强。值得注意的是，将这两个优化片段杂交生成前体2，进一步增强了其活性。参考BI-2865-KRAS复合物的晶体结构，前体2应有向G12区域延伸的空间，表明该区域存在进一步片段延伸的潜力。BI公司近期公布的专利也证实了此类结构的存在（WO2023099624）。专利数据对比显示，该片段向G12区域延伸可增强前体2的活性（图3），从而促进了泛KRAS抑制剂候选药物（BI-3706674）的开发。BI-3706674的详细结构尚未公开；然而，我们在图3中展示了BI公司专利中的类似结构 。该专利的结果表明，这种优化方法可增强KRAS与G12突变无关的结合，这可能进一步推动泛KRAS抑制剂进入临床阶段。 此外，在泛KRAS抑制剂开发中发现的优化结构基序（与H95区域结合）也可用于进一步改进G12C共价抑制剂。例如，将BI-2865中的环戊胺片段引入BI-0474中以取代哌嗪基团，可进一步提高其效力，该基团也用于临床阶段的G12C抑制剂BI-1823911中。 此外，通过对每个侧链和功能基团进行广泛的优化，使其与KRAS形成强非共价结合，该抑制剂对化学修饰的耐受性大大提高。这一优势不仅允许添加活性基团以开发不同的共价抑制剂，而且还允许添加连接子-降解基团以降解蛋白质，从而实现对多种KRAS突变蛋白的降解。在BI的优化过程中鉴定出的优化侧链和功能基团再次拓展了我们开发新型KRAS抑制剂的工具集。 RAS(ON)抑制剂的结构演化源于CypA依赖性分子胶 尽管Mirati和勃林格殷格翰在分子设计和开发方面采取了不同的策略，但Revolution Medicines (RMC) 开创了一种作用机制 (MOA) 独特的KRAS抑制方法。RMC系列化合物采用了一种创新的分子胶策略，这与传统的直接结合小分子抑制剂截然不同（图4）。这些化合物特异性地与环孢亲和素A (CypA) 结合，重塑其表面拓扑结构，同时利用CypA和KRAS之间的静电互补性，实现与活化（ON状态）KRAS蛋白的靶向结合。 图4. RAS(ON)抑制剂的设计与化学演变。 这种经过合理设计或筛选的分子粘合剂，在蛋白质降解领域之外的临床应用中鲜有成功案例，且风险和不确定性较大。然而，后续的临床前和临床数据已充分验证了这一开创性方法的有效性。该策略已成为KRAS抑制剂研发领域最有前景的方向之一，印证了突破性创新往往源于对具有挑战性的科学前沿的探索这一真理。 Revolution Medicines公司利用小分子丰富的化学空间和基因编码蛋白广泛的相互作用界面，提出了一种“三元复合物抑制剂”开发平台（图4）。该平台促进了一系列分子胶状大环肽模拟抑制剂的开发，这些抑制剂能够化学重塑分子伴侣蛋白CypA的表面，并与活化的RAS形成三元复合物，从而阻止下游效应分子与RAS结合，进而下调致癌信号通路。CypA和KRAS之间的相互作用界面具有互补的表面电荷，这为它们的结合提供了基础。这种天然优势表明，修饰CypA的天然配体有可能重塑CypA的表面拓扑结构，从而增强CypA与KRAS的相互作用。 该平台的概念验证最初侧重于靶向KRAS G12C突变体。Revolution Medicines公司从桑格非林A中提取了最小的CypA结合结构单元，并将其与能够与G12C形成共价键的二硫键基团偶联，从而验证了这一策略。进一步的构效关系研究和侧链优化最终确定了其通用结构式。对A/B基团和L/C基团（图4）的优化分别用于提高KRAS结合能力和药代动力学性能。 第一个优化分子是RMC-4998（图4），它具有独特的构象受限螺环连接基和炔酰胺活性基团，从而具有良好的类药性质。进一步优化，包括将通用结构式中L片段的芳香环替换为吗啉，得到了RMC-6291（图4），该分子已进入临床试验。 来自RMC-4998的螺环骨架和来自RMC-6291的吗啉连接基随后被杂交到RMC-9805中，RMC-9805通过其氮丙啶活性基团共价靶向G12D突变。此外，在RMC-9805的开发过程中，构效关系研究促使在RMC-9805上引入哌啶部分，该部分随后被用于泛RAS抑制剂RMC-6236和RMC-7977的开发。此外，在这些抑制剂的开发过程中，吗啉连接基被优化为噻唑部分，随后该噻唑部分被引入到me-better泛KRAS抑制剂ERAS0015（WO2024067857 A1）中。此外，RMC-6236/9805/7977的进一步优化促进了RMC-5127（用于G12V）、RMC-0708（用于Q61H）和RMC-8839（用于G13 C）的开发。 这种结构元素的系统性演变体现了一种合理的药物设计方法，其中成功的结构基序被策略性地纳入并优化于多代化合物中，从而产生越来越有效且突变覆盖范围更广的KRAS抑制剂。 针对RAS的靶向蛋白降解剂 由于已获批准的KRAS G12C药物的疗效低于预期，并且面临耐药机制的快速发展，导致药效降低，许多项目开始开发KRAS降解方法，希望能够超越并取代已进入临床的第一代G12C抑制剂。 与抑制KRAS功能相比，RAS蛋白的降解遵循事件驱动而非占据驱动的药理学范式。此外，在非共价结合的情况下，降解剂通过催化作用降解超化学计量量的RAS蛋白。因此，降解有望成为调节下游信号通路的一种更有效的方法。 2019年，Gray研究小组开发了KRAS G12C降解剂XY-4-88，该降解剂利用不同的碳链、PEG链和叔胺连接基将CRBN配体泊马度胺与KRAS G12C抑制剂偶联。然而，XY-4-88只能降解293T细胞中过表达的GFP-KRAS G12C，而不能降解MiaPaCa2和H358细胞中的内源性KRAS G12C蛋白。这些结果表明，多聚泛素化可能发生在融合的GFP上，而不是KRAS G12C蛋白上，改变降解剂的结构单元或许可以解决这个问题。 2020年，Crews研究组通过将VHL配体与MRTX849偶联，开发了第一个针对内源性KRAS G12C的PROTAC分子LC-2（图5）。LC-2是一种针对KRAS G12C的强效PROTAC分子，其DC 50值低于微摩尔级，并且能够有效降解不同G12C突变细胞系中的KRAS蛋白。 图5. 代表性的KRAS降解酶。 随后，其他KRAS G12C降解剂相继被报道，例如YF135、KP-14和YN14，它们均使用VHL配体，并实现了内源性KRAS G12C蛋白的降解（图5）。有趣的是，LC-2、YF135和KP-14均使用相似的取代位置将连接子-VHL配体锚定在KRAS抑制剂上，且它们的DC值均达到微摩尔级。而YN14分子中，连接子-VHL配体锚定在AMG 510的酚羟基上，其DC50值达到纳摩尔级，表明取代位置对KRAS PROTAC分子的效力至关重要。 值得注意的是，KRAS G12D降解剂ASP3082（图5）已成为KRAS降解剂临床开发的先驱。ASP3082由KRAS G12D结合剂、VHL配体和一个极短的刚性连接子组成。与YN14类似，ASP3082具有独特的取代位点，可将连接子-VHL配体锚定，并在降解KRAS G12D方面表现出显著的效力（WO2022173032 A1）。此外，ASP3082不仅在胰腺导管腺癌（PDAC）中展现出显著的抗肿瘤活性，而且在携带KRAS G12D突变的结直肠癌（CRC）和非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠模型中也表现出显著的抗肿瘤作用。 最近，Ciulli研究组开发了一种选择性强、高效且具有体内活性的泛KRAS降解分子ACBI3（图5）。ACBI3以BI-2865为泛KRAS结合剂，VHL为降解部分，在GP2d细胞中对KRAS蛋白的降解表现出极强的DC 5值（3.9 nmol/L），并且在异种移植瘤模型中也显示出有效的肿瘤生长抑制作用。 KRAS的降解，尤其是泛KRAS的降解，通过直接“标记”KRAS蛋白使其被蛋白酶体降解，提供了一种很有前景的替代方案，理论上可以克服抑制方法的局限性。KRAS降解剂具有以下几个优势：（1）其作用机制不依赖于与活性位点的持续结合，因此可能覆盖更广泛的突变类型；（2）KRAS蛋白的完全清除可防止残余信号传导和耐药突变的出现；（3）该方法可能对过表达的野生型KRAS也有效；（4）降解过程会产生突变型KRAS肽片段，特别是那些与药物分子共价修饰的片段，这些片段可以作为免疫系统识别的新型抗原，从而增强治疗效果。 尽管有这些优势，但KRAS降解剂的开发仍面临一些挑战：（1）PROTAC的大分子量可能会影响体内递送效率；（2）降解剂对正常组织中KRAS的影响需要进行严格的评估，以避免潜在的毒性。 尽管面临这些挑战，但新型KRAS抑制剂的研发、蛋白质降解技术的进步以及肿瘤特异性递送系统的进展，为KRAS降解剂的开发带来了巨大的机遇。KRAS降解剂的开发有望为KRAS驱动的肿瘤提供更通用、更有效、更持久的治疗策略，从而满足亟待解决的临床需求。 临床研发中直接KRAS抑制剂的概述 随着作用机制各异的KRAS抑制剂的研发，一系列KRAS G12C抑制剂、KRAS G12D抑制剂、泛KRAS抑制剂和泛RAS抑制剂开始进入临床试验，其中一些显示出显著疗效。这些抑制剂利用不同的作用机制，表明针对RAS的多种靶向策略已取得初步的临床成功。然而，单药KRAS靶向治疗经常遇到耐药性，因此需要开发联合治疗策略以克服耐药性并提高临床疗效。本节重点介绍(K)RAS抑制剂的关键临床研究，尤其是在非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺导管腺癌(PDAC)和结直肠癌(CRC)中的应用，并在表1中总结了当前的临床研发阶段。 表1. 直接靶向RAS抑制剂的当前临床开发阶段 靶向KRAS G12C突变 KRAS在非活性、GDP结合（OFF）状态和活性、GTP结合（ON）状态之间循环。根据药物靶向的KRAS状态，KRAS G12C抑制剂可分为KRAS(OFF) 抑制剂和KRAS(ON) 抑制剂。OFF状态抑制剂靶向非活性、GDP结合的KRAS形式，而 (ON) 状态抑制剂则结合活性、GTP结合的KRAS形式。两种类型的KRAS G12C抑制剂均已进入临床试验阶段。 索托拉西布和阿达格拉西布是两种KRAS G12C (OFF)抑制剂，在KRAS G12C突变型非小细胞肺癌（NSCLC）中展现出良好的临床疗效，KRAS G12C突变在NSCLC患者中的发生率约为13%～15%。在CodeBreak 100 I/II期临床试验中，索托拉西布的客观缓解率（ORR）为41%，中位无进展生存期（mPFS）为6.3个月。同样，阿达格拉西布在KRYSTAL-1 I/II期临床试验中也展现出类似的疗效，ORR为42.9%，mPFS为6.5个月。这些结果促使FDA分别于2021年和2022年加速批准了sotorasib和adagrasib。然而，3期CodeBreak 200试验的结果表明，虽然sotorasib的ORR为28.1%，mPFS为5.6个月，优于多西他赛，但它并未改善总生存期 (OS)，这引发了人们对其长期疗效的担忧，并强调了进一步研究的必要性。 KRAS G12C抑制剂在其他癌症类型中也显示出活性。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，KRAS G12C突变发生率约为1%-3%，索托拉西布（sotorasib）的客观缓解率（ORR）为21%，中位无进展生存期（mPFS）为4.0个月，而阿达格拉西布（adagrasib）的ORR为33.3%，mPFS为5.4个月。相比之下，结直肠癌（CRC）的KRAS G12C突变率约为3%-4%，对这些疗法的反应有限。索托拉西布的ORR仅为9.7%，mPFS为4.0个月，而阿达格拉西布的ORR略高，为19%，mPFS为5.6个月。研究将这些疗效不佳归因于适应性耐药机制，主要涉及通过上游受体酪氨酸激酶（例如EGFR）重新激活MAPK通路。与KRAS抑制剂单药治疗相比，KRAS和EGFR抑制剂联合治疗可显著改善疗效。事实上，索托拉西布联合帕尼单抗的客观缓解率 (ORR) 达到26.4%，中位无进展生存期 (mPFS) 为5.6个月，因此FDA于2025年批准该联合疗法用于治疗KRAS G12C突变型转移性结直肠癌成人患者。此外，阿达格拉西布联合西妥昔单抗的ORR达到46%，mPFS为6.9个月。该联合疗法也于2024年获得FDA加速批准，用于治疗KRAS G12C突变型局部晚期或转移性结直肠癌。这些研究结果强调了通过联合治疗策略优化MAPK通路抑制在CRC治疗中的重要性。 第三种已发表临床数据的KRAS G12C抑制剂，来自基因泰克公司的divarasib，在单药治疗试验中显示出优于sotorasib和adagrasib的疗效。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，divarasib的客观缓解率（ORR）达到53.4%，中位无进展生存期（mPFS）为13.1个月；在结直肠癌（CRC）（ORR为29.1%，mPFS为5.6个月）和胰腺导管腺癌（PDAC）（ORR为42.8%）中也显示出显著疗效。此外，在未接受过KRAS抑制剂治疗的结直肠癌患者中，divarasib联合西妥昔单抗治疗取得了令人瞩目的疗效，ORR达到62.5%，mPFS达到8.1个月。 其他KRAS G12C (OFF)状态抑制剂，包括D3S-001（非小细胞肺癌ORR为66.7%）、fulzerasib（非小细胞肺癌ORR为49.1%）、glecirasib（非小细胞肺癌ORR为47.9%，胰腺导管腺癌ORR为46.4%）、olomorasib（非结直肠癌实体瘤ORR为40%）、GEC255（非小细胞肺癌ORR为76.9%）、HS-10370（非小细胞肺癌ORR为51.2%）、garsorasib（非小细胞肺癌ORR为50%）和MK-1084（非小细胞肺癌ORR为22%）。 KRAS G12C突变型实体瘤）已显示出令人鼓舞的结果（表2）。新一代KRAS抑制剂也正在涌现，它们具有不同的作用机制和更高的疗效。RMC-6291是一种靶向活性KRAS G12C (ON) 状态的三元复合物抑制剂，在既往接受过KRAS G12C (OFF) 抑制剂治疗的非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中取得了57%的客观缓解率 (ORR )，在未接受过抑制剂治疗的结直肠癌 (CRC) 患者中取得了44%的ORR。有趣的是，研究发现KRAS-GTP的积累是KRAS G12C (OFF) 抑制剂相关的耐药机制。这一发现表明，与 (OFF) 状态抑制剂相比，KRAS G12C (ON) 抑制剂可能具有提高临床疗效的潜力。然而，还需要进一步的临床证据来证实这一潜力。值得注意的是，首创的KRAS G12C (ON) 和 (OFF) 形式的直接双重抑制剂BBO-8520已进入KRAS G12C NSCLC患者的1期临床试验(NCT06343402)，比较双重KRAS抑制剂与 (ON) 或 (OFF) 状态抑制剂的疗效将是一件很有趣的事情。 表2. KRAS突变选择性抑制剂和泛RAS抑制剂的临床疗效 针对其他KRAS突变 除了KRAS G12C抑制剂外，针对其他KRAS突变的多种策略也正在研发中，包括小分子抑制剂、蛋白降解剂和分子胶。尽管MRTX1133是一种里程碑式的非共价KRAS G12D靶向抑制剂，但其临床开发已终止。HRS-4642是另一种选择性靶向KRAS G12D的非共价抑制剂，在KRAS G12D突变型晚期实体瘤患者中显示出良好的安全性，61.1%的患者病情稳定，33.3%的患者靶病灶缩小。ASP3082是一种首创的KRAS G12D特异性PROTAC分子，在一项纳入98例晚期KRAS G12D阳性实体瘤（包括胰腺癌 (PC)、非小细胞肺癌 (NSCLC) 和结直肠癌 (CRC)）患者的I期剂量递增研究中，显示出可接受的安全性和良好的抗肿瘤活性。当剂量≥100 mg时，观察到抗肿瘤活性增强，在300 mg剂量下疗效最佳，客观缓解率 (ORR) 为33.3%，疾病控制率 (DCR) 为75.0%。PROTAC的优势在于其催化机制：一旦KRAS被降解，PROTAC可以继续靶向并降解其他分子，从而降低所需的有效剂量。然而，由于PROTAC的分子量较大，ASP3082需要静脉给药，这限制了其频繁和长期治疗。因此，优化PROTAC分子的口服递送将是其临床开发中的关键一步。 RMC-9805和RMC-6236是极具前景的 (K)RAS(ON) 抑制剂，在RAS突变驱动的晚期癌症患者中展现出显著的抗肿瘤活性。RMC-9805是一种特异性抑制RAS(ON) 状态下KRAS G12D的抑制剂，在胰腺导管腺癌 (PDAC) 患者中达到30%的客观缓解率 (ORR)，在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中达到61%的ORR，表明其具有治疗多种KRAS G12D突变型癌症的潜力。RMC-6236是一种多选择性RAS(ON) 抑制剂，可抑制突变型和野生型KRAS、NRAS和HRAS。在针对携带特定KRAS G12突变（包括KRAS G12D、KRAS G12V和KRAS G12R）的晚期实体瘤患者的RMC-6236-001 I/Ib期研究中，该药物展现出令人鼓舞的疗效和安全性。在二线治疗中，携带KRAS G12X突变的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的中位无进展生存期（mPFS）为8.8个月，客观缓解率（ORR）为36%；而所有RAS突变患者的mPFS为8.5个月，ORR为27%。该药物目前也在接受免疫治疗和铂类化疗但未接受多西他赛治疗的RAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）二线或三线患者的试验中进行评估。结果显示，患者的中位PFS为9.8个月，中位总生存期（OS）为17.7个月，ORR为38%。这些(K)RAS(ON)抑制剂共同展现出治疗多种RAS驱动型癌症的巨大潜力，并在难治性患者群体中取得了令人鼓舞的早期临床结果。基于这些令人鼓舞的结果，一项针对既往接受过治疗的转移性胰腺导管腺癌(PDAC)患者的RMC-6236 III期临床试验(NCT06625320)已于近期启动。 克服耐药性的综合策略 尽管KRAS抑制剂在多种癌症类型中均显示出疗效，但单药治疗常导致耐药性，临床获益有限，因此人们广泛探索联合治疗方案。化疗仍然是KRAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PDAC）患者的基石治疗；然而，耐药性常常出现。临床前研究表明，化疗和KRAS抑制剂可能选择性地靶向不同的癌细胞状态或分子亚型。因此，将化疗与KRAS抑制剂联合使用可通过双重机制增强疗效，并可能降低耐药性产生的风险。例如，在CodeBreak 101 Ib期临床试验中，索托拉西布联合铂类双药化疗在局部晚期NSCLC中取得了65%的客观缓解率（ORR），在转移性NSCLC中取得了42%的ORR。同样，在SCARLET单臂II期研究中，对于未接受化疗的KRAS G12C突变型非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）患者，索托拉西布联合卡铂/培美曲塞治疗的客观缓解率（ORR）为88.9%，中位无进展生存期（mPFS）为6.6个月，总生存期（OS）为20.6个月。在转移性结直肠癌（mCRC）中，FOLFIRI方案联合索托拉西布和帕尼单抗治疗，将ORR提高至75%，与单独使用索托拉西布和帕尼单抗治疗的KRAS G12C突变型CRC患者相比，ORR提高了近三倍。 靶向治疗联合策略主要集中于纵向和横向两种途径。由于RAS信号通路包含多个上游和下游介质，耐药性通常是由于遗传和非遗传事件导致RAS通路重新激活而产生的，因此靶向RAS信号通路的上游因子（例如受体酪氨酸激酶）和下游因子成为合理且有吸引力的策略。靶蛋白包括EGFR（上游RTK）、ERBB2（上游RTK）、SHP2（RTK激活的衔接磷酸酶）、SOS1（负责将GTP加载到KRAS蛋白上的鸟嘌呤核苷酸交换因子）和MEK（RAS的下游调节因子）。事实上，如上所述，在CRC中，KRAS抑制剂与EGFR抑制剂联合使用显著提高了客观缓解率（ORR），优于单独使用KRAS抑制剂。此外，多项临床研究已对KRAS G12C抑制剂和SHP2抑制剂联合用药的疗效进行了测试。例如，在一项I/IIa期研究中，KRAS G12C抑制剂glecirasib与SHP2抑制剂JAB-3312联合用药在非小细胞肺癌（NSCLC）中取得了64.7%的客观缓解率（ORR）。同样，KRAS G12C抑制剂JDQ443与SHP2抑制剂TNO155联合用药在早期临床试验中也显示出良好的缓解率。除了垂直联合疗法外，水平联合疗法还靶向与KRAS/MAPK通路平行的信号通路，例如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶（NCT05840510，NCT04185883）、细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6，细胞周期依赖性激酶）（NCT05178888，NCT05358249）、血管内皮生长因子（VEGF）（NCT05180422）、Aurora-A激酶（NCT05374538）和黏着斑激酶（FAK）（NCT06166836）。上述所有靶向疗法目前均在多种癌症类型中进行临床研究，并与KRAS G12C抑制剂联合使用。 除了在细胞增殖、细胞周期等方面发挥调控作用外，KRAS突变还会显著影响肿瘤免疫微环境（TIME），促进免疫抑制并削弱抗肿瘤免疫。这些突变会导致免疫抑制细胞（如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg））的积累，从而抑制T细胞功能并促进肿瘤生长。KRAS驱动的MAPK通路激活可上调免疫检查点（如PD-L1）的表达，从而促进肿瘤免疫逃逸。据此，临床前研究表明，KRAS抑制剂可逆转免疫抑制并增强肿瘤免疫原性，这为将其与免疫疗法联合应用提供了理论依据。事实上，在PD-L1高表达的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，阿达格拉西布联合帕博利珠单抗的客观缓解率（ORR）达到63%，12个月无进展生存率（PFS）为60.8%，凸显了免疫疗法在延长临床疗效方面的作用。然而，在KRAS G12C突变型NSCLC患者中，索托拉西布联合帕博利珠单抗的临床试验中观察到了严重的不良事件，这些不良事件可能通过调整剂量来减轻。其他KRAS G12C抑制剂，如MK-1084和olomorasib与pembroluzumab联合使用，在KRAS G12C突变实体瘤中达到71%的ORR，在NSCLC中达到63%的ORR。 这些进展共同凸显了针对KRAS的疗法的日益丰富，以及优化联合治疗方案以克服耐药性并改善KRAS突变癌症临床疗效的迫切需要。 未来方向与挑战 新模式 尽管小分子KRAS抑制剂的研发进展迅速，但许多研究人员仍在探索多种KRAS靶向策略和新型方法。这些创新方法包括工程化结合蛋白、环状肽、针对修饰KRAS抗原的抗体或T细胞受体（TCR）以及RNA干扰（RNAi）技术。虽然这些策略目前尚未产生获批药物，但它们已展现出令人鼓舞的进展，为KRAS的治疗干预提供了新的契机。这些替代方法拓展了潜在的KRAS靶向疗法，并可能为传统小分子疗法遇到的挑战提供解决方案。 环肽抑制剂 由于肽类具有较大的分子相互作用界面，兼具小分子和抗体的部分优势，因此已成为靶向蛋白质-蛋白质相互作用的理想治疗分子。在KRAS靶向研究领域，近年来对多种类型的肽类抑制剂进行了广泛的研究，包括单环肽、双环肽、交联肽和蛋白质模拟抑制剂。 线性肽在体内易受蛋白水解酶降解，而环状肽因其稳定性、渗透性和生物活性的提高，作为一种有前景的治疗手段而备受关注。这促使过去几十年中，KRAS靶向环状肽抑制剂的研发取得了显著进展。目前已开发出多种KRAS靶向环状肽，包括Cyclorasin 9 A/Cyclorasin 9 A5、KD2、KRpep2/KRpep2D、Cyclorasin B4-27和LUNA18。然而，这些环状肽分子虽然大多能有效结合KRAS，但其细胞活性较差，体内疗效更弱。在基于环肽的KRAS抑制剂的开发过程中，这一直是一个持续的挑战：通过亲和力筛选鉴定的分子往往无法通过细胞活性筛选。 为了应对这一根本性挑战，中外制药株式会社的研究人员通过对模型化合物进行广泛的溶解度、膜渗透性和稳定性测试，建立了一个类药性评价模型。他们将这些类药性标准作为环肽库筛选的过滤标准，最终鉴定出AP8784为先导化合物。随后对该分子进行优化，开发出了泛KRAS抑制剂LUNA18。值得注意的是，LUNA18不仅展现出高细胞内活性和良好的药代动力学特性，而且无需特殊制剂即可实现30%的口服生物利用度。这一突破挑战了传统肽类药物口服给药的局限性。LUNA18的成功不仅代表着KRAS靶向治疗领域的重大进展，也是环肽药物研发史上的一个重要里程碑。 找到合适的组合 尽管临床前和临床研究表明联合治疗策略可以增强KRAS抑制剂单药治疗的疗效，但确定最佳联合方案对于更精准的治疗至关重要。针对KRAS突变型癌症寻找合适的联合治疗方案，需要同时靶向特定的KRAS突变以及复杂的肿瘤内在信号通路和免疫网络。这需要采用多学科方法，包括分子特征分析（例如基因谱分析）和生物标志物发现以进行患者分层，以及包含靶向治疗、化疗和免疫调节剂的多方面治疗方案。遗传和细胞状态的异质性进一步增加了治疗的复杂性，因为肿瘤细胞能够适应并激活补偿通路，从而导致耐药性。此外，肿瘤微环境因素，例如基质和免疫微环境的重塑，也与耐药性相关。正交联合治疗策略，例如将靶向治疗与免疫检查点抑制剂联合使用，或整合靶向、免疫和化疗方法，可能通过多种机制攻击肿瘤，从而提高疗效。但是，同样重要的是要确保联合用药时所用药物的毒性水平在可接受范围内。 扩大目标可及性 由于KRAS G12C突变仅占KRAS突变型癌症的一小部分，目前FDA批准的KRAS G12C抑制剂仅惠及有限的患者群体。将RAS抑制剂的研发范围扩展到KRAS G12C以外的其他突变类型，是未来至关重要的发展方向，旨在应对更广泛的KRAS突变，例如G12D、G12V、G13D和Q61H，以及其他RAS亚型，包括NRAS和HRAS。有前景的策略包括非共价抑制剂（可靶向缺乏活性半胱氨酸的突变）以及PROTAC等新型选择性蛋白降解方法。此外，开发泛KRAS抑制剂（靶向野生型KRAS和所有致癌性KRAS突变）以及泛RAS抑制剂（能够靶向整个RAS家族的野生型和突变型）是拓展RAS驱动型癌症治疗领域的重要一步。 结论 近年来，我们见证了利用小分子抑制剂靶向KRAS的显著进展。除了KRAS G12C抑制剂的临床成功外，RAS靶向治疗领域也迎来了复兴。该领域正从多个方面取得进展：研究人员正在开发针对各种KRAS/RAS突变的解决方案，从突变特异性抑制剂扩展到泛KRAS或泛RAS策略，并将靶向机制从KRAS的非活性（OFF）状态扩展到活性（ON）状态。 RAS长期以来难以被小分子抑制剂成药，这使得RAS成为新型治疗策略的试验场。此外，目前正在开发更广泛的治疗方法，包括蛋白质降解剂和各种针对突变RAS新抗原的免疫疗法，例如疫苗、细胞疗法和利用免疫系统对抗癌症潜力的蛋白质疗法。 随着RAS被认为是“不可成药”的时代彻底结束，并且我们预计KRAS抑制剂在未来几年将取得显著的临床成功，基于我们目前的理解，仍有几个关键问题需要解决： •除了KRAS G12C和KRAS G12D突变外，其他KRAS突变（以及NRAS和HRAS突变）患者是否会在临床上成为重点治疗对象？ •在临床实践中，哪种方法能提供更优的患者疗效：泛KRAS靶向策略还是泛RAS靶向策略？ •KRAS抑制剂能否在保持可接受的安全性和治疗窗口的前提下，成为类似于免疫疗法或化疗的基础治疗手段？此外，哪些联合治疗策略能够最大程度地提高不同类型癌症的临床疗效？ 在不久的将来，随着许多采用新方法靶向RAS的化合物临床试验结果陆续公布，这些问题有望得到逐步解答。我们相信，靶向RAS的疗法将成为我们对抗癌症的又一有力武器。 微信号：maple31415926 点击“转发”吧

2025年11月26日发表于npj precision oncology 摘要 KRAS基因突变发生于超过三分之一的结直肠癌（CRC）中，主要影响12和13号密码子，较少见于61、117和146号密码子。其他密码子的罕见突变也有报道，但通常缺乏明确的功能意义。这些突变激活驱动细胞增殖、抑制细胞分化和凋亡的信号通路。KRAS突变型CRC预后较差、复发率较高、化疗反应降低以及对EGFR靶向治疗耐药。目前，根据KRAS突变状态对患者进行分层已成为指导治疗的标准方法，但并非所有突变都具有相同的致癌性或治疗反应。KRAS突变曾被认为无法成药，但近年来，针对特定KRAS突变亚型的抑制剂的研发取得了进展。因此，精确表征KRAS突变谱对于优化CRC的治疗策略至关重要。本研究对KRAS突变频率和共现情况进行了系统分析，回顾了当前的靶向治疗，并考察了针对CRC中最常见的KRAS改变的正在进行的临床试验。 介绍 结直肠癌（CRC）是第三大常见癌症和第二大癌症致死率，全球每年新增病例近200万例，死亡人数近100万。大多数结直肠癌的发生是一个循序渐进的过程，由控制细胞分裂的基因突变引发，导致细胞不受控制地增殖并形成良性息肉。这些病变可通过获得额外的基因组改变而进展为恶性肿瘤，这些改变包括染色体异常、基因突变以及调控增殖、分化、凋亡和血管生成的基因的表观遗传修饰。 结直肠癌（CRC）是一组具有不同突变谱和表型特征的异质性肿瘤。自20世纪90年代初发现突变表型以来，临床上将CRC分为两大类：微卫星稳定型（MSS）肿瘤，其错配修复系统功能正常（pMMR）；以及微卫星不稳定性（MSI）肿瘤，其错配修复系统存在缺陷（dMMR），导致显著的突变表型，主要靶向微卫星序列。这种分类对于理解CRC的病因和生物学以及临床治疗至关重要。 2012年，癌症基因组图谱（TCGA）联盟发表了一项关于结直肠癌（CRC）的综合分子分析，根据体细胞突变率将肿瘤分为两大类：非高突变肿瘤（主要为微卫星稳定型，MSS）和高突变肿瘤，后者主要包括微卫星不稳定性（MSI）肿瘤和携带DNA聚合酶ε基因（POLE ）突变的肿瘤。TCGA研究总结了数十年的研究成果，为CRC的分子异质性以及高突变（MSI和POLE）与非高突变癌症的显著差异提供了强有力的证据 。2015年，基于转录组分析的包含四种分子亚型的替代分类系统被提出。虽然这种基于转录组的分类与肿瘤特征和患者预后相关，但尚未在临床实践中得到广泛应用。 Ras蛋白是小GTP酶，作为分子开关激活调控细胞生长、分化和凋亡的基本信号转导通路。人类拥有三个RAS基因——HRAS、KRAS和NRAS——编码四种蛋白质（KRAS编码两种剪接变体，KRAS4A和KRAS4B），这些蛋白质序列高度相似。尽管如此，RAS亚型在组织分布、膜定位和下游信号传导偏好方面存在差异，导致不同肿瘤类型中突变谱和致癌作用的差异。 RAS蛋白在活性GTP结合状态和非活性GDP结合状态之间循环。生长因子与膜结合受体相互作用刺激RAS蛋白，激活RAS蛋白，进而通过GRB2和SOS（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，GEF）进行信号转导，GRB2和SOS催化GDP-GTP交换并激活RAS蛋白。这种构象变化被RAS效应蛋白检测到，激活下游信号通路，最显著的是RAF/MEK/ERK（MAPK通路）和PI3K/AKT/mTOR（PI3K通路），从而调节细胞凋亡抑制、细胞生长、转化、迁移和分化。RAS蛋白通过GTP水解为GDP而失活，该过程由RAS蛋白的固有GTP酶活性催化，并被GTP酶激活蛋白（GAP）加速。最主要的RAS GAP是神经纤维蛋白1（NF1）和RASA1（也称为p120GAP）。 RAS基因的突变频率和谱系因癌症类型和基因类型而异，这表明并非所有RAS突变都相同，特定突变表现出独特的生物学和临床行为。驱动RAS基因中特定突变占据主导地位的因素是多种因素复杂相互作用的结果，包括组织特异性因素，例如基因毒性应激、生物选择、基因组拓扑结构、基因表达和细胞环境。最常见的癌症相关Ras改变是错义突变，这些突变破坏了非活性形式和活性形式之间的平衡，通常涉及氨基酸替换，从而降低GTP水解或增加GTP结合。密码子12、13、61和146处的突变会破坏GAP介导的GTP水解，导致Ras持续激活和下游信号传导，从而促进细胞存活和不受控制的增殖。突变氨基酸决定了突变型KRAS的生化活性和转化能力。携带不同KRAS突变的细胞在糖酵解、谷氨酰胺利用以及氨基酸、胆碱和核苷酸己糖胺代谢方面也存在差异，这可能影响对抗癌治疗的反应。 靶向MAPK和PI3K通路中KRAS上游和下游蛋白的抑制剂早已获准用于临床。然而，由于KRAS对GTP/GDP具有皮摩尔级的亲和力、细胞内GTP浓度高、缺乏变构调节位点，以及涉及GEF、GAP和效应蛋白的复杂相互作用网络（这些相互作用网络通过延伸的蛋白-蛋白相互作用表面形成），开发特异性KRAS抑制剂面临着巨大的挑战。克服KRAS对GTP的皮摩尔级亲和力需要开发具有卓越结合特性的小分子，其结合特性需远超ATP结合蛋白抑制剂。此外，KRAS突变体中GTP结合口袋的差异也增加了抑制剂设计的难度。由于直接和间接方法屡屡失败，KRAS长期以来被认为是“不可成药的”。索托拉西布和阿达格拉西布（KRAS G12C特异性抑制剂）的开发，将KRAS重新定义为一个具有挑战性但可控的靶点，导致近几年KRAS靶向疗法出现了前所未有的激增。 多年来，抑制KRAS信号传导的新策略不断涌现，主要集中在以下几个方面：(i) 靶向致癌突变型KRAS亚型的抑制剂；(ii) 破坏KRAS-效应蛋白相互作用以阻止下游信号传导；(iii) 抑制KRAS/GEF相互作用以阻止GTP再充电。此外，针对KRAS突变型癌症的疫苗（基于肽和mRNA的疫苗）以及T细胞受体（TCR）工程化T细胞疗法目前正在研发中。 KRAS G12C抑制剂索托拉西布和阿达格拉西布与突变型KRAS的半胱氨酸-12残基共价结合，在经过后期临床开发后，率先获得监管部门批准上市。这些抑制剂阻断KRAS G12C的非活性GDP结合状态，从而阻止SOS催化的核苷酸交换和下游信号传导。然而，它们对野生型或其他活性位点缺乏半胱氨酸的常见KRAS突变体无效。许多具有类似机制的KRAS G12C抑制剂正在进行临床开发。 KRAS G12C抑制剂在携带G12C突变的癌症中取得了显著疗效，但由于它们是专门针对该等位基因设计的，因此对更常见的KRAS突变（例如G12D和G12V）无效。2021年，Wang等人报道了首个KRAS G12D靶向抑制剂MRTX1133，该抑制剂与KRAS的开关II口袋结合，抑制其活性和非活性状态。MRTX1133对KRAS G12D具有高度选择性，并在包括CRC在内的多种体内模型中诱导肿瘤消退。此后，人们开发了许多靶向最常见的G12D和G12V KRAS突变体的分子。 泛RAS抑制剂靶向所有RAS蛋白的野生型和突变型，包括KRAS、NRAS和HRAS，因此具有更广泛的适用性，并且能够在初始KRAS抑制后潜在地阻断KRAS、NRAS或HRAS的代偿性激活或继发性突变。然而，在正常细胞中同时抑制所有三种RAS亚型会带来严重的毒性风险。 泛RAS抑制剂遵循以下几种可能的策略：（i）直接抑制Ras蛋白，例如RMC-6236（daraxonrasib），一种多RAS(ON)抑制剂，能够抑制多种Ras亚型，包括KRAS、NRAS和HRAS的任何突变以及野生型亚型；（ii）通过抑制SOS1驱动的GDP/GTP交换间接靶向Ras，例如BI 1701963。SOS1抑制剂通常与其他KRAS抑制剂联合使用，以抑制反馈再激活并增强反应。 第一代KRAS抑制剂，包括索托拉西布和阿达格拉西布，仅靶向GDP结合的非活性形式（OFF）。使用这些抑制剂治疗通常会触发野生型RAS-GTP的适应性反馈激活或继发突变，从而促进肿瘤持续存在。靶向GTP结合的活性形式的RAS(ON)抑制剂已显示出更优的疗效。Revolution Medicines公司开发了一类RAS(ON)抑制剂，该类抑制剂利用分子伴侣辅助的构象变化，形成可成药的口袋，从而稳定突变型KRAS、分子伴侣蛋白和抑制剂之间的三元复合物。该复合物通过空间位阻阻断KRAS与效应蛋白的相互作用，抑制下游信号传导。这些抑制剂的例子包括RMC-6291（elironrasib，KRAS G12C）、RMC-4998（KRAS G12C）、RMC-9805（zoldonrasib，KRAS G12D）、RMC-5127（KRAS G12V）、RMC-8839（KRAS G13C）和RMC-0708（KRAS Q61H）。此外，RAS(ON)抑制剂，例如RMC-7977和RMC-6236，具有更广泛的活性，可靶向多种突变型和野生型RAS亚型，并克服RAS(OFF)抑制剂常见的耐药性。临床前研究表明，RAS(ON)抑制剂能够持续抑制RAS通路信号传导并延长肿瘤消退时间，而RAS(OFF)抑制剂则常常由于适应性耐药而导致复发。 除了KRAS的药理学抑制外，针对KRAS突变型癌症的免疫治疗方法——包括疫苗和过继性T细胞疗法——目前也正在研发中。靶向KRAS的肽疫苗早在很久以前就已进行过测试，但单个肽通常无法产生足够的表位以充分激活T细胞。靶向KRAS的DNA疫苗也已被探索。近年来，基于个体化mRNA的疫苗接种已应用于KRAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）或胰腺腺癌患者。例如，mRNA衍生的KRAS靶向疫苗V941（mRNA-5671）基于脂质纳米颗粒（LNP）制剂的mRNA，可靶向四种最常见的KRAS突变（G12D、G12V、G12C和G13D）。目前，大多数针对KRAS的免疫治疗策略仍处于早期研发阶段，尚无任何一种策略进入临床应用阶段。 针对KRAS突变型转移性结直肠癌（mCRC）的治疗策略正逐渐超越单一KRAS抑制剂。将KRAS抑制剂与抗EGFR疗法或其他靶向药物联合应用已成为一种极具前景的策略，因为与单独使用KRAS抑制剂相比，这种联合疗法能够增强抗肿瘤疗效。该联合策略基于垂直或平行通路阻断的原理：通过同时靶向MAPK信号级联或互补通路中的多个蛋白，可以减少代偿性信号传导，并延缓耐药机制的出现，而耐药机制通常会限制单药治疗的持久性。近期临床前和临床研究已证实，这些联合疗法能够提高KRAS突变型癌症患者的缓解率和无进展生存期。这些观察结果强调了合理联合治疗策略在为这一棘手患者群体开发精准疗法中的重要性。 KRAS靶向治疗在结直肠癌（CRC）中的临床应用价值取决于KRAS突变的具体分布及其与其他基因改变的共存情况。大量文献探讨了CRC中KRAS突变的发生率，其中一些研究分析了非常庞大的样本量。诸如癌症体细胞突变目录（COSMIC）等资源为探索大样本的突变谱提供了宝贵的工具，但由于样本选择和突变检测策略（例如，靶向测序、全外显子组测序或全基因组测序）的差异，汇总研究可能会引入偏差。此外，这些资源并非总能提供影响KRAS突变发生率的关键因素的信息，例如错配修复缺陷或导致高突变表型的POLE突变。 鉴于KRAS突变的多样性及其日益凸显的治疗意义，亟需深入了解其在结直肠癌（CRC）中的发生率、共突变模式以及对靶向治疗的反应。本研究对三个大型CRC队列的KRAS突变谱进行了详细分析，这些队列拥有全面的临床和突变数据，并校正了已知影响KRAS突变发生率的因素。我们还探讨了不同的KRAS突变及其共突变基因如何影响CRC患者的治疗策略，并参考了目前正在进行的KRAS靶向治疗临床试验的最新进展。我们的讨论涵盖了已获批准的治疗方法和正在进行临床研究的疗法。 结果 结直肠癌中RAS突变的发生率 根据COSMIC数据库的数据，KRAS是CRC中最常见的突变癌基因，在起源于大肠的腺癌中发生率高达34%。相比之下，NRAS和HRAS的突变频率要低得多，分别占病例的4%和1%。然而，COSMIC数据库汇集了来自不同研究的数据，这些研究采用不同的患者选择标准和突变分析方法，这可能会导致观察到的突变频率存在偏差。为了更准确地估计RAS突变在结直肠癌 (CRC) 中的频率，我们对来自cBioPortal的最大结直肠癌队列进行了全面分析：DFCI（来自丹娜-法伯癌症研究所的原发性 CRC）、TCGA Pancancer（来自癌症基因组图谱联盟的原发性 CRC）和 MSKCC（来自纪念斯隆-凯特琳癌症中心的原发性 CRC 和转移性 CRC）（参见“方法”）。这三个队列的患者在人口统计学、临床和病理学特征方面存在显著差异，我们在后续分析中考虑了这些差异（表1）。 表1. 本研究中使用的CRC数据集的临床和病理特征 RAS突变与肿瘤分期、MSI状态和队列的关联 在原发性结直肠癌（CRC）中， KRAS基因突变率为38%（670/1748），而NRAS和HRAS基因突变率则显著较低（分别为4.9%，85/1748和0.9%，15/1748）。转移灶中的突变频率与原发性肿瘤相似，KRAS（41%，216/532）、NRAS（3.9%，21/532）和HRAS（0.4%，2/532），与原发性肿瘤相比无统计学差异（图1）。原发性肿瘤和转移灶之间相似的突变率与RAS基因突变是CRC早期事件的普遍观点相符，更重要的是，这些基因的突变对转移进展没有显著影响。相比之下，CRC 中其他经常发生突变的基因，如抑癌基因APC、TP53、FBXW7和SMAD4，以及癌基因PIK3CA和BRAF，在比较原发肿瘤与转移瘤时，突变频率表现出统计学上的显著差异（图1）。 图1. RAS基因和其他常见突变基因在CRC中的突变频率。A. 原发性结直肠癌（I-II期、III期或IV期）和结直肠癌转移灶（M）中最常见的癌症相关基因突变频率。根据微卫星不稳定性（MSI）状态和肿瘤突变负荷（见“方法”），病例分为微卫星稳定型（MSS）（左）或微卫星不稳定性/高突变型（右）。B .采用多变量logistic回归分析Ras基因突变频率的差异。点表示对数比值比（x轴）。水平线表示对数比值比的95%置信区间，颜色代表经Tukey HSD法校正后的统计学显著性（显著性水平）。垂直虚线左侧的值表示相应比较中第一个列出的组的突变频率较高（y轴），而右侧的值表示第二个列出的组的突变频率较高。图中显示了两个多变量逻辑回归分析：一个包括所有样本，并以样本类型（原发肿瘤或转移）作为协变量（上排）；另一个仅包括原发肿瘤，以便将队列作为协变量纳入分析（下排）。 在原发性肿瘤中，KRAS突变在MSS型肿瘤中的发生率高于MSI/高突变型肿瘤（40% vs. 31%，OR=0.7，CI=[0.5–0.9]，p=0.002，Fisher精确检验），而HRAS突变与MSI/高突变型肿瘤密切相关（3.8% vs. 0.2%，OR=18.7，95%CI=[5–104]，p=2.7×10⁻⁷，Fisher精确检验）（图1）。KRAS突变在晚期肿瘤（III/IV期，399/955，41.8%）中的发生率高于I/II期肿瘤（253/743，34.1%，p=0.001，Fisher精确检验）。NRAS和HRAS在I/II期和III/IV期原发肿瘤中表现出相似的突变频率。包含生物性别、MSI状态、肿瘤分期和队列的多变量逻辑回归分析证实了KRAS突变与MSS肿瘤的关联（OR=1.4，CI=[1.1–1.8]，p=0.014），以及HRAS与MSI肿瘤的关联（OR=15.7，CI=[5.0–48.8]，p=2×10⁻⁶）（图1B）。值得注意的是，大多数HRAS突变（88%，17个突变中的15个）位于G12、G13、Q61、K117和A146以外的密码子，提示其致癌潜力尚不明确，可能仅作为乘客突变发挥作用。多变量逻辑回归分析显示，与DFCI队列相比，TCGA队列（OR=1.8，CI=[1.4–2.5]，p=4×10⁻⁶）和MSKCC队列（OR=2.2，CI=[1.6–3.0]，p=1.6×10⁻⁸）中KRAS突变更为常见。这种差异并非由不同队列间的生物性别、微卫星不稳定性（MSI）或分期差异所致（图1B）。对最常见突变基因进行类似的多变量分析显示，APC、TP53、PIK3CA和BRAF的突变频率在不同队列间存在显著差异。 同一患者肿瘤样本中KRAS突变的一致性 MSKCC数据集包含31例分析了多个肿瘤样本的病例。其中19例至少分析了一个原发肿瘤和一个转移灶，结果显示原发灶和转移灶的KRAS突变状态高度一致（17/19，89%）。这一观察结果与KRAS突变的克隆起源相符，并与之前的报道一致。仅有两例（P-0002463和P-0012418）的原发肿瘤和相关转移灶的突变状态存在差异。患者P-0002463的原发肿瘤为KRAS野生型，而转移灶携带G12A突变。在针对该染色体位置的二代测序读段中，仅有8.8%（1570个读段中的 138 个）检测到该突变，提示该突变是克隆扩增后获得的继发事件。相反，在P-0012418中，KRAS G13C突变存在于原发肿瘤中，但在转移灶中未检测到。该突变仅存在于3.5%的读段（811个读段中的29个）中，提示KRAS突变并非原发肿瘤中的克隆性突变，而产生转移灶的细胞为KRAS野生型，或者突变等位基因在肿瘤进展过程中丢失。 CRC中KRAS的突变谱 最常见的KRAS突变（即G12、G13、Q61、K117和A146密码子的突变）集中在GTP/GDP结合口袋周围（图2）。残基G12和G13位于P环内，紧邻GDP/GTP的二磷酸/三磷酸部分，它们参与活性位点GTP核苷酸的稳定。Q61位于开关II结构域的N端，该结构域在KRAS的ON和OFF状态转换过程中的构象变化中起着关键作用。K117与G13非常接近（<3Å），并与GDP/GTP的鸟嘌呤和核糖部分相互作用。最后，A146 位于GTP/GDP核苷酸鸟嘌呤部分附近的密集疏水区域，有助于核苷酸结合的特异性。 图2. GDP结合的野生型KRAS的结构。A. KRAS蛋白的表面结构图，突出显示了常见突变残基。残基Q61（红色）、G12和G13（橙色）、K117（黄色）和A146（蓝色）均已标注并以颜色区分。结合的GDP分子以球棍模型表示。B .野生型KRAS中GDP结合位点的放大图。GDP分子被细分为二磷酸、核糖和鸟嘌呤部分。原子以颜色区分（碳为灰色，氧为红色，氮为蓝色，磷为橙色）。KRAS残基（G12、G13、K117和A146）与GDP之间的关键相互作用以虚线表示：氢键（蓝色）、离子相互作用（黄色）和弱氢键（灰色）。G12的氧原子与K117的氮原子之间形成氢键，距离为2.94 Å。 我们对1748例原发性结直肠癌（CRC）肿瘤和532例转移灶中的KRAS突变谱进行了更详细的分析。综合所有样本来看，微卫星不稳定性（MSI）/高突变型CRC中KRAS G12突变的发生率低于微卫星稳定型（MSS）CRC（11% vs. 27%，OR=0.33，CI=[0.2–0.5]，Q值=2.6×10⁻¹⁰）（图3）。相反，G13、Q61、K117和A146密码子的突变在MSS和MSI/高突变型CRC之间未显示出统计学上的显著差异。正如预期，鉴于其显著的突变表型，MSI/高突变型肿瘤表现出更高的KRAS多突变发生率（OR=5.3，CI=[1.8–15.5]，Q值=0.003）和其他密码子突变发生率（OR=4.2，CI=[1.7–10.4]，Q值=0.003）（图3）。分析显示，与TCGA和MSKCC数据集相比，DCFI数据集中KRAS突变发生率较低主要反映了KRAS G12突变发生率较低，无论是在MSS病例（19% vs. 29%–31%）还是在MSI/高突变病例（2% vs. 15%–18%）中均是如此。在多变量逻辑回归分析中，这种差异仍然具有统计学意义，包括患者年龄、生物性别、肿瘤分期和 MSI 状态作为可能的混杂因素（DFCI与TCGA 队列相比，OR=0.5，CI=[0.3–0.7]，p=2.2×10 -6； DFCI与MSKCC队列相比，OR=0.4，CI=[0.3–0.6]，p=4×10 -6）。 图3. CRC中KRAS密码子特异性突变频率。A. 所有样本（ALL）和各队列中KRAS野生型（WT）和KRAS突变型的密码子频率。每个组显示两个百分比：括号外为相对于队列中所有样本的百分比；括号内为相对于KRAS突变型样本的百分比。B .使用Fisher精确检验分析MSS和MSI/高突变样本之间密码子特异性KRAS突变频率的差异。为了绘制与极端比值比相关的图，计算了Yule's Q值（见“方法”）。虚线垂直线（Yule's Q=0）右侧的点 表示MSI/高突变（MSI）肿瘤中频率较高，而左侧的点表示MSS肿瘤中频率较高。水平线代表Yule's Q值的95%置信区间，颜色代表使用FDR方法校正多重假设检验后的统计学显著性水平（显著性水平）。 与既往文献一致，12号和13号密码子的突变合计占CRC中所有KRAS突变的近82%，其发生率顺序为G12D>G12V>G13D>G12C>G12A>G12S（图4）。KRAS G12D和G13D在MSS和MSI/高突变病例中的发生率相似（G12D ： 10.8% vs. 7.8%，OR=1.4，p=0.1；G13D：7.2% vs. 7.5%，OR=0.96，p=0.8，Fisher精确检验）。相比之下，KRAS G12V突变在MSS癌症中是第二常见的突变，但在MSI/高突变型癌症中则少见得多（8.3% vs. 1.8%，p=2.3×10⁻⁶）。KRAS G12C突变在MSS病例中是第四常见的突变（3.1%），但在336例MSI/高突变型病例中均未发现（p=7.6×10⁻⁵）（图4）。值得注意的是，尽管KRAS G12D突变在同一研究（MSKCC）的MSI/高突变型原发肿瘤中占13%（13/97），但在19例MSI/高突变型转移灶中均未发现该突变。然而，这种差异未达到统计学意义（p=0.12）。 图4. MSS和MSI/高突变CRC中的KRAS突变。A. 所有样本（ALL，n=2280）以及不同研究中MSS（上排，n=1945）和MSI/高突变肿瘤（下排，n=335）的KRAS突变情况。突变按其在整个数据集（包括KRAS 野生型（WT）病例）中的发生率排序。每个组显示两个百分比：括号外为相对于队列中所有样本的百分比；括号内为相对于KRAS突变体的百分比。B .使用Fisher精确检验分析MSS和MSI/高突变样本之间密码子特异性KRAS突变频率的差异。为了便于绘制具有极端比值比的关联图，计算了Yule's Q值（参见“方法”）。虚线垂直线（Yule's Q=0）右侧的点 表示在微卫星不稳定性/高突变（MSI）肿瘤中频率较高，而左侧的点表示在微卫星稳定（MSS）肿瘤中频率较高。水平条形图代表 Yule's Q值的 95% 置信区间，颜色代表使用 FDR 方法校正多重假设检验后的统计显著性水平（显著性水平）。 在密码子61（占所有KRAS突变的4.5%：Q61H>Q61K>Q61R>Q61L）、A146（占所有KRAS突变的7.4%，A146T>A146V>A146P）和K117（K117N>K117R）处发现了较低发生率的突变。除KRAS Q61K外，这些突变在MSS和MSI/高突变型CRC之间未显示出统计学上的显著差异。KRAS Q61K在MSI/高突变型CRC中的发生率（2.1%）高于MSS型CRC（0.31%，OR=6.9，p=0.001）。 我们发现不同研究中KRAS突变频率存在一些差异。对原发肿瘤进行多变量logistic回归分析，并将患者年龄、性别、肿瘤分期和MSI状态作为可能的混杂因素纳入考量，结果显示不同研究中G12D和G12V突变的发生率存在统计学意义上的显著差异，这主要反映了DFCI数据集中这些突变的发生率较低。 共突变分析 由于KRAS、NRAS、HRAS和BRAF基因的致癌突变具有重叠的下游效应，因此通常认为这些突变是互斥的。因此，同一信号通路中多个基因的致癌突变并不一定能为癌细胞提供显著的额外生长优势。非典型BRAF突变（非V600E突变，例如激酶活性降低的2类变异体和激酶活性受损或缺失的3类变异体）常与其他RAS通路突变同时发生。然而，KRAS突变也可能与其他癌症基因的突变同时发生，这可能会限制KRAS靶向治疗的疗效，或者反过来，这种联合治疗策略可以用于改善患者的预后。 我们分析了KRAS、NRAS和HRAS与IMPACT-341测序panel中包含的其余341个癌症相关基因的共突变情况。IMPACT-341测序panel代表了所有样本中分析的最小基因集。为了控制MSI/高突变表型对总体突变频率（从而对共突变概率）的混杂影响，我们分别对MSS和MSI/高突变原发肿瘤进行了分析。 在MSS型原发性CRC中，KRAS突变与APC、PIK3CA、FBXW7、AMER1和SMAD2基因突变频率显著升高相关，而与BRAF、NRAS和TP53基因突变频率降低相关。NRAS基因突变与APC基因突变频率升高相关，而与KRAS基因突变频率降低相关。在MSI/高突变型CRC中，KRAS突变与APC基因突变频率升高相关，而与BRAF基因突变频率降低相关（图5）。 图5. 原发性CRC中KRAS、NRAS和HRAS共突变分析。采用Fisher精确检验计算MSS（上排）和MSI/高突变（下排）原发性CRC中的共突变分析。为了便于绘制具有极端比值比的关联图，计算了Yule's Q值（y轴）。水平虚线（Yule's Q=0）上方的点表示正相关（共突变），而虚线下方的点表示负相关（互斥性）。垂直线表示Yule's Q值的95%置信区间。颜色表示使用FDR方法校正多重假设检验后的统计学显著性水平。FDR校正后的p值低于0.05的基因已标记。条件共突变频率（x轴）表示KRAS、NRAS或HRAS突变型CRC中同时存在所研究基因突变的比例。 B图A详细展示了共突变分析发现的具有统计学意义的关联。图中显示了比值比和95%置信区间（OR [CI95%]）以及FDR校正后的p值。此外，图中还标明了A突变型病例和A野生型病例中B基因突变病例的比例。 我们在1.2%（22/1748）的原发性结直肠癌和1.5%（8/532）的转移性结直肠癌中发现了KRAS和BRAF同时突变。这些病例中大多数携带非典型BRAF突变（非V600E，n=23，77%），6例（40%）携带非典型KRAS突变（位于G12、G13、Q61、K117或A146以外的密码子）。在微卫星稳定型（MSS）肿瘤中，未观察到KRAS和BRAF V600E同时突变。仅有4例肿瘤（均为微卫星不稳定性/高突变型）显示BRAF V600E与已知的致癌性KRAS突变（2例G12D、1例G12A和1例G13D）共存；值得注意的是，这两个KRAS G12D病例除了V600E突变外，还携带非典型的BRAF突变，这可能会影响BRAF的功能。 KRAS密码子特异性共突变分析 我们研究了携带不同KRAS突变的肿瘤在其他癌症相关基因中是否表现出不同的突变谱。具体而言，我们评估了最常见KRAS突变密码子（G12、G13、Q61、K117和A146）的突变是否与IMPACT-341 panel中包含的340个基因的突变频率差异相关。在携带KRAS突变的微卫星稳定型（MSS）原发肿瘤中，我们未观察到与KRAS突变密码子相关的其他基因突变率存在统计学意义上的显著差异。相反，在微卫星不稳定性（MSI）/高突变型原发肿瘤中，我们发现了11个基因，它们的突变频率因KRAS突变密码子的不同而存在差异（图6）。值得注意的是，其中五个基因——DDR2、KDR（VEGFR2）、EPHA3、ALK和FLT1（VEGFR1） ——编码跨膜受体蛋白酪氨酸激酶，在 MAPK 通路上游的细胞信号传导中发挥作用（富集倍数=5.37，p=9×10⁻⁴，FDR Q值=0.04）。 图6. 与MSI/高突变原发性CRC中密码子特异性KRAS突变相关的突变基因。名义p值通过对列联表进行 Fisher 精确检验计算得出，列联表仅包含KRAS基因G12、G13、A146、Q61或K117位密码子发生突变的病例。野生型病例在图中作为参考，但未用于Fisher精确检验。基因按其名义p值排序。 KRAS和Ras-GAP编码基因的共突变 KRAS G13突变体在体外对NF1介导的GTP水解表现出部分敏感性。据报道，携带KRAS G13或A146突变的癌细胞系与携带G12突变的癌细胞系相比，NF1共突变频率更高。相反，携带Q61突变的癌细胞系未显示NF1共突变。在一项包含大量不同来源肿瘤样本的研究中，约12%的KRAS G13突变样本携带NF1突变，而仅有5.5%的KRAS G12突变样本携带NF1突变。 在本研究中，无论是在原发肿瘤（23.4% vs. 2.1%；OR=12.5，95% CI：8–20；p<2×10⁻¹⁶）还是转移灶 （37% vs. 2.3%；OR=24，95% CI：6.7–81；p=8.6×10⁻⁷）中，NF1突变在MSI/高突变型肿瘤中的发生率均显著高于MSS型肿瘤。NF1基因非常大，跨越287 kb，编码序列长度接近8.5 kb（第99百分位数），因此容易发生突变，尤其是在具有突变表型的肿瘤中。然而，在MSS或MSI/高突变CRC中，NF1突变的频率并不高于其他长度相当的基因，这表明CRC中不存在对NF1失活的强阳性选择。 在所有研究的CRC队列中，我们均未发现KRAS G13突变与NF1突变之间存在统计学意义上的关联（图7）。在MSS肿瘤中，KRAS G12（0.8%）和G13（0.9%）突变体中NF1突变的发生频率均较低，均低于KRAS野生型病例（3%）。在MSI/高突变型CRC中，KRAS G13突变体中NF1突变的发生频率（13%）低于G12突变体（21%）和野生型病例（23%），但这些差异无统计学意义。在包含队列、性别、年龄、MSI/高突变状态和KRAS密码子的多变量logistic回归模型中，仅MSI/高突变状态与NF1突变显著相关（p<2×10⁻¹⁶）。 图7. NF1和RASA1与密码子特异性KRAS突变的共突变分析。根据突变的KRAS密码子对MSS（A）和MSI/高突变（B ）肿瘤中的NF1（左）和RASA1 （右）突变频率进行分类。名义p值通过Fisher精确检验计算得出，检验对象为包含KRAS密码子G12、G13、A146、Q61或K117突变病例的列联表。野生型病例作为参考，但未用于Fisher精确检验。未发现NF1或RASA1突变与突变的KRAS密码子之间存在统计学意义上的关联。 我们将KRAS共突变分析扩展至RASA1，RASA1编码另一种重要的GTP酶激活蛋白，该蛋白在人类癌症中经常发生突变。RASA1突变的结果与NF1的观察结果相似。具体而言，与大小相近的基因相比，我们未发现MSS或MSI/高突变型CRC中RASA1突变频率增加的证据，也未发现RASA1突变与KRAS突变状态之间存在关联（图7）。这些观察结果在MSK-CHORD数据集上得到了进一步验证，该数据集包含超过5000个CRC样本。 KRAS靶向化合物 通过对NCI词库和PubChem数据库进行系统检索，结合自动检索和人工筛选（见“方法”部分），共检索到106种靶向SHP2/SOS1/KRAS的药物或细胞疗法。该列表包含73种抑制剂、15种T细胞受体（TCR）、14种疫苗、3种降解剂和1种反义寡核苷酸。这些化合物中大多数直接靶向KRAS（n=89），其余则靶向SOS1（n=5）或SHP2（n=12）。其中大多数靶向特定的KRAS突变（32种靶向KRAS G12C，22种靶向KRAS G12D，6种靶向KRAS G12V，1种靶向KRAS G13N）。其中19种化合物靶向多种KRAS突变亚型，26种化合物靶向任何类型的KRAS突变，原因在于这些化合物要么抑制所有KRAS亚型（包括野生型），要么靶向SOS1或SHP2，从而抑制GDP到GTP的交换，进而抑制KRAS从非活性形式向活性形式的转变。这85种化合物已在或正在进行针对CRC患者的临床试验（图8）。 图8. 靶向KRAS、SOS1或SHP2的药物。本研究鉴定的106种化合物示意图。每条线代表一种化合物，连接化合物类型（左列）、靶点（中列）以及是否已进入CRC患者临床试验（右列）。线条颜色根据化合物的靶点而定。 针对KRAS靶向疗法的结直肠癌临床试验正在进行中 我们对临床试验数据库进行了系统性检索，结合自动搜索和人工筛选，共检索到156项临床试验，这些试验已评估或正在评估至少一种化合物对结直肠癌（CRC）患者的疗效（参见“方法”部分）。图9展示了这些试验的时间轴，图中标明了所测试的化合物、靶点、试验阶段以及当前状态。此外，我们还提供了包含这156项临床试验完整信息的表格作为补充材料。该表格包含临床试验数据库提供的数据、所研究的化合物或治疗方法（类型、靶点）的数据，以及PubMed和PubMed Central数据库中引用这些临床试验的参考文献。 图9. 针对CRC患者的KRAS靶向治疗的临床试验。图8展示了包含至少一种化合物的临床试验的时间轴图，这些化合物均来自实体恶性肿瘤（包括结直肠癌）患者，并评估了其疗效。水平线段代表临床试验的计划开始日期和结束日期。每条柱状图的左侧标明了靶向KRAS突变或KRAS相关蛋白，右侧标明了KRAS相关药物。临床试验按研究阶段分为不同的面板，并根据研究状态着色。白色圆点表示最新信息更新。灰色竖条表示当前日期。 在156项临床试验中，有52项评估了专门靶向KRAS G12C的化合物（图9），尽管这种突变在结直肠癌（CRC）中的发生率极低。这主要是由于G12C抑制剂的早期研发和监管审批，这些抑制剂开创了人们对KRAS作为药物靶点的兴趣。这些药物在临床前CRC模型中显示出活性，并在非小细胞肺癌（NSCLC）中显示出临床疗效，促使人们评估它们在其他KRAS G12C突变肿瘤（包括CRC）中的疗效。 然而，治疗格局正迅速发展，不再局限于G12C特异性策略。越来越多的近期和正在进行的临床试验正在研究针对CRC中常见的其他KRAS突变（例如G12D和G12V）的抑制剂，以及旨在抑制所有KRAS突变的更广泛方法（图10）。一些临床试验也在评估联合疗法，例如将KRAS抑制剂与EGFR、SHP2或免疫检查点阻断剂联合使用，以克服耐药性并提高缓解率。 图10. Ras/MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号通路。配体结合后（图中以细胞膜外的黄色球体表示），受体酪氨酸激酶（RTK）募集衔接蛋白（SHP2、GRB2和SOS），促进KRAS上的GDP与GTP交换，从而激活KRAS（KRAS-GTP）。激活的KRAS通过RAF、MEK和ERK等下游信号通路促进细胞生长、增殖、存活、运动和迁移。RTK和G蛋白偶联受体（GPCR）均可通过Gβγ亚基激活PI3K，催化PIP2转化为PIP3。PIP3促进AKT的膜募集，并通过PDK1和mTORC2激活AKT。激活的AKT调节下游效应分子，包括TSC1/2复合物和mTORC1，从而控制细胞生长和存活。RAS-GAPs（例如NF1）和PTEN（一种脂质磷酸酶，可将PIP3还原为PIP2）介导负调控。本研究中讨论的化合物靶点以橙色方框标出。截至2025年6月1日，仅有靶向RAS(OFF) G12C的sotorasib和adagrasib获得FDA批准用于治疗CRC。其他靶向RAS上游的治疗药物（例如西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、呋喹替尼、瑞戈非尼、图卡替尼和ziv-aflibercept）也已获得FDA批准用于治疗CRC，但本文未对此进行讨论。 目前有80项试验正在招募患者，另有11项试验将在不久的将来招募患者，这反映出临床上积极希望扩大治疗KRAS突变型CRC患者的治疗选择，而不仅仅局限于KRAS G12C突变病例。 讨论 尽管KRAS是最早被发现的原癌基因之一，也是人类癌症中最常见的突变癌基因，但在近40年的时间里，它一直被认为是无法成药的。近年来，随着针对KRAS G12C（一种在结直肠癌(CRC)中相对罕见的突变）的选择性共价抑制剂的开发，这种观点发生了改变（图4）。最近，针对更常见KRAS突变的新型药物以及抑制多种或所有KRAS亚型的泛KRAS药物正在进行测试，这有望扩大KRAS靶向治疗的受益人群。为了确定这些新一代KRAS靶向疗法对CRC患者的影响，必须了解KRAS突变和共突变的谱系，并考虑到该疾病的遗传异质性。 我们利用三个最大的公开可用的结直肠癌数据集（包含临床和突变信息）对KRAS突变频率进行了全面分析。值得注意的是，尽管这些研究中的患者并非根据其KRAS突变状态进行选择，但这些数据集并非严格意义上的人群数据集。尤其值得注意的是，MSKCC研究纳入了较高比例的IV期结直肠癌患者（约60%，表1），因为其主要目的是比较转移性结直肠癌和非转移性结直肠癌。MSI/高突变原发肿瘤的频率为18.1%（95% CI，16.3%–20%），与结直肠癌患者人群中报道的频率（15%–20%）一致，且三个队列之间未观察到统计学意义上的显著差异（卡方检验，p=0.24）。正如预期的那样，MSKCC转移样本中MSI/高突变肿瘤的比例显著较低（3.6%，表1），这反映了MSI CRC的转移潜能较低。为了减少潜在的偏倚，在统计分析中将肿瘤分期和MSI/高突变状态作为协变量纳入，或者分别对MSS和MSI/高突变肿瘤进行分析。 我们详细概述了MSS型和MSI/高突变型CRC中特定KRAS突变和共突变的发生率，并发现所研究数据集之间存在显著差异，这些差异无法用人口统计学特征（年龄、性别）或肿瘤分期差异来解释。先前已有研究描述了不同人群中mCRC患者KRAS突变患病率的差异。也有研究报道，与白种人CRC患者相比，非裔美国人CRC患者的KRAS突变发生率更高（OR=1.56，95%CI=[1.30-1.87]，p=0.0001）。然而，我们研究中使用的数据集并未包含患者遗传祖先的完整信息；因此，我们无法确定不同数据集之间KRAS突变的差异是否与遗传祖先组成的变化有关。 大多数KRAS 12号密码子突变体在内在GTP水解和GAP介导的GTP水解方面均表现出显著的损伤，但核苷酸交换速率并未改变。KRAS G12C突变体是一个例外，在稳态下，约75%的突变蛋白与GTP结合，但其内在GTP酶活性仍与野生型KRAS相似，且远高于其他G12位点的致癌突变体。RAS蛋白的突变也会影响其与下游效应分子的结合亲和力。例如，与野生型KRAS相比，KRAS G12D突变体与RAF1-RBD（Ras结合域）的亲和力大约降低了五倍。 既往研究表明，与13号密码子突变相比，12号密码子KRAS突变通过抑制细胞凋亡和增强非接触依赖性生长，展现出更高的致癌潜能。体外和体内实验均证实，12号密码子突变的转化能力高于13号密码子突变。一项针对晚期或复发性结直肠癌的回顾性研究发现，12号密码子突变患者的总生存期低于KRAS野生型患者，而13号密码子突变对生存期无显著影响。对晚期和复发性结直肠癌患者的进一步研究发现，在五种最常见的12号密码子突变中，G12D和G12V与诊断后较差的总生存期独立相关。然而，最近的研究并未观察到KRAS G12D与其他KRAS突变体之间存在预后差异。综上所述，这些发现表明KRAS G12D的预后意义仍然不确定，并且可能取决于具体情况，会因患者人群、肿瘤分期和伴随的分子改变而变化。 我们的分析揭示了DFCI队列中KRAS G12突变频率的显著差异，这种差异无法用人口统计学（生理性别或年龄）或病理学（肿瘤分期和MSI状态）差异来解释，与其他两个研究队列（图1和图3）相比，这种差异是无法解释的。 尽管KRAS突变通常被认为与MSS肿瘤相关，但我们的分析表明，这种情况尤其适用于G12突变，因为我们发现MSS与MSI/高突变肿瘤之间其他密码子（G13、Q61、K117和A146）的突变频率没有显著差异（图3）。此外，更详细的分析显示，在两个数据集（TCGA和MSKCC）中，最常见的KRAS突变G12D在MSS和MSI/高突变原发性CRC中的发生率相似（图4）。相比之下，G12V突变的发生率要低得多，而G12C突变尽管具有突变表型，但在MSI/高突变癌症中却从未发现，这表明这两种突变的致癌潜力可能受到细胞遗传背景的影响。 KRAS基因13号密码子的突变表现出独特的特征。具体而言，13号密码子突变体影响水解作用，并显著增加内在核苷酸交换约10倍。值得注意的是，有报道称抑癌基因NF1在KRAS G13突变细胞中常发生共突变，但在KRAS 12号或61号密码子突变的癌症中很少发生突变。有趣的是，NF1 GAP蛋白对KRAS G12和Q61突变的KRAS无活性；然而，当其与KRAS G13D结合时，会刺激GTP水解。结果表明，KRAS G13D突变细胞也能以NF1依赖的方式对EGFR抑制剂产生反应。KRAS G13D CRC可能对EGFR抑制产生反应的临床观察结果，可以用其对NF1刺激的GTP水解敏感性增加来解释。在NF1活性正常的情况下，KRAS G13D癌细胞的KRAS GTP水平可能降低，并部分依赖于EGFR或其他受体酪氨酸激酶的上游信号传导。我们的分析未观察到NF1或RASA1突变与任何特定KRAS密码子显著富集，这表明NF1失活并非CRC中KRAS驱动的肿瘤发生的常见机制。此外，NF1和RASA1的突变频率在MSS和MSI/高突变肿瘤中均与其他长度相近的基因相似，表明这些基因的突变并非肿瘤发生或进展的强选择压力。MSI/高突变肿瘤中较高的NF1突变频率可能反映的是潜在的高突变表型，而非功能选择。 谷氨酰胺-61 (Q61) 位于KRAS GTP水解结构域的开关II区（图2）。该残基的突变会损害KRAS的固有GTP水解和GAP介导的GTP水解。这些突变还会加速GDP-GTP交换速率，导致突变蛋白在GTP结合状态下积累。特别是，与野生型KRAS相比，Q61H和Q61L突变会导致固有水解速率显著降低，约40至80倍。此外，与野生型KRAS相比，这些突变还会导致GAP刺激的水解速率显著降低。然而，Q61L突变体的GAP刺激速率比其固有速率高约15倍，这表明Q61L突变体中部分GAP依赖性催化机制仍然具有功能。与这些观察结果一致，与G12和A146突变体类似，携带Q61突变的CRC肿瘤对EGFR抗药治疗表现出耐药性，表明这些突变会损害体内GAP刺激水解的反应。 KRAS基因117位密码子的突变虽然不如12、13或61位密码子的突变常见，但却代表了一类独特的激活性改变。K117N突变通过增强核苷酸交换和降低GTP水解促进KRAS的组成型激活，但其程度低于G12或Q61突变体。生化分析显示，K117突变导致GAP刺激的GTP水解中度受损，并增强了与RAF等效应分子的结合，这支持了其致癌潜力。功能上，它们赋予KRAS基因不依赖于生长因子的信号传导，但其转化活性通常低于经典的G12突变。临床上，K117突变对EGFR抑制剂治疗的预测价值尚不明确。一些回顾性分析已将K117纳入与EGFR阻断耐药相关的非经典RAS突变中，但由于该突变发生率较低，证据有限。K117突变的相对低频率和中间生化表型凸显了进一步机制研究和临床分层的必要性。 KRAS基因A146密码子的突变表现出独特的特征。Poulin等人的研究表明，KRAS A146T突变体外固有GTP水解活性与KRAS G12D相似，但显著低于KRAS野生型。然而，KRAS G12D的GAP介导的GTP水解活性显著降低，而KRAS A146T的GAP介导的GTP水解活性仅轻微降低。此外，KRAS A146突变导致GEF介导的核苷酸交换增加，但不影响GAP活性。关于抗EGFR治疗对携带KRAS A146突变的CRC患者的影响，目前尚无定论。一些研究表明，与携带其他KRAS突变的肿瘤患者相比，携带KRAS A146突变肿瘤的CRC患者在接受抗EGFR治疗后，临床预后更佳。相反，其他研究表明，具有KRAS A146突变的肿瘤与抗EGFR疗法的耐药性有关。 截至2025年6月，仅有阿达格拉西布（adagrasib）和索托拉西布（sotorasib）获得FDA批准用于治疗结直肠癌（CRC）患者。阿达格拉西布（Krazati）于2024年6月21日获得FDA批准，用于治疗KRAS G12C突变的局部晚期或转移性结直肠癌。该批准用于与西妥昔单抗（Erbitux）联合治疗既往接受过氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康类化疗的患者。索托拉西布（Lumakras）与帕尼单抗（Vectibix）联合治疗于2025年1月16日获得FDA批准，用于治疗结直肠癌。该批准专门用于治疗既往接受过氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康类化疗的KRAS G12C突变转移性结直肠癌成人患者。欧洲药品管理局 (EMA) 尚未批准 sotorasib 或 adagrasib 用于结直肠癌 (CRC) 的治疗，但这些药物可能通过临床试验或同情用药途径获得。尽管已获批准，但这两种抑制剂仅靶向罕见的KRAS G12C突变，该突变约占微卫星稳定型 (MSS) CRC病例的3%，且在微卫星不稳定性 (MSI)/高突变型病例中未发现（图4），因此限制了其对绝大多数CRC患者的适用性。 在156项临床试验中，有52项评估了专门靶向KRAS G12C的化合物（图9），尽管这种突变在结直肠癌（CRC）中的发生率极低。这主要是由于G12C抑制剂的早期研发和监管审批，这些抑制剂开创了KRAS作为药物靶点的研究先河。这些药物在临床前CRC模型中显示出活性，并在非小细胞肺癌（NSCLC）中显示出临床疗效，促使人们评估它们在其他KRAS G12C突变肿瘤（包括CRC）中的疗效。 尽管目前G12C抑制剂存在局限性，但KRAS突变型结直肠癌的治疗格局正在迅速发展。大量临床试验正在进行中（图9），旨在研究针对其他更常见的KRAS突变（如G12D、G12V和G13D）的新型药物。这些努力反映了药物研发的重大转变，不再局限于G12C，而是着眼于更广泛的KRAS改变，这些改变构成了大多数KRAS突变型结直肠癌病例。特别是，泛RAS抑制剂和RAS(ON)抑制剂的出现是一项重大突破。这些药物旨在抑制多种KRAS突变亚型或靶向处于活性GTP结合状态的KRAS，从而克服了早期化合物的突变特异性局限性。其中一些新型抑制剂已进入I期和II期临床试验（图9），早期结果表明，它们可能为更大比例的结直肠癌患者带来显著的临床获益。 目前，多项临床试验正在评估联合疗法，例如将KRAS抑制剂与EGFR、SHP2或免疫检查点阻断剂联合使用，以克服耐药性并提高缓解率。此外，针对突变型KRAS的免疫治疗策略也正在蓬勃发展。肽疫苗、mRNA疫苗和T细胞受体（TCR）工程化疗法等方法正在临床环境中积极研究。这些疗法旨在利用免疫系统特异性识别并清除KRAS突变型肿瘤细胞，为实现持久缓解带来新的希望。 综上所述，这些正在进行的努力可能标志着KRAS突变型结直肠癌治疗的新纪元。目前临床试验的多样性和规模体现了人们克服KRAS靶向治疗历史挑战的坚定决心和浓厚兴趣。随着这些新疗法在临床开发中不断推进，人们越来越乐观地认为，不久的将来，将有更多有效且涵盖所有突变类型的治疗方案惠及更广泛的结直肠癌患者群体。 本研究全面且最新地概述了结直肠癌中KRAS突变及其治疗策略，整合了大型公开数据集以及来自多个数据库和临床试验注册中心的精选信息。本研究的一大优势在于系统地交叉引用化合物、临床试验和突变频率，并对MSS和MSI病例进行细致分层，从而提高了准确性和临床相关性。此外，本研究还重点关注具有临床意义的共突变模式，并为正在进行的治疗研究提供了背景信息，使其既可作为该领域的资源，也可作为参考。总而言之，我们的整合分析强调了KRAS突变密码子特异性和上下文特异性表征对于指导结直肠癌精准肿瘤学的重要性。然而，我们也承认本研究存在一些局限性。首先，本研究依赖于公开数据集，尽管这些数据集规模庞大且适用于此类分析，但它们并非基于人群，因此可能存在选择偏倚；突变频率可能无法完全反映在未经选择的、源自人群的队列中观察到的情况。其次，数据库注释可能不完整或不一致，尽管进行了广泛的交叉引用，但由于索引方式或报告标准不统一，一些化合物或试验可能仍被遗漏。最后，KRAS靶向疗法是一个快速发展的领域，未来很可能会出现更多未纳入本研究的化合物和临床试验。 总之，我们的研究证实了既有认知，并对CRC中KRAS突变的发生机制提出了新的见解。KRAS突变在CRC中高度普遍，最常累及12和13号密码子，较少累及61、117和146号密码子。原发灶和转移灶之间KRAS突变的高度一致性反映了其早期克隆起源。我们的分析表明，突变分布因微卫星不稳定性（MSI）状态而异。MSS肿瘤常携带KRAS-PIK3CA共突变。在MSS原发性CRC中，KRAS突变常与PIK3CA突变同时发生。这种共突变模式可能具有临床意义，因为单独靶向KRAS可能不足以抑制肿瘤生长。与之前的报道相反，我们发现KRAS G13突变与NF1突变之间没有关联；相反，NF1改变与MSI/高突变肿瘤的发生率与其他大基因相似。目前，FDA批准的KRAS抑制剂仅靶向KRAS G12C，这是一种MSS CRC中的罕见变异，在MSI CRC中几乎不存在。然而，治疗领域正在迅速扩展，涵盖了更常见的KRAS等位基因（例如G12D、G12V、G13D）的抑制剂、泛RAS和RAS(ON)抑制剂，以及免疫疗法，例如疫苗和基于TCR的疗法。 方法 结直肠癌数据集 突变和临床数据主要来源于两个数据库：癌症体细胞突变目录（COSMIC）和cBioPortal提供的结直肠癌队列。我们访问了三个队列：DFCI（619例原发性结直肠癌）、TCGA泛癌（594例原发性结直肠癌样本）和MSKCC（601例原发性结直肠癌样本和533例转移性结直肠癌样本）。在本文撰写期间，MSK-CHORD研究发布了一个更大的数据集。该泛癌数据集包含来自MSKCC的5543例结直肠癌样本，其中一些与我们分析中使用的样本重叠。然而，该数据集的临床信息缺少患者确诊时的年龄（而是提供其当前年龄，这与之前发表的重叠数据集不同），并且分期信息不如我们分析中使用的数据集详细。这些局限性使得MSK-CHORD数据与其他数据集的整合变得困难。更重要的是，与DFCI和TCGA数据集相比，MSK-CHORD数据集的样本数量显著更多，这会给分析带来相当大的偏差。因此，我们决定不将MSK-CHORD数据集纳入本研究。尽管如此，我们仍使用该数据集来验证一些观察结果，例如共突变关联以及KRAS G13与NF1突变之间缺乏关联。 TCGA队列中有66例病例和MSKCC队列中有1例病例因缺乏突变信息而被排除在后续分析之外。数据中缺少两名患者的生物性别信息，即TCGA-M5-AAT5和TCGA-M5-AATA。这两名患者的生物性别（分别为女性和男性）是根据从GDC数据门户获取的X染色体甲基化谱推断的。14例TCGA病例和56例DFCI病例缺少肿瘤分期信息。在TCGA病例中，可以通过查阅GDC数据门户中获取的病理报告，根据TNM分期信息确定肿瘤分期。对于56例DFCI病例，由于病理报告未公开，因此无法确定肿瘤分期。合并数据集包含2287例结直肠癌（CRC）。根据注释的MSI状态，病例被分为MSS或MSI：DFCI（438例MSS，91例MSI-high，90例未确定）和MSKCC（701例MSS，105例MSI，328例未确定或不确定）。TCGA病例中，MSI MANTIS评分大于0.4的病例被归类为MSI。高突变肿瘤的鉴定基于其非同义肿瘤突变负荷（TMB）。DFCI和TCGA样本中TMB大于14个突变/Mb的被认为是高突变的，而对于MSKCC样本，则应用了25个突变/Mb的TMB阈值，如先前报道。不同的阈值是由于不同队列间TMB的差异造成的，而这种差异是由不同的测序策略引起的。TCGA和DFCI数据集采用全外显子组测序 (WES) 进行分析，而MSKCC样本则使用富集癌症相关基因的靶向测序panel进行测序（214个样本使用IMPACT-341，910个样本使用IMPACT-410，9个样本使用IMPACT-468）。所有分析中，病例均根据TCGA提出的分类标准分为MSS和MSI/高突变型。 共突变分析 突变数据来自cBioportal。本研究重点分析了所有样本中涉及的341个基因（包含在IMPACT-341测序panel中的基因）。对于每对基因（A和B），条件共突变频率 (CCMF) 计算为基因A发生突变且基因B也发生突变的样本百分比（CCMF=100×(NAB/NA)，其中NAB为基因A和B均发生突变的样本数，NA为基因A发生突变的样本数）。共突变的统计分析采用Fisher精确检验（基于列联表）进行单变量分析，或采用逻辑回归，并进行Tukey事后检验（Tukey's HSD）进行多变量分析。为了以图形方式呈现具有极端值（例如等于零或无穷大）的优势比 (OR)，我们采用了尤尔关联系数，它是优势比的归一化变换 (Q=(OR−1)/(OR+1))。Q值为+1表示完全共现，-1表示完全互斥，0表示无关联。与优势比不同，尤尔Q值能够压缩较大的效应量并避免奇异性，从而为突变频率差异很大的基因提供更易于解释且视觉上更稳定的比较。 KRAS 3D渲染 GDP结合的野生型KRAS的结构来自参考文献（ID：5W22），可在PDB数据库中获得，并使用Mol*进行渲染。 统计分析 统计分析使用R语言进行。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。正态分布变量采用参数检验（例如t检验、ANOVA）进行分析。非正态分布变量采用非参数检验（Wilcoxon-Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验）进行分析。单变量分析中，比例差异采用Fisher精确检验（基于列联表）进行分析；多变量分析中，比例差异采用逻辑回归进行分析。分类变量各水平之间的两两比较采用emmeans包中的pairs函数进行评估，该函数对边际均值进行两两t检验，并使用Tukey法校正多重比较。基因集富集分析采用PANTHER Overrepresentation Test进行。名义p值小于2×10⁻¹⁶的结果汇总为p值<2×10⁻¹⁶。必要时，采用错误发现率 (FDR) 方法进行多重假设检验校正。FDR校正后的p值（称为Q值）小于0.05被认为具有统计学意义。 KRAS靶向化合物、临床试验和文献综述汇编 我们从NCI词库数据库中检索到66种靶向Ras的化合物（47种抑制剂、11种疫苗、6种TCR和2种降解剂）、12种靶向SHP2的化合物和4种靶向SOS1的化合物。为了减少冗余，我们未考虑某些药物的盐形式（例如，己二酸迪伐拉西布、利戈塞替钠、甲苯磺酸索拉非尼、甲磺酸达拉非尼、马来酸利非拉非尼和无水瑞戈非尼）。值得注意的是，NCI词库数据库中将帕鲁拉肽和Ras抑制剂LUNA18列为两个不同的代码（分别为C206963和C185876），而它们实际上是同一种化合物（CID 166509683）。我们在临床试验数据库中发现了24种靶向KRAS、SOS1或SHP2的治疗化合物，这些化合物未被NCI词库数据库收录，我们手动将其添加到数据库中，使靶向KRAS/SOS1/SHP2的化合物数量增加到106种。我们将这些信息与临床试验进行比对，这些临床试验在“条件”字段中注明了结直肠癌、结肠癌、直肠癌、CRC或实体瘤，在“研究类型”中注明了“干预性”，在“主要目的”中注明了“治疗性”，最终检索到153项研究，其中至少有一种药物曾被测试或正在测试。我们注意到，有三项重要的研究，即NCT06385925、NCT04330664和NCT03785249，由于它们在“条件”字段中没有明确注明结直肠癌或实体瘤，因此未能通过此策略检索到。这些研究是手动添加到列表中的，最终共纳入156项临床试验。对于11项“完成日期”字段缺失信息的临床试验，我们使用了“最后更新日期”。我们在PubMed（检索所有字段）和PMC（检索标题、摘要或正文关键词）中检索了引用这些临床试验的科学文章。 微信号：maple31415926 点击“转发”吧