VERVE-101

2025 年 6 月 17 号，Sekar Kathiresan 教授在高达 13 亿美金的收购协议书上签下了自己的名字，将花费七年时光培育的孩子—Verve therapeutics 完全交给了医药巨头礼来。在庆祝收购的晚宴上，Sekar Kathiresan 教授作为创始人感谢了 Verve 全体成员的努力，深信在礼来的扶持下，Verve 致力于开发的动脉粥样心血管基因编辑药物会加速上市的脚步，更快地惠及改善数全球数千万心血管患者的生活。 像 Verve 这样拥有 1-2 条具备商业化潜力管线的初创 biotech，能被 MNC 看中收购，是最没有风险的功成出路。毕竟，创新药研发是“九死一生”。对于初创公司，一个 III 期临床的失败可能意味着破产；但对于像礼来这样的医药巨头 MNC 来说，一次管线的失败不过是管线布局的一次微调。 Sekar Kathiresa 教授出身名校，是一位临床心脏病专家和人类遗传学家，曾担任麻省总医院预防心脏病科主任，哈佛医学院教授等要职。他长期致力于发现导致个体间心脏病风险差异的基因，揭示心脏病发作的生物学机制，从而改进心脏病的预防治疗。 2012 年，Sekar Kathiresa 教授挚爱的兄弟因突发心脏病不幸离世，年仅 42 岁。此前，心血管疾病就已经夺走了 Kathiresa 家族多个亲人的生命。受此触动，Sekar Kathiresa 教授在 2018 年创立 Verve therapeutics，就做一件事情：研发一次治疗便可根除动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的基因编辑药物。 2021 年，Verve 以每股 19 美元的价格上市，筹集到 2.67 亿美元，成为当年规模最大的生物科技公司 IPO 之一。随后，由于基因疗法的蓬勃发展，Verve 股价一度突破 70 美元。然而，2024 年，Verve 遭遇巨大挑战，其首个管线 VERVE-101 临床试验安全性数据不佳—一名患者出现肝酶升高和血小板计数降低的症状。虽然受试者症状迅速自行缓解，并未造成永久性损害，但是，Verve 立即叫停了 VERVE-101 临床试验项目，这也掩盖了该项目显著的疗效信号，例如部分受试者 LDL-C 水平降低了高达 73% 。 Verve 迅速转向开发 VERVE-102。这款新一代候选药物采用了新型递送系统：将 GalNAc 偶联至 LNP 表面，以实现更精准的肝脏靶向。事实证明，这一举措至关重要。2025 年 4 月 14 日公布的 Heart-2 试验的初步 1b 期数据显示，LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）水平呈剂量依赖性降低。在最高剂量组中，患者的平均 LDL-C 水平降低了 53%，其中一名患者的 LDL-C 水平降低了 69%，且未发生与治疗相关的严重不良事件。良好的安全性解决了 VERVE-101 之前存在的问题。这再次肯定了碱基编辑技术的潜力，并为礼来公司收购 VERVE 铺平了道路。 Verve 利用 LNP 作为递送系统，将编码碱基编辑器的 mRNA 精准递送至肝脏，实现体内编辑肝脏基因，以安全地失活与 ASCVD 风险相关的基因。目前，Verve 研发管线主要针对 PCSK9、ANGPTL3 和 LPA 基因，这些基因已通过人类遗传学和药理学验证，可作为降低血脂水平的靶点。本期内容，我们将深度解析 VERVE 打造的心血管研发管线，以帮助大家更好地理解基于 mRNA-LNP 技术路线的体内基因编辑药物的研发要素。 动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD） 动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球致死率最高的疾病，全球范围内有数亿患者，每年有 1500 万患者死亡。ASCVD 的致命风险源于血液胆固醇的‘长期累积效应’，这种持续的压力诱发冠状动脉粥样硬化斑块的进行性积聚，最终导致管腔阻塞。 血液胆固醇以何种形式存在呢？ 第一种，被称为''好胆固醇''，由高密度脂蛋白（HDL）携带。HDL 是所有脂蛋白中体积最小，密度最大的，其高密度源于蛋白质占比极高（约占 50%），ApoA-I 是 HDL 最核心的蛋白质成分。通过“胆固醇逆转运”路径，HDL 将外周血管壁中多余的胆固醇抓取并运回肝脏进行清理，从而预防动脉硬化。 第二种，被称为''坏胆固醇''，是 ASCVD 的关键驱动者，均含有载脂蛋白 ApoB，分为低密度脂蛋白（LDL）、富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）、脂蛋白(a)(LP(a))。TRL 由乳糜微粒（Chylomicron）、极低密度脂蛋白（VLDL）、中间密度脂蛋白（IDL）及此三种物质的残余物构成。LP(a))属于类 LDL 颗粒，由肝脏直接合成并分泌的，Apo(a) 蛋白在肝细胞表面或细胞外与 LDL 颗粒结合形成完整的 Lp(a)。 致动脉粥样硬化颗粒（含有 ApoB）携带的胆固醇含量（Non-HDL-C）可以通过总胆固醇减去 HDL-C 来简单计算。Non-HDL-C 一般反映的是 LDL 携带的胆固醇，因此，血液 LDL-C 水平被认为是动脉粥样硬化形成的主要原因。然而，当甘油三酯水平较高时，TRL 颗粒携带的胆固醇在 Non-HDL-C 中占据的比例将得到极大提升。 LDL-C 如何生成？有何功能？ 众所周知，肝脏是人体胆固醇和脂质合成的核心工厂。当肝脏需要向外周组织（如肌肉供能、脂肪组织储存）输送能量时，它会分泌 VLDL。 VLDL 是一种疏水性颗粒，疏水中心由 50%–60%的甘油三脂和 10%–15%的胆固醇酯(Cholesteryl Esters)构成，亲水外壳由磷脂、胆固醇及载脂蛋白（ApoB-100 等）构成。VLDL 进入血液循环后，并不会直接进入组织，而是在全身（主要是肌肉和脂肪组织）的毛细血管内皮内壁上进行“卸货”。所谓“卸货”是指被激活的 LPL（脂蛋白脂肪酶）将 VLDL 内部的核心成分—甘油三酯（TG）水解为游离脂肪酸（FFA）和甘油。脂肪酸随后进入肌肉细胞（作为能量燃烧）或脂肪细胞（重新合成脂肪储存）。随着 TG 的丢失，颗粒体积缩小，密度增加，转变为脱酯中间产物—VLDL 残粒 / IDL（中密度酯蛋白）。最终颗粒内的 TG 几乎被完全分解，核心成分变成胆固醇酯，颗粒表面仅剩下 ApoB-100，VLDL 变为最终代谢产物 LDL-C。LDL 负责将肝脏合成的胆固醇通过血液运送到全身组织利用，但若过剩则会沉积在血管壁形成斑块。 LDL-C 如何引发 ASCVD？ 高浓度的 LDL-C 颗粒在血流压力下穿过受损的动脉内皮屏障，滞留并沉积于内皮下间隙。沉积的 LDL 发生氧化修饰（ox-LDL），转化为具有细胞毒性的促炎分子。这些变性颗粒激活免疫系统，招募单核细胞并使其分化为巨噬细胞，进入血管壁。巨噬细胞疯狂吞噬 ox-LDL，由于缺乏代谢这类脂质的有效途径，巨噬细胞最终被“撑死”，转化为泡沫细胞（Foam Cells）。这些死亡的细胞和脂质堆积在一起，形成了脂质条纹（Fatty Streak），即早期斑块。平滑肌细胞迁移过来，在其表面覆盖一层纤维帽。随着炎症持续，斑块表面的纤维帽变薄变脆。一旦发生破裂（Rupture），内部促凝物质暴露，迅速诱发原位血栓形成（Clot/Thrombosis），导致血管腔急性闭塞，触发心梗或中风。ASCVD 的本质是胆固醇驱动的慢性炎症反应。高累积暴露的 LDL-C 提供了成斑块的‘底物’，而内皮损伤与炎症级联反应则推动了从脂质条纹到不稳定性斑块的演变，最终通过斑块破裂及继发性血栓导致临床事件的爆发。 ASCVD 现有疗法的困境 通过上面对于 ASCVD 发病机制的详细介绍，朋友们应该意识到，只要保证血液胆固醇（LDL-C)长期维系足够低水平就能够避免 ASCVD 发生。尽管他汀类药物（Statins）已应用数十年，但 ASCVD 依然是全球首位死因。由于存在他汀不耐受以及极低的长期依从性，导致大部分高危患者无法达到指南要求的 LDL-C 目标值（70mg/dL）。即使 LDL-C 达标，血液中依然存在 Lp(a) 或 ANGPTL3 介导的残余致病脂蛋白（TRL），这些是传统药物（他汀和 PCSK9 抑制剂）无法触及的“盲区”。 一次治疗，终生获益的 ASCVD 基因编辑疗法 人类遗传学研究表明，某些个体携带的基因变异会导致血液中 LDL-C 水平升高，从而增加 ASCVD 及其相关并发症（如心脏病发作）的风险。相反，某些基因变异与天然的疾病抵抗力相关，并能降低 ASCVD 的风险。例如，部分人群携带一种名为 PCSK9 或者 ANGPTL3 基因的天然保护性变异。携带这种变异的人 LDL-C 或者 LDL-C& TG 水平极低，心脏健康，不易发生心脏病发作。基于此，Verve 希望通过体内基因编辑肝脏中某些特定基因，模拟与降低 ASCVD 风险相关的天然基因突变，实现一针注射便可强效且持久地降低患者 LDL-C 水平，从根本上颠覆现有的 ASCVD 慢性病治疗模式。 PCSK9 项目 为何选择 PCSK9 基因作为编辑靶点？ LDLR 是位于肝脏细胞表面的 LDL 受体，可捕获 LDL 并将其运输至溶酶体降解，自身重新返回肝脏细胞表面。肝细胞表面的 LDLR 数量越多、活性越强，血液里的 LDL-C 降得就越快。PCSK9 是一种由肝脏合成并分泌到血液中的蛋白质。它的唯一目标就是降解 LDLR，破坏 LDLR 的循环利用。PCSK9 越高，肝细胞表面的 LDLR “抓手”就越少，血液里的胆固醇就堆积得越多。 研究发现，虽然在人类 PCSK9 基因中罕见的‘功能获得性’（gain-of-function）突变会导致家庭性高胆固醇血症（Familial hypercholesterolemina)；但与之相对，在某些人群中存在约 2%–3% 的个体，天然携带‘功能缺失性’（loss-of-function）PCSK9 变异。这些 PCSK9 功能缺失者体内 LDL-C 水平极低，ASCVD 风险骤降，而且，并不存在任何严重的健康问题。 既然如此，开发精准靶向并且失活 PCSK9 基因的基因编辑药物，便可实现一次治疗根除 ASCVD。针对 PCSK9 靶点，Verve 拥有两个管线：VERVE-101 和 VERVE-102。两个管线共同点在于均采用 ABE 碱基编辑器，靶向 PCSK9，而不同之处在于递送系统，Verve-101 采用常规四组分 LNP，Verve-102 采用 GalNAc 的 LNP 递送系统。 ABE 碱基工作原理 不同于传统的 CRISPR-Cas9（会产生 DNA 双链断裂，即 DSB），ABE 腺嘌呤碱基编辑器(Adenine Base Editor) 能够实现单碱基对的精准转换：将 A-T 转换为 G-C。在 gRNA 的指引下，nCas9 带着脱氨酶精准锁定基因组上的目标位点。当 nCas9 结合 DNA 时，它会强行拉开一段双链，形成一个 R-Loop。这使得非靶向链（Non-target strand）暴露出来。融合在前端的 TadA 脱氨酶接触到非靶向单链 DNA，将目标窗口内的 A 变成 I。然后，nCas9 在另一条链上（A →I改写的那条链）切开缺口。细胞发现有切口后，会启动修复机制。细胞会认为被切开的那条链是“旧的/错的”，而包含 I（肌苷，被视为 G 的前体）的那条链是“准确的模板”。于是，细胞会参照编辑后的链来修复切口链，从而将 A-T永久锁死为 G-C。 VERVE-101 管线 VERVE-101 采用常规四组份 LNP 递送编码靶向 PCSK9 的 ABE 碱基器 mRNA 与 gRNA（1:1），经由 ApoE-LDLR 途径被肝脏细胞摄取。进入肝脏细胞后，LNP 裂解释放出 mRNA，翻译表达碱基编辑器 ABE8.8。在 gRNA 引导下，碱基编辑器 ABE8.8 靶向 PKSC9，诱导 A→G 与 T→C 突变，破坏内含子的剪接供体位点（GT）和受体位点(AG)，从而达到失活 PKSC9 基因。 在 NHP 模型中，单次注射 1.5mg/kg VERVE-101，肝脏 PCSK9 基因平均编辑效率可达 70%，血液 PCSK9 蛋白水平降低幅度为 89%，血液 LDL-C 水平降低幅度为 68%。更令人感到振奋的是，PCSK9/LDL-C 下降水平至少维系三年（仍在持续观察）。PCSK9 基因编辑富集于肝脏组织中，表现出显著的器官靶向性，且未发现生殖传递。在分析的 6000 个肝脏基因组位点中，均未出现 ABE 碱基的脱靶现象。 肝脏是人体内极少数具有强大再生能力的器官。研发团队设计了小鼠部分肝切除（PHx）挑战模型，旨在证实 VERVE101 编辑肝脏 PCSK9 基因的永久性。静脉注射 0.5mg/kg VERVE101 后，健康小鼠肝脏 PCSK9 基因的碱基编辑效率为 60%左右，血液 PCSK9 蛋白水下降 75%左右且可维持 95 天。对于切除部分肝脏又重新长出完整肝脏的小鼠来说，肝脏 PCSK9 基因的碱基编辑效率在肝脏重生过程中一直维持在 60%左右，同时，血液 PCSK9 蛋白水下降 75%左右且可维持 95 天。也就是说，切除部分肝脏后，再生出来的肝脏依然携带经 VERVE101 编辑后失活的 PCSK9 基因，伴随着极低的血液 PCSK9 蛋白水平，充分证实 ERVE101 编辑肝脏 PCSK9 基因的的永久性。 Heart-1 临床试验项目是一项开放标签的 phase1b 临床试验，旨在评估 VERVE-101 的安全性和耐受性。招募受试者为异合子型家族性高胆固醇血症（HeFH）、确诊 ASCVD 且血脂控制不佳的患者，其中，有 9 名曾接受过冠状动脉血运重建术（搭桥手术或支架手术），4 名曾有过心肌梗死病史。患者筛选时的平均 LDL-C 水平高达 193 mg/dL，在接受了最大耐受剂量的口服降脂治疗后，无一人能达到 LDL-C 控制目标。采用静脉注射分别给予 0.1 mg/kg (n=3)、0.3 mg/kg (n=3)、0.45 mg/kg (n=6) 和 0.6 mg/kg (n=1) 的单次剂量。以血液 PCSK9 蛋白水平和 LDL-C 水平来表征 VERVE-101 的体内药效。血液 PCSK9 蛋白水平和 LDL-C 水平下降程度与 VERVE-101 注射剂量呈现剂量依赖效应。在 0.45mg/kg 与 0.6mg/kg 两个高剂量组，血液 PCSK9 蛋白平均降幅＞60%。在 0.45mg 剂量组（n=6），LDL-C 下降最高幅度为 73%，平均降幅为 42%；0.6mg 剂量组（n=1），LDL-C 平均降幅为 57%。在长期随访中，0.45mg/kg 与 0.6mg/kg 高剂量组降低后的 LDL-C 水平可持续超过一年，仍在持续随访观察。 然而，在 0.45 mg/kg 剂量组中接受治疗的第六名参与者，在给药后的前四天内出现了 3 级药物诱导的血清丙氨酸转氨酶（ALT）暂时性升高，以及 3 级药物诱导的血小板减少严重不良事件。该参与者未出现其他症状，且这些异常在几天内完全消退。初步数据表明，不良事件的发生可能是由于 LNP 导致的。由于这起不良事件的发生，为保护受试者安全，VERVE 暂停 Heart-1 临床试验项目的患者招募，转而优先启动 VERVE102 临床试验项目 Heart-2。 VERVE-102 与 VERVE-101 相比，VERVE-102 在递送系统上做了升级，将 GalNAc 偶联至 LNP 表面。在肝脏细胞表面缺乏 LDLR 的情况下，借助肝脏细胞表面 ASGPR 与 GalNAc 的结合，使得 LNP 精准靶向肝脏细胞。无论是在野生型（Ldlr+/+）、杂合子（Ldlr+/-）还是纯合子（Ldlr-/-）缺失的小鼠模型中，VERVE-102 的编辑效率基本保持一致（均在 0.5mg/kg以上达到约 50%–60% 的编辑率）。这证明了新一代递送系统可以不受 LDL 受体缺失程度的影响，使疗法能覆盖更广泛的严重遗传性高血脂群体。 Heart-2 是一项开放标签的 Phase1b 临床试验，用来评估 VERVE-102 的安全性和耐受性。招募受试者为异合子型家族性高胆固醇血症（HeFH）或者早发性冠状动脉粥样硬化患者（PCAD）。单次剂量递增试验（SAD）设置为 0.3mg/kg（n=4），0.45mg.kg(n=6)，0.6mg/kg(n=4)，0.7mg/kg。目前已接受治疗的 14 个受试者，未出现 ALT 或者血小板异常的 SAE 事件，血液 PCSK9 与 LDL-C 均表现出剂量依赖性下降。在 0.6mg/kg 高剂量组，血液 PCSK9 下降平均幅度为 60%，LDL-C 下降幅度为 53%。注射 RNA 剂量超过 50mg 时，LDL-C 下降幅度超过 50%。 ANGPTL3 项目 ANGPTL3 是一种由肝脏分泌的蛋白，可抑制脂蛋白脂酶 (LPL)和内皮脂酶 (EL)。当 ANGPTL3 基因被抑制或失活时，人体内的甘油三酯 (TG) 和 LDL-C 会显著下降。研究发现，天然携带 ANGPTL3 失活突变的人群，LDL-C 水平终生维持在极低水平，其冠心病风险也极低，且没有明显的负面健康影响，因此，ANGPTL3 基因被视为心血管疾病药物开发中的一个重要靶标。 纯合家族性高胆固醇血症(HoFH)特征是由于血液中 LDL-C 水平极高，常常超过 500 mg/dL，导致过早心脏病发作或中风。RH （refractory hypercholesterolemia，难治性高胆固醇血症）指的是尽管接受最大耐受标准治疗，但其未达到医学推荐 LDL-C 目标的 ASCVD 患者。虽然目前针对 ASCVD 的治疗选择——包括口服治疗和 PCSK9 抑制剂——通常对该患者群体无效。 VERVE 研究团队针对 HoFH 和 RH 患者群体，专门设计了 VERVE-201 一次性基因编辑药物 ，旨在关闭肝脏中的 ANGPTL3 基因，抑制肝脏 ANGPTL3 蛋白的生成，降低血液中 ANGPTL3 蛋白水平，从而持久降低 LDL-C 和残留胆固醇水平。 在 ANGPTL3 人源化小鼠中，肝脏 ANGPTL3 基因编辑效率呈现 VERVE-201 注射剂量依赖效应，并且，血液 ANGPTL3 蛋白水平下降幅度可达到 98%。在野生型（Ldlr+/+）、杂合子（Ldlr+/-）还是纯合子（Ldlr-/-）缺失的小鼠模型中，注射高剂量 VERVE-201（2mg/kg），ANGPTL3 基因编辑效率均可达到 60%，血液 ANGPTL3 蛋白水平下降幅度可达到 99%，并且，ANGPTL3 基因基因编辑 只富集在肝脏中，呈现精确的组织靶向性。 在 NHP 模型中，1.5mg/kg 和 3mg/kg 剂量组的肝脏 ANGPTL3 基因编辑效率可分别达到 55%和 63%。在 3mg/kg 剂量组，血液 ANGPTL3 蛋白水平下降幅度可达 96%。在 LDL-R 缺失 NHP 模型中，注射 VERVE-201 后，LDL-C 下降幅度 46%（从 458mg/dL 下降至 247mg/dL），TG 下降幅度为 54%。 LPA 项目 LPA 基因调控脂蛋白(a) (LP(a))，这是一种肝脏来源的脂蛋白，在血液中循环。Lp(a)是一种类 LDL 颗粒，只是还附着有另一种蛋白，称为载脂蛋白(a)（apo(a)）。血液中 Lp(a)水平升高会增加 ASCVD 风险。Lp(a) 水平高的患者与 LDL-C 水平高的患者不同——尽管两者都有患 ASCVD 的风险，但血液 LDL-C 水平与血液 Lp(a) 水平之间的相关性较低。研究发现，LPA 基因天然突变失活可降低 ASCVD 风险，且无任何健康风险。因此，VERVE 研发团队希望可开发一款靶向 LPA 的体内基因编辑药物，一次性降低血液 Lp(a)水平，降低 ASCVD 风险。 小结 VERVE 研发团队找到了与心血管疾病密切相关的靶基因，将 mRNA-LNP 技术与碱基编辑技术相结合，精准编辑失活靶基因，实现标记物血液水平的长久下降，实现一次治疗便可终生避免心血管疾病的发作。对于体内基因编辑药物来说，最为关键的是，找到与疾病发生相关的基因，采用精准高效的靶向递送系统，将编码基因编辑工具的 mRNA 递送至靶器官或者组织内，使其能够发生精确的基因编辑。VERVE体内基因编辑药物被礼来重金收购再次说明未来决定mRNA技术商业化上限的将会是递送系统的精准靶向性。 BioFactory留胡子的豆腐 出品 本公众号所发文章仅用于业内技术交流，欢迎转载。 请相信： 21世纪是生物的世纪， 然而，这和你并没有太大的关系... 纸上谈兵，偏见解读，偶尔瞎扯，欢迎指正。

摘要 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术已彻底改变分子生物学领域，并为基因靶向治疗的未来奠定基础。CRISPR系统由CRISPR相关（Cas）核酸内切酶和向导RNA（gRNA）组成，可通过编程实现互补DNA或RNA的序列特异性结合、切割或修饰。然而，CRISPR基疗法的应用面临诸多挑战，如分子大小、原核或噬菌体起源以及必需的gRNA辅因子需求等，这些因素均会影响疗效、递送效率和安全性。本综述聚焦于gRNA的化学修饰和工程化方法，旨在增强或实现CRISPR基疗法的应用，重点以Cas9和Cas12a作为治疗范式进行探讨。文章还讨论了化学修饰gRNA旨在解决的问题（包括药物递送、生理稳定性、编辑效率和脱靶效应）以及仍存在的挑战。 引言 随心所欲改变基因的能力，极大地提升了我们理解生物学和治疗遗传性疾病的能力。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关（Cas）核酸内切酶，凭借其简便的可编程性，成为基因编辑技术的前沿。 CRISPR-Cas效应酶（如化脓链球菌的Cas9（SpCas9））最初被发现是原核生物抵御病毒感染的防御机制。然而，其在基因编辑中的广泛应用潜力迅速显现——2020年获得诺贝尔奖认可，如今CRISPR基疗法已获批用于临床。相比锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等传统技术（针对每个新基因都需精心设计新蛋白），CRISPR-Cas系统可遵循高度可预测的核酸碱基配对规则，通过改变gRNA序列，快速针对几乎任何基因进行编程。 当靶向双链DNA的Cas酶被引导至靶标时，会解开DNA双链并切割两条链的磷酸二酯键。DNA双链断裂（DSBs）随后通过细胞机制修复，如非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），进而实现基因编辑。NHEJ通路修复不精确，会导致插入缺失（indel）突变，但高效适用于基因“敲除”——因为indel通常会引入提前终止密码子或错义突变，最终产生无功能蛋白。HDR通路需要“供体”DNA模板（通常其末端与DSB侧翼序列具有同源性），这种重组机制因靶标同源性而具有更高精确性，但效率较低。理论上，可利用HDR通路，通过供体DNA插入任何感兴趣的序列。尽管Cas9基系统应用最为广泛，但CRISPR的发现已涵盖两类、六型和近四十种亚型。II类系统具有单一多结构域效应蛋白（即Cas9和Cas12a酶），是生物技术和治疗领域研究最深入的类型。 开发CRISPR基药物（尤其是全身性治疗药物）需要进行常规药物学优化，包括递送效率、半衰期、疗效、特异性和作用持续时间。此外，还需对CRISPR-Cas系统进行特殊考量，例如减少脱靶编辑（即对错误基因的非预期编辑）——与传统药物不同，脱靶编辑难以逆转或修正。由于CRISPR-Cas系统由蛋白质和RNA组成，因此优化这两种组件对于治疗开发至关重要。核酸疗法的成败经验，为gRNA的化学探索提供了指导。反义寡核苷酸（ASOs）和小干扰RNA（siRNAs）等寡核苷酸疗法处于现代医学前沿，目前已有约二十余种获批用于临床。这一成就得益于两项关键化学创新：一是对磷酸骨架、核糖或脱氧核糖以及核苷酸碱基进行化学修饰，以增强递送效率和核酸酶稳定性，并减少免疫刺激；二是近期发现的高效递送方法。本综述聚焦gRNA化学工程在CRISPR-Cas系统中的作用，探讨该技术治疗转化的最新进展、潜在应用和关键问题。 CRISPR-Cas系统概述 药物设计和开发面临诸多挑战，包括递送、安全性和代谢稳定性。对于生物制剂和基因靶向药物而言，由于生物聚合物（如蛋白质和核酸）的复杂构效关系（包括折叠和分子相互作用），挑战更为复杂。为全面了解CRISPR-Cas gRNA化学工程面临的挑战、解决方案以及CRISPR疗法的广泛发展，本部分将讨论CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a酶的结构和机制——这两种酶是目前正在开发的典型治疗用系统。 Cas蛋白、向导RNA和核糖核蛋白结构 Cas9是II类II型CRISPR效应酶，具有双叶结构，包裹着gRNA:靶标DNA异源双链体。识别（REC）叶负责与异源双链体相互作用；核酸酶（NUC）叶包含原间隔区相邻基序（PAM）相互作用（PI）结构域以及HNH和RuvC催化结构域——PI结构域与靶标DNA的PAM序列相互作用，HNH和RuvC结构域的活性位点分别负责Mg²⁺依赖的靶标链和非靶标链DNA磷酸二酯键的核酸内切酶切割。最后，桥螺旋连接两个叶。 图1 天然CRISPR–Cas9和CRISPR–Cas12a复合物的结构组织 （A）化脓链球菌Cas9（SpCas9）结构域的示意图及其在核酸酶（NUC） lobe和识别（REC） lobe中的排列。右侧为SpCas9与向导RNA及靶标DNA形成复合物的晶体结构（PDB ID: 4OO8），标注了NUC lobe和REC lobe的位置，结构域颜色与左侧示意图一致。SpCas9天然双向导RNA的示意图显示了CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA），靶标DNA双链中，非靶标链为紫色，靶标链为蓝色，非靶标链上的原间隔区相邻基序（PAM）序列（NGG；N=A、C、G、T）用橙色框突出显示，红色箭头标注切割位点。 （B）嗜酸乳球菌Cas12a（AsCas12a）结构域的示意图及其在NUC lobe和REC lobe中的排列。右侧为AsCas12a与向导RNA及靶标DNA形成复合物的晶体结构（PDB ID: 5B43），标注了NUC lobe和REC lobe的位置，结构域颜色与左侧示意图一致。AsCas12a crRNA的示意图显示了向导（间隔区）和5'柄（重复序列）区域，靶标DNA双链中，非靶标链为紫色，靶标链为蓝色，非靶标链上的PAM序列（TTTV；V=A、C、G）用橙色框突出显示，红色箭头标注切割位点。 注：BH=桥螺旋；PDB=蛋白质数据库；PI=PAM相互作用结构域；WED=楔形结构域。（A）部分经Elsevier许可改编自参考文献34；（B）部分经Elsevier许可改编自参考文献33。 天然CRISPR-Cas9是双RNA引导系统，需要CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）共同实现靶标识别和切割。crRNA有两个不同区域：一个是源自CRISPR阵列间隔区的向导区域（与靶标序列互补），另一个是源自CRISPR阵列重复序列的tracrRNA配对区域（与tracrRNA的5'端互补）。tracrRNA通过折叠的茎环结构将gRNA锚定在Cas9上。在含有Cas9效应物的细菌（如化脓链球菌）中，前体crRNA在CRISPR阵列内的加工由RNase III核酸内切酶介导——与tracrRNA杂交后，产生成熟的crRNA:tracrRNA复合物。这种双向导系统通常可简化为单向导RNA（sgRNA）——通过GAAA四环将crRNA和tracrRNA连接，长度约100个核苷酸。 Cas12a（前称为Prevotella和Francisella 1的CRISPR（Cpf1））是II类V型效应酶。尽管存在多种V型亚型，但Cas12a是研究最深入的亚型，其来自不同物种的同源物在长度和基因编辑效率上存在差异。来自嗜酸胺球菌（AsCas12a）、新凶手弗朗西丝菌（FnCas12a）和毛螺菌科细菌（LbCas12a）的Cas12a常用于人类基因编辑应用。Cas12a的结构域根据与Cas9中已鉴定结构域的功能相似性命名，但二者无结构相似性。Cas12a还具有一个楔形结构域，负责与其crRNA相互作用。此外，Cas12a包含一个单一的RuvC活性位点，负责切割靶标链和非靶标链。其辅助Nuc结构域此前被认为与Cas9中的HNH结构域类似，但实际上不含活性位点，而是参与将靶标链定向到RuvC结构域中进行切割。 Cas12a具有crRNA自加工机制——通过位于楔形结构域中的额外独立活性位点，分离CRISPR阵列内的crRNA序列，产生长度约39-43个核苷酸的成熟crRNA。这种独特的核糖核酸内切酶活性已用于Cas12a基编辑系统的多重编辑。此外，与Cas9不同，Cas12a不需要tracrRNA，是天然紧凑的单RNA引导系统。这一特性对于临床应用可能具有重要价值——因为单一、较短的crRNA可通过标准固相寡核苷酸合成轻松制备。Cas12a的crRNA包含一个源自重复序列的区域（通常称为5'柄）和一个源自间隔区的向导区域——5'柄折叠成假结结构，其序列在Cas12a同源物中高度保守（这与其折叠需求和结合Cas12a的作用相关）。 gRNA通过多种弱相互作用与Cas蛋白结合，包括带负电的磷酸骨架与带正电的氨基酸之间的电荷-电荷相互作用、碱基与脂肪族侧链的疏水堆积以及氢键网络。核糖2'-羟基（2'-OH）基团与Cas蛋白之间的极性接触（通常是与肽骨架形成氢键），似乎与gRNA的化学修饰尤为相关——研究已证实，这些残基位置的2'-OH基团缺失，会对Cas蛋白功能产生显著影响。gRNA与Cas蛋白的结合会导致蛋白质结构发生构象变化，进而组装成活性核糖核蛋白（RNP）复合物。 图2 向导RNA与Cas蛋白之间代表性的2'-羟基（2'-OH）相互作用与Cas蛋白形成2'-OH相互作用的核苷酸用红色标注。 （A）Cas9单一向导RNA向导区域中的2'-OH基团，与化脓链球菌Cas9（SpCas9）蛋白中Y450的羰基氧形成氢键（PDB ID: 4OO8）。 （B）Cas12a CRISPR RNA 5'柄中的2'-OH基团，与嗜酸乳球菌AsCas12a蛋白中D966的羰基氧形成氢键（PDB ID: 5B43），键长为2.8 Å。 靶标DNA结合和切割机制 CRISPR-Cas系统切割靶标DNA的机制可概括为三个关键步骤：（1）PAM识别；（2）异源双链体“R环”形成；（3）DNA切割。Cas RNP对PAM的识别，似乎是通过与DNA分子的快速碰撞而非沿DNA滑动实现的——这也解释了为何DNA非PAM区域的结合持续时间较短。当靶标DNA与RNP复合物相互作用时，其定位方式使得带负电的DNA骨架通过与REC叶的静电相互作用，被固定在带正电的中央通道中，而PAM序列的小沟则位于PI结构域中。该结构域中的氨基酸通过碱基和形状读出机制，采样碱基相互作用以确定是否完全匹配。 图3 天然CRISPR–Cas9和CRISPR–Cas12a系统切割双链DNA及修复的通用机制 （A）左侧：Cas9蛋白（SpCas9）通过识别非靶标链（NTS）上的NGG（N=A、C、G、T）原间隔区相邻基序（PAM）序列定位靶位点，crRNA间隔区序列与PAM序列上游的靶标链（TS）杂交形成R环结构，Cas9蛋白在靶标DNA的PAM近端区域诱导双链断裂（DSB），产生平末端切割位点。crRNA间隔区衍生的向导区域为黄色，重复序列衍生的tracrRNA配对区域为橙色，tracrRNA为红色，靶标链为深蓝色，非靶标链为浅蓝色，PAM序列为黑色。右侧：Cas12a蛋白（AsCas12a）通过识别非靶标链上的TTTV（V=A、C、G）PAM序列定位靶位点，crRNA间隔区序列与该位点下游的靶标链杂交形成R环结构，Cas12a蛋白在PAM远端区域诱导双链断裂，产生粘性末端切割位点。 （B）左侧：非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制通过随机插入核苷酸形成插入缺失（indel），导致多种突变（沉默突变、错义突变、无义突变或移码突变）。右侧：同源定向修复（HDR）DNA修复机制利用两端与切割位点同源的供体模板，通过插入模板实现受控的基因校正或改造。 Cas9识别富含G的PAM（对于SpCas9，具体为NGG（N=A、C、G、T）），位于非靶标链上靶标结合区域的下游。相反，Cas12a识别富含T的PAM（对于AsCas12a，具体为TTTV（V=A、C、G）），位于非靶标链上靶标结合区域的上游。如果PAM序列完全匹配，一个氨基酸残基将插入双链DNA中，破坏双链杂交并导致靶标链上的+1磷酸基团远离非靶标链——这促进了双链DNA的局部解旋，并允许crRNA向导区域开始与靶标链进行碱基配对采样。DNA中的错误碱基序列会导致空间位阻排斥，阻碍与PI结构域的有利相互作用以及+1磷酸基团的旋转。然而，Cas12a蛋白的该结构域比Cas9的对应结构域具有更大灵活性，使其能够识别含胞嘧啶（C）残基的非经典PAM序列，尽管相互作用较弱。 第二步涉及crRNA向导区域与互补DNA靶标链形成异源双链体（也称为“R环”）。满足PAM要求后，与靶标链的碱基配对启动——非靶标链对齐到RuvC活性位点，分离的DNA双链通过NUC叶上的氢键和范德华接触得以稳定。crRNA间隔区中靠近PAM的前5-10个核苷酸（称为种子区），通过与Cas9或Cas12a的各种相互作用进行结构预排序，这种预排序有助于异源双链体碱基配对的成核。因此，这些crRNA核苷酸对错配碱基高度敏感，且Cas氨基酸高度保守。不适当或形成不良的R环不稳定，会导致Cas RNP与DNA解离。远离种子序列的错配或凸起，会导致更易耐受的结构扰动，通常允许DNA切割活性降低。两个系统中均形成20个碱基对的R环后，疏水氨基酸与异源双链体形成破坏性相互作用，阻止进一步的碱基配对。 最后一步是DNA切割。当形成满意的R环结构时，Cas蛋白内部会发生构象变化，解锁活性位点。对于Cas9，REC结构域和HNH结构域两侧的接头氨基酸会感知正确的R环形成，这一“守门”步骤被称为REC结构域构象检查点。随后，DNA链的易断裂磷酸基团被拉到活性位点中，以正确的方向和距离靠近催化残基，促进水解。HNH结构域的激活会触发额外的构象变化，激活RuvC结构域以切割非靶标链。对于Cas9，这一系列事件通常在PAM上游的第3和第4个核苷酸之间产生“平末端”DSB。 对于Cas12a，RuvC结构域中PAM序列下游第18和第19个核苷酸之间的非靶标链切割，会导致R环PAM远端的DNA双链解开。Nuc结构域与靶标链协同作用，将其折回RuvC活性位点（与非靶标链具有相同极性），在约第23和第24个核苷酸之间切割，产生“粘性末端”DSB。非靶标链可通过活性位点中的修剪进一步加工，产生更长的突出端——这可能有利于促进HDR。由于靶标链在PAM远端区域参与碱基配对的核苷酸下游被切割，因此该链在异源双链体受影响前可经历多轮切割，导致靶标序列大量缺失，可能增加indel突变导致基因敲除的概率。 CRISPR-Cas系统的化学工程 CRISPR-Cas gRNA的化学工程旨在实现多个目标，包括提高对核酸酶的稳定性、调节Cas蛋白活性和特异性、便于合成和控制，以及实现治疗递送。已有多项研究通过各种策略应对这些挑战。本部分重点介绍gRNA的化学修饰——这些修饰能够实现治疗应用，并与Cas酶活性或预期治疗结果兼容。关于所讨论的化学修饰，读者可参考专栏1和专栏2，了解已纳入gRNA的化学修饰特性的更深入描述。本综述不推测gRNA的最佳化学修饰模式——因为制定广泛的设计规则可能为时尚早。迄今为止开展的许多研究具有多样性，难以轻松、系统地相互比较以找出最佳修饰模式。研究之间的差异包括体外生化分析与基于细胞的分析、不同细胞系、递送方法、靶标序列以及每项研究特有的化学性质。此外，许多修饰尚未在每个位置单独测试，且通常在多重修饰的背景下进行。 将天然Cas9双向导RNA融合为单向导RNA 已发表的gRNA首批改造之一，是通过截短crRNA和tracrRNA，并通过GAAA四环将其融合，将SpCas9的天然双向导系统转化为sgRNA。与双RNA引导系统相比，sgRNA简化了载体表达，并已被证明可增强小鼠肝脏中的编辑活性。化学工程研究表明，四环可通过“点击化学”及相关反应引入的三唑键或其他化学基团替代。 点击化学已成功应用于多种应用中，用于连接两个分子。其具有生物正交性，且通常是快速、高产率的反应。产生三唑键的两种最常见点击反应是铜（I）催化的炔烃-叠氮化物环加成和应变促进的炔烃-叠氮化物环加成。铜（I）催化的炔烃-叠氮化物环加成可使用任何非应变炔烃基团，但依赖铜催化剂——铜对细胞有毒性，且在核酸纯化过程中难以去除，因此不太可能轻易用于治疗应用。在应变促进的炔烃-叠氮化物环加成中，应变炔烃（如环辛炔和二苯并环辛炔）无需金属催化剂即可提高对叠氮化物的反应性。三唑键用于替代整个四环或其磷酸基团时，表现出高度兼容性，甚至与未修饰的sgRNA相比，编辑效率略有提高。由于Cas9蛋白不与sgRNA四环相互作用，因此它应该能够耐受多种修饰和化学性质。连接crRNA和tracrRNA的另一种方法是利用基于四嗪的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应——该反应具有与炔烃-叠氮化物点击反应相似的有利条件。 延长半衰期、提高编辑效率和规避免疫反应 RNA的核酸酶稳定性差且易激活免疫反应，使其不适合作为治疗药物候选物。因此，gRNA的化学修饰旨在解决这些缺点。应对这些挑战的一种最简单方法，是对gRNA的5'和3'末端进行最小修饰，以抑制核酸外切酶降解并延长细胞半衰期。首个报道gRNA化学修饰的研究，将三个末端核苷酸替换为2'-O-甲基（2'-OMe）、带有硫代磷酸酯（PS）键的2'-OMe或带有硫代膦酰乙酸酯键的2'-OMe，后两种修饰在引入原代人类细胞（通常难以转染和编辑）时，显著提高了编辑活性。随后，其他研究小组证明了末端修饰对提高Cas9和Cas12a编辑效率的效用，包括带有和不带有PS键的2'-脱氧（DNA）和2'-氟RNA（2'F-RNA）。如今，在生物医学CRISPR应用中，使用修饰核苷酸和骨架键对合成gRNA的末端进行封端已成为标准做法。其他已使用的键包括酰胺键（在PAM远端区域耐受）和刺激响应性硫代磷酸酯（可响应光或过氧化氢等刺激激活编辑）。刺激响应性方法也已应用于核糖。 核苷酸碱基修饰是生物系统调控的基础，可在DNA（表观遗传学）或mRNA（表观转录组学）水平调节基因和蛋白质表达。例如5-甲基胞嘧啶（m⁵C）、5-羟甲基胞嘧啶和N⁶-甲基腺苷。转运RNA（tRNA）中存在许多天然核苷酸碱基修饰，它们在tRNA折叠、稳定性和相互作用中发挥关键作用。对其他核酸疗法的核苷酸碱基进行修饰，可减少免疫反应、增强核酸酶稳定性，并改变热稳定性和与靶标的亲和力。2023年诺贝尔生理学或医学奖基于鉴定和纳入天然核苷酸碱基修饰（如假尿苷（Ψ）），将mRNA转化为可行疫苗的价值——Ψ可减少先天免疫系统检测并增加蛋白质表达。尽管已对核苷酸碱基修饰进行了大量研究，但目前仅有三种获批用于临床（m⁵C、Ψ和N¹-甲基假尿苷）。 已有多项研究探索了核苷酸碱基修饰对gRNA的潜力。体外或无细胞Cas9切割分析表明，m⁵C、Ψ、5-甲基尿苷（m⁵U）和其他碱基修饰在tracrRNA和crRNA中均具有良好耐受性，且可提高特异性。在细胞中，这些修饰的gRNA可减少免疫识别和细胞毒性，但同时也会降低编辑活性。这项研究强调了gRNA修饰的体外和基于细胞的分析之间的差异——这在其他碱基修饰（如N⁶-甲基腺苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷和N¹-甲基假尿苷）中也观察到。有趣的是，利用尿苷耗竭增加核苷酸碱基修饰（m⁵C和Ψ）在Cas9 mRNA中的掺入，可增强编辑效率并降低免疫原性。对于Cas12a，N⁶-甲基腺苷在体外和细胞中均会降低切割效率，且这种作用依赖于细胞脱甲基酶活性。Cas蛋白与核苷酸碱基发生相互作用，而某些修饰的存在可能会破坏这种相互作用。例如，N¹-甲基假尿苷的碱基呈顺式构象，导致RNA:DNA R环杂合体不稳定。 专栏1 常用于治疗性核酸的核糖和磷酸二酯修饰特性 化学修饰在现代治疗性核酸中发挥关键作用。核酸酶抗性、热亲和力和螺旋结构等化学性质，深刻影响其生物活性。糖环的构象决定每种修饰的螺旋结构。修饰大致分为两类：形成A型螺旋结构（与RNA相似）的修饰和形成B型螺旋结构（与DNA相似）的修饰。 2'-脱氧（DNA） DNA缺乏2'-羟基（2'-OH），这增加了核糖的灵活性，允许各种糖折叠构象。因此，DNA可根据其局部环境呈现A型或B型螺旋几何结构。例如，当DNA位于相邻RNA核苷酸的环境中时，会容易获得RNA首选的A型样螺旋结构。与RNA核苷酸相比，DNA具有增强的核酸酶稳定性，但无法形成氢键相互作用。 2'-O-甲基（2'-OMe） 对于寡核苷酸疗法而言，添加2'-OMe不仅可提高靶标结合亲和力和核酸酶稳定性，还有助于降低免疫反应。这种突破性修饰在临床应用中取得了显著成功，是小干扰RNA药物帕替拉尼、吉沃西兰和英克西兰疗效的关键组成部分。由于甲基取代氢，新引入的基团不能作为氢键供体，但可以作为受体。有趣的是，RNA可被天然修饰为2'-OMe，例如通过位点特异性RNA引导的box C/D小核仁RNP复合物。 2'-氟RNA（2'F-RNA） 这种修饰通过氟原子取代2'-OH基团，是最早研究的合成RNA模拟物之一，已用于多种FDA批准的寡核苷酸疗法，包括哌加他尼和帕替拉尼。由于电负性极强的氟增强了碱基对中核苷酸碱基之间的氢键强度，2'F-RNA可提高互补核酸的热亲和力（每次修饰的ΔTm=+2-3°C；Tm为解链温度）。氟原子可作为氢键受体，但不能作为供体。值得注意的是，尽管这种修饰增强了核酸内切酶稳定性（尤其是嘧啶核苷酸），但2'F-RNA修饰的寡核苷酸仍易被核酸外切酶降解。 桥接核酸（BNAs） 研究表明，BNAs还可增强细胞摄取、结合亲和力和核酸酶稳定性。其中最简单的锁核酸（LNA），显著提高了与RNA的热亲和力（每次修饰的ΔTm=+5-9°C）。糖的预组织形成RNA样构象，以及2'-O,4'-C亚甲基桥增强的疏水相互作用，可解释结合亲和力的提高。在CRISPR-Cas9系统中测试的其他双环类似物包括受限2'-O-乙基（cEt）和N-甲基取代的BNAs（BNA NC）。 硫代磷酸酯（PS） PS键是研究最广泛的磷酸修饰之一——其中一个非桥接氧原子被硫原子取代。这种细微变化略微降低了与互补RNA的结合亲和力（每次修饰的ΔTm=-0.5°C），但增强了与血清蛋白（如白蛋白）的结合，有助于循环。由于核苷酸间PS键具有手性，长度为n个核苷酸的完全PS修饰寡核苷酸的合成，会产生2ⁿ⁻¹种可能的非对映异构体。具有Rp立体化学的PS键更易被核酸酶降解，而具有Sp立体化学的PS键对结合亲和力的损害较小。因此，差向异构体（Rp+Sp）混合物在结合亲和力和核酸酶抗性之间取得了良好平衡。 探索构效关系和扩展治疗效用 化学改变核酸结构，会对其生物物理性质（如杂交亲和力和螺旋结构）和药理性质（如疏水性、核酸酶抗性、免疫原性、药代动力学和药效学，以及在组织中的积累或半衰期）产生深远影响。这些变化可能成为临床转化的关键决定因素。化学修饰对于核酸疗法的成功至关重要——美国食品药品监督管理局（FDA）批准的每项疗法均具有至少一种必需的化学修饰。这包括PS修饰（已用于早期反义药物，如福米韦生）、2'-OMe和2'F-RNA修饰（有助于小干扰RNA疗法，如吉沃西兰和卢马西兰的疗效）、2'-O-甲氧基乙基修饰（存在于ASO中，如米泊美生、英托森和沃拉诺森，可提高靶标结合和稳定性）。吗啉代磷酸二酰胺寡核苷酸具有抗核酸酶的中性骨架，用于剪接转换寡核苷酸（如依特立生和戈洛迪生），治疗杜氏肌营养不良症。从基础科学角度而言，核酸的化学修饰还可作为探针，更好地理解与辅因子（即Cas9）或分子靶标（即DNA或RNA）相互作用时的构效关系和作用机制。 对RNA核苷酸碱基的核糖部分进行修饰，可通过减少免疫识别、增加半衰期和稳定性，以及调节靶标杂交亲和力，增强治疗性质。最直接的修饰之一是将2'-OH基团替换为氢（H），形成2'-脱氧核糖（即DNA）。已有多个研究小组探索了Cas9和Cas12a crRNA中的DNA取代——既作为探索构效关系的探针，也作为提高潜在治疗效用的方法。完全转化为DNA会使crRNA失活，可能是由于失去了足够的A型结构和氢键网络。然而，部分DNA修饰（尤其是在与Cas蛋白相互作用不显著的位置，如环区域、末端以及远离预测的2'-OH接触点）具有良好耐受性，甚至可增强酶活性和特异性。 图4 CRISPR–Cas9系统中连接crRNA和tracrRNA形成单一向导RNA（sgRNA）的化学修饰此类化学修饰包括非张力（A部分）和张力（B部分）三唑基连接体，以及短链（C部分）和长链（D部分）四嗪基连接体。注：crRNA=CRISPR RNA；tracrRNA=反式激活crRNA。 DNA是天然存在的核苷酸，仍易受酶降解，并会被参与先天免疫传感的细胞因子识别。因此，已对其他具有明确特性且在核酸疗法中取得成功记录的核糖修饰进行了更深入的研究。这些修饰包括2'-OMe、2'F-RNA和2'-4'桥接核酸（BNAs）——它们更能模拟RNA核苷酸结构，要么阻断RNase识别，要么阻止2'氧对相邻3'磷酸的通常分子内攻击。 2'位置的甲基化（生成天然存在的2'-OMe），已用于替换Cas9 crRNAs、tracrRNAs和sgRNAs以及Cas12a crRNAs末端的5'和3'核苷酸。据报道，这种修饰可提高稳定性、活性和特异性——尽管更高的活性可能源于细胞中更长的半衰期。在内部特定位置（略微庞大的甲基不会造成空间限制或破坏由2'-OH基团介导的预测极性接触），2'-OMe的内部放置也具有良好耐受性。 2'F-RNA修饰已被纳入Cas9的双向导系统（即crRNA和tracrRNA）和sgRNA，以及Cas12a的crRNA。当放置在高度2'-OMe修饰的Cas9 sgRNA的向导区域时，可提高体内编辑活性并减少脱靶编辑事件。在双向导背景下，完全2'F-RNA修饰的crRNA在体外保持编辑活性，但在细胞中几乎完全丧失活性。向导区域中交替的2'F-RNA/2'-OMe模式，完全消除了体外编辑活性。在种子区域3'端放置2'F-RNA，在主要为全DNA修饰或未修饰的crRNA背景下，在体外具有耐受性。然而，当这些crRNA用于细胞时，基因编辑显著降低。2'F-RNA最有效的位置之一是在gRNA间隔区的5'端（种子区域外）。在Cas9的tracrRNA中，2'F-RNA可有效提高细胞编辑效率，尤其是与2'-OMe等其他修饰结合时。 当2'F-RNA被纳入Cas12a的crRNA时，内部2'F-RNA取代比2'-OMe具有更好的耐受性，允许纳入更多修饰。此外，在3'端替换多达五个连续的2'F-RNAs，相对于未修饰的crRNA，可提高活性。这可能是由于氟的原子半径小，对整体结构的影响最小，并保护RNA链免受核酸内切酶稳定性影响（尤其是在嘧啶位点）。这种修饰模式广泛适用于不同的靶标基因，并可用于增强低产量同源物（如LbCas12a）的编辑活性。然而，用2'F-RNA或其他核苷酸类似物对crRNA进行更广泛的修饰，需要考虑对这种取代敏感的2'-OH接触。 在Cas9的间隔区种子区域放置BNAs（如LNA、cEt和BNA NC），可提高细胞中的PAM特异性，但降低体外切割动力学和活性。这归因于BNA修饰有助于诱导强A型螺旋特征，从而更好地与靶标DNA结合。由于其空间位阻较大，在gRNA间隔区的特定位点纳入BNA NC，与锁核酸相比，可提高靶标特异性。尽管BNA类似物在构象上“锁定”，但增强寡核苷酸灵活性的修饰，在靶向复杂二级结构时非常有用。当在双向导系统中使用时，经解锁核酸（UNA）修饰的Cas9 crRNA，在体外表现出最低的基因编辑活性。然而，仅在间隔区3'端的单个位置（与其他化学修饰结合）测试了UNA。增强灵活性的另一类是非核苷酸连接体（如丁二醇）——当在与UNA相同的位置和化学修饰背景下使用时，也表现出最低的编辑活性。因此，需要开展更多研究，以确定UNA和丁二醇等柔性修饰是否可在其他位置增强gRNA特性。 不符合典型RNA模拟物特性但已被研究的修饰，是2'-阿拉伯核酸和2'-氟-阿拉伯核酸。鉴于它们倾向于DNA样糖构象，已用于研究先前研究中涉及的A型螺旋结构、灵活性和2'-OH要求。当用于Cas9和Cas12a crRNAs时，这些修饰通常降低体外编辑活性。然而，当用于Cas9 crRNA的tracrRNA配对区域时，体外切割活性得以维持。 2'-羟基屏障 目前，文献中评估的所有核糖修饰，均未能令人满意地替换gRNA与Cas9或Cas12a蛋白形成2'-OH极性接触的大多数残基。我们通俗地将这一瓶颈（有效阻止gRNA的完全化学调节）称为“2'-羟基屏障”。围绕2'-羟基屏障的一个令人困惑的现象是，一些修饰在这些位置在体外具有良好耐受性——即使使用完全化学修饰的gRNA，也能提供强大的酶促切割，但当引入细胞时，这些相同的gRNA通常不支持高效的基因编辑。这些结果表明，细胞环境或染色质底物的独特特征，赋予CRISPR-Cas酶对2'-OH接触的关键敏感性。细胞环境中固有的几个因素可能导致这种差异。一个关键考虑因素是活性RNP复合物的浓度——体外分析通常使用更高浓度的RNP和靶标DNA，且不受细胞摄取、区室化、定位和分子拥挤的限制。此外，基因组DNA的染色质可及性，使其比纯化DNA更难结合和切割。因此，2'-OH接触的细微变化及其在Cas活性中的作用，在体外可能无关紧要，但会影响细胞环境中的基因编辑。 当试图替换关键2'-OH位置的天然RNA残基时，观察到体积较大的修饰（如Cas9 crRNA中的2'F-4'OMe和2'4'-diOMe修饰，以及Cas12a crRNA中的七元环氧杂环核酸）兼容性较差。相反，结构干扰较小的修饰（如2'F-RNA和DNA）在某些位置具有更好的耐受性。不幸的是，DNA不具备氢键形成能力，且2'F-RNA仅能提供一些氢键受体特性，而不能提供氢键供体特性。2'-阿拉伯核酸是RNA的立体异构体，但2'-OH指向相反方向，在少数关键2'-OH残基处的替换，尽管表现出体外切割活性，但未能支持Cas12a的基因编辑。为了在2'位置替换氢键供体和氢键受体特性，在Cas12a crRNA的5'柄中的单个残基处纳入了2'-氨基（2'-NH₂）。对两个关键残基进行2'-NH₂和2'F-RNA的逐步替换，发现无法替换大多数接触位置的2'-OH，尽管观察到每种修饰都具有一定的位置依赖性和序列依赖性。 尽管关键2'-OH残基必须在很大程度上保持为天然RNA核苷酸，但仍可通过相邻磷酸二酯键的修饰（如PS键）对其进行部分保护，尽管编辑活性通常会降低。鉴于PS键改变了微妙的蛋白质相互作用，并略微降低了杂交亲和力，这些观察结果表明，2'-OH基团除了简单的氢键外，还发挥着其他功能（如支持酶动力学）。除硫代膦酰乙酸酯外，还在Cas9 crRNA的间隔区探索了膦酰乙酸酯（PACE）骨架修饰。在特定位置纳入PACE，可显著降低脱靶效应。尽管未在特定2'-OH接触的背景下进行PACE纳入，但这些结果表明，关键2'-OH接触可能有助于控制特异性和活性，并主张对连接修饰进行更多研究。还探索了Cas9 crRNA中的2',5'-RNA——这种连接在保持糖上的羟基的同时，提供了增强的核酸酶抗性。然而，在整个Cas9 crRNA中多次连续插入这种非经典连接，会导致编辑活性降低或丧失。最后，磷酰胍是一种电荷中性骨架修饰——当策略性地纳入Cas9 crRNA的PAM远端间隔区的特定位置（远离2'-OH接触）时，发现在不显著影响编辑活性的情况下，可提高靶标特异性。 为解决2'-羟基屏障问题，应进一步探索能够维持2'-OH接触但赋予核酸酶抗性的新型化学物质（如4'核糖修饰）。然而，它们对核糖环构象、碱基配对效率和空间位阻的影响可能会影响功能，需要加以考虑。其他工程替代方案可能提供解决方案，例如最近展示的使用化学修饰的寡核苷酸，与不稳定RNA核苷酸上的sgRNA杂交，从而实现sgRNA在体内的“裸”未配方递送。同样，共价缀合物的探索较少，但它们可以掩盖gRNA或有效地将其导向特定组织。例如，与SpCas9a蛋白融合的细胞穿透肽，已被证明可增强向纹状体的递送。单个Cas酶的蛋白质工程，也可能为某些治疗应用提供解决方法。尽管已投入大量精力进行Cas蛋白工程，但在将CRISPR gRNA的化学工程与Cas蛋白工程相结合方面，仍存在巨大差距。 Cas9和Cas12a系统均观察到2'-羟基屏障，这表明RNA引导的CRISPR酶可能共享更广泛的特征。一种假设是，对2'-OH接触的依赖，源于RNA向导与其蛋白质对应物的密切协同进化——有助于调节酶活性（如许多辅因子所做的那样），或确保DNA不能被替代用于促进切割活性。值得注意的是，对于Cas9和Cas12a，2'-OH接触主要发生在gRNA和肽骨架之间，而非氨基酸侧链之间。这些接触可能通过构象动力学在调节酶活性中发挥作用。然而，在Cas酶催化所经历的许多构象状态转变过程中，它们的状态仍不清楚。尽管gRNA的完全修饰对于许多应用可能并非必需，但深入理解修饰耐受性的规则，对于精确调整CRISPR-Cas系统以满足临床疗效标准并解锁更广泛的治疗用途至关重要。重要的是，类似的2'-羟基屏障可能适用于其他RNA引导的酶。因此，理解2'-羟基屏障可能不仅加速CRISPR基疗法的发展，还将影响CRISPR之外的其他RNA引导系统（这些系统最终可能找到治疗应用，如最近发现的桥RNA引导的IS110基重组系统）。 图5 CRISPR–Cas系统中使用的化学修饰 这些修饰分为三类：核苷酸碱基修饰（黄色）、糖基修饰（红色）和磷酸基团修饰（蓝色），涵盖核碱基（如m⁵C、Ψ）、糖环（如2'-OMe、2'F-RNA、LNA、UNA）及磷酸骨架（如PS、PACE、PG）等多种修饰类型。 专栏2 纳入CRISPR RNA的其他多种化学修饰 4'-O-甲基（4'-OMe）与2'-F和2'-OMe结合 2'F-4'OMe和2'4'-diOMe修饰被证明采用RNA样构象。这两种修饰均增强核酸酶稳定性，提高热亲和力，并在小干扰RNA中具有耐受性。 解锁核酸（UNA）和非核苷酸连接体 UNA得名于核糖中缺乏C2'-C3'键，显著降低RNA双链体中的结合亲和力（每次修饰的ΔTm=-10°C；Tm为解链温度），但增加了寡核苷酸靶向二级结构的灵活性。尽管降低了结合亲和力，但与天然RNA相比，它确实增强了错配识别和核酸酶抗性。 丁二醇（C4）连接体等非核苷酸结构已被证明可破坏双链体结构，但增强其灵活性。这种修饰维持了磷酸距离，并已被证明可破坏双链体（每次修饰的ΔTm=-5至-8°C），但当纳入DNA:RNA双链体的反义链时，可将RNase H切割速率提高3.5倍——这与反义寡核苷酸应用相关。相比之下，UNA修饰未显示出这种增强。 阿拉伯核酸（ANA）和2'-氟-阿拉伯核酸（2'F-ANA） ANA是RNA的立体异构体，由于2'-OH位于核糖的相反面，构象与DNA相似。ANA可与RNA结合，但不能与DNA互补，并且比DNA和RNA对3'核酸外切酶具有更高的抗性。 2'F-ANA修饰是2'F-RNA的差向异构体，采用DNA样糖构象。2'F-ANA:RNA杂合体的一个特殊特征是在嘌呤:嘧啶步骤（如TG和TA）形成核苷酸间氟-氢键（2'F-H8）。有证据表明，这些相互作用也发生在嘧啶和嘌呤核苷的分子内。2'F-ANA寡核苷酸有许多应用，包括反义寡核苷酸、小干扰RNA和适配体。与ANA类似，2'F-ANA也赋予增强的3'核酸外切酶抗性。 2',5'-RNA 2',5'核苷酸间连接是核酸中最常见的经典3',5'连接的替代方案。尽管这种连接破坏了RNA双链体（每次修饰的ΔTm=-2.5至-4.3°C），但糖折叠适应其构象的能力（尤其是当在其他3',5'-RNA链中使用单个或最小插入时），允许分子的结构灵活性。 2'-氨基（2'-NH₂） 2'-NH₂包含胺基而非2'-OH基团，可同时作为氢受体和氢供体。在生理pH下，由于2'-NH₂基团的pKa约为6.2，2'-NH₂的主要形式是非质子化的。这增加了形成氢键相互作用的可能性。这种修饰采用与DNA相似的构象。 氧杂环核酸 氧杂环核酸（OxNA）具有扩展的环结构，带有七元环。随着环大小的增加，它可以在多个位置拥有羟基，原则上能够形成多个氢键相互作用。OxNA的扩展环结构，使其能够将核苷酸间连接放置在糖环的各个位置。 膦酰乙酸酯和硫代膦酰乙酸酯 骨架修饰膦酰乙酸酯（PACE）和硫代膦酰乙酸酯（thioPACE）具有磷-碳键，分别带有非桥接氧或硫原子。研究表明，当用于DNA时，它们会募集RNase H，并且对核酸酶具有抗性。 磷酰胍 磷酰胍（PG）连接是一种骨架修饰，用磷酰胍基团取代其中一个非桥接氧原子，使骨架呈电荷中性。这种修饰增强了细胞摄取和核酸酶抗性。此外，与其他骨架修饰不同，这种连接增强了与DNA和RNA靶标的杂交亲和力，并在细胞中具有低毒性。 递送难题 与许多核酸疗法类似，靶向且安全的递送，是CRISPR-Cas系统在临床应用中有效使用的重大挑战。该系统组件的大尺寸、负电荷和可变稳定性，带来了诸多困难。 图6 CRISPR–Cas系统的递送方式 （A）临床试验中使用的CRISPR组件（mRNA和向导RNA）及递送系统（脂质纳米颗粒）：脂质纳米颗粒（LNP）包裹编码Cas蛋白的mRNA和化学稳定的向导RNA（gRNA），mRNA 5'端带有帽子结构（5'GPPPAAA-3'），通过LNP实现体内递送。 （B）临床前开发阶段的组件及递送系统：包括DNA质粒（编码Cas蛋白和gRNA）、核糖核蛋白（RNP），以及类病毒颗粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、细胞穿透肽和外泌体等递送载体，可实现不同CRISPR组件的靶向递送。 正在进行的临床试验主要利用腺相关病毒表达或脂质纳米颗粒（LNP）制剂进行递送。病毒载体（尤其是腺相关病毒）已被广泛探索用于基因编辑应用——因其尺寸小、递送效率高且具有组织特异性嗜性。然而，其包装容量限制在约4.7 kb，这限制了更大CRISPR系统的递送。这一障碍可通过使用不同的病毒递送载体（如慢病毒和腺病毒颗粒）来克服——这些载体在负载容量、封装的遗传物质类型、免疫原性和组织嗜性方面存在差异。或者，可将CRISPR组件分为两个病毒载体，并使用更小的Cas酶（如金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）和丹毒丝菌科的Cas12a（EbCas12a））或内含肽分裂Cas9，以减少总体负载。类病毒颗粒已成为一种有前途的方法，兼具病毒和非病毒递送的优点。类病毒颗粒源自逆转录病毒（如HIV-1和莫洛尼小鼠白血病病毒），能够直接递送mRNA、蛋白质或RNPs，而非工程化病毒基因组。DNA表达载体可与细胞穿透肽组装成纳米结构，作为病毒载体或类病毒颗粒的替代方案。这些短肽带正电，通过静电相互作用与载体DNA结合。它们还可与核定位序列缀合，以促进核转运，或与适配体缀合以实现细胞靶向能力。 除了递送编码基因编辑系统的DNA外，还可将CRISPR组件作为单独的RNA分子递送至细胞，具体为编码Cas蛋白的mRNA和化学稳定的gRNA。Cas蛋白必须从mRNA翻译而来，这在RNP组装前造成时间滞后，因此gRNA的化学稳定尤为重要。基于RNA的递送最常见的方法是使用LNPs——如先前经临床批准的小干扰RNA疗法和mRNA疫苗所证明的。此外，由于其瞬时和非病毒特性，以及无法永久整合到患者细胞的基因组中，使用LNPs进行基于RNA的CRISPR-Cas系统递送，可减轻DNA表达的风险。LNPs能够在全身给药或直接给药至所需组织后，靶向多种组织（基于其大小和脂质组成）。它们还可共同配制，将Cas mRNA和gRNA封装在同一个颗粒中，确保递送至确切位置。LNPs可通过靶向配体进一步功能化，以提高特异性。例如，N-乙酰半乳糖胺功能化的LNPs优先靶向肝脏，并且在临床批准的小干扰RNA和ASO递送中安全且稳健。LNPs在血清中与载脂蛋白E（ApoE）复合后，主要被肝细胞内吞。内吞作用遵循N-乙酰半乳糖胺与脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPRs）的结合——ASGPRs在肝细胞中的表达浓度显著高于其他细胞类型，从而实现靶向摄取。 在基于RNP的递送方法中，预先组装的RNP复合物直接递送至细胞，可精确控制Cas蛋白和gRNA的组成和浓度。这种方法有助于最大限度地减少对gRNA的化学修饰要求，并消除RNP组装作为限制因素，通常可实现高编辑效率。然而，与质粒和mRNA类似，RNP复合物必须受到保护，且无法轻易穿过细胞膜。电穿孔有利于合子和干细胞的体外基因编辑。然而，这种方法对于体内基因编辑既不安全也不实用。大脑有多种直接注射途径，如鞘内注射、纹状体内注射和脑室内注射。然而，研究人员主要利用静脉内或皮下给药，在肝外组织中递送RNP复合物。LNP制剂和外泌体可全身封装并向细胞递送RNP复合物。外泌体是由脂质双层组成的天然细胞外囊泡。该双层在循环过程中保护RNP复合物，并防止其被免疫细胞识别和破坏。外泌体可源自靶细胞类型，或通过肽人工功能化以实现靶向递送。 下一代CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统进化为原核生物抵御噬菌体和自私遗传元件的防御机制，而非用于临床应用中的精确遗传操作。将其引入哺乳动物细胞以产生DSBs，通常会导致除偶尔脱靶编辑外的不良副作用，如诱导遗传毒性、大缺失、染色体易位和染色体重排。控制DNA修复结果的难度，促使开发不产生DSBs的替代CRISPR-Cas效应物。这些系统利用催化失活的“失活”（即dCas9）或切口酶（即nCas9）版本，与其他酶或因子融合以产生预期效果。例如DNA核苷酸碱基转换（碱基编辑）、通过逆转录引入新的短模板序列（引导编辑），以及瞬时表观基因组编辑技术（如转录激活（CRISPRa）或转录干扰（CRISPRi））。此外，使用Cas13等CRISPR-Cas系统靶向RNA，为基因靶向治疗创造了新机会。重要的是，化学crRNA工程的许多优势和挑战将扩展到这些下一代系统——因为它们仍然依赖RNA向导。有关表观基因组编辑的更深入讨论，读者可参考Villiger等人的综述。 图7 无双链断裂的工程化CRISPR–Cas介导编辑 （A）碱基编辑：将Cas9切口酶（nCas9）与脱氨酶融合，无需产生双链DNA断裂即可实现单碱基替换（C→T或A→G）。 （B）引导编辑：由nCas9和逆转录酶（RT）组成，利用引导编辑向导RNA（pegRNA）进行精确DNA编辑，pegRNA包含单一向导RNA、RT模板和引物结合位点。 （C）转录激活（CRISPRa）：将催化失活的Cas9（dCas9）与转录激活结构域（如VP64、VPR、SunTag）融合，工程化单一向导RNA通过MS2适配体募集与MS2外壳蛋白连接的转录激活因子P65和HSF1，靶向基因启动子区域以提高靶基因表达。 （D）转录干扰（CRISPRi）：将dCas9与转录抑制结构域（如KRAB）融合，复合物靶向基因靶位点以抑制转录。 碱基编辑器和引导编辑器 碱基编辑器（BEs）可将核苷酸碱基对从C·G转换为T·A，或从A·T转换为G·C，无需产生DSBs或需要供体模板。它们由gRNA和dCas9（在某些情况下为nCas9）与胞苷或腺苷脱氨酶融合组成。RNA引导系统引导脱氨酶催化靶标碱基的化学转换，从而改变DNA序列。胞嘧啶碱基编辑器将C转换为U，随后在DNA复制或修复过程中被校正为T。同样，腺嘌呤碱基编辑器将A转换为肌苷（I），进一步被校正为G。 编码BE蛋白的mRNA和sgRNA的化学修饰，已被证明可增强碱基编辑效率。在非人灵长类动物中，基于LNP的体内递送利用了带有末端2'-OMe和PS修饰的合成gRNA。用5-甲氧基尿苷替换mRNA中的所有尿苷残基，以及sgRNA的末端2'-OMe和PS修饰，可增加蛋白质表达并显著提高A-to-G转换率。此外，将修饰的sgRNA（带有PACE的2'-OMe）与BE4 mRNA结合使用，与2'-OMe-PS修饰相比，胞苷碱基编辑效率提高了40%，残留sgRNA水平增加了250倍。 与BEs（仅限于特定类型的核苷酸碱基转换）不同，引导编辑器允许更广泛的高精度编辑，包括小插入、缺失和所有12种可能的碱基到碱基转换，无需诱导DSBs。这些系统依赖于与逆转录酶（RT）融合的nCas9，以及称为引导编辑向导RNA（pegRNA）的工程化gRNA。pegRNA由靶向基因组位点的间隔区序列、作为RT介导合成起始序列的引物结合位点，以及编码预期编辑的RT模板序列组成。 pegRNA的稳定性极大地影响引导编辑的功效。核酸外切酶降解导致截短的pegRNAs与全长RNAs竞争，从而降低效率。已使用pegRNA 3'端的结构化基序来解决稳定性问题。例如，3'假结（evopreQ1或mpknot）在各种基因组背景和细胞类型中，使引导编辑效率提高了3-4倍。其他基序包括寨卡病毒核糖核酸外切酶抗性RNA基序（xr-pegRNA）和G-四链体结构，可使引导编辑效率提高4.5倍。 pegRNAs的化学修饰也提高了编辑效率。三个末端2'-OMe和PS键被证明可在人类细胞中提高编辑效率高达3.1倍。体内研究还表明，pegRNA中带有三个末端PS键的全2'-OMe引物结合位点，使编辑效率提高了2.8倍。相反，RT模板的全2'-OMe替换导致活性显著降低。在使用DNA聚合酶而非逆转录酶的分裂引导编辑器中，引物结合位点的全2'-OMe修饰也具有良好耐受性。与带有逆转录酶和pegRNAs的传统引导编辑器不同，这些系统利用DNA聚合酶和未连接的sgRNA（称为线性RNA引导编辑模板或DNA聚合酶模板）。值得注意的是，将DNA修饰引入RT模板，增强了该系统的活性。 转录激活（CRISPRa）或干扰（CRISPRi） CRISPRa和CRISPRi等系统利用dCas9进行靶标DNA结合，而不进行切割。当被引导至基因启动子时，dCas9可与各种转录因子或表观遗传酶融合，以上调或下调基因表达。CRISPRa将dCas9与多个拷贝的VP16反式激活因子结构域或其他激活结构域（如三方激活模块VP64-p65-Rta（VPR））融合。这些结构域与细胞的转录机制相互作用，导致转录上调。或者，SunTag利用重复肽阵列，每个dCas9融合多个VP64激活结构域。协同激活介质（SAM）利用dCas9-VP64，带有包含两个MS2适配体的工程化sgRNA支架——这些适配体结合与HSF1和p65激活结构域融合的MS2外壳蛋白。与VPR和SunTag相比，这种方法导致更高水平的基因激活。第一代CRISPRi使用与dCas9融合的KRAB阻遏物结构域。该结构域通过其锌指基序与DNA结合，并募集TRIM28以诱导异染色质扩散，从而导致基因表达。向KRAB添加MeCP2等效应物，进一步增强了转录抑制，且据报道，SALL1-SDS3等其他结构域表现异常出色。很少有研究探索CRISPRa或CRISPRi的化学修饰向导。仅报道CRISPRi通过纳入两个相对标准的末端2'-OMe-PS键，利用化学修饰的gRNAs。 靶向RNA 天然靶向RNA而非DNA的CRISPR-Cas系统（如CRISPR效应物Cas13家族），是治疗开发的新兴工具。RNA靶向Cas酶的核酸内切酶活性，是RNAi或基于ASO的基因靶向治疗的替代方案。然而，非靶向RNA的非特异性附带切割是一个持续存在的挑战，限制了安全性。化学修饰的crRNAs是否有助于控制Cas13系统的附带切割或脱靶/在靶编辑，目前尚不清楚。迄今为止，仅有一项研究专门调查了Cas13d crRNA的化学修饰，得出结论：RNA敲低活性和持续时间的最显著提升，来自用2'-OMe或PS替换三个3'末端核苷酸，但不同时使用两者。用2'-OMe替换更大部分或整个crRNA，导致活性大幅丧失。然而，RfxCas13d（前称为CasRx）的高分辨率分子结构尚未获得，因此无法研究crRNA与Cas13d之间潜在的2'-OH接触。RNA靶向治疗应用可能转向催化失活（dCas13）版本。这些包括最近改进转剪接技术的尝试——可在pre-mRNA剪接过程中替换整个外显子，或dCas13与其他效应酶融合（如用于位点特异性和靶向A-to-I RNA编辑的ADAR催化结构域）。 CRISPR基疗法 用于血液疾病的Exa-cel/CTX001和Reni-cel/EDIT-301 首个获得临床批准的CRISPR基疗法是exagamglogene autotemcel（exa-cel，前称为CTX001），由Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics联合开发，用于治疗输血依赖性β-地中海贫血（TDT）或镰状细胞贫血（SCD）患者。由于血红蛋白疾病的单基因性质和孟德尔遗传模式（简化了靶向并导致其在不同人群中的高患病率），这些疾病成为CRISPR基药物干预的有希望候选者。 这两种疾病均由编码成人血红蛋白（HbA）β-珠蛋白亚基的HBB基因突变引起，导致红细胞缺陷或畸形。尽管TDT和SCD影响HbA的正确形成，但胎儿血红蛋白（HbF）不受影响。HbF的产生由转录因子BCL11A调控，BCL11A抑制γ-珠蛋白表达。通常，HbF在出生前后被HbA取代；然而，具有HbF遗传性持续性的个体，其BCL11A变体失活，允许出生后γ-珠蛋白表达，且无临床后果。HbF的遗传性持续性可预防疾病的临床表现。 Exa-cel利用CRISPR-Cas9进行编辑，模拟天然存在的BCL11A变体，以恢复TDT和SCD患者的红细胞功能。该疗法涉及CRISPR编辑的自体CD34+造血干祖细胞（HPSCs）——收集患者细胞，体外编辑，然后通过静脉输注返回患者体内。编辑使用与带有三个末端2'-OMe-PS修饰的sgRNAs组装的Cas9 RNPs。sgRNA靶向红细胞特异性增强子区域的BCL11A基因，从而降低其表达。这种优化策略导致最低的细胞毒性、高水平的基因编辑和检测不到的脱靶编辑。 Exa-cel的初步I期临床试验显示，一名TDT患者和一名SCD患者反应良好。该方法导致两名患者的等位基因编辑频率分别为68.9-82.7%。在第15个月时，TDT患者100%的外周红细胞表达HbF（F细胞），SCD患者98.1%的外周F细胞表达HbF。随后，共有97名患者纳入该研究，绝大多数患者达到了输血独立性和无血管闭塞危象的终点。2023年11月，exa-cel获得英国药品和医疗产品监管局的有条件批准，成为首个获得监管机构批准的CRISPR基疗法。FDA随后于2023年12月和2024年1月，分别批准exa-cel用于治疗TDT患者和伴有血管闭塞危象的SCD患者。 与exa-cel类似，另一种用于TDT和SCD的体外CRISPR基疗法是renizgamglogene autogedtemcel（reni-cel，前称为EDIT-301），由Editas Medicine开发。Reni-cel也由CRISPR编辑的自体CD34+ HPSCs组成；然而，使用的是CRISPR-Cas12a系统，靶标是HBG1/2基因。编码γ-珠蛋白亚基的HBG1/2基因，与HBB基因一起包含在β-珠蛋白基因座中。HBG1/2启动子区域包含靠近激活因子NF-Y结合位点的近端CCAAT盒基序，以及靠近BCL11A阻遏物结合位点的远端CCAAT盒基序。在成人阶段的红细胞中，BCL11A及其辅阻遏物在空间上阻断NF-Y结合，导致NF-Y及其辅激活因子结合到HBB启动子上。远端CCAAT盒基序内的多个单核苷酸多态性（SNPs）可阻止BCL11A结合，这些SNPs通常在具有HbF遗传性持续性的患者中发现。Reni-cel通过使用CRISPR-Cas12a，模拟BCL11A结合区域中的破坏性SNPs。与Cas9系统相比，专有Cas12a系统的使用导致更高的特异性和编辑效率、更大的缺失和更多的indel形成。 在临床前研究中，供体CD34+ HPSCs中观察到约90%的编辑效率，这在小鼠中赋予40-50%的HbF表达。鉴于总血红蛋白中约30%的HbF与两种疾病的症状消失相关，这些水平被认为具有治疗相关性。在一项有限的I/II期临床试验中，两名重度TDT患者和七名重度SCD患者接受了reni-cel治疗。治疗导致HbF和总血红蛋白均增加，4个月后观察到超过40%的HbF，并在整个随访期间保持稳定，从而达到目标水平。治疗还使TDT患者实现输血独立性，SCD患者无血管闭塞危象。 用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性的NTLA-2001 尽管血液疾病易于通过体外方法靶向，但靶向组织更具挑战性。一种利用体内递送的CRISPR基疗法是NTLA-2001，由Intellia Therapeutics和Regeneron Pharmaceuticals开发，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白（hATTR）淀粉样变性患者。这种进行性和致命性疾病，由TTR蛋白的错误折叠和聚集引起，导致多发性神经病和心肌病等临床表现。NTLA-2001旨在靶向并敲除TTR基因，从而减少TTR蛋白并改善患者预后。鉴于该疾病是单基因疾病且TTR主要在肝脏中表达，hATTR淀粉样变性是RNA疗法的常见靶标，包括首个FDA批准的小干扰RNA疗法帕替拉尼。NTLA-2001由靶向TTR基因的sgRNA和编码SpCas9蛋白的mRNA组成，共同配制在具有脂质嗜性的LNP中。由于RNP复合物在进入细胞前未组装，因此sgRNA需要更广泛的化学修饰。基于早期发表的研究，Intellia展示了末端带有2'-OMe-PS且内部茎环带有2'-OMe修饰的sgRNA的体内活性。 转基因小鼠的临床前研究表明，单次给药后，NTLA-2001可敲低TTR表达。此外，在原代人类肝细胞中，即使在预期治疗暴露量的倍数下，在七个预测的顶级位点均未观察到脱靶编辑事件。使用替代sgRNA在食蟹猴中进行编辑，发现该基因通过NHEJ机制修复，在98.8%的序列中产生'A'的单核苷酸插入，导致移码突变。在一项涉及六名患有多发性神经病的hATTR淀粉样变性患者的有限I期临床试验中，单次静脉输注0.3 mg/kg剂量，在第28天使基线血清TTR蛋白水平平均降低87%。接受1 mg/kg更高剂量的队列，在第28天使基线血清TTR平均降低93%。在这些积极结果之后，I期临床试验扩展至72名患者，其中部分患者纳入心肌病组。NTLA-2001（现称为nexiguran ziclumeran或nex-z）已推进至针对多发性神经病和心肌病的关键临床试验。 用于遗传性血管性水肿的NTLA-2002 继NTLA-2001研究成功后，Intellia Therapeutics开发了NTLA-2002，用于治疗遗传性血管性水肿患者。这种疾病主要由SERPING1基因的多个突变引起，导致C1酯酶抑制剂（C1-INH）缺乏（1型）或功能障碍（2型）。C1-INH调节接触激活途径，包括血浆激肽释放酶对高分子量激肽原的切割和释放。缓激肽通过增加血管通透性，在血管性水肿发作中观察到的炎症和肿胀中发挥作用。在罕见的弗莱彻因子缺乏症患者中，血浆前激肽释放酶的减少除了活化部分凝血活酶时间延长外，无重大临床后果。因此，有人认为，敲除编码血浆激肽释放酶B1的KLKB1基因，应是通过降低总血浆激肽释放酶水平，治疗遗传性血管性水肿患者的有效方法。 鉴于血浆激肽释放酶主要在肝脏中表达，NTLA-2002采用与NTLA-2001相同的设计，将sgRNA向导区域的序列重新编程以靶向KLKB1基因，展示了该平台的模块性。在一项涉及十名1型或2型遗传性血管性水肿患者的I期临床试验中，单次给药NTLA-2002，导致总血浆激肽释放酶水平持续降低。与基线相比，接受25 mg、50 mg或75 mg剂量的患者，分别降低了67%、84%和95%。基于先前的研究，已确定总血浆激肽释放酶降低>60%与发作的几乎完全控制相关。该研究中的数据进一步支持了这一点——尽管允许患者继续使用长期预防药物，但所有服用这些药物的患者在NTLA-2002治疗后均停止使用。此外，允许患者在发作期间继续使用按需治疗药物；然而，每位患者的每月发作次数要么减少，要么完全停止，因此不再需要频繁使用按需治疗药物。与NTLA-2001一样，所有不良事件均为轻度至中度。基于这些积极数据，该研究推进至II期临床试验，测试两个最低剂量以及在NTLA-2002给药前停止预防治疗的要求。 用于杂合子家族性高胆固醇血症的VERVE-101和VERVE-102 LNP递送的肝脏疗法的其他例子是VERVE-101和VERVE-102，由Verve Therapeutics开发。这些疗法利用ABE8.8-m碱基编辑技术，以及带有2'-OMe和PS修饰的gRNA，设计用于治疗杂合子家族性高胆固醇血症（HeFH）。HeFH是一种常染色体共显性疾病，其特征是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平高，导致早发性动脉粥样硬化性心血管疾病。HeFH由负责胆固醇代谢的多个基因突变引起，包括PCSK9、LDLR和APOB，导致LDL-C水平升高。前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（PCSK9）在肝脏中产生并释放到血液中，与肝细胞表面的LDL受体（LDLRs）结合并将其靶向降解。PCSK9减少了肝脏表面的LDLR数量，从而限制了肝脏从血液中清除LDL-C的能力。值得注意的是，已证明PCSK9中的功能丧失突变可降低血液中的LDL-C水平。PCSK9基因具有功能丧失突变的个体，冠心病的发生率降低了88%。因此，降低PCSK9水平，可作为降低HeFH患者LDL-C的有效策略，从而减少冠心病事件。 VERVE-101和VERVE-102均利用相同的有效载荷；然而，VERVE-102使用N-乙酰半乳糖胺-LNP递送系统，以增强肝脏递送。这些系统靶向主要在肝细胞中表达的PCSK9基因。在PCSK9基因中引入A-to-G碱基编辑，可有效破坏PCSK9的产生，从而降低血液中的LDL-C。非人灵长类动物的临床前研究表明，PCSK9蛋白血清水平和LDL-C血液水平均显著降低。具体而言，单次给药0.75和1.5 mg/kg的VERVE-101，分别导致LDL-C降低45%和69%。在HeFH患者的临床试验中，单次输注0.45 mg/kg剂量的VERVE-101，使LDL-C胆固醇降低了39-48%。接受0.6 mg/kg更高剂量的患者，LDL-C水平降低了55%，并维持长达180天。然而，由于一名患者出现血清丙氨酸转氨酶水平严重升高，Verve Therapeutics暂停了VERVE-101临床试验的招募。幸运的是，不良事件在几天内完全解决。该公司已将重点转向VERVE-102试验。 结论 CRISPR技术已彻底改变分子生物学、生物医学研究和医学领域。它允许研究人员敲除基因、添加新基因和序列元件、开启或关闭转录，以及向生物体基因组添加表观遗传标记。最近，它还实现了RNA序列水平的编辑，有可能在基因治疗中获得类似的收益，同时降低风险。使用CRISPR进行人类基因编辑，已在临床上展示了治疗先前无法治愈的疾病的能力，包括TDT、SCD和hATTR淀粉样变性——通过有意改变患者细胞内的DNA。 gRNA的化学修饰为其作为治疗剂的成功做出了贡献。常用修饰包括PS键、2'F-RNA和2'-OMe——这些修饰在Cas9和Cas12a gRNAs的末端和选定内部位置具有良好耐受性。然而，这些化学修饰（甚至是在CRISPR-Cas研究中广泛使用的修饰），仅代表先前为核酸疗法探索的化学物质的一小部分。因此，仍有许多其他化学物质可能适用于CRISPR-Cas系统。这些包括核苷酸碱基修饰、防止核酸内切酶降解的内部修饰，以及理解和克服2'-羟基屏障的核糖修饰。尽管仍有进步空间，但CRISPR基疗法的未来前景极为光明——已取得临床成功，且许多令人兴奋的应用即将出现。