VERVE-101

mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗的显著临床成功，尤其是在新冠疫情期间的广泛应用以及随后荣获2023年诺贝尔奖，促使全球加大力度将其应用拓展至治疗性生物制剂领域。尽管mRNA-LNP疫苗展现出强大的预防效果，但对于其从初始全身暴露、组织特异性生物分布、细胞内递送到最终蛋白质表达动态的层级生物学过程，仍存在诸多认知空白。这些尚未解决的机制问题对下一代mRNA-LNP疗法的合理设计构成了重大制约，而这些疗法面临着对精准给药、疗效优化和安全性提升的更高要求。 吉林大学的张勇/顾景凯团队在Acta Pharmaceutica Sinica B杂志上发表名为"Deciphering the biological fate of mRNA-LNP-based biologics: A perspective from tissue to intracellular distribution"的长篇综述性文章，解析了mRNA-LNP的体内命运，重点关注给药后完整mRNA-LNP及其解离组分的血液/组织/细胞分布、动力学/暴露特征；探讨了影响表达蛋白分布的关键因素，并总结了相应的研究工具包及其优缺点。此外，本文还汇总了提高mRNA-LNP递送效率、组织趋向性和安全性的策略。作者期望通过本文能够更深入地了解mRNA-LNP的生物学过程和动态模式，从而加速开发具有可预测安全性和递送效率的下一代mRNA生物制剂。 目录： 1.引言 2. mRNA-LNPs的组成、结构和制备技术 3. mRNA-LNP的生物分布 3.1 脂质的生物分布 3.2 mRNA的生物分布 4. 影响表达蛋白分布的关键因素 4.1. LNP组成对表达蛋白分布的影响   4.1.1 胆固醇和磷脂   4.1.2 可电离脂质   4.1.3 脂质比例 4.2. LNP特性对表达蛋白分布的影响   4.2.1 尺寸   4.2.2 表面电荷   4.2.3 mRNA-LNP的形态和内部微观结构 4.3 管理路线 4.4. 剂量 5. mRNA-LNP的细胞摄取、内体逃逸和分布 5.1 细胞摄取机制 5.2 内体逃逸效率和动力学 6. mRNA-LNP的血浆药代动力学、代谢和排泄 6.1 血浆药代动力学 6.2 代谢 6.3 可电离/聚乙二醇化脂质的排泄 7. 研究工具包 7.1 基于放射性标记的技术 7.2 质谱分析 7.3 荧光成像 7.4 杂交技术 7.5 酶联免疫吸附试验 8. 提高mRNA-LNP的功效、靶向性和安全性 8.1 提高mRNA-LNP的功效   8.1.1 通过优化脂质设计和组成来提高LNP的递送效率   8.1.2 提高预防性疫苗的免疫原性   8.1.3 提高治疗应用的效果 8.2 增强mRNA-LNP的靶向性   8.2.1 增强mRNA-LNP的组织靶向性   8.2.2 增强mRNA-LNP的细胞靶向性 8.3 提高mRNA-LNP的安全性   8.3.1 克服抗PEG抗体的影响   8.3.2 降低可电离脂质的免疫原性 8.4. 下一代mRNA-LNP   8.4.1 下一代脂质纳米颗粒   8.4.2 下一代mRNA 8.5 促进mRNA-LNP疗法的临床应用 9. 结论与展望  1. 引言 在全球新冠肺炎疫情大流行期间，两种基于脂质纳米颗粒的mRNA（mRNA-LNP）疫苗--Comirnaty®（BNT162b2，BioNTech/Pfizer）和Spikevax®（mRNA-1273，Moderna）--以空前的速度获得了FDA的紧急使用授权，并为全球疫情防控做出了重大贡献。它们的成功主要源于两项革命性技术：1）核苷酸修饰的mRNA能够逃避人体固有免疫监视；2）基于可电离脂质纳米颗粒的胞质递送系统。除了在疫情应对方面的应用外，mRNA-LNP在抗原设计灵活性和可扩展生产方面也优于传统疫苗，这对于对抗新出现的病原体至关重要。迄今为止， 基于clinicaltrials.gov的数据，已有超过200种mRNA-LNP疫苗进入临床试验，但仅有少数获批用于治疗COVID-19。该平台的临床验证促进了其在三大领域的拓展：针对多种病原体的预防性疫苗、个性化癌症新抗原疗法和基因编辑（图1）。2024年5月，FDA批准了mRNA-1345（MRESVIA®），这是首个用于治疗60岁及以上成人呼吸道合胞病毒（RSV）引起的下呼吸道疾病的mRNA-LNP疫苗。同时，个体化新抗原疫苗mRNA-4157 (V940) 与帕博利珠单抗联合治疗在2b期黑色素瘤试验中，复发或死亡风险降低了49%，远处转移或死亡风险降低了62%，显著提高了生存获益。此外，在 1 期临床试验中，NTLA-2001（一种首个人体体内基因疗法，包含包裹向导 RNA (gRNA) 和优化Cas9 编码mRNA的mRNA-LNP）在低剂量组中使血清转甲状腺素水平降低了47%-56%，在高剂量组中降低了80%-96%，且未报告严重不良事件。在另一项I期临床试验中，VERVE-101（一种基于LNP的疗法，可同时递送腺嘌呤碱基编辑器的mRNA和gRNA）通过A到G的碱基编辑沉默了PCSK9基因，且具有剂量依赖性效应。在高剂量0.6mg/kg下，它使血液中低密度脂蛋白胆固醇降低了55%，且疗效可持续长达180 天。 图 1.基于mRNA-LNP的代表性生物制剂及其相关适应症。 尽管mRNA-LNP技术在满足未被满足的临床需求方面具有显著的治疗潜力，但对其体内命运的理解仍然存在关键的知识空白，尤其是在与其疗效和安全性密切相关的方面。这些局限性严重阻碍了下一代基于mRNA-LNP的治疗药物的开发，包括蛋白质替代疗法、基因编辑和体内CAR-T细胞免疫疗法，这些疗法对剂量、递送、蛋白质持续表达和安全性提出了更严格的标准。已有充分证据表明，mRNA-LNP疫苗即使在局部（例如，肌肉注射或皮下注射）以低剂量给药且递送效率低于1%的情况下，也能有效激活先天性和适应性免疫系统，从而诱导强大的保护性体液和细胞免疫反应。相比之下，基于mRNA-LNP的蛋白质替代疗法通常需要精确的组织/细胞特异性靶向和持续的高水平蛋白质表达，其表达量可能是疫苗蛋白的1000倍以上。增加现有mRNA-LNP制剂的剂量以提高靶蛋白表达显然是不切实际的，因为目前的mRNA-LNP疫苗在临床试验和实际应用中已显示出许多不良反应（例如疼痛、肿胀、发热、嗜睡、头痛等），且发生率高于传统疫苗。剂量增加很可能导致不良反应谱进一步恶化，发生率和严重程度均有所提高。此外，高效的组织/细胞特异性靶向递送面临着更大的挑战，因为它需要对mRNA-LNP的组分和理化性质进行策略性协调，以克服多方面的生理屏障。这些屏障包括代谢酶和单核吞噬细胞系统介导的全身清除、动态的细胞摄取-胞吐平衡以及内溶酶体运输/逃逸，同时还需要解决关键的递送问题，例如优化脱靶生物分布和控制胞质mRNA释放。 鉴于这些挑战以及目前mRNA-LNP疫苗较高的不良事件发生率，阐明完整纳米颗粒及其核心组分在复杂生物微环境中的时空生物分布特征和分子相互作用至关重要。这些见解对于指导mRNA-LNP平台的合理设计和系统级优化至关重要，有助于实现精准的组织特异性靶向、提高递送效率以及达到最佳的风险/获益平衡。本综述重点关注mRNA-LNP在体内的代谢现状，尤其关注其血液/组织/细胞分布和动力学/暴露特征，以及给药后其关键组分的分布和动力学/暴露特征。此外，本综述还探讨了影响其分布的关键因素，对当前的分析方法进行了批判性评估，并重点介绍了提高递送效率、靶向性和安全性的先进策略。通过阐明生物学过程和系统动力学，本综述旨在推动下一代mRNA-LNP生物制剂的开发，使其具有更优的安全性和更佳的递送效果。 表1. 代表性mRNA-LNP 基因生物制剂. 2. mRNA-LNPs的组成、结构和制备技术 mRNA-LNP通常由mRNA和四种脂质成分组成：可电离脂质（ILs）、聚乙二醇（PEG）脂质、DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱）和胆固醇。每种成分都发挥着不同的功能作用，对纳米颗粒的完整性和mRNA的递送至关重要，如图2所示。在结构上，mRNA-LNP是球形囊泡，最佳粒径范围为50-200 nm。这些mRNA-LNP的精确内部微观结构受多种因素影响，包括制剂成分和生产工艺 。目前普遍认为，市售的两种mRNA-LNP疫苗主要具有纳米结构的核壳结构（图2 ）。 图 2. mRNA-LNP 的化学结构及其组分对LNP特性和体内命运的影响。 mRNA-LNP通常是通过将乙醇脂质溶液与溶解在酸性水性缓冲液中的mRNA混合而形成的。薄膜水化和乙醇注入是LNP的主要传统批量生产方法。然而，这些方法通常无法有效控制纳米粒子的自组装过程，导致质量不稳定和批次间差异显著。微流控混合是目前mRNA-LNP制备的主要方法，可确保优异的重现性和稳定的过程控制。诸如交错式人字形微混合器、分叉混合器、挡板混合器和T型混合器等先进的微流控系统已有大量文献记载其应用和优化策略。 微流控平台虽然显著推动了LNP的开发，但这些系统通常基于芯片，通量相对较低。为了克服这一限制，一些研究采用了并行微流控技术来扩大生产规模 。然而，必须仔细考虑器件的溶剂兼容性（尤其是与有机试剂的兼容性）以及潜在的堵塞或污染问题。受限冲击射流反应器是制备mRNA-LNP的另一种方法，它可以通过冲击射流实现mRNA和脂质组分的高效快速混合。由于其通量更高，因此适用于大规模生产。 后包封是另一种正在开发的制备技术。Tanaka等人分别制备了空载LNP，然后在优化的pH条件下将mRNA与这些LNP混合，完成了mRNA-LNP的制备。此外，该策略特别适用于小规模mRNA-LNP的制备，为快速筛选多种mRNA或LNP提供了一种实用方法 。SMART（喷雾多吸收液滴重定位技术）平台集成了多通道导向的内部控制打印头，构成了一种创新的制造技术，有望实现对LNP尺寸的精确控制。 吸入制剂，包括液体和粉末，常用于黏膜给药。与液体制剂相比，粉末制剂具有更高的稳定性。Sarode等人报道了采用喷雾干燥法制备mRNA-LNP粉末制剂。该方法需要添加赋形剂，并涉及加热干燥。为了避免制备过程中加热对mRNA功能的影响，另一项研究开发了一种新型的喷雾冷冻干燥技术，并添加了pH调节剂。所得mRNA-LNP在储存62天后仍保持其功能，这有利于其广泛应用。 3. mRNA-LNP的生物分布 mRNA-LNP的生物分布受多种因素影响，包括LNP的组成、粒径、表面特性（例如表面电荷和化学修饰）、剂量和给药途径，这些因素共同影响其疗效和安全性。尽管同位素和荧光标记技术已被广泛用于追踪mRNA-LNP的生物分布，但纳米颗粒的解离和组织特异性积累之间的动态相互作用仍未得到充分阐明，导致我们对该领域的理解存在关键的知识空白。 从分析角度来看，理想情况下，每个LNP组分都需要单独测试。只有整合每个组分的组织和细胞共定位数据，才能真正确定特定组分是否能代表整个LNP。然而，大多数研究仅关注LNP中的单个组分或负载mRNA编码的靶蛋白。因此，以下讨论将着重探讨有证据支持的LNP组分分布，而不是像许多研究经常声称的那样，试图描述整个mRNA-LNP的生物分布。 3.1 脂质的生物分布 比较研究揭示了组织特异性分布模式。一项早期针对CD-1小鼠中含有不同可电离脂质（MC3和新型脂质）的mRNA-LNP的直接分析表明，肌内注射的可电离脂质主要定位于注射部位，随后在肝脏和脾脏中蓄积。外源性脂质的生物分布数据突显了消除差异。在Wistar Han大鼠中静脉注射mRNA-LNP（1 mg/kg）后，可电离脂质ALC0315约60%的给药剂量分布于肝脏，3小时后肝组织峰浓度达到294 μg/g。ALC0315的肝脏消除缓慢，2周后仍保留约25%的峰浓度，表明其从大鼠肝脏完全清除需要约6周时间。相反，PEG-脂质ALC0159的肝脏分布约为20%，在30分钟内达到峰值15.2 μg/g肝组织，并在2周后迅速下降至约0.04%的残留水平。与ALC0315相比，ALC0159的肝脏蓄积减少，消除动力学加快。这种差异可能主要源于其与LNP制剂中可电离脂质的摩尔比较低，以及PEG-脂质的快速解离。至关重要的是，可电离脂质的生物分布可能更接近LNP的生物分布，因为可电离脂质主要定位于LNP核心内。然而，将脂质组分的分布推断为LNP的生物分布需要谨慎解读，因为由于代谢消除、结构解体或摄取后的胞吐作用，检测到的信号可能无法反映完整的脂质/LNP。 氘代胆固醇以其安全性、高灵敏度和强特异性而著称。利用LC-MS/MS技术，可以精确量化其在各种组织中的浓度变化。然而，将氘代胆固醇作为LNP标记物的应用依赖于一个关键假设，即LNP在体内保持结构完整，不会发生解体或胆固醇脂质交换。这一假设可以通过同时标记其他LNP成分（例如，可电离脂质或聚乙二醇化脂质）并分析其分布模式的差异来验证。由于证据不足，本综述仅关注mRNA-LNP给药后氘代胆固醇的体内分布。 Di等人记录到，肌内注射mRNA-LNP后，小鼠血液中可在30分钟内检测到氘代胆固醇信号，并在2小时达到峰值，之后逐渐下降，但即使在注射后24小时仍能检测到。血液中检测到的氘代胆固醇约占总注射剂量的15%。这种分布模式可能表明完整的mRNA-LNP快速进入体循环，或者LNP在进入血液循环前解体释放了氘代胆固醇。此外，注射部位的肌肉组织中氘代胆固醇含量最高，约占给药剂量的60%–80%，其次是肝脏（10%–20%）和脾脏（约1%–2%）。这些发现与LNP包裹的荧光染料DiR的体内分布特征基本一致。观察到的相似性可能是由于它们具有强疏水性的共同特征和/或这些化合物在 LNP 中的共同封装造成的。 3.2 mRNA的生物分布 mRNA的分布可通过RNA探针原位杂交（ISH）进行定性观察。Di等人利用靶向mRNA序列的Cy5标记探针，在局部注射部位的肌肉、肝脏和引流淋巴结组织中检测到了mRNA。此外，通过体外转录由核苷酸组分合成的荧光标记mRNA可直接用于体内分布研究。Chen等人使用Cy5标记的mRNA研究了肌内注射SM102基mRNA-LNP的组织分布。有趣的是，荧光信号主要扩散到肝脏而非肌肉（给药后6小时），表明肌内注射后，mRNA-LNP可在短时间内从局部注射部位分布到体循环，进而到达远端器官。然而，目前尚不清楚这些颗粒是直接从注射部位迁移到体循环，还是先迁移到淋巴组织再进入体循环。其他远端组织，例如脾脏，也显示出mRNA-LNP分布，其分布水平与肌肉相似。鉴于基于SM102的LNP已成功应用于肌注新冠疫苗，其在注射部位的集中分布可能并非触发免疫反应的关键。了解细胞水平（尤其是免疫细胞内）的分布情况，对于阐明mRNA分布如何影响疫苗效力至关重要。 可以通过定量分析来研究LNP递送的mRNA的分布情况。Bahl等人应用支链DNA（bDNA）研究了小鼠肌肉注射LNP后mRNA的分布情况。他们发现mRNA在肌肉组织中含量最高，其次是近端淋巴结。此外，远端淋巴结、肝脏和脾脏也显示出显著的分布。这一发现意义重大，因为它揭示了mRNA-LNP通过淋巴系统从注射部位转移到体循环的体内过程。虽然mRNA的生物分布对于免疫或治疗比脂质的生物分布更有意义，但值得注意的是，mRNA在特定组织或细胞内的分布并不能保证功能性蛋白质的翻译。事实上，已有研究观察到，mRNA可以被某些细胞类型内化，但随后并不表达蛋白质。 4. 影响表达蛋白分布的关键因素 mRNA编码蛋白的丰度可通过ELISA进行定量，而其空间分布则可通过基于荧光素酶的生物发光成像直接绘制。值得注意的是，由于LNP解体、细胞摄取、细胞内降解、胞吐作用以及组织特异性翻译效率等动态过程的影响，蛋白表达模式与mRNA-LNP的生物分布并不完全一致。 对于静脉注射给药，基于MC3的mRNA-LNP在小鼠肝脏中的蛋白（EGFP）表达高于脾脏。Li等人证实，通过基于MC3的mRNA-LNP进行静脉注射给药后，肝脏中的荧光素酶表达高于脾脏。肝脏/脾脏的分布比约为5-20，具体数值取决于氮磷比。值得注意的是，静脉注射的肝脏/脾脏分布比（通过翻译蛋白评估）远高于肌内注射的分布比（约为1，通过脂质含量定量）。这种差异源于给药途径、注射或进入循环的剂量以及定量方法等因素的综合影响。 肌内注射基于MC3的mRNA-LNP后，通过荧光素酶表达分析，观察到了不同的生物分布模式。在4.5小时时间点，肌肉被确定为主要分布部位，其表达水平高于肝脏中的表达水平 。这种组织分布模式与质谱分析（1至24小时）评估的脂质含量结果一致。值得注意的是，肝脏中也观察到了显著的积累，这与静脉输注后基于MC3的LNP已知的肝脏趋向性相符。了解肌肉、肝脏和脾脏中的组织分布情况对于指导新型脂质的合理设计，以用于各种临床应用至关重要。为了将mRNA-LNP疗法的应用范围扩展到传染病以外的领域，开发能够增强肝外递送的制剂仍然至关重要。 此外，Bahl等人发现，在肌内注射后6小时成像时，不同剂量（2、0.4和0.08 μg）下，mRNA表达蛋白的生物发光分布顺序为肌肉、肝脏、脾脏。进一步观察发现，皮肤和淋巴结中生物发光丰富，这可能与肌肉注射部位邻近有关。值得注意的是，上述mRNA表达蛋白的分布与mRNA本身的定量结果不同，后者的分布顺序为肌肉、近端淋巴结、脾脏、肝脏。这种差异可能源于多种因素，例如组织大小、不同的生物过程、细胞种类、细胞的翻译能力、不同的检测方法、方法的分辨率等。值得注意的是，Carrasco等人的研究也支持了这一观点。肌注Fluc-mRNA MC3-LNP后，在4小时和24小时时间点，肝脏中蛋白质表达占主导地位（与肌肉相比） 。这种差异可能源于LNP的组成、理化性质、注射参数（体积/深度）或分布动力学。 这些研究结果凸显了mRNA-LNP在体内复杂的命运，包括淋巴转运、体循环和广泛的组织分布。此外，它们还强调了多种因素对蛋白质分布模式的影响，包括给药途径、LNP制剂、组织趋向性和方法学差异（图3）。以下将讨论关键的影响因素。 图3. mRNA-LNP在体内的过程及其生物分布的影响因素。给药后，mRNA-LNP可转运至淋巴结，激活免疫细胞；也可进入血液循环，在其表面形成生物分子冠，同时PEG-脂质脱落，导致形态变化。循环中的mRNA-LNP将广泛分布于各种组织和器官。影响上述过程（尤其是生物分布）的因素有很多，主要包括：LNP组成（可电离脂质、辅助脂质、组分比例、额外的选择性器官靶向（SORT）脂质等）、LNP特性（大小、表面特性、形态等）、给药途径（炎症微环境、注射深度）、剂量、成像方法以及动物种类等。 4.1 LNP组成对表达蛋白分布的影响 4.1.1 胆固醇和磷脂 mRNA-LNP中的胆固醇含量对蛋白质表达具有关键的调控作用。例如，在PEG-脂质和可电离脂质的摩尔百分比保持不变的情况下，将胆固醇的摩尔百分比从10%提高到40%，同时降低辅助脂质DOPC的比例，可显著提高小鼠肝脏中基于SS-OP或MC3的mRNA-LNP的表达水平。值得注意的是，这种配方调整并未显著改变局部注射部位肌肉中的荧光素酶表达。有趣的是，皮下注射时，在注射部位的局部组织中也观察到了与胆固醇摩尔百分比相关的蛋白质表达增强 。在体外HepG2细胞中也观察到了类似的现象。尽管研究人员排除了mRNA-LNP的粒径和zeta电位的影响，但观察到的现象很可能归因于改变胆固醇/DOPC摩尔比所引起的LNP表面脂质分布特征的改变和内部结构的重组。至关重要的是，表面脂质的重新分布可能会改变蛋白质冠的组成，从而影响循环稳定性、组织/细胞趋向性及其相互作用。 4.1.2 可电离脂质 可电离脂质决定组织趋向性。Long等人发现，肌内注射后，基于MC3的LNP介导的生物发光信号主要定位于肝脏；而基于 YK009 的 LNP 则主要分布于注射部位和脾脏。据报道，基于SM102的LNP在组织中广泛分布（肌肉>肝脏>脾脏，通过肌注后6小时的Fluc-mRNA表达评估）。鉴于其在各种组织中的广泛分布可能导致非靶组织出现副作用，研究人员设计了一种新型可电离脂质异构体iso-A11B5C1，使其主要在注射部位消散。事实上，在小鼠肌注后，大部分Fluc-mRNA表达在肌肉中检测到，而在肝脏、脾脏、淋巴结和抗原呈递细胞中的表达较少 。鉴于这种有趣的肌肉趋向性，研究人员进一步研究了其免疫诱导作用。有趣的是，尽管淋巴结和免疫细胞中的mRNA表达有限，但基于iso-A11B5C1的mRNA-LNP在黑色素瘤模型中作为癌症疫苗诱导了强烈的细胞反应和显著的治疗效果 。这项研究表明，肌肉中的特定分布足以诱导免疫反应。为设计有效疫苗并最大限度减少脱靶效应和副作用提供了见解。 Lam等人研究了多种已上市或用于临床试验的可电离LNP，例如MC3、Lipid 10、SM102和ALC0315（图4），所递送的mRNA表达蛋白的分布情况。肌内注射6小时后，在注射部位检测到了荧光素酶蛋白的表达。Lipid 10、SM102和ALC0315基LNP在肌肉中的总生物发光信号强度相当，但约为MC3基LNP的两倍。此外，该研究发现，静脉注射后，负载EGFP mRNA的SM102基LNP在肝脏中未显示出明显的表达，而ALC0315基LNP在脾脏中的表达显著高于SM102基LNP。 图4. 可电离脂质用于 Comirnaty® (ALC0315) 和 Spikevax® (SM102) 以及 Onpattro (MC3)。 鉴于可电离脂质在mRNA-LNP递送中的关键作用，众多研究合成了一系列具有不同长度、头部基团数量和尾链数量的可电离脂质，以探究其对组织分布的影响。例如，Hashiba等人研究了可电离脂质的支链长度如何影响小鼠静脉注射后表达蛋白的生物分布。结果表明，随着脂质尾链长度的缩短，荧光素酶的表达模式逐渐从肝脏转移到脾脏。 4.1.3 脂质比例 在LNP制剂中，各脂质的摩尔比是一个决定性参数，它直接影响核酸递送效率、生物分布和蛋白质表达模式。一项研究表明，无论采用肌内注射还是皮下注射，肝脏中的荧光素酶表达水平均会降低，同时胆固醇水平也会降低。另一项研究探讨了不同DSPC摩尔百分比下表达蛋白的生物分布特征。结果表明，静脉注射后，与参考制剂（10% DSPC）相比，DSPC水平升高（30%）的LNP所表达的荧光素酶在炎症结肠中表现出明显的生物分布偏好，同时在肝脏和脾脏中的积累减少。此外，LNP的最佳脂质比例因给药途径的不同而有所差异。在小鼠气管内给药后6小时，将DMG-PEG的摩尔浓度从1.5%降低至0.5%可显著增强肺部荧光素酶的表达。 4.2 LNP特性对表达蛋白分布的影响 4.2.1 尺寸 粒径是影响mRNA递送效率和生物分布的关键参数。Cui等人比较了组成相同但通过工艺参数调整获得不同流体动力学直径的MC3基LNP。与较小的LNP相比，较大的LNP表现出更强的肝脏mRNA表达（静脉注射后24小时的生物发光）和更广泛的白色脂肪组织分布。机制研究表明，较大的LNP通过容纳更大的载药量来增强mRNA递送。 4.2.2 表面电荷 传统的mRNA-LNP在生理pH条件下被设计成电中性，这一关键设计特征增强了其系统稳定性和安全性。然而，通过引入第五种带电脂质，可以调节其表面电荷。改变后的表面电荷能够显著影响表达蛋白的生物分布。Cheng等人将第五种脂质，即1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP，带正电荷）或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯（18PA，带负电荷），加入LNP制剂中，以调控LNP的整体电荷特性。在MC3标准制剂中添加DOTAP后，有效载荷荧光素酶mRNA在肝脏中的表达下降，但在肺部（静脉注射）中的表达增加。值得注意的是，带正电荷的脂质需要谨慎使用，以减轻过度使用可能带来的不良反应。类似地，当将带负电荷的18PA加入LNP制剂中时，可以使发光信号主要分布在脾脏中。在另一项研究中，将阳离子脂质 IM21.7c 添加到基于 DODMA 的 LNP 制剂中，得到的纳米颗粒在静脉注射后，通过荧光素酶表达评估，表现出优先分布到肺部。 4.2.3 mRNA-LNP的形态和内部微观结构 LNP的形态和内部微观结构是决定其包封mRNA完整性和递送效率的关键因素，可通过低温透射电镜、散射技术或荧光显微镜进行表征 。脂质组成的变化，特别是胆固醇的含量和分子结构的变化，显著影响LNP的结构。Eygeris等人确定了胆固醇衍生物在调控LNP结构中的关键作用。由传统胆固醇组成的LNP主要形成单层结构，而β-谷甾醇则诱导多形性并增加多层膜的比例。值得注意的是，基于β-谷甾醇的LNP在HeLa细胞中表现出比基于胆固醇的LNP更高的转染效率。 LNP中双层脂质的比例直接影响其内部结构和生物分布。Cullis及其同事研究了高比例双层脂质（卵磷脂和胆固醇）的mRNA-LNP体系的特性。当双层脂质与可电离脂质的摩尔比达到4时，该体系呈现出脂质体形态，其特征在于固体核心悬浮于脂质双层包裹的水性内部。静脉注射后，这些脂质体LNP（In标记）显示出延长的循环半衰期。体内成像系统（IVIS）显示，该制剂优先分布于淋巴结和胰腺，这由nanoLuc发光信号指示，表明其具有增强的肝外转染能力。需要增加样本量或使用其他动物模型进行进一步研究以证实这些发现。 LNP通常以其表面性质表征，例如平均粒径、多分散指数和表面zeta电位。相比之下，系统研究其内部结构与蛋白质表达/生物分布之间关系的研究较少，部分原因是光谱结果解读的挑战。Wu等人制备了三种具有不同内部结构的LNP：乳液状LNP、富含膜的LNP和经典的“泡状”结构LNP，并比较了它们的生物分布和免疫效应。结果表明，与其他LNP相比，乳液状LNP编码的荧光素酶信号在肌内注射后主要保留在注射部位，从而引发更快的免疫反应和更持久的免疫反应。值得注意的是，这三种LNP结构是通过调节脂质比例获得的，并且它们的粒径和zeta电位也存在差异。因此，需要进一步探索以建立LNP内部结构与生物分布/功能效应之间的直接关联。 4.3 管理路线 传染病疫苗通常采用局部给药方式。在广泛应用的给药途径中，肌内注射和皮下注射因其便捷性而备受青睐，而皮内注射则具有节省剂量的潜力。不同注射部位的微环境，例如空间大小、驻留细胞的类型和数量以及局部蛋白质表达能力，都会影响蛋白质表达和免疫效力。 皮内注射的注射部位位于皮肤真皮层，该层富含抗原呈递细胞（APC），能够内化并处理mRNA和mRNA编码的抗原。真皮层中的APC，例如朗格汉斯细胞（LC），能够摄取并呈递抗原，随后迁移至引流淋巴结并激活淋巴T细胞。在此过程中，mRNA-LNP和mRNA编码的抗原可通过LC运输至引流淋巴结。此外，mRNA-LNP和mRNA编码的抗原也可能通过血管或淋巴管被动运输至淋巴结，从而更容易与免疫细胞接触，最终激活T细胞和B细胞。与真皮层相比，皮下组织免疫细胞较少，脂肪组织较多，因此注射时疼痛感较轻，但免疫反应激活通常也较弱。肌肉是皮下组织下方的一种组织，含有相对丰富的血管网络，能够迅速将抗原呈递细胞（APC）募集到注射部位。研究发现，在肌肉注射部位浸润的免疫细胞中存在mRNA和mRNA翻译的蛋白质。此外，APC和mRNA-LNP迁移至引流淋巴结以激活免疫反应，巨噬细胞表现出高水平的蛋白质表达。 肌内注射 (IM)、皮下注射 (SC) 和皮内注射 (ID) 后，表达的蛋白质主要分布于局部注射部位。Qiu 等人应用生物发光成像 (BLI) 评估了给药途径对小鼠体内表达蛋白质分布的影响。结果表明，静脉注射 (IV) 导致蛋白质广泛分布于肝脏、脾脏、肺和淋巴结等器官；相比之下，皮下注射导致荧光素酶表达局限于淋巴结。此外，注射深度也会影响表达蛋白质的分布。浅表肌内注射主要导致肌肉表达，而深部肌内注射则导致大部分蛋白质分布于肝脏。 4.4 剂量 剂量会影响局部或远端分布。Bahl等人利用生物发光成像（BLI）研究了荧光素酶-mRNA-脂质纳米颗粒（luciferase-mRNA-LNPs）的剂量依赖性生物分布。研究结果表明，低剂量mRNA-LNPs经肌内注射（ IM）和皮内注射（ID）后主要分布于肌肉和皮肤等局部组织。相反，高剂量mRNA-LNPs则主要分布于脾脏和肝脏等远端组织。这种有趣的扩散现象很可能与注射部位的有限容量以及高浓度下mRNA-LNPs向周围组织和远端组织的快速扩散有关。同时，高浓度颗粒会导致注射部位的细胞摄取达到饱和，从而促进远端扩散。 5. mRNA-LNP 的细胞摄取、内体逃逸和分布 尽管通过各种途径给药的mRNA-LNP可系统性地分布到各种组织，但摄取这些颗粒的具体细胞类型--这是决定蛋白质表达和治疗效果（例如免疫激活）的关键因素--至今仍未明确。Hassett等人研究了基于SM102的mRNA-LNP及其表达的蛋白质在肌肉和淋巴结中的组织和细胞水平分布。在非人灵长类动物（NHP）的肌肉注射部位，分析显示mRNA及其编码的EGFP蛋白分布于巨噬细胞、成纤维细胞和肌间脂肪细胞中。有趣的是，在肌纤维中未检测到mRNA或蛋白质表达。在小鼠的淋巴结中，大部分mRNA被清除，残留的mRNA定位于B细胞滤泡和滤泡间区域。然而，编码的EGFP蛋白主要定位于位于被膜下和髓窦的巨噬细胞中。此外，EGFP在左侧腘窝淋巴结中的表达极低（5%），在对侧腘窝淋巴结和双侧腹股沟淋巴结中的表达水平几乎可以忽略不计；这种差异可能与组织采集不一致以及距注射部位的距离有关。值得注意的是，即使在髂淋巴结内，蛋白质表达在整个组织中也存在差异。以上结果表明，LNP在靶组织内的分布不均可能导致细胞摄取不均匀。这反过来又会导致蛋白质翻译不一致，从而产生不同的生物学效应。因此，研究mRNA-LNP的细胞分布和细胞内命运至关重要。 5.1 细胞摄取机制 胞内递送后，mRNA最终进入细胞质，并在那里翻译成靶蛋白。据报道，网格蛋白介导的内吞作用（CME）是LNP进入细胞的主要途径。网格蛋白通过三条重链和三条轻链形成三聚体支架。Gilleron等人发现，重链下调会使LNP的摄取减少约50%，证实CME是主要的进入途径。蛋白冠——特别是载脂蛋白E（ApoE）的吸附——通过与低密度脂蛋白受体（LDLr）结合，介导网格蛋白和穴蛋白介导的内吞作用，从而对CME起着至关重要的作用 。 Moderna 发现，在 ApoE 敲除小鼠和 LDLr 敲除小鼠中，mRNA-LNP 的表达几乎完全丧失，证实了蛋白质冠对 mRNA-LNP 细胞摄取的重要性。 巨胞饮作用是一种非特异性的细胞摄取方式，细胞通过质膜皱褶吸收细胞外液和溶质。LNP也可以通过这种方式进入细胞。减少相关通路调节因子或添加抑制剂可使LNP的细胞摄取减少60%以上。该研究推断，巨胞饮作用在细胞膜内吞作用（CME）后被诱导，并且就数量而言，似乎是LNP的主要递送机制。有趣的是，LNP本身似乎也能诱导细胞巨胞饮作用。 5.2 内体逃逸效率和动力学 mRNA-LNP通过内吞途径进入细胞后，会被包裹在膜衬里的囊泡内，并与早期内体融合。随着内体的成熟，mRNA-LNP可能面临三种主要命运：逃逸到胞质溶胶、经晚期内体转运后在溶酶体中降解，或通过循环内体途径胞吐回到细胞外空间（图5）。至关重要的是，功能性翻译需要mRNA定位到细胞质才能与核糖体结合。因此，内体逃逸效率是mRNA-LNP递送效率的关键决定因素。一项研究表明，只有不到2%的siRNA能够发生内体逃逸。Sabines等人利用荧光原位杂交技术定量分析了胞质 mRNA 的递送，测得基于 MC3 的LNP的逃逸效率为 2.5%。此外，该团队还研究了一种新型脂质（脂质 5，系统命名为十七烷-9-基 8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯），该脂质显著提高了逃逸效率至 15% 62。这种提升与体内蛋白质表达的显著增加相关。一个关键的机制见解是，融合性的增强驱动了效率的提高。 图5. mRNA -LNP被细胞摄取后，内体酸化触发四种不同的转运途径（蓝色箭头）：③通过内体运输循环至细胞膜，释放至细胞外；④通过多泡体加工包装至外泌体；⑤被溶酶体酶降解；或②内体逃逸（蛋白质表达的关键步骤）。逃逸的mRNA被核糖体翻译成抗原蛋白，激活两条免疫通路：1）内源性呈递（粉色箭头）：蛋白酶体加工生成肽段，这些肽段被加载到主要组织相容性复合体I类（MHC I类）分子上，激活CD8+细胞毒性T细胞；2）外源性呈递（橙色箭头）：分泌的蛋白质被抗原呈递细胞（APC）内化，加工成肽段，并加载到MHC II类分子上，激活CD4+  T细胞。这些细胞通过诱导B细胞成熟为浆细胞来介导下游免疫反应。 LNP内体逃逸的主要部位仍存在争议，现有证据支持不同的细胞区室，例如早期内体、循环小管或早期-晚期混合内吞区室。Patel等人观察到晚期内体/溶酶体的形成对于外源mRNA的有效递送至关重要。关于动力学方面，Wittrup等人发现siRNA的内体释放发生在内吞作用后约5-15分钟内。此外，内化的mRNA-LNP还可以产生特化的细胞外囊泡（EVs）。Maugeri等人发现，在内吞作用后约5-15分钟内，内体释放的mRNA-LNP可以释放出特化的细胞外囊泡。研究95发现，hEPO-mRNA-LNP中一部分hEPO mRNA和可电离脂质--具体而言，是那些既不解离/逃逸到胞质溶胶中也不在内体中降解的成分--可以被包装到内体来源的细胞外囊泡（endo-EVs）中并分泌到细胞外。与外源性mRNA-LNP相比，endo-EVs中mRNA与可电离脂质的摩尔比为1:1。有趣的是，静脉注射endo-EVs后，血浆中可检测到hEPO，这表明endo-EVs具有递送功能性mRNA并在体内介导蛋白质表达的能力。 6. mRNA-LNP的血浆药代动力学、代谢和排泄 预防性mRNA疫苗通常通过肌内注射给药，其作用机制是通过编码抗原蛋白，利用免疫系统固有的扩增途径来诱导强烈的免疫反应。然而，最终的疗效及其持续时间与抗原表达的水平或持久性并非直接成正比。其他mRNA应用--例如癌症疫苗、基因编辑疗法和自身免疫性疾病治疗--可以采用更广泛的给药途径，例如瘤内注射、静脉注射和吸入给药。与预防性mRNA疫苗相比，静脉注射mRNA疗法的血浆药代动力学(PK)特征对于预测有效剂量和给药方案至关重要。此外，与已有的辅助脂质（例如胆固醇和DSPC）不同，新型LNP赋形剂（例如可电离脂质和PEG脂质）的生物降解性与组织清除率、注射部位炎症和安全性密切相关。对这些赋形剂进行全面的药代动力学表征对于评估其生物相容性和不良反应风险至关重要。由于生物分布已在第3节（“mRNA-LNP的生物分布”）中单独讨论，本节将重点关注血浆药代动力学、代谢和排泄。 6.1 血浆药代动力学 mRNA-1944由编码CHKV-24 IgG重链和轻链的两条mRNA组成，通过LNP包裹的静脉输注给药，以在体内表达功能性中和抗体。其mRNA成分表现出独特的药代动力学（PK）特征：初始阶段急剧下降，随后进入延长的终末期。mRNA-3927、mRNA-3705和mRNA-3210的mRNA成分也观察到类似的血浆PK特征。这种趋势可能因物种和给药水平而异。值得注意的是，mRNA-1944中mRNA的半衰期（约80小时）显著长于其可电离脂质成分的半衰期（约7小时）。这种现象可能归因于可电离脂质的快速代谢和/或检测到的mRNA主要被包裹在其他载体（例如外泌体）中。 在Pfizer/BioNTech COVID-19疫苗的临床前药代动力学研究中，Wistar Han大鼠经静脉注射了编码荧光素酶的mRNA-LNP（1 mg/kg），ALC0315和ALC0159的剂量分别相当于15.3 mg/kg和1.96 mg/kg。两者均表现出明显的双相消除动力学特征。初始快速清除相的半衰期分别为1.62 h（ALC0315）和1.72 h（ALC0159），随后进入较长的末端消除相，半衰期分别为139 h和72.7 h。这与Patisiran中DLin-MC3-DMA（可电离脂质）的血浆药代动力学特征相符。此外，DLin-MC3-DMA的末端半衰期也比PEG2000-C-DMG（PEG-脂质）更长。该研究假设，初始阶段的快速清除可能源于给药后PEG-脂质的迅速脱落，这促进了肝细胞通过ApoE依赖性LDL受体途径对LNP的摄取。然而，可电离脂质的终末半衰期延长可能源于核酸-脂质复合物随后通过胞吐作用重新进入体循环。 6.2 代谢 可电离/聚乙二醇化脂质可通过代谢消除而表现出生物降解性。辉瑞/BioNTech公司利用体外（肝微粒体、肝细胞、S9组分）和体内（大鼠药代动力学研究样本）模型，评估了不同物种（小鼠、大鼠、猴、人）的代谢情况。ALC0315经历酯的连续水解：单酯→双脱酯代谢物→葡萄糖醛酸苷结合物（仅存在于大鼠尿液中）。水解还会产生2-己基癸酸（图6）。此外，可电离脂质还可能发生β-氧化。一项研究揭示了大鼠单次静脉注射mRNA-LNP后，[C14]标记的脂质5的体内代谢情况。给药后1小时，血浆中含有完整的脂质5及其二酸酯水解代谢物。随着时间的推移，脂质5从血浆中被清除，唯一检测到的[C14]标记的脂质5代谢物是其两个链连接基团的碳链长度均减少了四个碳原子的二酸。完整的[ C14]脂质5在尿液和粪便中几乎检测不到，其中主要成分是二酸代谢物。ALC0159的代谢涉及酰胺键水解，生成N , N-二十四烷基胺和PEG 104。 图 6. [C14]脂质 5、ALC0315 和 ALC0159的代谢途径。已鉴定的代谢物可能来源于体外培养（红色）和/或体内研究（绿色）。图中使用的物种缩写如下：H，人；R，大鼠；Mo，小鼠；Mk，猴 。 6.3 可电离/聚乙二醇化脂质的排泄 向大鼠静脉注射编码荧光素酶的mRNA-LNP（1 mg/kg）后，尿液中未检测到ALC0315和ALC0159，而它们的粪便排泄特征则截然不同：约1%的ALC0315和50%的ALC0159以其原始分子形式通过粪便排出。鉴于在尿液和粪便中均极少检测到未修饰的ALC0315，代谢转化似乎是该化合物的主要排泄途径。然而，其代谢物的排泄模式仍未进行定量分析。 7. 研究工具包 研究LNP的生物分布和药代动力学对于评估其靶向效率、治疗效果和安全性至关重要。根据分析物或实验目标，可采用多种分析方法，包括放射性标记、荧光/生物发光成像、基于质谱的分析以及杂交技术。例如，杂交探针因其极高的灵敏度而成为mRNA定量分析的最佳选择，而荧光或放射性标记技术则更适用于动态体内追踪。本节将讨论这些方法在研究mRNA-LNP体内命运方面的优势和不足。 7.1 基于放射性标记的技术 基于放射性标记的技术能够高灵敏度地检测生物组织中的放射性核素，从而提供空间分辨的分布图。生物分布研究的关键技术包括定量全身放射自显影（QWBA）、正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）。其中，QWBA 已常规应用于核酸疗法的临床前生物分布评估。临床前QWBA研究通常使用白化大鼠和有色大鼠。白化大鼠的数据与毒性特征相关，而有色大鼠的数据则可预测由于黑色素结合诱导的放射性标记积累而导致的人体辐射暴露。QWBA 能够最大限度地保留天然组织结构，并将破坏降至最低，从而实现精确的原位生物分布分析，同时降低交叉污染的风险。然而，它也存在一些局限性。首先，该技术通常需要将样本处理成组织切片进行监测，这不利于动态评估。相比之下，PET-CT 在动态实时监测方面表现出色，能够捕捉示踪剂动力学，这对于表征颗粒转运动力学至关重要。例如，Lindsay 等人使用放射性核素-近红外双探针标记 mRNA。他们通过正电子发射断层扫描-计算机断层扫描和近红外成像技术监测了 mRNA 疫苗从肌肉到淋巴结的动态引流信号。其次，QWBA 无法区分药物（载体或材料）及其代谢物。多项研究发现，使用 QWBA 观察到的广泛生物分布通常是由降解产物或代谢物造成的，尤其是在使用稳定性较低的同位素标记（例如H3、I125）时。一项研究表明，静脉注射后2小时，3H标记的siRNA损失了9%的标记，48小时后损失了26%的标记这凸显了评估放射性标记稳定性以及在研究过程中考虑分析物代谢影响的重要性。此外，QWBA组织切片通常需要脱水，这可能导致挥发性代谢物的损失。质谱成像技术为解决代谢物损失和分布畸变问题提供了一种很有前景的替代方案。对于靶向细胞的LNP，实现细胞水平的分辨率至关重要。然而，由于冷冻引起的形态破坏，QWBA缺乏细胞分辨率。因此，微放射自显影是分析细胞水平药物分布的首选方法。 7.2 质谱分析 质谱 (MS) 通过测量质荷比实现分析物鉴定，并与分离技术相结合，可实现化合物的精确表征。迄今为止，基于质谱的方法已广泛应用于脂质成分的药代动力学分析和代谢物鉴定，例如Pfizer/BioNTech 的脂质药代动力学研究和 Moderna 的优化LNP制剂筛选。对于组织分布研究，传统的均质化方法可以提供定量数据，但无法揭示分析物在组织内的空间定位。相比之下，质谱成像 (MSI) 能够对完整组织中的脂质分布进行空间分辨分析。例如，Christensen 等人利用基质辅助激光解吸电离质谱成像成功绘制了脂质 DLin-KC2-DMA 的生物分布图。 尽管脂质分析取得了这些进展，但直接质谱表征mRNA仍面临严峻挑战。大分子mRNA（10⁵-10⁶ Da）有时会超出传统质谱的检测范围。Lowenthal等人近期建立了一种酸水解-同位素稀释质谱技术，用于定量制剂产品中LNP包裹的mRNA。酸水解可同时从LNP中释放mRNA并将其水解成组成核碱基，以便进行定量。虽然该方法能够确保准确性，但其灵敏度仍低于传统的聚合酶链式反应（PCR）。更重要的是，它无法解决一些关键挑战，例如体内mRNA定量或区分复杂形式的mRNA（完整与降解、游离与包裹）。除了核酸外，质谱平台还支持疫苗相关蛋白的表征，包括抗原蛋白和冠状蛋白等。 7.3 荧光成像 荧光成像 (FLI) 和生物发光成像 (BLI) 能够对mRNA-LNP的生物分布进行非侵入性追踪。它们的主要区别在于发光机制；FLI需要特定波长的光激发荧光染料或蛋白质，从而检测其发射的光。相比之下，BLI通常涉及先注射编码荧光素酶的 mRNA-LNP，然后注射相应的底物（例如荧光素）以启动酶促反应并发出光。这两种技术均被广泛应用于追踪临床前模型中 mRNA-LNP 制剂的时空分布。 LNP可标记亲脂性染料（例如DiD、DiR、DiO）用于体内成像。然而，这些染料可能会改变被标记物质的理化性质。此外，一项研究表明，静脉注射后，染料ICG会从LNP中泄漏，从而影响生物分布的表征。这种泄漏可能与其两亲性以及在LNP中的定位有关，凸显了谨慎选择合适荧光染料的必要性。对于mRNA追踪，Cy5和Cy7等染料可以实现追踪，但会引入空间位阻和疏水性，从而损害转录和翻译。其他技术--包括纳米载体偶联探针（例如金纳米颗粒）和适体融合策略--也会降低翻译效率或破坏RNA-蛋白质相互作用。相比之下，化学修饰方法（例如，叠氮基功能化的5′端帽类似物或3′端polyA尾）干扰极小，并可在细胞内进行转录后标记，但有限的标记位点导致信号强度较低。Baladi等人开发了一种荧光三环胞嘧啶类似物，该类似物不仅能产生足够的荧光进行可视化，而且关键在于保持了翻译活性，在mRNA-LNP递送研究中展现出应用前景。此外，包裹编码荧光蛋白的mRNA的LNP制剂常用于研究mRNA-LNP的生物分布。 生物发光成像（BLI）利用荧光素酶-底物反应产生生物发光信号，从而实现对荧光素酶蛋白的非侵入性追踪。BLI消除了自发荧光的问题，因此与荧光成像（FLI）相比具有更高的特异性。多种成像方式的结合通常可以提供更丰富的动态信息。例如，Ma等人利用包裹Cy5标记的荧光素酶mRNA的DiR标记的LNP，通过FLI和BLI追踪实时生物分布。他们利用Cy5和DiR之间的荧光共振能量转移（FRET），通过Cy5荧光信号的恢复来监测mRNA从LNP上的解离。此外，转基因模型（例如Ai14小鼠）可以用于间接评估功能性mRNA的递送和表达。在该系统中，Cre编码mRNA-LNP的递送导致Cre蛋白的翻译，该蛋白催化基因组整合的lox P -Stop-lox P盒的切除，从而激活tdTomato荧光表达作为读数。 在mRNA疫苗研究中，编码荧光素酶的mRNA常被用作替代指标，以间接推断mRNA-LNP的生物分布，因为LNP被广泛认为是决定生物分布的主要因素。然而，该信号反映的是蛋白质表达，而非LNP的分布。此外，应仔细考虑荧光素酶的固有动力学，因为荧光素酶与功能性蛋白质的生物分布模式可能存在显著差异。例如，荧光素酶是一种短寿命蛋白，在活的HEK293细胞中的半衰期约为2小时，而SARS-CoV-2刺突蛋白则表现出更长的持久性（在BEAS-2B细胞中>8小时）。值得注意的是，对于mRNA治疗药物而言，靶组织中编码蛋白的表达水平和持续时间会影响药物疗效的起效时间和持续时间。这表明，用于研究mRNA疫苗生物分布的替代方法可能并不适用于mRNA治疗药物。 7.4 杂交技术 原位杂交（ ISH）是一种基本的分子技术，它通过互补探针杂交来可视化特定的核酸序列（DNA或RNA），从而实现对生物样本内核酸的精确空间定位。荧光原位杂交（FISH）是固定标本中RNA检测的金标准，具有无与伦比的特异性和分辨率。Moderna公司利用单分子FISH技术定量分析了mRNA疗法的细胞内递送。bDNA技术采用顺序夹心杂交和分支DNA介导的信号放大（而非靶标放大）来产生与原始核酸量直接成正比的化学发光信号，从而提供了一种高灵敏度的方法来定量分析低丰度靶标，例如体内mRNA。例如，Moderna 利用 bDNA 在临床前评估期间对各种组织中的六种封装 mRNA 进行定量，突显了其多重分析能力。其他技术，如定量逆转录 PCR、RNAscope 和基于核酸序列的扩增、液滴数字PCR，为 mRNA的检测和定量提供了互补策略。 此外，杂交方法与FRET技术联用时，可用于评估内体逃逸效率。Zhang等人开发了一种靶向GAPDH mRNA的Cy5/BHQ3标记的部分互补双链DNA探针。在双链状态下，Cy5荧光通过FRET被BHQ3猝灭。当探针进入细胞质后，其中BHQ3标记的单链DNA会被GAPDH mRNA竞争性置换，导致Cy5荧光恢复，可通过共聚焦激光扫描显微镜检测到。该探针可作为货物可及性和递送系统效率的间接指标，而非直接反映mRNA释放动力学，从而克服了传统mRNA标记方法的局限性。 原位杂交（ISH）技术主要用于组织或细胞内核酸的空间分布定位和定量。然而，由于其需要组织固定，且探针稳定性及空间分辨率存在局限性，因此不适用于体内动态追踪。此外，由于RNA探针长度的限制，该方法可能无法区分检测到的信号是来自完整的mRNA还是降解片段，这可能会影响与蛋白质表达的相关性分析。通过联合使用靶向多个区域的探针，可以评估目标mRNA的完整性。 7.5 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是一种用于定量分析多种分析物（包括蛋白质、激素、抗体和免疫标志物）的基础技术，其主要方法有四种：直接法、间接法、夹心法和竞争法。ELISA是mRNA-LNP疫苗研发中的一种综合工具，能够实现精确的抗原定量（例如，受体结合域）、抗体谱分析、细胞因子动态监测以及通过检测 PEG 特异性抗体进行安全性评估 ，从而为疫苗诱导的体液免疫、免疫极化和潜在的超敏反应提供关键信息。ELISA 具有极高的灵敏度（可检测皮克级）、高通量和更高的安全性。尽管如此，它仍然容易受到非特异性抗体结合引起的交叉反应伪影的影响，这会破坏检测的特异性，并产生假阳性或假阴性信号。 7.6 条形码技术 DNA条形码技术是一种用于体内LNP分析的新型高通量筛选技术。每个LNP都含有独特的条形码序列核酸，通过对靶细胞或组织中的条形码进行测序，即可追踪纳米颗粒的递送情况。例如，Huayamares等人利用DNA条形码技术结合PCR技术评估了94种LNP制剂，筛选出能够靶向头颈部鳞状细胞癌的递送系统。虽然DNA条形码技术能够实现高通量筛选，但它无法直接报告mRNA的翻译水平。将mRNA与DNA条形码共递送可以解决这一局限性，因为它能够同时提供蛋白质表达数据，从而筛选出具有最佳递送和功能功效的LNP。Sanchez等人通过筛选128种共递送Cre mRNA和DNA条形码的LNP制剂，验证了这种方法，从而能够同时评估生物分布和功能。Liu等人也采用了类似的方法。146通过将 dsDNA 条形码与 qPCR 和 BLI 相结合，系统地评估了 mRNA-LNP在小鼠体内的生物分布和递送效率。 除了基于DNA的条形码策略外，一些新型条形码方法也展现出良好的筛选效果。例如，Rhym等人开发了一种LC-MS/MS方法，用于检测由mRNA翻译而来的肽条形码，从而能够对384种结构不同的可电离脂质进行体内评估。此外，Wang等人创建了反转录条形码定量分析方法，该方法利用细菌逆转录子系统将功能性mRNA的胞质递送与cDNA条形码的读取相结合。 总之，仅监测mRNA-LNP中的单一组分无法有效确认其在靶细胞中的成功递送和功能活性。因此，多模式分析方法对于全面表征mRNA-LNP的药代动力学和生物学归宿至关重要。传统分子探针（荧光/生物发光）、放射性标记和新型条形码策略的整合应用，为快速筛选具有高递送效率的组织特异性LNP提供了一个变革性的平台。 8. 提高mRNA-LNP的功效、靶向性和安全性 LNP在递送RNA疗法方面展现出显著的疗效，但其递送效率、靶向特异性、安全性和免疫原性等方面仍需进一步优化。本节将探讨这些关键挑战，以促进下一代LNP的设计优化，并拓展mRNA-LNP的应用范围。 8.1 提高mRNA-LNP的功效 8.1.1 通过优化脂质设计和组成来提高LNP的递送效率 提高内体逃逸效率对于提升蛋白质表达至关重要。优化LNP的设计和配方是增强内体逃逸的核心，其中可电离脂质的优化是目前研究最为广泛的方法。可电离脂质具有三个结构组成部分：头部、连接基团和尾部。脂质结构的变化——例如头部基团的数量、尾部的不饱和度和疏水性、不饱和键的位置和构象以及尾部的数量和长度--会显著影响LNP的递送效率。例如，将三烷基脂质引入LNP可以促进其形成反六方相，从而增强对内体膜的破坏。Lam等人开发并筛选了一系列三烷基可电离脂质，最终确定了最佳候选脂质（脂质10）。基于脂质10的LNP展现出比基于MC3的LNP更强的基因沉默能力和更好的耐受性。对具有2、3和4个尾部的可电离脂质（均具有咪唑头基）的进一步比较研究表明，4尾变体取得了最佳效果。Mrksich等人构建了一个具有不同尾长的可电离脂质组合库。与基准C12-200相比，用C10-200（短尾离子液体）配制的LNP使肝脏中荧光素酶mRNA（1929 bp）的转染效率提高了10倍以上。对于Cas9 mRNA（4521 bp），基于C9-200的LNP诱导的插入/缺失数量是C12-200对照组的三倍以上。这表明不同大小的 mRNA 的最佳脂质尾长度不同，这表明对于旨在用于不同治疗目的的 mRNA 药物，可电离脂质的结构和比例可能仍需进一步优化。 连接基团通常由醚键、酯键或酰胺键组成，连接头部和尾部，也会影响递送效率。例如，当疏水尾部的横截面积大于亲水头部时，LNP倾向于呈现锥形形态，从而促进内吞体逃逸并提高递送效率。利用这一特性，Liu等人设计了带有支链β-异丁基戊二酸酯连接基团的可电离脂质，提高了LNP的转染效率。此外，Chen等人开发了具有二硫键桥联酯连接基团的谷胱甘肽（GSH）响应性可降解脂质，其锥形结构促进了优异的内吞体逃逸和快速的mRNA释放动力学。 一项引人入胜的研究表明，可电离脂质的立体化学结构显著影响其递送效率和耐受性。具体而言，基于C12-200- S的LNP的mRNA递送水平分别高于其外消旋体和C12-200- R对应物。值得注意的是，立体纯的LNP在体内表现出比外消旋制剂更优异的耐受性。然而，另一项研究表明，可电离脂质的立体化学结构对递送结果的影响可能因不同的分子体系而异，这凸显了阐明化学结构如何调控LNP活性和耐受性特征的迫切需求。 对脂质组分进行修饰是提高mRNA递送效率的有效策略。一项研究将一种新型氟化可电离脂质（F-L319）整合到基于L319的LNP中，所得LNP在体内mRNA递送效率方面显著优于单独的L319-LNP或F-L319-LNP。此外，研究人员还设计了不对称甾醇偶联的可电离脂质，以实现更持久、更安全的mRNA递送。另外，修饰辅助脂质（例如胆固醇）也可以调节内体逃逸。研究表明，用可电离胆固醇类似物3β- [L-组氨酰胺-氨基甲酰]胆固醇替代传统胆固醇可显著增强GFP表达。这种增强可能是由于新型胆固醇类似物中的组氨酸咪唑基团在内体中质子化，从而促进了内体逃逸。类似地，Patel等人也观察到了类似的结果。研究人员筛选出171种基于β-谷甾醇的LNP，这些颗粒具有优异的转染效率，这可能与其多面体形态有关。值得注意的是，尽管这些新型可电离脂质展现出卓越的蛋白质表达效率，但目前的研究缺乏对其体内免疫原性、生物降解性和靶向特异性的全面表征。因此，这些先进材料值得进一步研究。此外，由于物种间存在显著差异，因此需要在大型动物模型（尤其是非人灵长类动物）中进行治疗验证，以确认其临床疗效。 在传统LNP中加入第五种组分是提高mRNA递送效率的另一种策略。例如，Bogaert等人通过用阳离子两亲性药物部分替代胆固醇，策略性地增强了LNP中siRNA和mRNA的胞质递送。阳离子两亲性药物已被证实能够促进小核酸的细胞内转运。将四醚脂质卡尔达古醇（一种古菌醚脂）整合到LNP中显著提高了递送效率，体外mRNA表达量提高了10倍，这可能归因于该脂质的融合性和溶致性。此外，将膜嵌入型共轭寡电解质COE-S6整合到mRNA-LNP中，静脉注射后可使全身荧光素酶表达量提高1.75倍。此外，将带负电荷的聚合物引入LNP是提高mRNA递送效率的另一种可行方法，其原理是通过促进mRNA从载体上的扩散和解离。Zhang等人通过将聚γ-谷氨酸掺入mRNA-LNP中增强了胞质mRNA的释放。随后的体内研究证实，优化后的mRNA-LNP制剂在静脉注射或肌肉注射后分别使荧光素酶表达提高了5倍和3倍。 细胞内吞机制或细胞内转运途径的改变也能有效解决内吞体逃逸效率低的问题。例如，一项研究表明，用互补脂肽预处理细胞，并使用卷曲螺旋肽修饰的LNP，可以绕过内吞途径，实现大量的基因载体递送。与未修饰的LNP相比，这种方法使GFP表达量提高了高达63倍。然而，值得注意的是，这种高效的递送只能通过细胞预处理来实现，因此可能在过继细胞疗法中具有潜在的应用价值。Wang等人开发了一种基于非阳离子硫脲的LNP系统，该系统能够绕过细胞内循环途径--一种将内化的纳米颗粒排出到细胞外空间的常见机制。通过抑制这种外排，该系统显著提高了基因转染效率。 8.1.2 提高预防性疫苗的免疫原性 预防性疫苗的主要功能是通过诱导免疫反应来建立长期保护性免疫。将佐剂功能引入LNP中，可以协同增强先天免疫激活和抗原特异性适应性免疫反应。Han等人设计了一种佐剂类脂质，通过在LNP中进行部分取代，增强了mRNA的递送并赋予其TLR7/8激动活性，从而提高了小鼠SARS-CoV-2疫苗的先天免疫力。Misra等人开发了共封装TLR7选择性佐剂CL347的LNP，与未添加佐剂的对照组相比，淋巴器官中IFN-γ+ CD4+/CD8+ T细胞的数量增加了一倍。虽然mRNA疫苗能够有效诱导适应性免疫，但其保护作用通常较短。增强免疫记忆的持久性仍然是一项关键挑战。微生物群代谢物是增强 CD8 + T 细胞记忆的有希望的佐剂候选物。一项研究通过将微生物代谢物（例如丁酸盐）纳入 LNP，实现了干细胞样记忆 T 细胞的增强生成和记忆 T 细胞反应的放大，表明这是一种有希望的持久免疫策略。 8.1.3 提高治疗应用的效果 为了提高治疗效果，研究人员正在开发创新的LNP策略，通过共递送具有协同作用的治疗药物来克服生物屏障。Li等人证明，地塞米松预处理可增强小鼠和猴子体内荧光素酶的表达。机制研究表明，地塞米松抑制了巨噬细胞的吞噬作用，从而增加了肝细胞中LNP的积累。该策略最终提高了蛋白质替代疗法和基因组编辑疗法的疗效。在另一项研究中，Park等人构建了一种用于递送IL-12 mRNA和吲哚莫德前药的LNP共递送系统。吲哚莫德抑制吲哚胺2,3-双加氧酶通路，从而抑制IL-12诱导的免疫抑制性CD4+ Foxp3+调节性T细胞的活化。该策略增强了CD8+ T细胞的效应功能并延缓了肿瘤生长，展现了一种有前景的癌症免疫治疗方法。此外，新兴研究表明，肿瘤来源的小细胞外囊泡会劫持治疗性纳米颗粒并将其递送至肝脏库普弗细胞进行降解，从而降低抗肿瘤疗效。Gong等人构建了一种包含mRNA和Rab27a siRNA的LNP共递送平台；通过抑制肿瘤来源的小细胞外囊泡的分泌，该策略显著提高了治疗效果，凸显了其在肿瘤治疗领域的应用潜力。 8.2 增强mRNA-LNP的靶向性 8.2.1 增强mRNA-LNP的组织靶向性 为了拓展LNP在多种RNA疗法中的应用，开发有效靶向体内特定器官和组织的策略至关重要。此类进展将提高治疗效果，同时最大限度地减少不良反应。合理设计可电离脂质是当前研究中构建LNP靶向特异性的关键策略，尤其是在脾脏和肺部靶向方面。对于脾脏靶向，树枝状可电离脂质、缩酮酯可电离脂质和含碳酸盐的可电离脂质能够有效介导递送。相反，尾部含有酰胺键的可电离脂质和哌嗪类可电离脂质（例如244cis）能够使LNP趋向肺部。值得注意的是，连接基团的结构类型也会影响LNP的靶向特异性。此外，在LNP中添加第五个组分是调节靶向特异性的关键策略。一个典型的例子是SORT LNP的开发，通过将SORT脂质掺入制剂中，改变了其靶向特性，从而能够高效递送至包括肺、脾、上皮细胞和免疫细胞在内的多种器官和细胞类型。Liu等人合成了几种可电离胆固醇类似物作为第五个LNP组分。他们的研究表明，静脉注射后，0315-Ergo-40%制剂在主要分布器官（肝脏、肺和脾脏）中，脾脏荧光信号占总信号的95%。相反，在102-Sito-40%制剂中，肺部荧光信号占这些器官总信号的78%。这证实了通过掺入可电离胆固醇类似物来调节器官选择性的可行性。 除了LNP之外，其他类型的载体也能介导肝外靶向。例如，Lin等人开发了磷脂化烷基化聚合物（PAP），其中单组分PAP可促进mRNA向脾脏的特异性递送。此外，PAP可与多种辅助脂质协同形成LNP，从而分别实现mRNA向肺部和肝脏的特异性递送。一项关于聚合物-脂质杂化纳米颗粒的研究表明，LNP的器官趋向性取决于可电离氨基聚酯的侧链长度，较短的侧链（C4-C5）可将颗粒导向脾脏和肺部，而较长的侧链（C7-C9）则可递送至肝脏。此外，改变给药途径也可以改变LNP的靶向性。例如，气管内给药或雾化可介导肺部给药 。 与脾脏和肺脏相比，针对其他器官的靶向递送研究仍然相对有限。Isaac等人通过将胆钙化醇作为第五组分整合到LNP中，构建了一个内源性靶向平台。这种新型系统能够将LNP静脉递送至胰腺，为胰腺疾病的治疗提供了广阔的应用前景。对于骨靶向，双膦酸盐配体修饰是一种有效的经典方法。研究表明，经双膦酸盐基团化学修饰的可电离脂质能够有效地将LNP递送至骨微环境 。值得注意的是，一项有趣的研究开发了一种创新的LNP系统，该系统通过将共价结合脂质基团（例如硬脂酸N-羟基琥珀酰亚胺酯）作为第五组分整合到LNP中，从而实现骨髓靶向。其靶向机制是由内源性过程驱动的，其中共价结合的脂质能够富集LNP表面的载脂蛋白E（ApoE）。这些 LNP 可转染至少 14 种细胞类型（包括造血干细胞和免疫细胞），从而在骨髓中实现高效的基因组编辑，并展现出治疗血液疾病的潜力。 8.2.2 增强mRNA-LNP的细胞靶向性 免疫细胞和癌细胞是重要的预防或治疗靶点，众多研究通过优化可电离脂质探索了LNP的靶向策略。Zhao等人证明，含咪唑的类脂质体基LNP能够高效地将mRNA递送至T淋巴细胞。Fenton等人设计了一种新型的基于OF-Deg-Lin的LNP，该LNP能够将mRNA递送至脾脏B淋巴细胞并诱导蛋白质表达。此外，Suzuki等人发现，含15% DSPC的LNP具有刚性、疏水性和电荷中性表面，从而抑制ApoE介导的肝脏摄取，同时促进补体受体介导的B细胞靶向。 将配体（包括小分子、适配体和肽）偶联到LNP表面，可以实现将mRNA靶向递送至特定细胞。Tang等人开发了一种苯硼酸衍生的LNP，能够将mRNA靶向递送至唾液酸过表达的肿瘤细胞。Zeng等人设计了甘露糖基化的LNP，使其能够靶向递送至抗原呈递细胞（APC）。LNP上的抗体修饰是调节细胞靶向特异性的关键策略。例如，CD5抗体偶联的LNP能够将mRNA高效递送至T淋巴细胞，从而驱动体内功能性CAR-T细胞的高效生成。另一项研究表明，EGFR靶向的LNP能够被转移性卵巢癌细胞特异性摄取。Shi等人研究设计了一种经 CD117 抗体功能化的LNP，该颗粒可通过静脉注射实现对啮齿动物造血干细胞的靶向 RNA 递送。最近，Papp 等人通过用 CD47 修饰抗体靶向LNP，开发了一种CD47/tLNP平台。他们的研究结果表明，CD47/tLNP 可减少吞噬清除并提高细胞特异性递送效率。 8.3 提高mRNA-LNP的安全性 8.3.1 克服抗PEG抗体的影响 重复给药聚乙二醇化脂质纳米颗粒（PEGylated LNPs）可能诱发超敏反应，因此需要采取缓解策略来提高mRNA-LNPs的安全性并拓展其治疗应用。给药途径和剂量可能显著影响抗LNP抗体（ALA）的水平，这些参数通常根据具体的治疗目标来选择。一项单颗粒抗体测量分析研究检测了雌性C57BL/6JRj小鼠在静脉注射（IV）、皮下注射（SC）或肌肉注射（IM）mRNA-LNPs后ALA的产生情况。结果表明，无论剂量高低（300 μg/kg或0.3 μg/kg），肌肉注射始终产生最低的ALA水平。相比之下，皮下注射以剂量依赖的方式产生最高的ALA浓度，而静脉注射产生的ALA水平则呈现剂量依赖性，这与之前的观察结果一致。这些发现表明，给药途径的选择需要仔细考虑。 mRNA-LNP疗法的制剂设计能够调控免疫反应，包括与超敏反应相关的抗PEG IgE/IgM。调节PEG脂质的酰基链长度可以调控抗PEG抗体的产生。一项研究比较了分别与C14和C18酰基链PEG脂质偶联的LNP诱导的抗PEG IgM水平。结果表明，与长链PEG脂质相比，短链PEG脂质的LNP诱导的抗PEG IgM水平较低。这种差异可能归因于短链PEG脂质更容易从LNP中脱落，而游离PEG诱导抗PEG IgM产生的能力较弱。此外，研究表明，可裂解支链和支链PEG-脂质衍生物能够减少抗PEG抗体的产生，从而缓解加速血液清除（ABC）现象。修饰PEG化纳米颗粒的表面性质也可以微调免疫反应。Zhang等人设计了一种抗PEG单链可变片段，该片段通过与抗PEG抗体竞争结合位点来缓解ABC现象。 此外，研究人员正在探索聚乙二醇（PEG）的替代品，例如聚（N-乙烯基吡咯烷酮）、聚丙烯酰胺、聚（2-噁唑啉）和聚肌氨酸（pSar）。研究表明，基于pSar-LNP的mRNA递送效率与PEG脂质体相当，且具有相似的体内安全性。更重要的是，pSar 脂质体诱导的 IgM/IgG 水平显著低于 PEG 脂质体，从而有效缓解了 ABC 效应。聚（羧基甜菜碱）脂质（PCB）是 PEG 脂质的另一种有前景的替代品。研究表明，与基于 PEG 的 LNP 相比，掺入 PCB 的 LNP 能够缓解 ABC 效应，并表现出更高的内体逃逸效率。最近，Xiao 等人将工程化的刷状聚合物脂质取代了PEG 脂质，与基于 DMG-PEG2000 的 LNP 相比，新型 LNP 表现出更低的抗 PEG 抗体结合水平，并在蛋白质替代和基因组编辑领域具有更优异的治疗性能。 合理使用免疫抑制剂是减轻不良反应的一种策略。Chen等人将LD003（一种疏水性地塞米松前药）整合到LNP中，该纳米颗粒可包裹多种核酸，从而有效降低免疫刺激。然而，免疫抑制剂的疗效和广泛适用性仍需进一步研究。此外，对预先存在的抗聚乙二醇（PEG）抗体进行临床筛查对于识别对聚乙二醇化疫苗发生严重超敏反应的高危人群至关重要。对于这些患者，在确认对赋形剂无交叉反应后，可以考虑其他替代疗法，例如病毒载体疫苗或蛋白质疫苗。 8.3.2 降低可电离脂质的免疫原性 LNP可能引发炎症反应，导致疫苗相关不良反应，例如发热、疲劳和注射部位疼痛。研究表明，LNP诱导的强效炎症反应主要来源于可电离脂质。一项研究证实，在可电离脂质中，含胺基团的头部基团通过两条关键途径诱导LNP的免疫原性--一条途径是与Toll样受体4和CD1d结合，另一条途径是促进脂筏的形成 。因此，有研究提出用高生物相容性的替代品取代可电离脂质，以降低免疫原性。例如，研究人员开发了高生物相容性、pH响应性的二肽偶联脂质（DPL），其脂质头部基团中含有二肽（而非叔胺基团）。优化的基于DPL的LNPs实现了与基于SM-102的LNPs相当的抗OVA抗体产量，但诱导的炎症介质产生水平却显著降低。另一项研究采用海藻糖糖脂部分替代可电离脂质，所得LNPs在保持基因表达和免疫原性的同时，显著降低了器官毒性，证实了部分替代可电离脂质可提高安全性。降低LNPs中可电离脂质的比例是另一种减轻炎症反应的策略。Liu等人构建了含有1%米屈肼衍生阳离子脂质的LNPs，实现了与基于SM-102的LNPs相当的mRNA递送效率，同时显著减轻了炎症反应。 8.4 下一代mRNA-LNP 8.4.1 下一代LNP RNA疗法的应用范围不断扩大，涵盖癌症治疗、单基因疾病和自身免疫性疾病等领域，这加剧了对高效递送平台的需求。除了LNP之外，人们正在探索多种替代递送平台，例如细胞外囊泡（EV） 、聚合物纳米颗粒和病毒载体。此外，混合递送系统展现出显著的通用性，它结合了不同平台的优势，克服了单一系统方法固有的局限性。例如，一项研究将融合相关小跨膜蛋白（FAST）整合到LNP中，开发出蛋白脂质载体（PLV）。 FAST-PLVs是一种结合了病毒和非病毒载体特性的混合系统，在小鼠和非人灵长类动物模型中表现出广泛的组织分布和高效的递送能力。更重要的是，FAST-PLVs具有较低的免疫原性，并且在重复给药后仍能保持功能活性。另一项研究设计了聚合物-脂质混合纳米颗粒，提高了15 kbp pDNA的转染效率，从而推进了大片段DNA的递送。 混合递送系统发展迅速，目前已有大量文献报道此类混合系统，例如混合LNP、基于细胞外囊泡（EV）的混合系统、脂质-聚合物混合系统、纳米颗粒-水凝胶混合系统以及混合聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒。与单一递送系统相比，混合系统展现出更高的稳定性和递送效率，使其成为极具潜力的治疗平台。然而，其复杂的组成成分需要更多的生产资源和专业知识，而结构复杂性的增加也可能增加监管审批的难度。 8.4.2 下一代mRNA mRNA是基于mRNA的疫苗和治疗药物的功能性组成部分。目前，药物研发中主要利用三种不同类型的mRNA：非复制型mRNA、自扩增型mRNA（saRNA）和环状mRNA（circRNA）。saRNA疫苗由RNA病毒（主要是甲病毒）的基因组改造而成。其主要优势在于具有自我复制能力，从而显著降低了疫苗接种所需的RNA剂量。仅10 ng saRNA即可在小鼠体内诱导强烈的免疫原性，而临床试验仅需5 μg。然而，saRNA易引发过度先天免疫反应仍然是一个挑战，而通过合理设计可电离脂质可以部分缓解这一问题。 由于其共价闭合结构，环状RNA（circRNA）的半衰期显著长于线性RNA。这种固有的稳定性延长了其保质期，降低了对储存和运输的严格要求，并增强了其在多种细胞类型和组织中的药代动力学积累。尽管circRNA疫苗展现出优于线性mRNA疫苗的免疫原性，但其生产工艺复杂。开发高效、低毒的mRNA疗法，关键在于优化生产和纯化方法。 8.5 促进mRNA-LNP疗法的临床应用 理想的mRNA-LNP候选药物需要具备高蛋白表达、低免疫原性和重复给药后的长期安全性。然而，目前的mRNA-LNP面临诸多挑战，阻碍了其向临床应用的转化。首先，mRNA-LNP的细胞内转运、内体相互作用和内体逃逸的具体机制仍未完全阐明。尽管已有研究提出一些策略来增强逃逸，例如使用可电离脂质破坏内体膜或抑制内体循环，但阐明控制这一过程的具体因素对于提高递送效率至关重要。 其次，在mRNA疫苗中，LNP兼具载体和免疫刺激佐剂的双重作用。然而，LNP触发的免疫反应对疫苗不良反应的影响尚不明确。这种佐剂活性可能会降低非疫苗应用（尤其是蛋白质替代疗法）的疗效，尤其是在重复给药的情况下。因此，降低LNP的免疫原性是一项重要的研究重点。此外，经典LNP成分（可电离脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇、磷脂）的体内药代动力学研究常常被忽视。鉴于可电离脂质/聚乙二醇化脂质的免疫原性风险，阐明其代谢和清除途径对于优化安全性至关重要。 第三，mRNA-LNP递送系统的优化仍需进一步完善。关键方面包括mRNA的设计、合成和纯化，以提高翻译效率并减轻先天免疫激活。然而，核苷修饰在全身给药的mRNA-LNP中的有效性可能因LNP组成和靶器官/细胞类型而异 ，因此有必要深入研究修饰策略、翻译产出和组织/细胞特异性之间的关系。 第四，物种差异阻碍了临床转化进程。尽管体外试验能够快速且经济高效地提供信息，但其对体内性能的预测可靠性仍然有限 。弥合受控的体外系统与复杂的体内生理环境之间的差距仍然是转化应用的一项重大挑战。历史上，由于伦理和经济方面的考虑，LNP的组成成分主要在啮齿动物中进行优化。然而，将啮齿动物的效力数据转化到非人灵长类动物（NHP）——尤其是对于静脉注射产品--已被证明十分困难。关键的LNP参数，包括粒径和脂质比例，在不同物种间存在显著差异。因此，在NHP模型中对核酸序列和LNP设计进行临床前验证至关重要。终末用途NHP研究或许能够提供一种在减少动物使用的同时生成临床相关数据的策略。 第五，不同年龄组的免疫功能存在显著差异。因此，临床前研究应建立合适的模型来研究年龄对疫苗效力的影响 。佐剂可能是提高老年人群疫苗接种效果的有效策略。此外，代谢紊乱会影响免疫反应，糖尿病和肥胖小鼠的免疫反应减弱即证明了这一点--这一发现强调了针对特定目标人群定制mRNA-LNP制剂的必要性。 第六，mRNA分子在室温下稳定性较差；因此，mRNA-LNP疫苗需要在低温（-20°C）或超低温（-70°C）下储存和运输。冻干制剂在4°C和室温下具有更长的保质期，且不影响免疫原性，这使得该技术成为mRNA疫苗研发领域极具前景的下一代平台。 9. 结论与展望 mRNA-LNP在预防性疫苗中已证实有效，且在肿瘤学/基因编辑领域展现出巨大潜力，凸显了其在核酸疗法中的关键作用；然而，其向更广泛的生物制剂领域的转化面临诸多挑战，包括安全风险、脱靶积累、内体逃逸不佳以及瞬时表达等，因此亟需阐明其体内命运（例如，组分药代动力学、代谢物谱和蛋白质生物分布），以指导下一代药物的设计。目前市售mRNA-LNP疫苗的研发严重低估了完整mRNA-LNP复合物及其组分的吸收、分布、代谢和排泄过程。虽然这种疏忽部分源于分析方法的技术局限性，但其主要依据是mRNA-LNP制剂已在广泛的动物研究和当前的临床应用中展现出可接受的安全性，从而表面上看似无需进行详细的药代动力学表征。这种解释可能部分适用于传统的mRNA-LNP疫苗。然而，如上所述，mRNA-LNP疫苗在几个关键方面与其他正在临床开发的基于mRNA-LNP的生物制剂存在根本差异。 尽管已有大量研究对mRNA-LNP的体内命运进行了表征，但目前的理解主要来源于采用肌注给药的疫苗研究。这与其他生物制剂常用的给药途径（例如皮下、皮内、静脉和瘤内注射）形成鲜明对比。纳米颗粒表面的蛋白冠组成会随着其在不同生物体液间的转运而动态变化。因此，给药途径和动态转运过程会显著改变蛋白冠的形成，最终影响生物分布。明确注射部位微环境、LNP界面性质、蛋白冠组成和组织趋向性之间的相互作用，对于合理设计下一代mRNA-LNP至关重要。然而，阐明这些关系需要高效的分离纯化方法，以有效区分原始LNP、PEG-脂质脱除的LNP、蛋白冠包覆的LNP和mRNA/脂质复合物，并对其组成和结构特征进行详细表征。遗憾的是，目前大多数研究仍然采用反复试验的方法，直接探究LNP自身的理化性质与组织分布或蛋白质表达之间的关系。这种知识空白阻碍了对机制的理解，因为目前的经验方法直接将初始LNP性质与组织分布关联起来，而忽略了中间转化状态。 mRNA-LNP疫苗与其他mRNA-LNP生物制剂的根本区别在于蛋白质表达与治疗效果之间的关系。对于疫苗而言，其效力很少与抗原蛋白表达水平呈现直接的剂量反应相关性。相反，疫苗效力主要取决于蛋白质抗原所在的组织微环境以及免疫细胞的摄取和呈递效率——蛋白质表达与免疫原性之间有限的相关性（r=0.54）也证实了这一点。相反，基因编辑和蛋白质替代疗法则依赖于表达蛋白的数量和生物学功能。内体逃逸仍然是mRNA-LNP高效表达蛋白质的关键瓶颈。巨胞饮作用通过其高摄取能力和高效的内体逃逸，展现出增强胞质mRNA-LNP递送的巨大潜力。然而，逃逸效率受脂质融合性、内体成熟度和细胞类型特异性 pH 值变化的影响，因此有必要进一步研究组织特异性 LNP 的性能。 此外，分析方法的局限性以及mRNA-LNP与生物系统相互作用的动态复杂性，通常限制了研究人员在评估体内分布动力学时只能追踪单一组分，例如特定的脂质或编码蛋白。然而，越来越多的证据表明，脂质、mRNA和表达蛋白等不同成分在体内的命运存在差异，这表明在生理暴露过程中会发生显著的组成重组。因此，仅基于部分组分追踪来表征完整mRNA-LNP的生物分布，而不对这些结构重塑后的复合物进行严格区分，从根本上来说是存在偏差且方法论缺陷的。 总之，mRNA-LNP疗法的临床应用拓展需要对其体内代谢过程进行全面深入的研究。阐明可电离脂质的构效关系、关联LNP的理化性质与组织趋向性以及评估其疗效与安全性是关键的研究重点。突破性进展将取决于创新的分析平台（包括分离、纯化和结构组成分析），以及对大量数据的持续积累和关联分析。 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.apsb.2025.11.023